Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Клинико-гематологические и иммунологические критерии долгосрочного прогноза приобретенной апластической анемии

На правах рукописи

Кулагин Александр Дмитриевич

КЛИНИКО-ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ДОЛГОСРОЧНОГО ПРОГНОЗА ПРИОБРЕТЕННОЙ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ

14.01.21 -гематология и переливание крови 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

18 ПАР 2015 005560799

Санкт-Петербург 2015

005560799

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Научные консультанты: Афанасьев Борис Владимирович, доктор медицинских наук, профессор Лисуков Игорь Андреевич, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Бессмельцев Станислав Семенович, заместитель директора по научной работе Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства", доктор медицинских наук, профессор

Богданов Александр Николаевич, профессор кафедры последипломного медицинского образования медицинского факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет", доктор медицинских наук, профессор

Тотолян Арег Артемович, заместитель директора по научной работе Федерального бюджетного учреждения науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Гематологический научный центр» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 2015 г. в ^^ часов на заседании

диссертационного совета Д.208.090.01 при Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. акад. И.П.Павлова (197022, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 68) в зале заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « ^^» ^ * ^ 2015 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность и степень разработанности темы исследования

Приобретенная апластическая анемия (АА) - редкое тяжелое заболевание крови, характеризующееся панцитопенией и аплазией костного мозга (КМ) вследствие глубокого дефицита и функциональных дефектов стволовых кроветворных клеток (СКК) [Алмазов В.А. и др., 1981; Young N.S. et al., 2013]. Аллогенная трансплантация КМ (ТКМ) и иммуносупрессивная терапия (ИСТ) антитимоцитарным глобулином (АТГ) и циклоспорином А (ЦсА) улучшили прогноз тяжелой АА, обеспечивая 60-90% длительную выживаемость [Абдулкадыров К.М. и др., 1995; Михайлова Е.А., Савченко В.Г. и др., 1997, 2003; Масчан А.А. и др., 1998; Новичкова Г.А., 2009; Ганапиев А.А., Афанасьев Б.В. и др., 2010; Kojima S. et al., 2011; Marsh J.C.W. et al„ 2012; Young N.S., 2013].

ТКМ позволяет излечивать пациентов вне зависимости от патогенетической гетерогенности и тяжести АА, но ограничена частым отсутствием совместимого донора и риском осложнений (отторжение трансплантата, реакция трансплантат против хозяина и др.), что особенно важно в старшей возрастной группе и у предлеченных больных [Passweg J.R., 2010; Buchbinder D. et al., 2012; Tichelli A. et al., 2012]. Поэтому ИСТ остается стандартной терапией для большей части больных [Михайлова Е.А., Савченко В.Г., 2012; Dufour С. et al.,

2013]. Однако частота и качество гематологического ответа на ИСТ существенно варьируют, а отдаленные результаты остаются непрогнозируемыми, в связи с рецидивами АА и риском клональных осложнений [Passweg J.R. et al., 2009; Afable M. G. et al., 2011; Scheinberg P. et al.,

2014]. Внедрение ТКМ от неродственных и гаплоидентичных доноров делает актуальным раннее выявление пациентов с истинно рефрактерной АА и с высоким риском поздних неудач ИСТ [Marsh J.C.W. et al., 2013]. Используемые критерии тяжести АА преимущественно отражают риск ранних осложнений, но не прогнозируют ответ на ИСТ и отдаленные исходы.

Экспериментальные данные и эффективность ИСТ сформировали концепцию иммунопатогенеза АА (иммуногенетические факторы, кандидатные аутоантигены, дефицит регуляторных клеток, эффекторные реакции повреждения СКК цитотоксическими Т-клетками и цитокинами) [Risitano A. et al., 2004; Nakao S. et al., 2005; Feng X. et al., 2011; Young N.S. et al., 2013]. При этом в резидуальных СКК могут иметься серьезные внутренние дефекты (мутации, пролиферативный стресс, укорочение теломер), влияющие на качество восстановления кроветворения и риск клональной эволюции при проведении ИСТ [Afable М. G. et al., 2011; Scheinberg P. et al., 2013]. Однако воспроизводимые маркеры иммунного повреждения и потенциала резидуальных СКК до настоящего времени в клиническую практику не внедрены.

Перспективным направлением оценки резидуального кроветворения и риска клональной эволюции АА является изучение длины теломерных участков ДНК в клетках крови, сформировавшим концепцию теломеропатий [Calado R. Т. et al., 2011]. Факторы риска и отдаленные исходы теломеропатий остаются недостаточно документированными, и подобные исследования ранее не проводились в популяции российских больных АА.

Недостаточно изученной остается нетяжелая АА (НТАА). Благоприятный краткосрочный прогноз НТАА часто определяет тактику наблюдения или неинтенсивной ИСТ [Marsh J.C.W. et al., 2009]. Однако ряд фрагментарных данных ставят под сомнение оправданность этого и требуют детального анализа НТАА [Howard S.C. et al., 2004; Nishio N. et al., 2009; Kwon J.H. et al., 2010].

Иммунопатогенетическая взаимосвязь АА и пароксизмальной ночной гемоглобинурии (ПНГ) сделала перспективным тестирование клонов ПНГ, как маркеров иммунной депрессии

кроветворения [Sugimori С. et al., 2006; Scheinberg P. et al., 2010; Pu J. J. et al. 2011]. Имеющиеся данные получены преимущественно ретроспективно и с использованием низкочувствительных методов, что затрудняет оценку прогностического значения. Остаются неизученными факторы риска и частота прогрессии субклинической ПНГ (сПНГ) в гемолитическую форму.

Комбинация лошадиного АТГ и ЦсА является стандартом первой линии ИСТ при АА [Scheinberg P. et al., 2011; Marsh J.C. et al., 2012]. Однако ряд вопросов тактики ИСТ остаются открытыми, в частности не определен оптимальный дозовый режим лошадиного АТГ.

Таким образом, выяснение иммунопатогенетической и клинико-гематологической гетерогенности АА, влияющей на эффективность ИСТ и долгосрочный прогноз, является актуальной проблемой современной гематологии, решение которой позволит получить новые фундаментальные данные о механизмах развития и прогрессии иммуноопосредованных депрессий кроветворения и оптимизировать результаты лечения больных АА. Все вышеизложенные аспекты позволили сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Охарактеризовать долгосрочную клиническую эволюцию и прогноз приобретенной апластической анемии при проведении иммуносупрессивной терапии и оптимизировать современный алгоритм лечения.

Задачи исследования

1. Оценить частоту и качество гематологического ответа, длительную общую (ОВ) и бессобытийную (БСВ) выживаемость, кумулятивную частоту рецидивов и клональной эволюции при проведении ИСТ.

2. Проспективно оценить частоту выявления и прогностическое значение клонов ПНГ при проведении первой и второй линии комбинированной ИСТ. Охарактеризовать независимые предикторы вероятности достижения и качества ответа на ИСТ.

3. Изучить клинико-гематологические и иммунологические факторы прогноза ОВ и БСВ и сформулировать принципы стратификации групп риска АА при проведении ИСТ.

4. Сравнить эффективность двух дозовых режимов лошадиного АТГ в первой линии ИСТ.

5. Провести анализ эффективности ИСТ, отдаленных исходов и охарактеризовать независимые факторы прогноза у больных с НТАА.

6. Исследовать иммунофенотип лимфоцитов КМ у первичных больных и в динамике ИСТ с определением потенциальных маркеров повреждения кроветворения.

7. В срезовом исследовании изучить длину теломерных районов ДНК гранулоцитов и определить ее клиническое и прогностическое значение при длительном динамическом наблюдении.

8. Провести длительное мониторирование клонов ПНГ. Сформулировать критерии диагноза и оценить частоту, факторы риска и тяжесть гемолитической ПНГ у больных АА при проведении ИСТ.

9. Разработать протокол мониторирования клонов ПНГ с использованием высокочувствительной проточной иммуноцитометрии для оценки клональной эволюции АА при проведении ИСТ.

Научная новизна

Впервые в репрезентативной когорте в контексте биологической и клинической гетерогенности детально изучены непосредственные результаты и отдаленные исходы ИСТ, идентифицированы ключевые факторы прогноза и сформулированы закономерности клинической эволюции приобретенной АА.

Впервые в проспективном исследовании верифицировано прогностическое значение наличия клонов ПНГ для развития гематологического ответа на ИСТ первой и второй линии и длительной БСВ. Проспективно валидизирован прогностический индекс, включающий статус ПНГ и уровень абсолютного числа ретикулоцитов (АЧР).

Показана недостаточная информативность классификации АА по степени тяжести для отдаленного прогноза OB и БСВ. Разработана новая модель прогноза OB для сбалансированной оценки риска ранней и связанной с отсутствием ответа на ИСТ летальности. Уточнен уровень нейтрофилов, дискриминирующий прогноз среди больных со СТАА. Изучены кумулятивная частота и прогноз рецидивов АА с идентификацией НТАА и продолжительности терапии ЦсА в качестве факторов риска. Проанализированы кумулятивная частота и исходы трансформации АА в МДС/ОМЛ. Показан повышенный риск при НТАА. Охарактеризованы случаи аномалий кариотипа с отсутствием критериев МДС/ОМЛ. Документированы различия с группой трансформации в МДС/ОМЛ в характере цитогенетических нарушений и ПНГ статуса.

Получены новые представления об эффективности и отдаленных исходах ИСТ при НТАА: низкая частота полного ответа (ПО), повышенный риск поздних неудач лечения (рецидивов и МДС/ОМЛ), низкая БСВ и отсутствие различий OB по сравнению с ТАА и СТАА в отдаленный период. Наряду с исходным ПНГ статусом и уровнем АЧР показано ключевое прогностическое значение хронического течения НТАА и предшествующей монотерапии ЦсА.

Получены оригинальные данные о преимуществе дозового режима лошадиного АТГ 40 мг/кг х 4 дня по сравнению с 20 мг/кг х 5 дней в частоте гематологического ответа, БСВ и необходимости второго курса АТГ и ТКМ.

Впервые в когорте российских пациентов с АА проведено исследование длины теломерных районов ДНК, документирован повышенный риск укорочения теломер при НТАА и значение данного феномена как фактора риска развития МДС/ОМЛ.

Подтверждена базовая характеристика субпопуляционного состава КМ с экспансией Т-лимфоцитов и активированной CD8+HLA-DR+ популяции с возможностью длительного мониторирования. Выявлено отсутствие связи ответа на ИСТ с исходным субпопуляционным составом лимфоцитов КМ. Получены оригинальные данные о связи рефрактерности на первый курс АТГ с быстрой реконституцией Т-лимфоцитов и активированных CD8+HLA-DR+ клеток.

Впервые в крупном исследовании с использованием жестких критериев включения и мониторирования показана вероятность разнонаправленной динамики размера клонов ПНГ при АА. Сформулированы оригинальные критерии иммунодиагностики, оценена кумулятивная частота и факторы риска гемолитической ПНГ. По сравнению с классической формой ПНГ выявлена закономерность позднего развития тромботических осложнений.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Полученные данные о предикторах и закономерностях клинической эволюции АА при проведении ИСТ создают теоретическую основу для дальнейших исследований в области депрессий кроветворения и оптимизации лечения АА. В исследовании развита и научно обоснована концепция биологической и клинической гетерогенности АА, определяющая результаты ИСТ и отдаленные исходы заболевания.

