Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клинико-генетическое исследование ряда кандидатных генов-маркеров костного ремоделирования при остеопорозе.

На правах рукописи

Маслова Карина Александровна

КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РЯДА КАНДИДАТНЫХ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ КОСТНОГО РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ПРИ ОСТЕОПОРОЗЕ

14.00.39 Ревматология 03.00.15 Генетика

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

003451358

Работа выполнена в Государственном Учреждении Институте ревматологии Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: профессор, доктор медицинских наук

Беневоленская Лидия Ивановна профессор, доктор медицинских наук Мякоткин Валерий Андреевич

Официальные оппоненты: профессор, доктор медицинских наук

Балабанова Римма Михайловна профессор, доктор медицинских наук Журков Вячеслав Серафимович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится часов на заседании

диссертационного совета Д 001.018.01 при ГУ Институте Ревматологии РАМН (115522, г. Москва, Каширское ш. 34А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института ревматологии РАМН (115522, г. Москва, Каширское ш. 34А)

Автореферат разослан_2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат медицинский наук И.С. Дыдыкина

Актуальность проблемы

Остеопороз (ОП) - системное метаболическое заболевание скелета, характерными проявлениями которого являются снижение массы костной ткани и нарушение ее микроархитектоники, что обусловливает низкую прочность кости и повышенный риск переломов. Распространенность заболевания в популяции возрастает с увеличением возраста, женщины страдают ОП чаще мужчин. Распространенность сниженной минеральной плотности костной ткани (МПКТ) среди лиц старше 50 лег достигает 30% среди женщин и 20% среди мужчин [Беневоленская Л.И., 2002г.]. Несмотря на большую социальную значимость болезни, патогенез ОП изучен недостаточно. В настоящее время ОП рассматривается в ряду мульти-факториальных заболеваний, патогенез которого обусловлен взаимодействием средовых и генетических факторов при значительном вкладе последних. Анализ вариабельности МПКТ показал, что среди взрослых индивидуумов она на 60-90% детерминируется генетическими факторами [Беневоленская JIM., 2002г.; Peacock M, 2002; Jones G., 2000; Nordstrom P, 1999].

В настоящее время активно изучается более 30 генов-кандидатов предрасположенности к ОП. Для изучения в нашем исследовании были отобраны гены эст-рогеновых рецепторов auß (ERa, ERß), которые реализуют действие эстрогенов в костной ткани, а также гены белков-участников процесса костного ремоделиро-вания: гены костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (LRP5), остеопроте-герина (OPG).

Одним из наиболее изученных генов предрасположенности к ОП является ген ERa. Исследования взаимосвязи этого гена с ОП проводятся на протяжении более 10 лет и охватывают азиатские и европеоидные популяции. Были показаны ассоциации определенных аллелей этого гена с МПКТ, маркерами костного ремо-делирования и переломами [Sapir-Koren R., 2001; Van Meurs J., 2003; Brown M., 2001; Bagger Y., 2000; Salmen T., 2000; Ioannidis J., 2005 и др.]. Относительно недавно описанный ERß также привлек внимание исследователей. Работы по изуче-

нию гена ER(5 немногочисленны, однако и в них показано наличие ассоциаций определенных полиморфизмов с ОП [Scariano J., 2004; Rivadeneira F., 2006 и др.].

Ген LRP5 кодирует синтез белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности, участвующего в реализации сигнальной функции Wnt-пути в различных клетках. В немногочисленных работах было показано влияние этого гена на нормальные вариации МПКТ [Van Meurs J., 2006], и обнаружены ассоциации с МПКТ и переломами у больных ОП [Mizuguchi Т., 2004; Bollerslev J., 2005; Коау M., 2004 и др.].

Белок ВМР4 относится к семейству костных морфогенных белков, являющихся факторами роста и участвующими в процессах хряще- и костеобразования. Белок кодируется геном ВМР4, который является геном-мишенью Wnt-сигнального пути. Исследование взаимосвязи этого гена с ОП представлено в единичных работах [Choi J., 2006; Semprini S., 2000; Ramesh Babu L., 2005].

Система RANK-RANKL-OPG, члены семейства лигандов и рецепторов фактора некроза опухоли а (ФНОа), рассматривается в настоящее время как один из ключевых механизмов регуляции формирования, дифференцировки и активности остеокластов и является посредником действия на костную ткань других регуляторов ремоделирования. В исследованиях гена OPG были показаны ассоциации с МПКТ и переломами [Wynne F., 2002; Arko В., 2005; Langdahl В., 2002 и др.].

Анализ литературных данных показывает, что в настоящее время при изучении различных выборок больных ОП выявлены достоверные ассоциации с канди-датными генами, участвующими в процессах костного метаболизма. Однако исследования различаются по дизайну, проводились на различных популяциях, возможно поэтому полученные результаты неоднозначны и зачастую противоположны, что диктует необходимость дальнейших исследований.

Цель исследования

Изучить участие генов эстрогеновых рецепторов аир (ЕЯа, Е1ф), костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (Ы1Р5), остеопротегерина (ОРв) в формировании генетической предрасположенности к ОП в московской выборке постмено-паузальных женщин.

Задачи исследования:

1. Изучить корреляции клинических факторов с показателями МПКТ поясничного отдела позвоночника и проксимального отдела бедра у больных первичным ОП и в контрольной группе здоровых индивидуумов в московской выборке постменопаузальных женщин.

2. Изучить распределение кандидатных генов-маркеров костного ремоделиро-вания: генов эстрогеновых рецепторов аир (ЕЯа, £/?/?), костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (ШР5), остеопротегерина {ОРС) у больных первичным ОП и в контрольной группе.

3. Изучить ассоциации показателей МПКТ поясничного отдела позвоночника и проксимального отдела бедра с аллельными полиморфизмами кандидатных генов.

4. Изучить ассоциации показателей относительного риска переломов у больных ОП с аллельными полиморфизмами кандидатных генов.

Научная новизна:

Впервые на выборке постменопаузальных женщин, проживающих в г. Москве, был изучен вклад полиморфизмов генов ЕЯа, ЕЯР, ВМР4, 1Л1Р5, ОРС в формирование предрасположенности к ОП.

Выбранные для изучения генетические маркеры обнаружили ассоциации с ростом (ХЬа1 полиморфизм гена ЕИл и ген 1ЛР5), возрастом наступления менархе

(сочетанный генотип Xbal/PvuII гена ERa), биохимическим показателями (PvuII полиморфизм гена ERa с уровнем фосфора, ген ERß с уровнем RANKL), что подтверждает значимую роль выбранных генов в процессах костеобразования и роста кости.

Впервые в России были изучены особенности частотного распределения генов ERa, ERß, ВМР4, LRP5, OPG в популяции постменопаузальных женщин. Выявлены генотипы риска развития ОП: РР (PvuII полиморфизм гена ERa), РР/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4) и СТ/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG), показатели относительного риска для указанных генотипов составили - 2,12, 2,3 и 13,1 соответственно. Таким образом, вероятность развития ОП у носителей генотипов РР и РР/СТ может увеличиваться в 2 раза, а у носителей генотипа СТ/АА - в 13 раз.

Обнаружены ассоциации генетических маркеров с МПКТ и переломами. Показано повышение МПКТ у носителей генотипов СС (ген LRP5), Рр/СТ (ERa (PvuII)/BMP4), СС/АА (LRP5/OPG), и понижение МПКТ у носителей генотипов TT (ген LRP5), РР/СС (ERa (PvuII)/BMP4), ТТ/АА (LRP5/OPG). Показана корреляция гена OPG с переломами поясничных позвонков (г=0,29, р=0,0036), носи-тельство генотипа AG является фактором риска развития переломов указанной локализации (OR=3,l).

В проведенном исследовании подтверждено, что формирование предрасположенности к ОП является результатом комплексного взаимодействия средовых и генетических факторов, при этом носительство определенных генотипов увеличивает риск развития заболевания.