Практическая значимость диссертации состоит в разработке систем стратификации первичных больных по вероятности достижения гематологического ответа на ИСТ и риску различных неудач лечения. Предложен алгоритм выбора второй-третьей линии терапии между повторным курсом АТГ и проведением аллогенной неродственной или гаплоидентичной ТКМ. Определены оптимальные сроки поиска неродственного донора КМ в зависимости от группы

риска и ответа на первый курс АТГ и ЦсА. Документирована необходимость отказа от тактики наблюдения и неинтенсивного лечения НТАА. Обоснован стандартный дозовый режим лошадиного АТГ. Выделены факторы риска развития гемолитической ПНГ и оптимизирован протокол мониторирования размера клона и интенсивности внутрисосудистого гемолиза.

Методология и методы исследования Методология диссертационного исследования базируется на традиционных методах эмпирического (наблюдения, измерения) и теоретического (формализация, гипотеза) уровня.

Положения, выносимые на защиту

1. Приобретенная АА в контексте эффективности ИСТ представляет собой спектр синдромов недостаточности КМ, различающихся по частоте и качеству достигаемого гематологического ответа, вероятности развития рецидива, клональной трансформации, OB и БСВ. Классификация АА по степени тяжести не отражает биологическую гетерогенность АА и не определяет в должной мере частоту и качество гематологического ответа и долгосрочный прогноз при проведении ИСТ. Низкая ранняя летальность и преимущества в OB при НТАА нивелируются в отдаленный период вследствие повышенной вероятности клональной трансформации в МДС/ОМЛ. Хроническое течение НТАА и отсрочка комбинированной ИСТ ассоциированы с низкой частотой гематологического ответа и БСВ.

2. Неблагоприятный прогноз OB при проведении ИСТ включает риск ранней летальности, летальности при отсутствии ответа на ИСТ и поздней летальности, связанной с клональной трансформацией АА. Критерием прогноза ранней летальности является абсолютное число нейтрофилов (АЧН) стойко ниже 0.1х109/л. Независимыми предикторами ответа на ИСТ являются ПНГ статус и АЧР. Наличие трех факторов риска (АЧН <0.1х109/л, АЧР < ЗОх 1 о'/л, отсутствие клона ПНГ) дискриминирует группу высокого риска с показаниями для ранней аллогенной ТКМ, включая неродственную и гаплоидентичную в первой линии.

3. Непосредственная и долгосрочная эффективность ИСТ зависит от дозы АТГ. Сравнение дозовых режимов 160 мг/кг/курс и 100 мг/кг/курс лошадиного АТГ показало преимущество первого в достижении ответа, потребности в дополнительной терапии и БСВ.

4. АА, в отличие от монолинейных иммунных цитопений и системной красной волчанки, характеризуется экспансией Т-лимфоцитов и активированных CD8+ Т-лимфоцитов КМ. Отсутствие ответа на первый курс АТГ+ЦсА ассоциировано с более быстрой реконституцией пула Т-лимфоцитов КМ. Повторное повышение количества активированных CD8+HLA-DR+ лимфоцитов КМ, выявляемое при длительном мониторировании, не сопровождается развитием рецидива АА.

5. Прогрессирующее укорочение теломер в гранулоцитах выявляется у 45% больных АА, находящихся на разных этапах лечения и отражает состояние длительного стрессового кроветворения, в том числе до начала ИСТ. Укорочение теломер чаще выявляется у больных с НТАА и ассоциировано с повышенным риском развития МДС/ОМЛ.

6. Клоны ПНГ присутствуют у 59% больных АА в дебюте заболевания вне зависимости от степени тяжести. В проспективном исследовании ПНГ+ статус является независимым биологическим предиктором частоты и качества ответа на комбинированную ИСТ первой и второй линии, и более высокой БСВ. Эволюция клонов ПНГ при длительном мониторировании носит разнонаправленный характер с преобладанием случаев со стабильным размером и менее вероятными сценариями уменьшения и увеличения размера. Развитие гемолитической ПНГ всегда является этапом роста присутствующего до начала ИСТ клона и прямо зависит от его исходного размера.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность полученных результатов обеспечивается большим числом клинических наблюдений, длительностью и спланированным дизайном работы, включавшем срезовые, ретроспективные и проспективные исследования, использованием стандартных методов диагностики, оценки эффективности лечения и хорошо воспроизводимых методов оценки биологических характеристик, адекватным поставленным задачам статистическом анализе.

Ключевые результаты исследования внедрены в работу клиники НИИ ДОГиТ им. P.M. Горбачевой ПСПбГМУ им. И.П. Павлова, отделений гематологии Ленинградской областной клинической больницы, Детской городской больницы № 1 Санкт-Петербурга, НИИ клинической иммунологии г. Новосибирск, Новосибирского городского гематологического центра. Материалы диссертации используются в процессе преподавания на кафедре гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ФПО ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова.

Результаты работы представлены на 31 российских и международных конференциях, в том числе I и II Конгрессах гематологов России (Москва, 2012, 2014), II и III Евразийском гематологическом форуме «Диагностика и терапия онкогематологических заболеваний (Новосибирск, 2013, 2014), III-VIII симпозиумах «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых» (Санкт-Петербург, 2009, 2010, 2011, 2014, Астана, 2013), конгрессах Европейского общества ТКМ (ЕВМТ 2008 - 2014), Европейской гематологической ассоциации (ЕНА 2006, 2011, 2013), Американского общества гематологов (ASH 2008, 2013, 2014).

Результаты диссертационного исследования опубликованы в 48 печатных работах, включая 20 в изданиях, рекомендованных ВАК, и 1 монографию.

Апробация диссертации состоялась 26.12.2014 ца совместном заседании кафедры гематологии, трансфузиологии и трансплантологии ФПО и секции гематологии и химиотерапии проблемной комиссии №1 «Онкология и регенеративная медицина» ГОУ ВПО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 8 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 90 рисунками и 44 таблицами. Библиографический указатель включает 345 источников, в том числе 23 отечественных и 322 зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методы исследования и характеристика пациентов Дизайн исследования

Проведено когортное неинтервенционное исследование эффективности и отдаленных исходов ИСТ при АА, включавшее ретроспективную и проспективную фазу. В рамках этих двух фаз проведены исследования фенотипа лимфоцитов КМ и длины теломерных районов ДНК. Учитывая редкость АА и необходимость оценки отдаленных результатов, общая продолжительность исследования составила 15 лет.

Пациенты, критерии диагноза и степени тяжести АА

В исследование включались пациенты с доказанной АА, не являющихся кандидатами для проведения родственной ТКМ в первой линии, проходивших обследование и лечение в Первом Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. И.П. Павлова и в НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (г. Новосибирск). Диагноз АА устанавливался согласно классическим критериям [International Agranulocytosis and Aplastic

Anaemia Study Group, 1987]. Конституциональные AA исключали на основании отсутствия физикальных признаков, характерных для анемии Фанкони и врожденного дискератоза, данных семейного анамнеза и отрицательного теста на ломкость хромосом с диэпоксибутаном. Гипоклеточный МДС исключали по результатам стандартного морфологическое и цитогенетическое исследование КМ. Тяжесть АА определяли по минимальным значениям базовых показателей минимум 3-х последовательных гемограмм в течение 4 недель до начала ИСТ согласно общепринятым критериям [Camitta В. et al., 1976; Bacigalupo et al., 1988].

Иммуносупрессивная терапия Лошадиный АТГ (АТГАМ, Pfizer Inc) вводился в дозе 40 мг/кг/д внутривенно в течение

4 дней или 20 мг/кг/д в/в в течение 5 дней), кроличий АТГ (Тимоглобулин, Genzyme; Sanofi Company - 2.5-3.75 мг/кг/д внутривенно в течение 5 дней, ЦсА (Сандиммун Неорал, Novartis) -

5 мг/кг/д per os. Терапия ЦсА продолжалась до достижения плато гематологического ответа с последующим снижением дозы (на 25 мг у взрослых и на 10% у детей в 2 месяца) с отменой при устойчивой ремиссии. Профилактика сывороточной болезни проводилась метилпреднизолоном 0.5-1.0 мг/кг/день в течение 14 дней и отменой за 7 дней, при развитии сывороточной болезни - до купирования симптомов. Сопроводительная терапия включала противомикробную профилактику и трансфузии без рутинного назначения ростовых факторов. Лечение инфекций проводилось по стандартам эмпирической антибактериальной, противогрибковой и противовирусной терапии с коррекцией при идентификации патогена.

Оценка базовых гематологических показателей, ответа на ИСТ и исходов В качестве базовых гематологических показателей использовались наименьшие значения гемограмм, выполненных в течение 4 недель до начала курса АТГ [Scheinberg P. et al., 2009].

Смерть в течение первых 3-х месяцев после начала ИСТ принимали за раннюю. Гематологический ответ оценивался через 3, 6, 9, 12 месяцев и далее ежегодно данными двух и более гемограмм с интервалом не менее 4-х недель согласно критериям [Camitta В., 2000].

Критериями рецидива АА у ответивших пациентов было снижение показателей гемограммы до уровня «отсутствие ответа» с или без зависимости от трансфузий. Общая выживаемость (OB) определялась от даты начала ИСТ до даты смерти от любой причины или даты последнего контакта с больным. Бессобытийная выживаемость (БСВ) определялась от даты начала ИСТ до даты наиболее раннего события из следующих: смерть, отсутствие ответа на ИСТ, рецидив, гемолитическая ПНГ, МДС, ОМЛ [Marsh J.C.W, et al, 1999; Frickhofen N. et al, 2003]. Пациенты были цензурированы на момент последнего контакта.

Определение клонов ПНГ Определение клонов ПНГ в периферической крови проводилось с использованием стандартизированной высокочувствительной многоцветной проточной цитометрии. До 2010 года использовался протокол, предоставленный профессором S.Nakao [Wang H. et al, 2002]. Тестировалось наличие CD1 lb+CD55-CD59- гранулоцитов и CD235+CD55-CD59- эритроцитов. Образцы крови в объеме 5 мл забирались в пробирки с ЭДТА. В пробах для тестирования гранулоцитов эритроциты лизировались хлоридом аммония. Использовались следующие моноклональные антитела (МКА): фикоэритрин (РЕ)-меченные анти-CDllb (клон D12, Becton Dickinson, США), PE-aHTH-CD235a, Гликофорин A (JC159; DAKO, Дания), флуоресцент-изоционат (FITC)-aHTH-CD55 (IA10, Becton Dickinson, США) и FITC-aHra-CD59 (р282 (Н19), Becton Dickinson, США) в комбинации с изотипическим контролем. Анализировалось минимум 1 х 105 CDllb+ гранулоцитов и CD235+ эритроцитов после гейтирования по параметрам прямого и бокового светорассеяния и положительной линейно специфической

метки для исключения из анализа дебриса и CD235dlr" и CD1 lbdjm клеток. Анализ проводился с использованием проточных цитометров FACSCalibur и FACSAria II (Becton Dickinson, США).

С 2011 года внедрен протокол Международного общества клинической цитометрии [Borowitz M.J. et al, 2010]. CD235+CD59- эритроциты, CD 15+CD24-FLAER- гранулоциты, CD64+CD14-FLAER- моноциты относились к клону ПНГ. Среди эритроцитов выделялись клетки с частичной (II тип) и полной утратой (III тип) экспрессии CD59. Использован набор реактивов: CD235a (гликофорин)-НТС (11Е4В-7-6, Beckman Coulter, США) и CD59-PE (МЕМ-43, Invitrogen, Великобритания), CD45-PerCP (2D1) и CD15-APC (HI98, Becton Dickinson, США), CD24-PE (ALB9, Beckman Coulter, США) и FLAER-Alexa 488 (CEDARLANE, Канада), CD45-PerCP (2D1) и CD64-APC (10.1, Becton Dickinson, США), CD14-PE (RM052, Beckman Coulter, США) и FLAER-Alexa 488 (CEDARLANE, Канада).

На основании данных обследования 29 здоровых доноров и текущих международных рекомендаций, универсальный межлабораторный порог чувствительности > 0.01% GPI/FLAER-дефицитных клеток с отчетливым кластер-подобным распределением событий на гистограммах являлся критерием наличия ПНГ клона в каждой из анализируемых популяций.

Определение фенотипа лимфоцитов КМ КМ аспирировали в объеме 3 мл в пробирки содержащих гепарин при проведении стандартных процедур обследования (трепанобиопсия, стернальная пункция). Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077г/мл). Фенотип МНК КМ изучался методом проточной одно- или двухцветной цитофлуориметрии на цитометре FACSCalibur (Bekton Dickinson, США). Использовались МКА: aHTH-CD3-FITC, анти-CD16-FITC (НПО «Сорбент» г. Москва), анти-HLA-DR-FITC, aHra-CD4-PE, aHm-CD8-PE, CD20-PE (НПО «Медбиоспектр», г. Москва). Контрольные группы включали 25 здоровых доноров и 14 больных с аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА), иммунной тромбоцитопенией (ИТП) и системной красной волчанкой (СКВ).

Определение длины теломер в клетках периферической крови Исследования проводились совместно с к.б.н. В.И. Борисовым методом проточной флюоресцентной in situ гибридизации (Flow-FISH). Образцы венозной крови (5 мл) забирали в пробирку с гепарином. Эритроциты осаждали в присутствии 10% раствора желатина в течение 35 минут. Полученную лейковзвесь отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) содержащим 0.1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА, Sigma, США) (ЗФР-БСА).

Стандартом гибридизации служили спленоциты мышей линии C57BL/6 с известной длиной теломер (Питомник «Рассвет», Томск). Тестируемые лейкоциты и спленоциты мыши смешивали в количестве 500x103, центрифугировали и ресуспендировали в 300 мкл гибридизационного раствора с 70% формамида (Sigma, США), 20мМ Tris (рН=7.1) (Sigma, США) и 1% БСА. Комплементарный к теломерной последовательности ДНК зонд флуоресцин-(СССТАА)з Peptide Nucleic Acid (PNA, Eurogentec Ltd, Бельгия) добавляли в концентрации 0.3 мкг/мл. Пробы перемешивались, инкубировались 10 минут при 80°С и оставлялись в темноте при комнатной температуре в течение 3 часов. Далее клетки переносили в пробирки для цитометрии (Falcon 2058), дважды отмывали 70% формамидом, содержащим 0.1% БСА, 0.1% Tween 20 (Sigma, США) и ЮмМ Tris (рН=7.1), и однократно ЗФР-БСА, содержащим 0.1% Tween 20. Осадок ресуспендировали в 0.5 мл ЗФР-БСА, содержащем 25 мкл/мл РНКазы и 2 мкл/мл 7-Аминоактиномицина D (7-AAD) (ICN Biomedicals Inc, США).

Пробы анализировались на цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США). Популяции тестируемых клеток и контрольных спленоцитов мыши дискриминировали по

характеру прямого и бокового светорассеяния. Сигнал флуоресценции теломерных участков ДНК определяли как средний уровень флуоресценции (MFI) клеток, находящихся в Go/Gi фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресценции образцов, подготовленных без PNA зонда. В анализ включены данные по исследованию гранулоцитов. Относительные значения длины теломер определяли как отношение MFI исследуемого образца к MFI спленоцитов мыши. Абсолютное значение вычислялось по формуле TEL = 2041.66 + 28098,70хх, где «TEL» - это получаемая длина в парах нуклеотидов, а «х» - это длина теломер относительно клеток внутреннего контроля [Борисов В.И., 2007]. Кроме абсолютной длины определялся скорректированный по возрасту показатель (DeltaTEL), представляющего собой разницу между длиной теломер у обследованного больного и соответствующей его возрасту точки уравнения линейной регрессии показателей здоровых доноров (п=71).

Статический анализ

Все данные были проанализированы по состоянию на 1 апреля 2013 года.

Принадлежность выборки к нормальному распределению определялась по данным теста Шапиро-Уилки. Большая часть числовых рядов отличалась от нормального распределения и для описания данных использованы медианно-квартильные оценки и непараметрические критерии при сравнении статистической значимости различий. Описательные характеристики включали пропорции, медианы, минимальные и максимальные значения, межквартильные размахи (МКР). Различия между группами оценивались с помощью точного теста Фишера для категориальных характеристик и U теста Манн-Уитни (2 группы) и критерия Крускала-Уоллиса (более 2 групп) для количественных характеристик. Различия повторных измерений внутри групп оценивались с помощью критерия Вилкоксона (2 измерения) или Фридмана (более 2 измерений), корреляции - с использованием рангового коэффициента Спирмена.

Кумулятивные частоты событий оценивались с использованием метода конкурирующих рисков [Fine J.P, Gray R.J., 1999]. При оценке кумулятивной частоты достижения ЧО и ПО в качестве конкурирующего риска принималась ранняя смерть. При оценке кумулятивной частоты рецидива, МДС/ОМЛ и гемолитической ПНГ конкурирующими рисками были смерть, несвязанная с событием и ТКМ до развития анализируемого события.

Независимые предикторы ответа на ИСТ оценивались в многофакторном анализе с использованием процедуры логистической регрессии с алгоритмом пошаговой селекции важных кофакторов. Сравнения частоты ответа на ИСТ проводили вычисляя отношение шансов (ОШ) с определением 95% доверительного интервала (ДИ) и критерия Вальда. OB и БСВ оценивались по методу Каплана-Мейера с расчетом 95% ДИ. Сравнения выживаемости между группами проводилось с использованием лог-рангового и Gehan-Wilcoxon критериев. Предикторы выживаемости определялись в однофакторном и многофакторном анализе с помощью регрессии Кокса с вычислением отношения рисков (ОР), 95% ДИ и критерия Вальда.

Для определения оптимального по соотношению специфичности и чувствительности порога отсечения классифицирующего количественного показателя, связанного с бинарным исходом, использовался метод построения кривой операционной характеристики приемника (Receiver Operator Characteristic - ROC) с определением площади под кривой (AUC).

Тестирование альтернативной гипотезы было двусторонним, статистически значимым при значении р < 0.05. Статистический анализ проводился с использованием программ NCSS 2007 (Kaysville, UT, США) и STATISTICA 8.0 (StatSoft Inc., США). Сравнение кумулятивных частот при наличии конкурирующих рисков выполнялось с использованием функции "cmprsk" статистического пакета R, версия 2.15.2 (R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Базовые клинические и лабораторные характеристики больных

В финальный анализ эффективности ИСТ было включено 247 больных, базовые клинические и лабораторные характеристики которых представлены в таблице 1. Кроме этого в анализ гемолитической ПНГ было включено 3 пациента с одновременным установлением диагноза АА/ПНГ у которых эффективность ИСТ не была оценена в связи с ранним проведением ТКМ или коротким периодом наблюдения и 27 больных, направленных в период доминирования гемолитической ПНГ и наличием в анамнезе документированной АА.

Таблица 1. Характеристика больных _

Характеристика Значение

Больные, п (%) 247(100)

Возраст на момент диагностики АА, лет, медиана (мин-макс) 20.7 (0.8-70.9)

Возраст, лет, < 18 / > 18 88 (36) / 159 (64)

Пол, М / Ж, п (%) / п (%) 133 (54)/ 114(46)

Этиология, п (%)

Идиопатическая 240 (97)

Постгепатитная 7(3)

Степень тяжести АА, п (%)

НТАА 88 (36)

ТАА 94 (38)

СТАА 65 (26)

Клон ПНГ, +/-, п (%) / п (%) 128 (59)/88 (41)

HLA DRB1 * 15 +/-, п (%) / п (%) 54 (43) / 73 (57)

Интервал дебют - ИСТ, дни, медиана (мин - макс) 114(11-4816)

ИСТ, ЦсА моно / АТГ+ЦсА, п (%) / п (%) 43 (17)/204 (83)

Больные с ТАА и СТАА составляли 2/3 анализируемой когорты. Возраст больных был обратно связан со степенью тяжести АА (медиана 26, 20 и 18 лет при НТАА, ТАА и СТАА соответственно). Интервал между дебютом АА и началом ИСТ был самым коротким при СТАА (медиана 65 день, против 103 и 251 при ТАА и НТАА, р=0.00001).

Ответ на ИСТ в зависимости от степени тяжести АА

К моменту финального анализа с учетом первой и последующих линий ИСТ как минимум 40 был индуцирован у 184 из 247 больных (74.5%, 95% ДИ 69.1-79.9), критерии ПО были достигнуты в 80 случаях (32.4%, 95% ДИ, 26.6-38.2). Частота достижения ЧО достоверно не различалась в группах больных с НТАА, ТАА и СТАА (78.4%, 72.3% и 72.3% соответственно, р=0.2650). В противоположность этому качество гематологического ответа обратно коррелировало со степенью тяжести АА и оказалось наиболее высокой при СТАА. Так ПО был достигнут у 43.1% больных с СТАА по сравнению с 34% при ТАА и 22.7% при НТАА (р=0.0073). Данная закономерность сохранилась при более прецизионной оценке с включением в анализ пациентов (п=204), получавших только комбинированную ИСТ АТГ+ЦсА (частота ПО: СТАА - 44.4%, ТАА - 37.8%, НТАА - 28.8%, р=0.0376).

Проспективное исследование прогностического значения клонов ПНГ и других независимых предикторов эффективности ИСТ

Прогностическое значение выявление клонов ПНГ остается дискутабельным. В связи с этим проведено большое (п=125) проспективное исследование прогностического значения клонов ПНГ и других клинико-лабораторных характеристик на момент диагностики АА.

К моменту начала ИСТ ПНГ+ и ПНГ- случаи составляли 74 (59.2%) и 51 (40.8%) соответственно. Медиана размера клона при первом тестировании составила 0.6% (МКР, 0.13.99%, мин-макс, 0.01-51.48%) в гранулоцитах и 0.145% (МКР, 0.033-0.51%, мин-макс 0.019.15%) в эритроцитах. Подавляющее количество ПНГ+ больных (67 из 74, 90.5%) имели размер клона в гранулоцитах менее 10%. Согласно рабочей классификации ПНГ [Parker С. et al., 2005] 11 больных (15%) отнесены в категорию АА/ПНГ. Оставшиеся 63 пациента (85%) имели сПНГ.