Практическая ценность:

Проведенное клинико-генетическое исследование дополнило представление о клинических и патогенетических механизмах развития ОП. Полученные данные позволили выделить генетические факторы риска, носительство которых может увеличить риск развития заболевания в 2-13 раз, а именно: генотипы РР (PvuII по-

диморфизм гена ЕЯа), РР/СТ (сочетанный генотип ЕЯа (Руи11)/ВМР4) и СТ/АА (сочетанный генотип ЬИР5/ОРО). Кроме того, были выявлены генотипы, ассоциированные с низкой МПКТ: генотип ТТ (ген 1ЛР5), РР/СС (сочетанный генотип генов ЕЯа (Руи11)/ВМР4), ТТ/АА (сочетанный генотип генов 1ЛР5/ОРО), а также с остеопоротическими переломами: генотип Ай гена ОРй ассоциирован с переломами поясничных позвонков. Выявленные факторы риска могут использоваться для определения круга лиц с высокой генетической предрасположенностью к заболеванию ОП.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наследственными факторами риска ОП являются генотипы РР (РуиП гена ЕЯа), РР/СТ (сочетанный генотип ЕЯа (Руи11)/ВМР4) и СТ/АА (сочетанный генотип 1ЛР5/ОРО).

2. Генотипы Рр (РуиП гена ЕЛа), ххРр (сочетанный генотип полиморфизмов ХЬа1 и РуиП гена ЕЯа), Рр/СТ (сочетанный генотип ЕЫа (Руи11)/ВМР4), хх/СС (сочетанный генотип ЕЯа (ХЬа1)ЛЛР5), СС/АА (сочетанный генотип Ы1Р5/ОРО) можно рассматривать в качестве про-тективных.

3. Носительство генотипов СС (ген 1Л1Р5), Рр/СТ (ЕЯа (РуиП)/ВМР4), СС/АА (1ЛР5/ОРО) ассоциировано с более высокими значениями МПКТ, а генотипов ТТ (ген 1ЛР5), РР/СС (ЕЯа (РуиИ)/ВМР4), ТТ/АА (ЬЯР5/ОРС) - с более низкими по сравнению с носителями других генотипов.

4. Носительство генотипа Аб гена ОРв может рассматриваться в качестве фактора риска переломов поясничных позвонков.

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на III Российском Конгрессе по Остеопорозу в г.Екатеринбурге в 2008г., на I Конференции по Остеоиммунологии в 2006г., (Крит, Греция), на Конгрессе Американского Общества по изучению костной ткани и минерального обмена (ASBMR) в 2006г., на Конгрессе Европейской Антиревматической Лиги (EULAR) в 2008г., а также приняты к постерному докладу на Всемирном Конгрессе по Остеопорозу IOF, Бангкок, 2008г. Первичная экспертиза диссертации была проведена в Государственном Учреждении Институте ревматологии Российской Академии Медицинских Наук 01 июля 2008 года.

Публикации и сведения о внедрении в практику:

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ (5 тезисов и 2 статьи). Результаты исследования внедрены и применяются в клинической практике Центра профилактики остеопороза Минздравсоцразвития РФ ГУ Института Ревматологии РАМН.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 14 рисунками.

Материал и методы исследования

Настоящая работа выполнена в Отделе эпидемиологии и генетики ревматических заболеваний с Центром профилактики остеопороза Минздравсоцразвития РФ ГУ Института ревматологии РАМН (директор - академик РАМН, профессор Е.Л.Насонов) и основана на результатах одномоментного исследования 200 по-стменопаузальных женщин в возрасте 45 лет и старше, жительниц Москвы и Мо-

сковской области, отобранных в группу больных первичным ОП (100 человек) и контрольную группу с нормальными показателями МПКТ (100 человек). Для диагностики ОП были использованы критерии ВОЗ (WHO, 1994г.), согласно которым отклонение ниже -2,5 SD от референтной базы по Т-критерию классифицируются как остеопороз, а к нормальным значениям МПКТ относятся показатели выше-lSD.

На каждую женщину заполнялась унифицированная анкета для сбора информации, и проводилось измерение МПКТ в проксимальном отделе бедренной кости и в поясничном отделе позвоночника (L1-L4) с помощью костного денситометра QDR-4500w (Hologic, США), исследование проводилось н. с. Н.В. Деминым. Клиническая характеристика исследуемой группы пациенток и группы здорового контроля представлена в табл. 1.

Таблица ]

Клиническая характеристика участниц исследования.

Группа остеопороза Группа контроля Р

Количество 100 100

Средний возраст (лет) 62,б±7,715 63,5±8,412 н/д

ИМТ (кг/м2) 24,6±3,24 31,5±5,4 <0,0001

МПКТ Ь1-Ь4 (г/см2) 0,712±0,079 1,031 ±0,087 <0,0001

МПКТШБ(г/см^) 0,609±0,082 0,842±0,066 <0,0001

Возраст наступления менопаузы (лет) 48,6±4,5 51,5:0,6 н/д

Продолжительность менопаузы (лет) 13,9±6,743 12,7±8,123 н/д

Для изучения частоты нетравматических переломов (деформаций) позвонков в группе ОП 50 пациенткам в рентгенологическом отделении ГУ Института ревматологии РАМН под руководством д.м.н. A.B. Смирнова проведена рентгенография грудного и поясничного отделов позвоночника с последующей морфомет-рией позвонков по методу McCloskey. У остальных пациенток наличие/отсутствие переломов позвонков регистрировалось по анамнестическим данным. Частота переломов рассчитывалась по числу индивидуумов, которые имели перелом хотя бы одного позвонка.

Всем пациенткам в группе ОП проведено биохимическое исследование сыворотки крови с определением концентрации кальция, фосфора, щелочной фосфата-зы в клинической лаборатории ГУ Института Ревматологии РАМН (зав. лабораторией к.м.н. Кашникова Н.А.). Полученные результаты находились в пределах нормы. Среднее значение кальция крови составило 2,44±0,13 ммоль/л, фосфора -1,06±0,18 ммоль/л, щелочной фосфатазы - 166,4±56,9 Ед/л.

80 пациенткам в группе ОП проведено исследование концентрации остеопро-тегерина (OPG) и лиганда рецептора-активатора ядерного фактора кВ (RANKL) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ELYSA) в лаборатории клинической иммунологии Института Ревматологии РАМН (зав. лабораторией ст.н.с. Александрова Е.Н.) с использованием лабораторных наборов фирмы BIOMEDICA GRUPPE (Австрия). По результатам анализа концентрации OPG и RANKL значительно отличались от нормальных значений. Среднее значение концентрации OPG составило 6,94±2,42 пкмоль/л (норма 1,8 пкмоль/л), RANKL -0,016±0,04 пкмоль/л (норма 0,37 пкмоль/л). Среднее значение соотношения OPG/RANKL составило 1625,15±1387,4.

Тестирование больных ОП и женщин контрольной группы по полиморфизмам генов ERa и ERp, LRP5, ВМР4 и OPG проводилось ст.н.с. М.Ю. Крыловым и ст.н.с. И.А. Гусевой в лаборатории генетики Отдела эпидемиологии и генетики ревматических заболеваний ГУ Института ревматологии РАМН с Центром профилактики остеопороза Минздравсоцразвития РФ (зав. лабораторией д.м.н., профессор Мякоткин В.А.) с использованием метода полиморфизма длин рестрикци-онных фрагментов (ПДРФ).

Статистический анализ результатов проводился с использованием стандартного пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 6.0. Для описания характера распределения количественных признаков в исследуемых группах использовались элементы вариационной статистики и критерий Стьюдента. Достоверность межгрупповых различий варьирующих качественных показателей оценивали с помощью критерия «хи-квадрат» (%2), при малых выборках - критерий Фишера. Оценка взаимосвязи между количественными и ранговыми показателями

и

проводилась с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена. Для оценки относительного риска использовался показатель отношения шансов OR (odds ratio).

Результаты исследования и их обсуждение.

1. Изучение клинических и денситометрических показателей у больных ОП и в контроле.

В нашем исследовании отмечалось снижение МПКТ во всех отделах при увеличении возраста как в группе больных ОП, так и в группе здорового контроля, что подтверждалось достоверными отрицательными корреляциями между возрастом и значением МПКТ различных областей скелета (табл. 2). Выявленная закономерность отражает возрастное снижение костной массы, показанное во многих эпидемиологических исследованиях [Беневоленская Л.И., 2002г.].

Таблица 2

Распределение средних значений МПКТ в зависимости от возраста у больных ОП

и в контрольной группе.

Область сканирован!« Группы Возраст (годы) МПКТ (г/см2) Коэффициент корреляции,г

45-49 50-59 60-69 70-79 80-89

1 ОП 0,723±0,06 п=4 0,711±0,07 п=35 0,704±0,08 п=45 0,706±0,1 п=15 0,866 п=1 1=-0,07, р=0,5

Норма 1,09±0,12 п=3 0,985±0,05 п=28 1,02±0,07 п=38 1,07±0,11 п=30 0,941 п=1 г = 0,18, р=0,08

и О ОП 0,607±0,09 п=4 0,613±0,09 п=35 0,606±0,08 п=45 0,59240,06 п=15 0,631 п=1 г = -0,17, р=0,09

% Норма 0,882±0,06 п=3 0,841±0,06 п=28 0,837±0,08 п=38 0,835±0,06 п=30 0,738 п=1 г = -0,2, р=0,049

•с о ОП 0,499±0,12 п=4 0,529±0,09 п=35 0,540±0,08 п=45 0,507±0,06 п=15 0,573 п—1 г = -0,05, Р=0,7

Ё Норма 0,847±0,17 п=3 0,737±0,08 п=28 0,757±0,07 п=38 0,751 ±0,1 п=30 0,635 п=1 г = -0,05, р=0,6

и ОП 0,891±0,08 п=4 0,848±0,15 п=35 0,812±0,28 п=45 0,786±0,13 п=15 0,723 п=1 г = -0,26, р=0,015

с Норма 1,297±0,15 п=3 1,172±0,13 п=28 1,182±0,1 п=38 1,186±0,1 п=30 0,963 п=1 г = -0,04, р=0,7

ОП 0,726±0,09 п=4 0,716±0,12 п=35 0,720*0,09 п=45 0,672±0,09 п=15 0,669 п=1 г = -0,21, р=0,04

Н Норма 1,106±0,12 п=3 0,999±0,09 п=28 1,014±0,08 п=38 1,008±0,08 п=30 0,846 п=1 г= -0,04, р=0,7

и ОП 0,451±0,14 п=4 0,425±0,09 п=35 0,407±0,1 п=45 0,383±0,06 п=15 0,379 п=1 г = -0,27, р=0,01

Норма 0,801±0,05 п=3 0,703±0,08 п=28 0,669±0,09 п=38 0,649±0,07 п=30 0,454 п=1 г = -0,43, р=0,000014

Средний индекс массы тела (ИМТ) в нашем исследовании был достоверно выше в группе контроля по сравнению с группой ОП (31,5±5,4 ув. 24,6±3,24 кг/м2 соответственно, р<0,0001). При этом в группе здорового контроля более 80% женщин имели избыточный вес и почти половина страдали ожирением (ИМТ>31 кг/м2). Тогда как в группе ОП 41% женщин имели избыточный вес и только 6% страдали ожирением. При оценке взаимосвязи МПКТ с массой тела было обнаружено нарастание МПКТ с увеличением ИМТ в обеих группах исследования, что подтверждается также выявленными достоверными положительными корреляциями между ИМТ и показателями МПКТ бедра (табл. 3).

Таблица 3

Распределение средних значений МПКТ различных областей измерения в зависи-

мости от ИМТ.

с я и" МПКТ (г/см2) Коэффициент корреляции, г

ИМТ (кг/м-1) 18,5-25 26-30 >31

С О Кол-во, п (%) 58 (58%) 35 (35%) 6 (6%) 100(100%)

Средний возраст, лет 62,06±8,09 65,6±6,78 60,25±5,31 г = -0,125, р=0,1

L1-L4 0,709±0,08 0,717±0,07 0,7I5±0,04 г = 0,029, р=0,9

Neck 0,600±0,08 0,623±0,09 0,669*0,03 г = 0,22, р=0,032

Troch 0,522±0,07 0,556±0,08 0,554±0,1 г = 0г30,р=0,0034

Inter 0,833±O, 11 0,820±0,35 0,870±0,19 г = 0,27, р=0,009

Total 0,703±0,09 0,742±0,1 0,753±0,13 г = 0,29, р=0,05

Ward 0,410±0,09 0,416±0,1 0,433±0,1 г = 0,065, р=0,5

Норма Кол-во, n (%) 16(16%) 37 (37%) 47 (47%)

Средний возраст, лет 60,6±7,42 62,4±8,46 66,1±8,39 г = -0,188,р=0,07

L1-L4 1,004±0,06 1,024±0,08 1,05±0,09 г = 0,179, р=0,08

Neck 0,843±0,07 0,837±0,06 0,842±0,07 г = 0,084, р=0,4

Troch 0,738±0,07 0,737±0,07 0,761 ±0,09 г = 0,085, р=0,4

Inter 1,165±0,13 l,174±0,12 1,188±0,U r = 0,125,p=fl,2

Total 0,991±0,09 1,004±0,09 1,015±0,09 г = 0,123,р=0,2

Ward 0,700±0,09 0,664±0,1 0,674±0,08 г = -0,08, р=0,5

Полученные данные хорошо согласуются с многочисленными эпидемиологическими исследованиями, в которых было показано, что женщины с избыточной массой тела в меньшей степени подвержены риску заболевания ОП по сравнению с женщинами с нормальной и низкой массой тела [Беневоленская Л.И., 2002г.].

В нашем исследовании в группе ОП средний возраст наступления менархе составил 14,6±7,45 лет, при этом абсолютное большинство (81%) составили женщины с нормальным возрастом наступления менархе (до 15 лет, согласно рекомендации ВОЗ). Хотя достоверных корреляций возраста менархе с МПКТ не было выявлено, тем не менее при сравнении пациенток с нормальной и поздней менархе по показателям МПКТ выявлена тенденция к более высоким значениям МПКТ в первой группе, достигшая статистической значимости при сравнении показателей поясничного отдела позвоночника (0,717±0,07 уз. 0,680±0,09 г/см2, р=0,053). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными [Беневоленская

Л.И., 2002r.; Csermely Т., 2002; Но A.Y., 2005; Galuska D.D., 1999]. Так, в исследовании Galuska D.A. et al., 1999, было показано, что каждый год задержки наступления менархе приводит к потере МПКТ: в среднем, на 0,023 г/см2 в поясничном отделе позвоночника и 0,0129 г/см2 в шейке бедра. Таким образом, показатели костной массы в постменопаузальном периоде зависят от возраста наступления менархе.

Возраст наступления менопаузы еще более критичен в отношении риска развития ОП, при этом ранняя менопауза является доказанным фактором риска по-стменопаузального ОП [Беневоленская Л.И., 2002г.]. Согласно рекомендациям ВОЗ ранним считается наступление менопаузы в возрасте до 46 лет. Средний возраст наступления менопаузы в нашем исследовании статистически не различался между группами. В обеих группах преобладали женщины с нормальным возрастом наступления менопаузы, однако следует отметить, что в группе ОП накапливались женщины с ранней менопаузой (27% vs. 5%, р<0,00001). При сравнении женщин с ранней и нормальной менопаузой в обеих группах исследования оказалось, что у последних средние значения МПКТ выше во всех отделах. Выявленные различия достигли статистической достоверности для показателей МПКТ бедра: в группе ОП для показателей большого вертела (0,540±0,08 vs. 0,504±0,07, р=0,04), а также в группе контроля для показателей большого вертела (0,754±0,08 vs. 0,695±0,03, р=0,04), межвертельной области (1,184±0,12 vs. 1,09±0,06, р=0,04) и общего показателя бедра (1,01±0,08 vs. 0,995±0,02, р=0,049).

Возраст наступления менопаузы не обнаружил статистически достоверных корреляций с МПКТ. Однако корреляции были обнаружены между продолжительностью менопаузы в годах и МПКТ бедра в обеих группах исследования (в группе ОП: для шейки бедра -1=-0,24 при р=0,015, для межвертельной области -г=-0,27 при р=0,009, для общего показателя бедра - г=-0,26 при р=0,012, для области Варда - г=-0,34 при р=0,001; в группе здорового контроля: i=-0,38 при р=0,0002 для области Варда). Таким образом, чем продолжительнее период менопаузы, тем ниже показатели МПКТ и выше риск ОП.

Известно, что образ жизни в целом оказывает выраженное влияние на МГЖТ и, соответственно, на риск ОП. В этой связи в группе ОП было оценено влияние таких факторов, как физическая нагрузка и курение на показатели МПКТ.

Общая физическая нагрузка, включавшая среднесуточную продолжительность и скорость ходьбы по улице, работу по дому, продолжительность статических нагрузок и другие параметры, обнаружила связь с показателями МПКТ. Было выявлено, что при увеличении общей физической нагрузки увеличивались и показатели МПКТ во всех отделах, четкая тенденция прослеживалась в поясничном отделе позвоночника: средние значения МПКТ составили: 0,659±0,09 г/см2 при низкой общей физической нагрузке, 0,713±0,07 г/см2 при средней и 0,736±0,06 г/см2 при высокой нагрузке.