ПНГ клон выявлялся у больных всех возрастных категорий, однако более часто у взрослых: 65.2% ПНГ+ случаев среди больных > 18 лет против 44.4% в группе младше 18 лет (р=0.0443). Частота выявления клона ПНГ клон не зависела от пола больных и степени тяжести АА: 22 (59.5%), 31 (59.6%) и 21 (58.3%) при НТАА, ТАА и СТАА соответственно. При анализе базовых лабораторных показателей не выявлено статистически достоверных различий в уровне лейкоцитов, АЧН, A4JI и ЛДГ в сравниваемых группах. При этом АЧР (медиана 19 * 109/л против 12 х 109/л, р=0.0229) и средний объем эритроцитов (медиана 94 fl против 89 fl, р=0.0301) оказались достоверно выше у ПНГ+ больных. Сравниваемые группы больных были хорошо сбалансированы в отношении первой и второй линии ИСТ (лошадиный против кроличьего АТГ, дозы лошадиного АТГ) и интервалов диагноз - ИСТ и первая - вторая линия ИСТ.

Пять больных (ПНГ+ 1, ПНГ- 4) с ТАА (п = 3) и СТАА (п = 2) погибли в первые 3 месяца от начала протокола ИСТ. Данные случаи рассматривались как отсутствие ответа при сравнении пропорций или как конкурирующий риск при анализе кумулятивной частоты ответа на ИСТ. По всей группе как минимум ЧО (общий ответ) через 3 и 6 месяцев после первой линии был достигнут у 42 (33.6%) и 73 больных (58.4%) соответственно.

Частота ответа к 6 месяцу ИСТ оказалась статистически достоверно выше в группе ПНГ+ пациентов (67.6% против 45.1%, р=0.0164) и данная закономерность сохранилась к 12 месяцу. Благоприятное прогностическое значение ПНГ+ статуса сохранялось после исключения из анализа случаев ранней смерти (ответ 68.5% против 48.9% в ПНГ- группе, р=0.0369) и при анализе группы ТАА и СТАА (63.3% против 41.7%, р = 0.0523). Наличие клона ПНГ было также сопряжено с более высокой частотой ПО (41.9% против 15.7%, р = 0.0029).

Второй курс АТГ на фоне продолжения терапии ЦсА получили 30 неответивших больных. В ранние сроки вследствие инфекционных осложнений погибли 2 пациента (по одному из каждой группы). К шестому месяцу ЧО был индуцирован у 8 из 15 (53%) ПНГ+ и у 2 из 15 (13%) ПНГ- больных (р = 0.0502), к 12 месяцу ответ у 73% и 27% соответственно (р = 0.0268). Аллогенная ТКМ от родственного и неродственного донора была проведена в 13 случаях (ПНГ+4, ПНГ- 9) по поводу рефрактерной АА (п = 9) и вторичного МДС (п = 4).

В однофакгорном анализе наряду с ПНГ+ статусом были выявлены следующие предикторы ответа на первую линию ИСТ: АЧР (р = 0.00006) с оптимальным пограничным значением 30 х 109/л (р = 0.0003) и позитивность по HLA-DRB1*15 (р = 0.0117; п=80). Прогностическое значение клона ПНГ нивелировалось при использовании критерия размера клона > 1% (р = 0.3097). Возраст, пол, тяжесть АА (НТАА против ТАА/СТАА), уровень лейкоцитов, АЧН, АЧЛ, гемоглобина, тромбоцитов и интервал между диагнозом АА и началом ИСТ достоверно не влияли частоту достижения гематологического ответа.

В многофакторном анализе идентифицированы только 2 независимых предиктора ответа на ИСТ: ПНГ позитивность и АЧР > 30 х 109/л с ОШ равном 2.56 (95% ДИ, 1.18-5.59, р=0.0180) и 5.192 (95% ДИ, 1.94-13.93, р=0.0011) соответственно. Основываясь на небольшом ретроспективном исследовании [Afable II M.G. et al., 2011], мы оценили гематологический ответ в 3-х группах больных, стратифицированных по индексу ПНГ/АЧР30, отражающем присутствие этих предикторов, каждому из которых присваивался 1 балл: 1. ПНГ/АЧР30=2 (п=25); 2. ПНГ/АЧР30=1 (п=61); 3. ПНГ/АЧР30=0 (п=39).

Для прецизионной оценки динамики формирования гематологического ответа (ЧР) на данном этапе анализа использовались кривые кумулятивной частоты (рисунок 1).

& 2

1,0

0,8

0.2 0.0

ПНГ7АЧР30=2

I1

ПНГ/АЧР30=1

ПНГ/АЧР30=0 Р=0.0007

Г

6 8 месяцы

10 12

Рисунок 1. Кумулятивная частота ответа после первой (А) и второй (Б) линии ИСТ

Как видно из рисунка 1А кумулятивная частота ЧО после 6 месяцев терапии составила 85.0% (95% ДИ, 71.7-100.0%), 69.4% (95% ДИ, 57.9-83.2 %) и 35.9% (95% ДИ, 23.1-55.7%) в первой, второй и третьей прогностической группе соответственно (р = 0.00001). При этом различия между группами сохранялись в течение всего первого года лечения.

Наличие ПНГ клона и АЧР оказались еще более информативными в прогнозе эффективности второй линии ИСТ (рисунок 1Б). Кумулятивная частота ЧО через 6 месяцев составила 71.4% (95% ДИ, 44.7-100 %), 33.3% (95% ДИ, 14.9-74.2%) и 0% в первой, второй и третьей группе больных соответственно (р = 0.0007). К 12 месяцу только 1 из 11 (9.1%) больных из группы ПНГ/АЧР30=0 достиг ЧР, тогда как 7/12 (58.3%) и 7/7 (100%) больных из второй и первой группы ответили на второй курс АТГ. Следовательно, предложенный прогностический индекс позволил идентифицировать подавляющее большинство больных с истинной рефрактерностью к ИСТ до начала второй линии терапии.

Общая выживаемость (ОВ)

К моменту проведения анализа живы 210 больных (85%) с медианой наблюдения с момента начала ИСТ 52 месяца (3.5 - 202, МКР 24-89), в том числе 104 из 125 в проспективной фазе (83%). Вероятность ОВ во всей когорте больных в течение 5 и 10 лет составила 84.8% (95% ДИ, 79.7 - 89.9) и 80.6% (95% ДИ, 73.7 - 87.5) соответственно (рисунок 2А). Анализ ОВ в зависимости от тяжести АА демонстрирует две тенденции: (1) снижение кривой в первые 2 года у больных с ТАА и СТАА с дальнейшей тенденцией к плато и (2) низкая летальность в первые 2 года при одновременном отсутствии отчетливого плато кривой у больных с НТАА (рисунок 2Б).

Общая выживаемость 5 лет: 84.8% 10 лет: 80.6%

Б

1,0

' -^С1—1

0,8- ^-^ТГ^ГГГ"""1-

0,2 0,0

ТАА

СТАД

НТАА

Р=0.2094 1.одгапк Р=0.023е Gehan-W¡lcoxon

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 годы

Рисунок 2. Общая выживаемость всех больных (А) и в зависимости от тяжести АА (Б)

0 2 4 6 В 10 12 14 16 18

ГОДЫ

Это приводит к перекрещиванию кривых и отсутствии различий в отдаленный период. Так вероятностная ОВ в течение 5 лет при НТАА, ТАА и СТАА составила 91.8% (95% ДИ, 84.4 - 99.2), 82.6% (95% ДИ, 74.1 - 91.1) и 79.5% (95% ДИ, 68.9 - 90.2), тогда как в течение 10 лет -83.3% (95% ДИ, 69.8 - 96.9), 82.6% (95% ДИ, 74.1 - 91.1) и 75.4% (95% ДИ, 62.5 - 88.2) соответственно. Поэтому степень тяжести АА имела значение для ОВ в первые 5-8 лет после ИСТ (критерий ОеЬап-\У11сохоп, р=0.0286) и нивелировалась при длительном наблюдении (1о;^гапк критерий не выявил достоверных различий).

К моменту проведения анализа погибли 37 из 247 больных (15%) с первичным диагнозом НТАА, ТАА и СТАА у 10, 14 и 13 больных соответственно. Медиана возраста погибших больных на момент диагностики АА и на момент смерти составляла 18.6 (2.4 - 53.2) и 20.9 (3.9 — 58.4) года. Причинами смерти являлись непосредственные осложнения цитопении при АА (инфекции, геморрагический синдром) у 22 (59%) больных, осложнения после ТКМ, включая инфекции при недостаточности трансплантата - 6 (16%), МДС/ОМЛ (включая 3 после ТКМ) - 8 (22%) и солидная опухоль - 1 (3%). Ранняя летальность оставалась стабильной на всем протяжении исследования (4 случая среди первых 123 больных в 1994-2007 г.г. и 4 случая среди последующих 124 больных в 2008-2013 г.г.), что косвенно свидетельствует о незначительной роли улучшения качества сопроводительной терапии в последние годы.

С целью выяснения потенциальных факторов, влияющих на ОВ, был проведен однофакторный и многофакгорный анализ с помощью регрессии Кокса. На основе теоретических рассуждений, анализа предшествующих публикаций и данных проспективного исследования в однофакторный анализ были включены следующие потенциальные предикторы: пол, возраст, степень тяжести АА (НТАА, ТАА или СТАА), базовые гематологические показатели (АЧР, АЧН, АЧЛ), клон ПНГ (нет/да), гаплотип НЬА-ОКВ 1*15 (нет/да), интервал дебют АА - старт ИСТ. В результате в однофакторном анализе были идентифицированы 4 предиктора (степень тяжести АА, клон ПНГ, АЧН и АЧР) с уровнем достигнутой значимости р<0.1 (таблица 2). Поиск оптимальной точки разделения АЧН для категориального анализа идентифицировал группу АЧН <0.1 х 10 /л с наиболее высоким риском смерти. Учитывая, что прогностическое значение АЧР реализуется в основном как предиктора ответа на ИСТ, был использован уровень 30 х 10 /л, идентифицированный в проспективном исследовании.