Курение является одним из доказанных факторов риска развития ОП, что нашло свое подтверждение в нашем исследовании: показатели МПКТ во всех областях измерения у некурящих и не куривших в прошлом женщин превышали таковые у курящих женщин, статистической достоверности различия достигли при сравнении показателей межвертельной области (0,849±0,13 vs. 0,706±0,42 г/см2 соответственно, р=0,016). Таким образом, курение может приводить к снижению МПКТ и должно учитываться при оценке факторов риска ОП.

Показатели концентрации OPG и RANKL в нашем исследовании значительно отличались от нормы: средняя концентрация OPG превышала норму в несколько раз, а концентрация RANKL была ниже нормы примерно в 20 раз. Вместе с тем, в нашем исследовании нашли свое подтверждение корреляции, описанные ранее в литературе [Yano К., 1999; Mezquita-Raya Р., 2005; Liu J.M., 2004; Abrahamsen В., 2005]. Так, для концентрации OPG выявлена достоверная положительная корреляция с возрастом (г=0,49 при р=0,000002), т.е. с увеличением возраста увеличивается и концентрация OPG, что отражает протективный механизм, направленный против повышенной резорбции, связанной с возрастом [Yano К., 1999]. Для концентрации RANKL были выявлены достоверные корреляции с концентрацией кальция (г=0,3 при р=0,0007) и фосфора (г=0,23 при р=0,037) сыворотки крови, что отражает интеграцию этого маркера в процессы костного ремоделирования.

Показатель соотношения ОРО/ЛАМСЬ коррелировал с показателем МПКТ области Варда по г-критерию (г=0,25 при р=0,03).

Переломы костей обусловливают тяжесть ОП и его социально-экономические последствия. Переломы костей перенесли 60 (60%) пациенток в группе ОП, из них 28 пациенток имели в анамнезе более одного перелома костей. Средний возраст развития первого перелома в группе ОП составил 56,7±9,3 лет. В большинстве случаев (41,7% пациенток) первым переломом был перелом предплечья, реже (31,7%) - переломы позвонков, в остальных случаях - переломы других локализаций, включая ребра (3,3%) и шейку бедра (5%). Наличие переломов в анамнезе коррелирует с продолжительностью менопаузы (г=0,28, р=0,046), т.е. с увеличением продолжительности периода менопаузы закономерно нарастает число пациенток с переломами в анамнезе. Также обнаружены отрицательные корреляции наличия переломов в анамнезе с показателями МПКТ: шейки бедра (г=-0,25, р=0,014) и области Варда (г=-0,23, р=0,03). Внутри группы ОП у пациенток с переломами костей в анамнезе показатели МПКТ во всех отделах были ниже по сравнению с таковыми у пациенток без переломов (рис. 1).

L1-L4 Neck Troch Inter Total Ward

Область сканирования

Рис. 1. Средние значения МПКТ (г/см2) у женщин с переломами костей и без таковых в группе ОП, *р<0,05.

При изучении семейного анамнеза по переломам костей обнаружено, что среди пациенток с отягощенным семейным анамнезом переломы костей зафиксированы в 76,3% случаев, а среди пациенток без семейного анамнеза - в 57,6% случаев. Различия между этими показателями близки к статистической достовер-

ности (р=0,059), что позволяет говорить об определенном влиянии положительного семейного анамнеза по переломам на риск остеопоротических переломов у потомков.

Таким образом, в группах участниц исследования проведен анализ взаимосвязи клинических и денситометрических показателей. Нашли свое подтверждение известные закономерности, такие, как снижение МПКТ с возрастом, протек-тивная роль массы тела в отношении риска развития ОП, влияние возраста наступления менархе и менопаузы, отрицательное влияние курения и протективная роль общей физической нагрузки в отношении риска развития ОП.

Следующим этапом исследования явилось изучение связи клинических и денситометрических показателей с полиморфными вариантами кандидатных генов у больных ОП и в контрольной группе.

2. Изучение полиморфных вариантов кандидатных генов Е1*а, ЕКр,

ЬНР5, ВМР4 и ОРв у больных ОП и в контрольной группе.

Геп ЕЫа.

Частотное распределение генотипов ХЬа1 и РтоП гена ЕЛа у больных ОП и в группе здорового контроля представлено в табл. 4.

Таблица 4

Частотное распределение генотипов Xbal и PvuII гена ERa.

Генотип Группа ОП (п=98) Группа контроля (п=100) OR+CI Р

XX 26(26,53%) 23 (23,0%) 1,2 [1,07-4,21 0,56

Хх 48 (48,98%) 43 (43,0%) 1,28 [0,93-1,81 0,39

xx 24(24,49%) 34 (34,0%) 0,62 [0,41-0,961 0,14

рр 34 (34,69%) 20 (20,0%) 2,12 (1,07-4,251 <0,01

Рр 42 (42,86%) 61 (61,0%) 0,48 10,26-0,92] <0,01

рр 22 (22,45%) 19(19,0%) 1,26 Г0,62-2,231 0,55

Данные частотного распределения генотипов Xbal и PvuII и их сочетаний, полученные в ходе нашего исследования, отличаются от данных других европеоидных популяций [van Meurs J.B., 2003; Albagha О.М., 2001; Ioannidis J.P., 2004]. В мета-анализе J.P. Ioannidis и соавт., включившем 18 917 индивидуумов в европейских странах (Великобритания, Нидерланды, Италия, Испания, Дания), пред-

ставленные данные частотного распределения указанных генотипов были сопоставимы между собой. Так, частота гомозиготного генотипа XX колебалась от 10,2% в датской популяции до 14,0% в британской, генотипа хх - от 37,3% в испанской популяции до 43,4% в датской и британской, а гетерозиготного генотипа Хх - от 42,5% в британской популяции до 48,8% в испанской. Аналогичным образом сопоставимы были и данные частотного распределения генотипов PvuII: гомозиготный генотип РР варьировал от 18,5% в итальянской популяции до 22,4% в британской, генотип рр - от 27,2% в британской популяции до 36,8% в итальянской, а гетерозиготный генотип Рр - от 48,1% до 51,8% в разных центрах в Великобритании (Абердин и Кембридж).

Как следует из таблицы, для полиморфизма Xbal различий частотного распределения генотипов между труппами ОП и контроля не выявлено, однако таковые были выявлены для полиморфизма PvuII. В группе ОП отмечается существенное увеличение (в 1,7 раза) частоты носительства гомозиготного генотипа РР, что позволяет расценивать данный генотип как генотип риска в отношении ОП, о чем также свидетельствует OR равный 2,12. Среди индивидуумов с нормальной МПКТ отмечается увеличение частоты гетерозиготного генотипа Рр (в 1,5 раза), что указывает на снижение риска развития ОП при гетерозиготном носительстве аллеля Р.

В нашем исследовании полиморфизмы гена ERa не обнаружили достоверных ассоциаций с показателями МПКТ, что согласуется с данными исследований испанской, итальянской, скандинавской и британской популяций, в которых также не удалось обнаружить значимых ассоциаций с МПКТ [Becherini L., 2000; Brown М.А., 2001; Aerssens J., 2000; Gennari L., 1998; Silvestri S., 2006].

Ген ЕКр.

В нашем исследованни был изучен полиморфизм ОЮ82А, выявляемый рест-риктазой Яза1. Частотное распределение представлено в табл. 5.

Таблица 5

Частотное распределение генотипа Кза1.

Генотип Группа остеопороза (п=99) Группа контроля (п=99) (Ж+С1 Р

1У1 87 (87,88%) 78 (78,79%) 1,95Г0,85-4,541 0,06

Яг 12(12,12%) 14(14,14%) 0,88 Г0,43-1,8] 0,68

1Т 0 (0,0%) 7 (7,07%) - 0,01

Результаты анализа частотного распределения генотипов в нашем исследовании оказались сопоставимы с данными, полученными в исследованиях словенских [Агко В., 2002] и греческих женщин [Ш&айиаскш Ъ., 2006]. Отмечается значительное преобладание генотипа ЯЯ и очень низкая частота (или отсутствие) генотипа гг. В нашем исследовании были выявлены достоверные различия частот генотипов между группами ОП и здорового контроля в сторону увеличения частоты генотипа гг в последней группе. Однако, с учетом сопоставимых результатов других исследований, а также малочисленности носителей данного генотипа в нашем исследовании, достоверность этих различий представляется сомнительной.

Следует отметить обнаруженные различия частотного распределения генотипов Яза1 в зависимости от возраста в общей группе постменопаузальных женщин. Было выявлено, что частоты генотипов Яг и гг уменьшались с возрастом, а частота Ю1 закономерно возрастала. Так, частотное распределение генотипов в возрастной группе до 50 лет составило ЯЯ / Ыг / гг - 66,7% / 33,3% / 0,0%; в возрастной группе 50-60 лет - 63,6% / 18,2% /18,2%; в возрастной группе 60-70 лет - 79,8% / 13,9% / 6,3%; в возрастной группе старше 70 лет - 91,0% / 5,9% / 3,1%. Возможно, носительство аллелей Я и г ассоциировано с неучтенными в нашем исследовании факторами, влияющими на продолжительность жизни.

Достоверных ассоциаций этого полиморфизма с МПКТ нами не было обнаружено. Ассоциаций с МПКТ не обнаружены также и в упомянутых выше иссле-

дованиях словенской и греческой популяций. Аналогичным образом не обнаружены ассоциации с переломами костей.

Ген 1Л1Р5.

Нами был исследован полиморфизм С2268Т гена ЬКР5, выявляемый рест-риктазой УБрГ, не приводящий к замене аминокислоты в полипептидной последовательности (Ш40М).

При изучении частотного распределения генотипов различий между группами ОП и здорового контроля выявлено не было (табл. 6).

Таблица б

Частотное распределение генотипов полиморфизма С2268Т гена LRP5.

Генотип Группа ОП (п=99) Группа контроля (п=88) OR+CI Р

СС 78 (78,8%) 73 (82,9%) О,76Г0,48-1,69] 0,48

СТ I 21 (21,2%) 12(13,6%) l,71f0,93-3,981 0,18

ТТ | 0 (0,0%) 3 (3,4%) - 0,07

В настоящее время в литературе имеется только одно аналогичное исследование данного полиморфизма, проведенное на выборке из 647 здоровых постме-нопаузальных китайских женщин [Zhang Z.L., 2005]. Частота генотипов N740N (С2268Т) составили: ТТ - 66,9%, ТС - 31,1%, СС - 2,0%. Авторами была выявлена ассоциация полиморфизма с МПКТ шейки бедра, при этом носители генотипа ТТ имели более высокие показатели МПКТ этой области по сравнению с носителями генотипов ТС и СС.

Сравнение наших данных с данными Zhang Z.L. с соавт. затрудняется тем, что исследования проведены на генетически очень различных популяциях, что делает сопоставление данных в известной степени условным. Частотное распределение генотипов в нашем исследовании значительно отличалось от такового в китайском исследовании. Так, в работе Zhang Z.L. с соавт. подавляющее большинство женщин являлись носителями гомозиготного генотипа ТТ, при этом генотип СС был представлен в выборке минимально. В нашем исследовании в обеих группах выявлена обратная ситуация.

Аналогично китайскому исследованию и, несмотря на отсутствие различий частотного распределения между группами, нами были выявлены ассоциации полиморфизма с МПКТ в группе ОП: с показателем большого вертела (г=-0,21, р=0,041), с МПКТ шейки бедра по /-критерию (г=-0,24, р=0,02), с МПКТ области Варда по ¿-критерию (г=-0.23, р=0,03). Согласно полученным данным, в группе ОП носители генотипа СС имели более высокие показатели МПКТ во всех отделах по сравнению с носителями генотипа СТ. В группе здорового контроля такой закономерности не было выявлено, однако было отмечено, что носители генотипа ТТ, не представленного в группе ОП, имели самые низкие показатели МПКТ во всех отделах. Данные представлены на рис. 2,3.

1 ,2

L 1 - L 4 Neck Troch Inter Total Ward

■ с с ист]

Рис. 2. Показатели МПКТ (г/см2) при распределении по генотипам С2268Т в группе ОП, *р<0,05.

1 ,4

L1-L4 Neck Troch Inter Total Ward

■ cc ист □ т т~~1

Рис. 3. Показатели МПКТ (г/см2) при распределении по генотипам С2268Т в группе здорового контроля, *ТТ СТ и СС, р<0,05.

Примечательно, что более высокие показатели МПКТ как в нашем исследовании, так и в китайском, выявляются у носителей самых частых генотипов, а более низкие показатели - у носителей редких генотипов.

Ген ВМР4.

Полиморфизм С6007Т гена ВМР4 обусловливает аминокислотную замену в позиции 152: аллель С кодирует аланин, аллель Т - валин.

В нашем исследовании частотное распределение генотипов не различалось между группами; наиболее часто встречались гетерозиготы СТ и наиболее редко -гомозиготы ТТ (табл. 7).

Таблица 7

Частотное распределение генотипов полиморфизма С6007Т гена ВМР4.

Генотип Группа ОП(п=100) Группа контроля (п=90) OR+CI Р

СС 38 (38,0%) 28(31,1%) 1,36 [0,9-2,1] 0,32

СТ 48 (48,0%) 50 (55,6%) 0,74 [0,6-1,01 0,29

ТТ 14(14,0%) 12(13,3%) 1,07 [0,5-2,2] 0,9

Выявленные частоты генотипов были сопоставимы с данными исследования австралийской популяции [Ramesh Babu L., 2005], в котором приняли участие более тысячи постменопаузальных женщин. В этом исследовании были выявлены ассоциации полиморфизма с МПКТ бедра, при этом носители генотипа СС имели более низкие показатели. Однако в нашем исследовании ассоциаций с МПКТ, а также с переломами для данного полиморфизма выявлено не было. Аналогичные результаты были получены на выборке постменопаузальных итальянских женщин [Semprini S., 2000], в которой также не было выявлено ассоциаций с МПКТ.

Ген OPG.

Полиморфизм A163G гена OPG располагается в промоторной части гена. При исследовании частотного распределения не обнаружено достоверных различий между группами больных ОП и контроля (табл. 8).

Таблиц 8

Частотное распределение генотипов полиморфизма А1630 гена ОРО.

Генотип Группа ОП(п=100) Группа контроля (п=60) (Ж (С! Р

АА 74 (74%) 47 (78,3%) 0,79Г0,34-2,791 0,54

АО 22 (22%) И (18,3%) 1,27[0,52-3,051 0,58

те 4 (4,0%) 2 (3,3%) 1,21[0,18-9,841 0,82

Частотное распределение генотипов было примерно сопоставимо с данными исследования датской популяции [Ьат^ааЫ В.Ь., 2002]. Достоверных корреляций с МПКТ в нашем исследовании не было обнаружено.

В исследованиях датских выборок [Langdahl В.Ь., 2002; Ъ^егвеп Н.Ь., 2004] была обнаружена ассоциация данного полиморфизма с остеопоротическими переломами. В нашей работе данный полиморфизм достоверно коррелировал с переломами поясничных позвонков (г=0,29, р=0,0036). При этом у носителей генотипа Ав достоверно чаще выявлялись переломы поясничных позвонков. В группе носителей генотипа АА только 3 пациентки имели переломы поясничных позвонков, что составило 4,05%, тогда как в группе с генотипом АО - 5 пациенток (22,73%). При сравнении с генотипом вв различия недостоверны, так как в группе ОП только 4 пациентки являлись носителями этого генотипа, и только у одной пациентки имелись переломы поясничных позвонков в анамнезе. Данные представлены на ряс. 4.

0 % 2 0 % 4 0 % 6 0 % 8 0 % 10 0%

¡ШЗБез переломов ИС переломами!

Рис. 4. Распределение пациенток в зависимости от наличия переломов поясничных позвонков и гено типа А163 в гена ОРО.

Таким образом, согласно нашим данным носительство генотипа АО можно считать фактором риска развития переломов поясничных позвонков, показатель (Ж для носителей этого генотипа по сравнению с носителями других генотипов составляет 3,1.

Сочетанные генотипы изучаемых генов.

При анализе взаимосвязи между полиморфизмами изучаемых генов достоверные корреляции были обнаружены в обеих группах исследования (табл. 9).

Таблица 9

Корреляции между изучаемыми полиморфизмами в группе ОП и контроля.