Таблица 2. Однофакторный и многофакторный анализ предикторов ОВ

Фактор Значение Однофакторный анализ Многофакторный анализ

ОР (95% ДИ) Р ОР (95% ДИ) Р

Степень тяжести НТАА 1.00 - -

ТАА 1.46 (0.56-3.78) 0.4358 - -

СТАА 2.38(0.91-6.13) 0.0759 - -

ПНГ клон Да 1 - 1 -

Нет 2.55(1.20-5.40) 0.0146 2.59(1.07-5.04) 0.0148

АЧН, х 10Ч/л 1.0 0.34 (0.10-1.12) 0.0875 - -

АЧН, х Ю9/л >0.1 1 - 1 -

<0.1 4.14(1.75-9.78) 0.0012 3.68(1.51-8.98) 0.0042

АЧР, х ю'/л 1.0 0.94 (0.90-0.98) 0.0013 - -

АЧР, х Ю9/л >30 1 - 1 -

<30 6.01 (1.43-25.30) 0.0157 4.37(1.02-18.79) 0.0477

Пол, возраст, гаплотип НЬА-01Ш1*15, интервал до начала ИСТ достоверно не влияли на ОВ. В связи с меньшей частотой НТАА у детей, для более точной оценки влияния возраста был проведен анализ только ТАА и СТАА, который также не выявил различий выживаемости больных до 18 лет и старше. Вероятность 10-летней ОВ составила 75.2% (95% ДИ, 62.4-88.0) у больных до 18 лет (п=66) против 81.6 (95% ДИ, 72.4-90.7) в старшей группе (п=93) (р=0.7095). Выявленная в проспективном исследовании тенденция к более высокой ОВ ПНГ+ больных была подтверждена во всей когорте как на ранних сроках (89.59%, 95% ДИ, 83.12-96.06 против 78.92%, 95% ДИ, 69.47-88.38 в течение 5 лет), так и при длительном наблюдении (87.68%, 95% ДИ, 80.35-95.02 против 68.09%, 95% ДИ, 51.75-84.43 в течение 10 лет) (рисунок ЗА).

годы годы

Рисунок 3. ОВ в зависимости от ПНГ статуса (А) и АЧР (Б)

Также подтверждено прогностическое значение АЧР (рисунок ЗБ). При этом у 2-х больных в ретроспективной группе, погибших в поздние сроки в связи с развитием МДС исходный уровень АЧР не был документирован, и эти больные не были включены в анализ.

Вторым базовым показателем гемограммы, дискриминирующим вероятностную ОВ, является АЧН < 0.1 х 10ч/л (рисунок 4А). В когорте СТАА (п=65) выделены подгруппы с 0.1 < АЧН < 0.2 х 109/л (п=42) и АЧН < 0.1 * Ю'/л (п=23) с резко различающимся прогнозом. Пятилетняя ОВ составила 91.21% (95% ДИ, 81.37-100.0) и 59.39% (38.76-80.03) (р=0.0020) (рисунок 4Б).

0.1 S АЧН < 0.2 (n=42)

10 12 14 15 1Э юды

Рисунок 4. ОВ всех больных в зависимости от АЧН во всей группе (А) и при СТАЛ (Б)

В многофакторном анализе независимое негативное значение подтвердили АЧН < 0.1 х 109/л, АЧР < 30 х 109/л и ПНГ- статус, а степень тяжести утратила значение. Очевидно, что значение ПНГ и АЧР реализуется за счет вероятности развития ответа на ИСТ, тогда как крайне низкий уровень нейтрофилов повышает риск ранней летальности. Учитывая близкие величины ОР, выделены 4 группы риска на основе суммы неблагоприятных факторов (таблица 3). Данный этап исследования был выполнен у 211 больных с полными данными первичного обследования (исключены 36 больных с неизвестным первичным статусом ПНГ и/или АЧР).

Таблица 3. ОВ больных в группах риска

Группа риска Число N ОВ, % (95% ДИ)

факторов 1 год 5 лет 10 лет

Низкий 0 46 97.78 (93.47-100.0) 97.78 (93.47-100.0) 97.78 (93.47-100.0)

Промежуточный - 1 1 90 95.45 (91.09-99.81) 88.6 (80.87-96.38) 86.17 (77.25-95.08)

Промежуточный - 2 2 66 90.81 (83.81-97.82) 82.33 (72.11-92.55) 70.69 (52.96-88.41)

Высокий 3 9 41.67 (7.78-75.56) - -

годы

На рисунке 5 представлены кривые вероятностной ОВ в группах риска.

Данная модель на основе трех базисных показателей позволяет сбалансировать прогноз ОВ, включая оценку риска ранней летальности и летальности у больных с отсутствием ответа на ИСТ. Низкая ОВ в группе высокого риска требует изменения тактики в пользу ранней аллогенной ТКМ.

Рисунок 5. ОВ больных в группах риска

Рецидивы АА

Частота и предикторы рецидива АА изучены у 184 больных, достигших как минимум ЧО. Согласно использованным критериям рецидив был диагностирован у 23 больных (12.5%). Медиана времени от начала ИСТ и от достижения гематологического ответа до момента диагностики рецидива составили 30.7 (15.2-105.3) и 23.0 (10.2-101.9) месяцев соответственно. Кумулятивная частота рецидивов по всей группе составила 14.73% (95% ДИ, 9.62-22.55) и 21.84% (95% ДИ, 14.36-33.21) в течение 5 и 10 лет соответственно (рисунок 6).

1,0

ГО 1- 0,8

О

и

3" «: 0,6

X

«а; 0,4

2

0,2

0,0

Рецидивы

5 лет: 14.7% (95% ДИ, 9.6-22.6) 10 лет: 21.8% (95% ДИ, 14.4-33.2%)

0 2 4 6 8 10 12 14 16

годы

Рисунок 6. Кумулятивная частота рецидивов (п=184)

При анализе факторов риска были выявлены следующие тенденции. Более часто рецидивы развивались у женщин: 30.1% (95% ДИ, 18.5^9.2) против 14.2% (95% ДИ, 6.7-30.5) у мужчин в течение 10 лет (р=0.0775). Другим фактором явился диагноз НТАА: 33.7% (95% ДИ, 19.1-59.3) против 14.7% (95% ДИ, 8.6-25.1) при ТАА и СТАА (р=0.1438) (рисунок 7).

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

Менщииы (п=92)

'

Мужчины (п=92)

Р=0.0775

1,0

г 0,8-

0 лз

т 0,6

в:

т

1 0,4

СС

с; >-

г

0,2 0,0

НТАА (п=бЗ)

■ ТАД/СТАА (п=115)

Р=0.1438

0 2 4 6 8 10 12 14 16 О 2 4 6 8 10 12 14 16

ГОДЫ ГОДЫ

Рисунок 7. Кумулятивная частота рецидивов: пол пациентов (А) и степень тяжести АА (Б)

Ключевой базовой характеристикой, связанной с риском рецидива, оказалось отсутствие клона ИНГ. Кумулятивная частота рецидивов составила 19.0% (95% ДИ, 9.5-38.0) и 36.8% (95% ДИ, 20.0-67.7) в течение 5 и 10 лет соответственно при отсутствии клона ПНГ. В противоположность, при наличии клона ПНГ кумулятивная частота рецидива достигала плато в 8.8% (95% ДИ, 4.3-17.9) после 3 лет (р=0.0194). В отношении другого маркера

иммунопатофизиологии АА - гаплотипа ЖА-ОИВ 1*15 получены противоположные данные. Кумулятивная частота рецидивов оказалась достоверно выше у больных с наличием данного маркера: 25.1% (95% ДИ, 12.6-49.9) в течение 5 и 10 лет против 7.1% (95% ДИ, 1.8-27.8) в оппозитной группе (р=0.0301) (рисунок 8).

1,0

г 0,8

0 т

1 0,6

па х ш

£ 0,4 >-

£

г о.г 0,0

ПНГ- (п=52)

ПНГ+ (п=111)

Р-0.0194

1,0

ГО 0,8

&

и

X 0,6

сс

I

г 0,4

>•

0,2

0,0

Н1А-ОРВ1*15+ (п-42)

Н1А-РЙВ1*15- (п—50)

Р=0.0301

2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16

годы годы

Рисунок 8. Кумулятивная частота рецидивов в зависимости от наличия/отсутствия клона ПНГ (А) и гаплотипа НЬА-Б11В1*15 (Б)

Отдельно проанализирована потенциальная связь развития рецидива с качеством достигнутого ответа и отменой ЦсА. Предполагалось более частое развитие рецидивов при достижении только ЧО. Однако рецидивы развились у 12 из 104 (11.5%) и у 11 из 80 (13.75%) больных с ЧО и ПО соответственно (р~0.6602). Анализ кумулятивной частоты также не выявил различий (24.6% (95% ДИ, 13.9-43.6) против 18.2% (95% ДИ, 10.6-31.5)) в течение 10 лет (р=0.8346). К моменту диагностики рецидива или даты цензурирования терапия ЦсА продолжалась у 97 (53%) и была завершена у 87 больных (47%), среди которых рецидивы развились у 10 (10.3%) и 13 (14.9%) соответственно (р=0.8242). При этом кумулятивная частота в течение 10 лет составила 20.9% (95% ДИ, 11.2-38.8) и 19.7% (95% ДИ, 11.6-33.4) при продолжении терапии и отмене ЦсА соответственно (р=0.3007). Следовательно, риск развития рецидива прямо не зависит от качества предшествующего ответа и отмены ИСТ.

Отдельно была проанализирована группа больных (п=87) с отменой терапии ЦсА, медиана продолжительности которой составила 38 месяцев. В 9 из 13 случаев рецидивы произошли при продолжительности терапии ЦсА менее 38 месяцев, и только 4 — при продолжительности более 38 месяцев. При этом 10-летняя кумулятивная частота рецидивов составила 28.2% (95% ДИ, 15.4-51.9) в сравнении с 10.2% (95% ДИ, 4.0-26) (р=0.0902).

В завершении анализа факторов риска рецидива АА был проведен многофакторный анализ, в который были включены следующие базовые предикторы: женский пол, НТАА, отсутствие клона ПНГ. Гаплотип НЬЛ-ОЯВ 1*15 не анализировался в многофакторной модели, поскольку данные тестирования имелись только у 92 больных (50% анализируемой когорты). Также не была включена в анализ длительность терапии ЦсА, поскольку этот фактор не относился к определяемым на момент диагностики АА и охватывал лишь 47% больных.

В результате единственным независимым предиктором рецидива оказалась НТАА (ОР 2.92, 98% ДИ, 1.09-7.81, р=0.0329). Отсутствие клона ПНГ сохраняло свое прогностическое значение, однако достигнутый уровень значимости был пограничным (ОР 2.34, 95% ДИ, 0.886.26, р=0.0893). Пол пациентов достоверно не влиял на риск рецидива (таблица 4).

Таблица 4. Однофакторный и многофакторный анализ предикторов рецидива АА

Фактор Значение Однофакторный анализ Многофакторный анализ

ОР (95% ДИ) Р ОР (95% ДИ) Р

Пол Мужской 1 1

Женский 2.19(0.93-5.16) 0.0743 1.93 (0.71-5.25) 0.1950

Степень тяжести ТАА/СТАА 1.00 - 1 -

НТАА 2.33(1.03-5.32) 0.0429 2.92(1.09-7.81) 0.0329

ПНГ клон Да 1 - 1 -

Нет 2.86(1.09-7.52) 0.0332 2.34 (0.88-6.26) 0.0893

Во всех 23 случаях рецидива проводилась ИСТ и вторая ремиссия была индуцирована у 19 из 22 (86.4%) оцененных больных, в том числе в 9 (40.9%) случаях был достигнут ПО. Ответ на ИСТ не достигнут у 3-х больных (НТАА 2, ТАА 1), из которых один пациент погиб от осложнений цитопении, два живы и получают поддерживающее лечение. В дальнейшем 5 из 19 (26%) ответивших больных развили повторные рецидивы и все вновь ответили на 3 - 4-й курс АТГ и ЦсА. К моменту проведения анализа живы и находятся в ремиссии 19 больных (82.6%), живы вне ремиссии 2, выбыл из-под наблюдения 1 и погиб 1 пациент.