Полиморфизмы Группа ОП Группа здорового контроля

Коэффициент корреляции, г, р

ЕЯа (ХЬаП/РучП г=0,53 р=0,0000001 г=033 р=0,0007

ЕЛа (Рто11)/ВМР4 г=-0,26 р=0,011 г=-0,12р=0,25

ЕКа(ХЬа1)/Ци>5 г=0,19 р=0,06 г=-0,28 р=0,009

ЕВД (КхаО/ОРв г=-0,001 р=0,99 г=0,26 р=0,048

1Ли>5/ОРО 1=-0,13 р=0,19 1=0,29 р=0,026

Для полиморфизмов, обнаруживших достоверные корреляции, был проведен анализ частотного распределения сочетанных генотипов, а также ассоциаций с клиническими и денситометрическими показателями. Частотное распределение сочетанных генотипов представлено в табл. 10 (приведены генотипы, обнаружившие достоверные различия между группами ОП и контроля).

Таблица 10

Частотное распределение сочетанных генотипов в группах ОП и контроля.

Генотип Группа остеопороза Группа контроля ОЯ+С1 Р

ххРр 5(5,1%) 23 (23,0%) 0,18[0,06-0,53] 0,0003

ЕКа(Руи11/ХЬаГ) п=98 п=100

РР/СТ 20(20,4%) 9(10,0%) 2,3 [0,93-5,87] 0,049

ЕКа(Руи11УВМР4 п=98 п=90

Рр/СТ 20(20,4%) 30 (33,3%) 0,5 [0,25-1,04] 0,047

Е11я(РУ1111УВМР4 п=98 п=90

хх/СС 16(16,5%) 29 (32,9%) 0,4(0,23-0,68] 0,0099

ЕКа(ХЬа1)ДЛи?5 п=97 п=88

СС/АА 55 (55,6%) 45 (76,3%) 0,4 [0,18-0,84] 0,0099

ЬКР5/ОРО п=99 п=59

СТ/АА 18(18,2%) 1 (1,7%) »3,1 [1,7-266,27] 0,023

Ы1Р5/ОРО п=99 п=59

Как следует из представленных данных, было обнаружено накопление в группе ОП носителей генотипов РР/СТ (сочетанный генотип ЕЯа(Руи11)/ВМР4), СТ/АА (1ЛР5/ОРО), причем последний встречался в группе ОП в 10 раз чаще, и риск развития ОП у носителей данного генотипа в 13 раз превышает априорный, что позволяет рассматривать данные генотипы в качестве генотипов риска. В группе контроля отмечена более высокая частота генотипов ххРр (ХЬа1 и РуцИ гена Е11а), Рр/СТ (Е11а(Руи11)/ВМР4), хх/СС (Е11а(ХЬа1)/1Л1Р5), СС/АА (ЬЯР5/ОРО), которые, таким образом, могут рассматриваться как возможно протективные, о чем свидетельствуют также показатели относительного риска менее единицы.

При изучении взаимосвязи сочетанных генотипов с МПКТ достоверные ассоциации выявлены для сочетаний Е11а(Руи11уВМР4 (в группе здорового контроля г=0,22, р=0,04 с показателем большого вертела и г=0,24, р=0,027 с общим показателем бедра) и ЬКР5/ОРО (в группе ОП г=0,2, р=0,046 с показателем шейки бедра и г=-0,27, р=0,01 с показателем большого вертела). Так, в группе здорового контроля носители генотипа Рр/СТ имели достоверно более высокие показатели МПКТ большого вертела и межвертельной области по сравнению с носителями генотипа РР/СТ. Для других областей скелета четких ассоциаций генотипов Е11а(Руи11)/ВМР4 с МПКТ не обнаружено. Для сочетанного генотипа ЬЯР5/ОРО в группах ОП и нормы получены противоположные результаты: генотип СС/АА по сравнению с генотипом СТ/АА ассоциируется с более высокой МПКТ бедра в группе ОП, но более низкой МПКТ бедра в группе здорового контроля. При этом носители генотипа ТТ/АА, не представленного в группе ОП, имели самые низкие показатели МПКТ всех областей в группе здорового контроля.

Таким образом, в результате исследования были показаны ассоциации клинических и денситометрических параметров с генетическими маркерами.

Выводы:

1. В результате изучения клинических и денситометрических параметров у 100 больных первичным остеопорозом и 100 здоровых постменопаузальных женщин показано снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) с

увеличением возраста, влияние возраста наступления менархе и менопаузы на показатели МПКТ; протективная роль массы тела и физических нагрузок на МПКТ, и отрицательная роль курения. Показано наличие взаимосвязи между наличием переломов костей и вариабельностью показателей МПКТ шейки бедра (г=-0,25, р=0,014). Установлено, что указание в анамнезе на наличие ос-теопоротических переломов у кого-либо из членов семьи повышает вероятность их возникновения у потомков.

2. Выявлена взаимосвязь концентрации ОРв в сыворотке крови с возрастом (г=0,49 при р=0,000002), а также концентрации ЯАМКЬ с содержанием кальция и фосфора в сыворотке крови (г=0,3, р=0,00069 и г=0,23, р=0,037 соответственно). Установлена корреляция между соотношением ОРО/ЯАЫКЬ и вариабельностью показателей МПКТ области Варда по 2-критерию (г=0,25, р=0,03).

3. Анализ особенностей распределения полиморфизмов кандидатных генов выявил у больных ОП по сравнению с контролем более высокую частоту носи-тельства генотипа РР гена ЕЯа (011=2,12), сочетанных генотипов РР/СТ ((Ж=2,3) и СТ/АА (011=13,1) генов ЕЯа/ВМР4 и 1ЛР5/ОРС соответственно, что дает основание рассматривать их как генотипы риска развития ОП. Выявлено прогрессивное накопление генотипа Ы5а1 полиморфизма гена ЕЯр у больных ОП с увеличением возраста, что может свидетельствовать об опосредованном влиянии этого аллеля на продолжительность жизни.

4. Частота генотипов Рр (РуиП гена ЕЯа), ххРр (сочетанный генотип полиморфизмов ХЬа! и РуиП гена ЕИа), Рр/СТ (сочетанный генотип ЕЯа (РуиП)/ВМР4), хх/СС (сочетанный генотип ЕЯа(ХЬа1)/ЬИ>5), СС/АА (сочетанный генотип 1Л1Р5/ОРО) у больных ОП была снижена по сравнению с контрольной группой (ОЯ - 0,48; 0,18; 0,5; 0,4; 0,4 соответственно), что позволяет рассматривать эти генотипы в качестве возможно протективных по отношению кОП.

5. Установлены ассоциации полиморфизмов генов Е11а, Ы1Р5, ОРй и ВМР4 с МПКТ. В выборке больных ОП более высокие значения МПКТ характерны для носителей генотипа СС по сравнению с обладателями генотипа СТ гена 1ЛР5.

В группе контроля более высокие показатели МПКТ выявлены у носителей со-четанного генотипа Рр/СТ и более низкие - у носителей генотипа РР/СС генов ERa/BMP4. В группе больных ОП такая зависимость не выявлена. Среди больных ОП в среднем более высокие значения МПКТ присущи носителям генотипа СС/АА комбинации генов LRP5/OPG, тогда как в группе контроля наблюдается инверсия этой закономерности. Подобного рода инверсии свидетельствуют о нарушении баланса между процессами костеобразования и костной резорбции у части постменопаузальных женщин, что может обуславливать возникновение ОП.

6. Обнаружена корреляция полиморфизма гена OPG с переломами поясничных позвонков (г=0,29, р=0,0036), при этом риск перелома указанной локализации был выше для носителей генотипа AG по сравнению с другими генотипами (OR=3,l).

Практические рекомендации:

Полученные при клинико-генетическом исследовании данные рекомендуется использовать для оценки генетических факторов риска ОП среди постменопаузальных женщин, что позволит выделять лиц с высокой генетической предрасположенностью к ОП с дальнейшей своевременной организацией системы лечебно-профилактических мер у данной категории женщин.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Krylov M.Ju., Myakotkin V.A., Korotkova Т.A., Maslova К.A., Mikhailov E.E., Benevolenskaya L.I. "BMP 4 gene polymorphism in Russian women with primary osteoporosis". // 28-й Конгресс Американского Общества по изучению костной ткани и минерального обмена (ASBMR), 2006г., № SU147.