Таким образом, кумулятивная частота рецидивов в течение 10 лет составляет 21.8% с повышением до 33.7% при НТАА и до 36.8% при ПНГ- статусе. Среди факторов, связанных с лечением, может рассматриваться продолжительность терапии ЦсА менее 38 месяцев. Противорецидивная ИСТ с включением АТГ и ЦсА эффективна у большинства больных, что позволяет оценить прогноз при развитии рецидива как относительно благоприятный.

Клепальная эволюция АА

Диагноз МДС/ОМЛ был установлен у 11 больных (4.5%) с кумулятивной частотой 3.3% (95% ДИ, 1.5-7.4) и 7.9% (95% ДИ, 3.7-17.0) в течение 5 и 10 лет соответственно (рисунок 9А).

1,0

га Ё

ё ■у

а:

га 0,6

к 0,4

2

V 0,2

0,0

МДС/ОМЛ

5 лет: 3.3% (95% ДИ, 1.5-7.4) 10 лет: 7.9% (95% ДИ, 3.7-17.0)

1,0

ГО 7

й 0,6

х

т

I 0,4 0,2 0,0

НТАА ((1=83) Р=0.0140 }

ТАА/СТАА (п=159)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16

годы годы

Рисунок 9. Кумулятивная частота МДС/ОМЛ: все больные (А), степень тяжести АА (Б)

Медиана возраста пациентов на момент диагноза МДС/ОМЛ составляла 20 (4-37) лет. Интервал между установлением диагноза АА и МДС/ОМЛ варьировал от 17 до 190 месяцев, медиана 44 месяца. Отмечено превалирование мужчин (64%) и первичного диагноза НТАА (73%). На момент установления диагноза АА клон ПНГ выявлялся у 3 из 9 обследованных больных (33%), морфологические признаки миелодисплазии не выявлялись ни у одного из

больных. Исходный кариотип был нормальным в 7 и неизвестен в 4 случаях. Все больные получали ИСТ (АТГ+ЦсА - 9, ЦсА в монорежиме - 2) с достижением 40 в 7 случаях (64%). ПО не документирован ни у одного из ответивших больных. В 4-х случаях МДС был диагностирован на фоне отсутствия гематологического ответа на ИСТ. Диагноз МДС был установлен у 7 больных (РЦМД - 3, РАИБ-1 - 2, РАИБ-2 - 2), ОМЛ - у 3 больных. В одном случае у больной с 7-летним анамнезом хронической НТАА развился хронический миеломоноцитарный лейкоз (через 9 лет от начала ИСТ). Доминирующей аномалией кариотипа была моносомия 7 (в 7 из 10 обследованных случаев).

Анализ потенциальных факторов риска развития МДС/ОМЛ выявил значение диагноза НТАА. В когорте 88 больных с НТАА документировано 8 случаев развития МДС/ОМЛ (9.09%, 95% ДИ, 3.08-15.10) в сравнении с 3 случаями среди 159 больных с ТАА и СТАА (1.90%, 95% ДИ, 0-4.0%) (р=0.0189). В результате кумулятивная частота МДС/ОМЛ составила 17.23% (7.4939.67) и 2.54% (95% ДИ, 0.82-7.87) в течение 10 лет соответственно (р=0.014) (рисунок 9Б).

Аллогенная ТКМ проведена в 9 случаях, том числе повторная (п=3) и с предшествующей гипометилирующей терапией (п=4). Два пациента получали химиотерапию и погибли без достижения ремиссии. Живы и находятся в ремиссии 3 пациента. Вероятностная ОВ в течение 2 лет составила 34.1% (95% ДИ, 4.8-63.4). Таким образом, несмотря на использование у современных методов терапии прогноз при развитии МДС/ОМЛ остается неблагоприятным.

Цитогеиетические аномалии без критериальных признаков МДС

Исключая случаи МДС и ОМЛ среди 189 больных с наличием как минимум одного цитогенетического исследования (1-9) мы наблюдали 13 больных (6.9%) с транзиторными или стойкими аномалиями кариотипа без критериальных морфологических признаков МДС при многократных исследованиях костного мозга. В 4-х случаях данные аномалии выявлены при первом тестировании, в 7 случаях - на этапах лечения и наблюдения. Чаще встречались трисомия 8 (п=5) и интерстициальная делеция длинного плеча 13 хромосомы (п=2), остальные по одному случаю - интерстициальная делеция длинного плеча 9 хромосомы, дупликация длинного плеча 1 хромосомы, трисомия 6, -У, дополнительный материал на 20 хромосоме и делеция длинного плеча X, реципрокная транслокация (1;3) и (14;15). В 6 (46%) случаях аномалии кариотипа были транзиторными и не выявлялись при последнем тестировании. У 10 (77%) больных одновременно выявлялся клон ПНГ. В 10 (77%) случаях имелся ответ на ИСТ, в том числе ПО - в 6 случаях. Не ответили на ИСТ 3 пациента с трисомия 8 (п=2) и с дупликацией длинного плеча 1 хромосомы. На момент анализа живы 12 больных (92%). Погиб больной с транзиторной трисомией 8 и отсутствием ответа на ИСТ без прогрессии в МДС/ОМЛ. При медиане наблюдения 67 (15-164) месяцев от диагностики АА и 23 (14-66) месяца от выявления аномалии кариотипа ни в одном из случаев не произошла трансформация в МДС и ОМЛ.

Таким образом, данная группа кардинально отличается от описанной выше с развернутой картиной МДС или ОМЛ, как по спектру цитогенетических аномалий (отсутствие моносомии 7, транзиторный характер в 46% случаев), так и по ряду клинических особенностей (отсутствие превалирования НТАА, частое выявление клона ПНГ, хороший прогноз ответа на ИСТ и выживаемости). Гипердиагностика МДС в подобных ситуациях может приводить к неоправданной терапии (деметилирующие агенты, ТКМ от альтернативного донора).

Бессобытийная выживаемость (БСВ)

В завершении анализа долгосрочной эффективности ИСТ проведено исследование БСВ (свободной от неудач лечения: смерть, отсутствие ответа на ИСТ, рецидив, гемолитическая

ПНГ, МДС/ОМЛ). Цензурированные случаи соответствуют живым пациентам с первым 40 или ПО на ИСТ, без признаков гемолитической ПНГ и МДС/ОМЛ. Среди 247 больных одна или несколько неудач лечения зарегистрированы у 114 больных (46%) с медианой времени наступления 2.1 года (0.4-10.4). В результате вероятностная БСВ составила 50.4% (95% ДИ, 4357.7) и 31.8% (95% ДИ, 22-41.6) в течение 5 и 10 лет соответственно (рисунок 10А).

годы годы

Рисунок 10. БСВ всех больных (А) и в зависимости от тяжести АА (Б)

Частота неудач лечения достоверно не зависела от степени тяжести АА: 42 из 88 (48%), 46 из 94 (49%) и 26 из 65 (40%) при НТАА, ТАА и СТАА соответственно (р=0.5036). Но медиана времени до развития события оказалась в 1.5 раза больше при НТАА: 2.4 (0.5-10.4) года против 1.6 (0.04-7.7) года при ТАА и СТАА (р=0.0133), что означает превалирование ранних неудач при ТАА и СТАА, и, наоборот, поздних - при НТАА. Выявлена тенденция к более благоприятным отдаленным результатам ИСТ при СТАА с формированием плато БСВ в отличие от НТАА (рисунок 10Б). БСВ в течение 10 лет составила 48.6% (95% ДИ, 31.8-65.3), 36% (95% ДИ, 22.3-49.7) и 20.4% (95% ДИ, 2.8-29.8) при СТАА, ТАА и СТАА соответственно.

В проспективном исследовании было идентифицировано независимое значение наличие клона ПНГ для БСВ после комбинированной ИСТ АТГ+ЦсА (рисунок IIA).

годы Г0ДЫ

Рисунок 11. БСВ от ПНГ статуса в проспективном исследовании (А) и во всей когорте (Б)

Для оценки этого феномена при более длительном наблюдении был проведен анализ всей когорты с включением ретроспективных случаев, в том числе получавших монотерапию

ЦсА (рисунок 11 Б). Благоприятное значение наличия клона ПНГ сохраняется, однако различия между ПНГ+ и ПНГ- группами становится менее выраженными в связи с неудачами монотерапии ЦсА и развитием гемолитической ПНГ. Оценка других факторов включала наряду с ПНГ статусом, возраст, пол, показатели гемограммы, интервал дебют - ИСТ и диагноз - ИСТ, гаплотип НЬА-ОГШ1 * 15 и подтвердила независимое значение ПНГ статуса и АЧР (таблица 5).

Таблица 5. Анализ предикторов БСВ после комбинированной ИСТ

Фактор Значение Однофакторный анализ Многофакторный анализ

ОР (95% ДИ) Р ОР (95% ДИ) Р

ПНГ клон Да 1 - 1

Нет 2.27(1.40-3.69) 0.0009 2.28 (1.39-3.75) 0.0011

АЧР, х 109/л >30 1 - 1 -

<30 2.04(1.08-3.87) 0.0291 2.05 (1.01-4.17) 0.0466

Таким образом, результаты проспективного исследования о значении ПНГ-статуса и АЧР в отношении БСВ подтверждены на всей когорте. При стратификации согласно индексу ПНГ/АЧРЗО в проспективном исследовании пятилетняя БСВ составила 65.2% (95% ДИ, 34.895.5), 58.9% (95% ДИ, 43.9-73.9) и 27.1% (95% ДИ, 10.5^3.8) при значениях индекса 2, 1 и 0 баллов соответственно (р = 0.0005).

Сравнение двух дозовых режимов лошадиного АТГ в первой линии ИСТ

Учитывая необходимость унифицирования протоколов ИСТ, был проведен ретроспективный анализ эффективности двух дозовых режимов лошадиного АТГ (АТГАМ). Первый курс АТГАМа в дозе 40 мг/кг х 4 дня (АТГАМ 160) был проведен у 74 больных (48%), в дозе 20 мг/кг х 5 дней (АТГАМ 100) - у 81 больного (52%). Анализируемые группы были сопоставимы по возрасту, полу, степени тяжести АА, базовым гематологическим показателями, частоте выявления клона ПНГ и генотипа НЬА-ОЯВ1*15, интервалом до начала ИСТ.

Переносимость курсов АТГ не зависела от дозового режима. Реакция на введение АТГ в виде лихорадки, ознобов и кожной сыпи развилась у 61 (75%) больных в группе АТГАМ 100 и 58 (78%) - в группе АТГАМ160 (р=0.7058). Проявления сывороточной болезни отмечались у 81 (52%), в т.ч. у 45 (56%) в группе АТГАМЮО и 36 (49%) в группе АТГАМ 160 (р=0.4236).