2. Krylov M.Ju., Maslova К.А., Mikhailov E.E., Myakotkin V.A., Benevolenskaya L.I. "Distribution of the bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) polymorphism in

Russian adult women". // Iм Ежегодная Конференция по Остеоиммунологии, Крит, Греция, 2006г.

3. Маслова КА., Крылов М.Ю., Торопцова Н.В., Никитинская О.А., Короткова Т.А., Михайлов Е.Е., Мякоткин В.А., Беневоленская Л.И. "Ассоциация полиморфизма гена ВМР4 с минеральной плотностью костной ткани и маркерами костного ремоделирования". // г.Москва. "Научно-практическая ревматология". -2006г. - №5. - с.20-24.

4. Маслова К.А., Крылов М.Ю., Торопцова Н.В., Никитинская О.А., Короткова Т.А., Мякоткин В.А., Беневоленская Л.И.. "Полиморфизмы генов эстрогено-вых рецепторов аир при постменопаузальном остеопорозе". // г.Москва. "Научно-практическая ревматология". - 2007г. - №3. - с.22.

5. Krylov MJu., Mikhailov Е.Е., Korotkova T.A., Maslova K.A., Myakotkin V.A., Benevolenskaya L.I. "Polymorphisms in the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) gene in Russian women". // Конгресс Европейской Антиревматической Лиги, 2008г., № АВ0075, Ann Rheum Dis 2008;67(Suppl II):592

6. Maslova K.A., Guseva I.A., Toroptsova N.V., Myakotkin V.A., Benevolenskaya L.I. "Lack of association of A163G polymorphism of osteoprotegerin gene and serum osteoprotegerin levels with Russian postmenopausal women". // Конгресс Европейской Антиревматической Лиги, 2008г., № АВ0026, Ann Rheum Dis 2008;67(Suppl II):589

7. Маслова K.A., Крылов М.Ю., Гусева И.А., Торопцова Н.В., Никитинская О.А., Мякоткин В.А., Беневоленская Л.И. "Ассоциация полиморфизмов генов ERA, ERB, LRP5, ВМР4 и OPG с МПКТ и переломами костей у российских постменопаузальных женщин". // III Российский Конгресс по Остеопорозу, 2008г., г. Екатеринбург.

Подписано в печать 13.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 938 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Остеопороз (ОП) - системное метаболическое заболевание скелета, характерными проявлениями которого являются снижение массы костной ткани и нарушение ее микроархитектоники, что обусловливает снижение прочности кости и повышенный риск переломов. Заболевание развивается постепенно и клинически нередко выявляется уже после перелома, что послужило основанием назвать его «скрытой эпидемией». Распространенность заболевания в популяции нарастает с увеличением возраста, женщины страдают ОП чаще мужчин. Распространенность сниженной минеральной плотности костной ткани (МПКТ) среди лиц старше 50 лет достигает 30% среди женщин и 20% среди мужчин [2]. Тяжесть заболевания обуславливается его исходами - переломами костей. Смертность при характерном для ОП переломе шейки бедра в течение первых 6 месяцев после перелома достигает 30%. Вероятность развития остеопоротического перелома любой локализации в пожилом возрасте очень высока. В европеоидных популяциях у 40% женщин и 13% мужчин в возрасте 50 лет и старше обнаруживается, по крайней мере, один клинически выраженный перелом [2]. Однако в условиях возрастающей продолжительности жизни ожидается значительное увеличение числа переломов. Лечение последствий переломов приводит к значительным экономическим потерям для общества.

Несмотря на большую социальную значимость болезни, патогенез ОП изучен недостаточно. В результате многочисленных исследований показателей МПКТ, остеопоротических переломов и их предикторов, проведенных на различных выборках, в разных популяциях и этнических группах, было показано, что формирование костной массы завершаетя к 20-30 годам, а на прочность костного скелета могут оказывать влияние как средовые (характер питания, физические нагрузки, курение, потребление алкоголя и др.), так и генетические факторы, к числу которых, в первую очередь, относятся половая и расовая принадлежность, а также системные гормоны и белки-регуляторы костного ремоделирования. Таким образом, ОП в настоящее время рассматривается в качестве мультифакториального заболевания, патогенез которого обусловлен взаимодействием генетических и средовых факторов [2]. В большом количестве семейных и близнецовых исследований, проведенных в последние десятилетия, было выявлено, что показатели размеров и структуры костей, включая рост, длину оси бедра, ширину запястья, структуру позвонков, а также МПКТ, являются высоконаследуемыми характеристиками [2,9-11]. Анализ вариабельности МПКТ показал, что среди взрослых индивидуумов она на 60-90% детерминируется генетическими факторами [2,12-15].

В последние годы большое число исследований было посвящено поиску генов предрасположенности к ОП. Наиболее часто в таких исследованиях используется метод изучения кандидатных генов, которые отбираются исходя из особенностей патогенеза заболевания. Следует напомнить о феномене генетического полиморфизма, представляющего собой наличие в геноме полиморфных вариантов генов (аллелей), не влияющих на жизнеспособность и репродуктивные свойства организма, но способных влиять на функциональную активность генов. Таким образом, изучение генетической предрасположенности к ОП представляет собой поиск полиморфизмов в кандидатных генах и установление достоверности ассоциации найденных полиморфизмов с заболеванием. В настоящее время предложено и активно изучается более 30 генов-кандидатов предрасположенности к ОП. Для изучения в нашем исследовании были отобраны гены эстрогеновых рецепторов аир (ERa, ER|3), которые реализуют эффект эстрогенов в костной ткани, а также гены белков-участников процесса костного ремоделирования: гены костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (LRP5), остеопротегерина (OPG).

Известно, что эстрогены играют исключительно важную роль в костном обмене и поддержании костной массы. В связи с этим одним из наиболее изученных генов предрасположенности к ОП является ген эстрогенового рецептора a (ER а). Исследования взаимосвязи этого гена с ОП проводятся на протяжении более 10 лет и охватывают азиатские и европеоидные популяции. Были показаны ассоциации определенных аллелей этого гена с МПКТ, маркерами костного ремоделирования и переломами [58-59,71-82,88,89]. Относительно недавно описанный эстрогеновый рецептор |3 (ER Р) также привлек внимание исследователей. Работы по изучению гена ER р немногочисленны, однако и в них показано наличие ассоциаций определенных полиморфизмов с ОП [97-102].

Ген LRP5 кодирует синтез белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности, участвующего в реализации сигнальной функции Wnt-пути в различных клетках. Примечательно, что разные мутации в этом гене приводят к противоположным фенотипам - остеопетроз и псевдоглиомный остеопороз [105-109]. Также было показано влияние этого гена на нормальные вариации МПКТ [115], и обнаружены ассоциации с МПКТ и переломами у больных ОП [116-120],

Белок ВМР4 относится к семейству костных морфогенных белков, * являющихся факторами роста и участвующими в процессах хряще- и костеобразования. Белок кодируется геном ВМР4, который является геном-мишенью Wnt-сигнального пути. Мутации в гене приводят к развитию прогрессирующей оссифицирующей дисплазии. В ограниченном числе исследований были обнаружены ассоциации с МПКТ [122-124].

Благодаря открытию белков RANK, RANKL и OPG, являющихся членами семейства лигандов и рецепторов фактора некроза опухоли а (ФНОа), был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов ремоделирования костной ткани. Система RANK-RANKL-OPG рассматривается в настоящее время как один из ключевых механизмов регуляции формирования, дифференцировки и активности остеокластов и является посредником действия на костную ткань других медиаторов ремоделирования. Изучение генов белков этой системы также представляет интерес в отношении предрасположенности к ОП. В частности, мутация в гене OPG приводит к развитию ювенильной болезни Педжета [46]. Кроме того, для гена OPG показаны ассоциации с МПКТ и остеопоротическими переломами [125-136].

Анализ литературных данных показывает, что в настоящее время при изучении различных выборок больных ОП выявлены достоверные ассоциации с кандидатными генами, участвующими в процессах костного метаболизма. Однако исследования различаются по дизайну, проводились на различных популяциях, возможно поэтому полученные результаты неоднозначны и зачастую противоположны, что диктует необходимость дальнейших исследований. В связи • с этим представляло несомненный интерес изучить перечисленные кандидатные гены среди постменопаузальных женщин, проживающих в г. Москве, для определения вклада генетических факторов в формирование; предрасположенности к ОП.