ЧО на первый курс АТГ и ЦсА к 6 месяцам документирован у 92 больных (59%) в целом по всей группе больных, получавший АТГАМ. При этом частота достижения ЧО была достоверно выше в группе АТГАМ 160: 69% (95% ДИ, 58-79) против 51% (95% ДИ, 40-61) в группе АТГАМЮО (р=0.023).

Кумулятивная частота ЧО оказалась выше в группе АТГАМ 160 на всех точках оценки эффективности (+3, +6, +12 месяцев) (рисунок 12).

месяцы

Рисунок 12. Кумулятивная частота ЧО у больных в группах АТГАМ160 и АТГАМЮО

В результате потребность во второй линии терапии оказалась достоверно выше в группе АТГАМ100 (п=38; 47%) по сравнению с группой АТГАМ160 (п=17, 23%) (р=0.0024), включая повторный курс АТГ (31% против 18%; р=0.063) и аллогенную ТКМ (16% против 5%; р=0.041).

При анализе поздних неудач ИСТ выявлена тенденция к повышению кумулятивной частоты рецидивов у больных в группе АТГАМЮО 18.79% (95% ДИ, 9.89-35.7) по сравнению с группой АТГАМ160 10.31% (95% ДИ, 3.97-26.77) (р=0.2721). Кумулятивная частота МДС/ОМЛ и гемолитической ПНГ достоверно не различалась в сравниваемых группах.

На момент проведения анализа живы 133 больных (85.8%), включая 66 (89.2%) из группы АТГАМ160 и 67 (82.7%) из группы АТГАМЮО. Погибли 22 пациента (14.2%), включая 8 (10.8%) из группы АТГАМ160 и 14 (17.3%) из группы АТГАМЮО. Медиана периода наблюдения 133 живых больных составила 54 месяца (7-182). Вероятность ОВ в течение 5 и 10 лет в целом по всей группе больных составила 84.3% (95% ДИ, 77.72-90.89) и 82.8% (95% ДИ 75.74-89.90). Преимущество в частоте достижения ответа определило отчетливую тенденцию к более высокой ОВ больных, получивших терапию АТГАМом в дозе 160 мг/кг (рисунок 13А).

А

1,0

0,8

Л

н о 0,6

S

<и

га со 0,4

i

ш 0,2

0.0

АТГАМ160

АТГАМЮО

Р=0.3954

Б

1,0

5 0,6

о 2 flí

S 0,4

s £

ш 0,2 0,0

АТГАМ160

Р=0.0282

0 2 4 6 8 10 12 14 16 ГОДЫ

Рисунок 13. Вероятностная ОВ (А) и БСВ (Б) больных в группах АТГАМ160 и АТГАМЮО

0 2 4 6 8 10 12 14 16

годы

Вероятность ОВ в течение 5 и 10 лег составила 89.69% (95% ДИ, 82.36-97.01) и 86.36% (95% ДИ, 76.85-95.88) в сравнении с 82.94% (95% ДИ, 73.97-91.91) и 80.57% (95% ДИ, 70.7390.41) в группе АТГАМЮО (р=0.395).

К моменту проведения анализа живы и находятся в ремиссии заболевания без рецидивов и признаков клональной трансформации 89 больных (57.42%). Неудачи лечения развились у 66 больных (АТГАМ160 - 23, АТГАМЮО - 43). В целом вероятностная БСВ составила 52.08% (95% ДИ, 42.75-61.40) в течение 5 лет и 35.46% (95% ДИ, 20.77-50.14) в течение 10 лет. Выявлено отчетливое преимущество режима 160 мг/кг - БСВ в течение 5 и 10 лет 64.62% (95% ДИ, 51.23-78.00) и 52.87 (95% ДИ, 36.22-69.52) против 43.18% (95% ДИ, 30.95-55.41) и 32.63% (95% ДИ, 15.21-50.04) в группе АТГАМЮО (р=0.0282) (рисунок 13Б).

Таким образом, дозовый режим лошадиного АТГ АТГАМ 40 мг/кг х 4 дня в сравнении с 20 мг/кг х 5 дней в рамках комбинированной ИСТ первой линии при АА при идентичной переносимости обеспечивает более высокую частоту достижения гематологического ответа и БСВ, снижает потребность во второй линии ИСТ и ТКМ. Это позволяет рекомендовать данный режим в качестве текущего стандарта первой линии ИСТ.

Нетяжелая апластическая анемия

Низкая частота ПО, повышенный риск рецидивов и клональной трансформации, и как следствие низкая БСВ, сделали актуальным специальный анализ когорты НТАА (п=88).

Учитывая существенные различия в продолжительности болезни до начала ИСТ, были выделены вновь диагностированная (п=50, 57%) и хроническая форма НТАА (п=38, 43%). Критерием хронической формы явилось документированная цитопения без прогрессии в ТАА более 3 месяцев до начала ИСТ. В группу вновь диагностированной НТАА отнесены пациенты с отсутствием длительной непрогрессирующей цитопении, а также больные с прогрессией в ТАА до ИСТ. Особенностями хронической НТАА являлись превалирование пациентов женского пола (68%) и тенденция к относительно редкому выявлению клона ПНГ (45%). При анализе базовых гемограмм отмечен более высокий уровень гемоглобина и тромбоцитов при отсутствии различий в уровне АЧР, лейкоцитов, АЧН и АЧЛ. Закономерным является в 5 раз более продолжительный интервал от выявления цитопении до начала ИСТ.

Эффективность ИСТ первично оценена в группах пациентов, получавших в первой линии монотерапию ЦсА (п=47) и комбинированную ИСТ АТГ + ЦсА (п=41). Группа монотерапии ЦсА в ретроспективной фазе формировалась вследствие первичной тактики в гематологическом отделении по месту жительства. Случаев ранней летальности не отмечалось. Ответ на комбинированную ИСТ был в 1.5 раза выше по сравнению с монотерапией ЦсА (76% против 49%, р=0.015). При этом медиана периода достижения ЧО в группе монотерапии ЦсА и комбинированной ИСТ составила 6.6 (1.4-55) и 3.0 (1.6-10) месяцев соответственно (р=0.0002), продолжительность трансфузионной зависимости - 121 и 56 дней соответственно (р=0.045). Вследствие эффективности 2-3 линии ИСТ с включением АТГ общая частота достижения ЧО достоверно не различалась в сравниваемых группах (72% и 85% соответственно, р=0.1949).

Дальнейший анализ проводился в группе комбинированной ИСТ. ЧО после первого курса АТГ получен у 38 из 59 больных (64%), среди которых было достоверно меньше больных с хронической НТАА (24%) в сравнении с группой без ответа на ИСТ (52%) (р=0.0433), что объясняет короткий интервал от момента диагностики до курса АТГ (79 против 231 дня). Исключение из анализа больных с предшествующей монотерапией ЦсА подтвердило меньший удельный вес (16% против 50%, р=0.0446) хронической НТАА среди отвечающих больных. Вторая группа предикторов ответа на ИСТ является общей для всех больных (клон ПНГ, АЧР). Наибольшее значение имел индекс ПНГ/АЧР30 с диапазоном кумулятивной частоты ответа через 6 месяцев от 25% (индекс 0) до 87.5% (индекс 2). Многофакторный анализ подтвердил независимое значение хронического течения НТАА и индекса ПНГ/АЧРЗО при пограничном значении предшествующей монотерапии ЦсА (таблица 6).

Таблица 6. Многофакторный анализ предикторов ЧО на комбинированную ИСТ при НТАА

Показатель Значение ОШ (95% ДИ) Р

Индекс ПНГАЧР30 1/0 3.67 (0.56-24.31) 0.17800

2/0 16.71 (2.13-130.91) 0.00734

Хроническая НТАА Нет/Да 6.61 (1.25-35.02) 0.02640

Предшествующая монотерапия ЦсА Нет/Да 4.59 (0.94-22.42) 0.05923

Таким образом, при НТАА в дополнении к охарактеризованным в проспективной фазе предикторам (наличие клона ПНГ и АЧР>30), продемонстрировано независимое негативное

влияние хронического течения и предшествующей монотерапии ЦсА на вероятность достижения гематологического ответа на комбинированную ИСТ.

Важной особенностью НТАА является более редкое по сравнению с ТАА/СТАА достижение ПО (20/69 ответивших больных, 28.9%). Удельный вес достижения ПО оказался значительно выше при комбинированной ИСТ в первой линии по сравнению с монотерапией ЦсА (40% против 13%, р=0.031), тогда как у больных, получавших АТГ после неудачи монотерапии ЦсА занимал промежуточное значение (27%), что очевидно отражает эффект селекции наиболее чувствительных к ИСТ пациентов на этапе монотерапии ЦсА.

Среди больных, ответивших на первый курс АТГ критерии ПО были достигнуты у 15 из 29 (52%) с вновь диагностированной НТАА и только у 1 из 9 (11%) больных с хронической формой (р=0.0525). Кумулятивная частота ПО в течение 36 месяцев после первой и второй линии комбинированной ИСТ составила 14.3% (95% ДИ, 3.64-55.9) и 42.7% (95% ДИ, 28.160.3%) у больных с хронической и вновь диагностированной формой НТАА (р=0.0247).

Вероятность достижения ПО, как и ЧО, коррелировала с наличием клона ПНГ и АЧР. Кумулятивная частота ПО в течение 36 месяцев у больных, стратифицированных по индексу ПНГ/АЧР30, составила 11.1% (95% ДИ, 1.8-70.5), 30.9% (95% ДИ, 13.4-71.5) и 61.1% (95% ДИ, 40.2-92.7) в группах больных со значением индекса 0, 1 и 2 соответственно (р=0.0032).

В отличие от ЧО вероятность достижения ПО также зависела от пола пациентов. После первого курса АТГ ПО был достигнут у 12 из 31 (39%) мужчин и только у 4 из 28 женщин (14%) (р=0.0439). Частично это объясняется большей пропорцией женщин в группе хронической НТАА. Однако, анализ, проведенный только при вновь диагностированной НТАА, подтвердил эту тенденцию (мужчины 11 из 22 (50%), женщины 4 из 17(24%), р=0.1112).

При проведении многофакторного анализа вновь, как и для прогнозирования ЧО, имели независимое значение характер течения НТАА и индекс ПНГ/АЧР30. Таким образом, низкая частота достижения ПО у больных НТАА, связана с хроническим течением заболевания до начала комбинированной ИСТ. При анализе больных только с вновь диагностированной НТАА качество ответа сравнимо с таковым при ТАА и СТАА. В продолжение изучения эффективности ИСТ при НТАА был проведен анализ частоты и потенциальных предикторов рецидивов и клональной трансформации.