ЦЕЛЬ

Изучить участие генов эстрогеновых рецепторов а и (5 (ERa, ER(3), костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (LRP5), остеопротегерина (OPG) в формировании генетической предрасположенности к ОП в московской выборке постменопаузальных женщин.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить корреляции клинических факторов с показателями МПКТ поясничного отдела позвоночника и проксимального отдела бедра у больных первичным ОП и в контрольной группе здоровых индивидуумов в, московской выборке постменопаузальных женщин.

2. Изучить распределение кандидатных генов-маркеров костного ремоделирования: генов эстрогеновых рецепторов а и (3 {ERa, ERfS), костного морфогенного белка 4 (ВМР4), белка 5, родственного семейству белков рецептора липопротеинов низкой плотности (LRP5), остеопротегерина (OPG) у больных первичным ОП и в контрольной группе.

3. Изучить ассоциации показателей МПКТ поясничного отдела позвоночника и проксимального отдела бедра с аллельными полиморфизмами кандидатных генов.

4. Изучить ассоциации показателей относительного риска переломов у больных ОП с аллельными полиморфизмами кандидатных генов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на выборке постменопаузальных женщин, проживающих в г. Москве, был изучен вклад полиморфизмов генов ERa, ER|3, ВМР4, LRP5, OPG в формирование предрасположенности к ОП.

Выбранные для изучения генетические маркеры обнаружили ассоциации с ростом (Xbal полиморфизм гена ERa и ген LRP5), возрастом наступления менархе (сочетанный генотип Xbal/PvuII гена ERa), биохимическим показателями (PvuII полиморфизм гена ERa с уровнем фосфора, ген ERf3 с уровнем RANKL), что подтверждает значимую роль выбранных генов в процессах костеобразования и роста кости.

Впервые в России были изучены особенности частотного распределения генов ERa, ER|3, ВМР4, LRP5, OPG в популяции постменопаузальных женщин. Выявлены генотипы риска развития ОП; РР (PvuII полиморфизм гена ERa), РР/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4) и СТ/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG), показатели относительного риска для указанных генотипов составили — 2,12, 2,3 и 13,1 соответственно. Таким образом, вероятность развития ОП у носителей генотипов РР и РР/СТ может увеличиваться в 2 раза, а у носителей генотипа СТ/АА - в 13 раз.

Обнаружены ассоциации генетических маркеров с МПКТ и переломами. Показано повышение МПКТ у носителей генотипов СС (ген LRP5), Рр/СТ (ERa (PvuII)/BMP4), СС/АА (LRP5/OPG), и понижение МПКТ у носителей генотипов ТТ (ген LRP5), РР/СС (ERa (PvuII)/BMP4), ТТ/АА (LRP5/OPG). Показана корреляция гена OPG с переломами поясничных позвонков (г=0,29, р=0,0036), носительство генотипа AG является фактором риска развития переломов указанной локализации (011=3,1).

В проведенном исследовании подтверждено, что формирование предрасположенности к ОП является результатом комплексного взаимодействия средовых и генетических факторов, при этом носительство определенных генотипов увеличивает риск развития заболевания.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Проведенное клинико-генетическое исследование дополнило представление о клинических и патогенетических механизмах развития ОП. Полученные данные позволили выделить генетические факторы риска, носительство которых может увеличить риск развития заболевания в 2-13 раз, а именно: генотипы РР (PvuII полиморфизм гена ERa), РР/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4) и СТ/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG). Кроме того, были выявлены генотипы, ассоциированные с низкой МПКТ: генотип ТТ (ген LRP5), РР/СС (сочетанный генотип генов ERa (PvuII)/BMP4), ТТ/АА (сочетанный генотип генов LRP5/OPG), а также с остеопоротическими переломами: генотип AG гена OPG ассоциирован с переломами поясничных позвонков. Выявленные факторы риска могут использоваться для определения круга лиц с высокой генетической предрасположенностью к заболеванию ОП.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наследственными факторами риска ОП являются генотипы РР (PvuII гена ERa), РР/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4) и СТ/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG).

2. Генотипы Рр (PvuII гена ERa), ххРр (сочетанный генотип полиморфизмов Xbal и PvuII гена ERa), Рр/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4), хх/СС (сочетанный генотип ERa (Xbal)/LRP5), СС/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG) можно рассматривать в качестве протективных.

3. Носительство генотипов СС (ген LRP5), Рр/СТ (ERa (PvuII)/BMP4), СС/АА (LRP5/OPG) ассоциировано с более высокими значениями МПКТ, а генотипов ТТ(ген LRP5), РР/СС (ERa (PvuII)/BMP4), ТТ/АА (LRP5/OPG) - с более низкими по сравнению с носителями других генотипов. 4. Носительство генотипа AG гена OPG может рассматриваться в качестве фактора риска развития переломов поясничных позвонков.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, состоит из введения, глав «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 14 рисунками.

выводы

1. В результате изучения клинических и денситометрических параметров у 100 больных первичным остеопорозом и 100 здоровых постменопаузальных женщин показано снижение минеральной плотности костной ткани (МПКТ) с увеличением возраста, влияние возраста наступления менархе и менопаузы на показатели МПКТ; протективная роль массы тела и физических нагрузок на МПКТ, и отрицательная роль курения. Показано наличие взаимосвязи между наличием переломов костей и вариабельностью показателей МПКТ шейки бедра (г=-0,25, р=0,014). Установлено, что указание в анамнезе па наличие остеопоротических переломов у кого-либо из членов семьи повышает вероятность их возникновения у потомков.

2. Выявлена взаимосвязь концентрации OPG в сыворотке крови с возрастом (г=0,49 при р=0,000002), а также концентрации RANKL с содержанием кальция и фосфора в сыворотке крови (г=0,3, р=0,00069 и i=0,23, р=0,037 соответственно). Установлена корреляция между соотношением OPG/RANKL и вариабельностью показателей МПКТ области Варда по Z-критерию (г=0,25, р=0,03).

3. Анализ особенностей распределения полиморфизмов кандидатных генов выявил у больных ОП по сравнению с контролем более высокую частоту носительства генотипа РР гена ERa (OR=2,12), сочетанных генотипов РР/СТ (OR=2,3) и СТ/АА (OR=13,l) генов ERa/BMP4 и LRP5/OPG соответственно, что дает основание рассматривать их как генотипы риска развития ОП. Выявлено прогрессивное накопление генотипа RR Rsal полиморфизма гена ERp у больных ОП с увеличением возраста, что может свидетельствовать об опосредованном влиянии этого аллеля на продолжительность жизни.

4. Частота генотипов Рр (PvuII гена ERa), ххРр (сочетанный генотип полиморфизмов Xbal и PvuII гена ERa), Рр/СТ (сочетанный генотип ERa (PvuII)/BMP4), хх/СС (сочетанный генотип ERa(XbaI)/LRP5), СС/АА (сочетанный генотип LRP5/OPG) у больных ОП была снижеиа по сравнению с контрольной группой (OR - 0,48; 0,18; 0,5; 0,4; 0,4 соответственно), что позволяет рассматривать эти генотипы в качестве возможно протективных по отношению к ОП.

5. Установлены ассоциации полиморфизмов генов ERa, LRP5, OPG и ВМР4 с МПКТ. В выборке больных ОП более высокие значения МПКТ характерны для носителей генотипа СС по сравнению с обладателями генотипа СТ гена LRP5. В группе контроля более высокие показатели МПКТ выявлены у носителей сочетанного генотипа Рр/СТ и более низкие — у носителей генотипа РР/СС генов ERa/BMP4. В группе больных ОП такая зависимость не выявлена. Среди больных ОП в среднем более высокие значения МПКТ присущи носителям генотипа СС/АА комбинации генов LRP5/OPG, тогда как в группе контроля наблюдается инверсия этой закономерности. Подобного рода инверсии свидетельствуют о нарушении баланса между процессами костеобразования и костной резорбции у части постменопаузальных женщин, что может обуславливать возникновение ОП.

6. Обнаружена корреляция полиморфизма гена OPG с переломами поясничных позвонков (г=0,29, р=0,0036), при этом риск перелома указанной локализации был выше для носителей генотипа AG по сравнению с другими генотипами (OR=3,l).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные при клинико-генетическом исследовании данные рекомендуется использовать для оценки генетических факторов риска ОП среди постменопаузальных женщин, что позволит выделить лиц с высокой генетической предрасположенностью к ОП с дальнейшей своевременной организацией системы лечебно-профилактических мер у данной категории женщин.