1,0

«3 £ 0,8

0 то

^ 0,6 (О

1

ш

3 0.4 ее

|о,2 0,0

Рецидивы

5 лет: 14.04% (95% ДИ, 6.99-28.19) Юлет: 33.65% (95% ДИ, 19.1-59.3%)

у

6 8 ГОДЫ

10 12 14

1,0

<п

| 0,8 -I

о го

к 0,6

П) X

со

^ 0,4 тс

5 0,2-

0,0

Хроническая

/

ГВновь

диагностированная

Р=0.0033

6 8 10 годы

12 14

Рисунок 14. Кумулятивная частота рецидивов при НТАА: все пациенты (А), в зависимости от течения (Б)

Оценка частоты рецидивов была проведена у 69 больных НТАА, достигших как минимум ЧО после ИСТ 1-3 линии. В общей сложности при использовании строгих критериев рецидивы были диагностированы у 11 больных (15.94%, 95% ДИ 7.3-24.58). Медиана времени от начала ИСТ до развития рецидива и продолжительности первого ответа составили 30.4 месяца (15-104, МКР 22-62) и 21.2 месяца (10-101, МКР 11-54). Кумулятивная частота развития рецидива составила 14.04% (95% ДИ, 6.99-28.19) и 33.65% (95% ДИ, 19.1-59.3%) в течение 5 и 10 лет соответственно (рисунок 14А).

Анализ предикторов развития рецидивов выявил доминирующее значение хронического течения НТАА, которое имело место в 8 из 11 случаев. Кумулятивная частота рецидивов при хронической НТАА более чем в 5 раз превышала таковую при вновь диагностированной форме 34.23% (95% ДИ, 16.66-70.31) против 6.05% (95% ДИ, 1.53-23.87) в течение 5 лет (рисунок 14Б).

В качестве других потенциальных предикторов развития рецидива рассматривались пол пациента, наличие клона ПНГ, протокол ИСТ на фоне которой был индуцирован ответ (монотерапия ЦсА против комбинированной ИСТ АТГ+ЦсА), лучший ремиссионный статус до рецидива (ПО против ЧО). Ни один из них не показал статистически достоверной значимости при оценке кумулятивной частоты рецидивов, и в многофакторном анализе единственным фактором риска рецидива осталось хронического течение НТАА (ОШ 7.59, 95% ДИ, 1.59-36.14, р=0.0109). Следовательно, в качестве ключевого и единственного фактора риска развития рецидива идентифицировано хроническое течение НТАА, которое как указывалось выше, более характерно для пациентов женского пола.

Еще одной потенциальной составляющей высокой частоты поздних неудач лечения при НТАА является трансформация в МДС/ОМЛ. Кумулятивная частота развития МДС/ОМЛ составила 4.97% (95% ДИ, 1.6-15.41) и 17.23% (7.49-39.67) через 5 и 10 лет от установления диагноза НТАА соответственно, и, вследствие 2-х еще более поздних случаев, достигла 29.59% (95% ДИ, 15.2-57.74) к 12 годам наблюдения. Характер течения НТАА не влиял на частоту развития МДС/ОМЛ. В группах вновь диагностированной и хронической НТАА было диагностировано 4 (8%, 95% ДИ, 0.48-15.52) и 4 (10.52%, 95% ДИ, 0.77-10.27) случая соответственно (р=0.7219). Кумулятивная частота МДС/ОМЛ к 10 годам наблюдения составила 16.45% (95% ДИ, 5.66-47.82) и 16.35% (95% ДИ, 5.05-69.9) (р=1.0). В связи с небольшим количеством событий детальное рассмотрение остальных потенциальных факторов риска развития МДС/ОМЛ проведено в общей когорте больных.

Прогрессия сПНГ в гемолитическую форму диагностирована у 6 больных с НТАА, в 2-х случаях имеется тяжелое течение ПНГ с наличием осложнений хронического гемолиза. Кроме этого у 3-х больных проявления гемолитической ПНГ имелись на момент диагностики НТАА, в том числе в 1 случае с тромботическими осложнениями.

К моменту проведения анализа живы 78 (88.6%) больных с медианой наблюдения от начала ИСТ 45 месяца (3.5-202), погибли - 10, в том числе 4 - с вновь диагностированной и 6 - с хронической НТАА. Причинами смерти стали осложнения цитопении (п=3), трансформация в МДС/ОМЛ и осложнения ТКМ (п=6) и солидная опухоль (п=1). В результате вероятность 5- и 10-летней ОВ составила 91.8% (95% ДИ, 84.4-99.2) и 83.3% (95% ДИ, 69.8-96.9) соответственно без отчетливого плато кривой вследствие поздних смертей (рисунок 15А). ОВ достоверно не различается в группах вновь и диагностированной и хронической, что частично связано с эффективностью второй линии ИСТ и поддерживающего лечения в группе неответивших на ИСТ больных с хронической НТАА (рисунок 15Б).

Общая выживаемость 5 лет: 92% (95% ДИ, 84-99) 10 лет: 83% (96% ДИ, 70-97)

2 4 6 8 10 12 14 18 18

ГОДЫ

1,0

0,8

| 0.6

0,4

0,2 0,0

Р=0.6738

8 10 12 14 16 18 ГОДЫ

Рисунок 15. OB при НТАА: все пациенты (А), в зависимости от течения (Б)

Стратификация по группам риска согласно индексу ПНГ/АЧР30 выявила тенденцию к лучшей выживаемости у больных с наличием клона ПНГ и высоким ретикулоцитарным ответом. Важно отметить, что ни один из 26 пациентов с наличием клона ПНГ и АЧР>30 не погиб в течение периода наблюдения, включая 7 больных с наблюдением более 5 лет.

Низкий ответ на ИСТ в группе хронической НТАА, рецидивов и клональной трансформации обуславливают отсутствие плато кривой БСВ. Вероятность 5- и 10-летней БСВ по всей группе составила 51.0% (95% ДИ, 37.9-64.2) и 20.4% (6.1-34.7) соответственно (рисунок 16А). Среди базовых характеристик и лабораторных показателей (пол, возраст, АЧН, АЧР, A4JI, ПНГ статус) и первичной ИСТ (монотерапия ЦсА против АТГ+ЦсА) не было выявлено предикторов БСВ. Также стратификация больных по индексу ПНГ/АЧРЗО не выявила достоверных различий между группами, что очевидно связано с большим вкладом поздних неудач лечения (рецидивы, клональная трансформация) по сравнению с отсутствием ответа.

Одновременно с этим, существенные различия в частоте достижения ответа на ИСТ, рецидивов между больными с вновь диагностированной и хронической НТАА интегрально отразились в вероятности БСВ (рисунок 16Б).

Бессобытийная выживаемость 5 лет: 51% (95% ДИ, 38-64) 10 лет: 20% (95% ДИ, 6-35)

Вновь

диагностированная

Хроническая

годы

Рисунок 16. БСВ при НТАА: все пациенты (А),

0 2 4 6 8 годы

I зависимости от течения (Б)

10 12 14

Вероятность 5- и 10-летней БСВ составила соответственно 62.9% (95% ДИ, 44.6-81.1) и 30.3% (95% ДИ, 6.9-53.7) при вновь диагностированной в сравнении с 33.8% (95% ДИ, 16.0-

Вновь

диагностированная

Хроническая

51.5) и 11.6% (95% ДИ, 0-25.9) при хронической НТАА (р=0.0018). Следует подчеркнуть, что использование комбинированной ИСТ в первой не изменяет данную закономерность: 68.3% (95% ДИ, 46.0-90.7) против 20.0% (95% ДИ, 0-52.6) в течение 5 лет (р=0.0070).

Таким образом, хроническое течение является главным негативным фактором низкой БСВ при НТАА, в первую очередь за счет низкой частоты достижения гематологического ответа и высокой вероятности рецидива. В связи с тем, что два этих негативных исхода при НТАА незначительно повышают риск смерти, различия в ОВ между группами вновь диагностированной и хронической НТАА отсутствуют.

Иммунофенотнпическая характеристика лимфоцитов костного мозга в динамике ИСТ

Несмотря на длительное изучение иммунопатогенеза АА оценка активности иммуноопосредованного подавления кроветворения в клинической практике остается неразработанной. В связи с длительным периодом включения больных и ключевой задачей динамического наблюдения была выбрана надежно воспроизводимая методика тестирования субпопуляционного состава лимфоцитов КМ с коэкспрессией активационного маркера молекулы НЬЛ-БЯ на СБ4+ и СБ8+ лимфоцитах.

Исследование у 55 первичных пациентов с АА выявило увеличение количества СОЗ+ Т-лимфоцитов в 1.5 раза (62% против 42%, р<0.0001) и почти 2-х кратное повышение СБ8+ субпопуляции (33% против 18%, р<0.0001) по сравнению с данными здоровых доноров (п=25). Уровень активированных СП8+НЬА-ОЯ+ лимфоцитов в 2.9 раза превышал донорский показатель (4.62% против 1.61%, р<0.0001). Повышение уровня СЭ4+ клеток оказалось не столь значительным, а уровень СВ4+НЬА-ВЯ+ лимфоцитов достоверно не отличался от контроля. Специфичность выявленных изменений субпопуляционного состава лимфоцитов КМ подтверждена при сравнении со второй контрольной группой, состоящей из пациентов с монолинейными иммунными цитопениями (АИГА, ИТП) и СКВ (п=14), которые также были обследованы в активной фазе заболевания до начала ИСТ. Эта группа пациентов не характеризовалась признаками экспансии и активации Т-лимфоцитов.

Достоверных различий фенотипа лимфоцитов КМ в группах НТАА (п=16), ТАА (п=23) и СТАА (п=16) не выявлено. В каждой из этих групп обнаруживались пациенты с выраженной Т-клеточной экспансией и активацией в КМ. Однако, наиболее высокие уровни СОЗ+, СБ8+ и С08+НЬА-0К+ лимфоцитов выявлялись при СТАА, в том числе при постгепатитной форме, что вероятно связано с коротким периодом заболевания до момента тестирования. При анализе в группе НТАА, которая характеризовалась наиболее значительными индивидуальными различиями продолжительности заболевания до момента первичного тестирования, прослеживается умеренно выраженная отрицательная связь данного периода и уровня СРЗ+ (Л= -0,6568, р=0,0057) и СБ8+ лимфоцитов (Я=-0,5287, р=0,0352). Следовательно, отсутствие признаков Т-клеточной экспансии и активации, по крайней мере, у части пациентов с НТАА, можно объяснить длительностью иммунопатологического процесса.

Таким образом, исследование, проведенное в репрезентативной группе первичных больных АА, свидетельствует в пользу избирательного накопления в КМ преимущественно СШ+ Т-лимфоцитов клеток с фенотипическими признаками их активации, что косвенно отражает поликлональную экспансию аутореактивных Т-лимфоцитов. Эти данные позволили проводить в дальнейшем анализ в различных подгруппах пациентов и при длительном наблюдении, используя уровни СЭЗ+, СБ8+ и С08+ПЬА-0Я+ лимфоцитов в качестве суррогатных маркеров активности иммунопатологического процесса при АА.

Следующим этапом работы была оценка динамики маркеров Т-клеточной пролиферации и активации у пациентов получающих различные варианты ИСТ, а также в зависимости от наличия или отсутствия ответа на лечение. В анализ включены данные 49 больных, у которых были получены результаты не менее 3-х последовательных тестирований (медиана 7, 3-14).

О 3 0 мес О 3 6 мес

ЦсА (р-0.779) АТГ+ЦсА(р<0,001)

0 3 6 мес 0 3 6 мес

ЦсА (р=0,б27) АТГ+ЦсА(рО,СЮ1)

О 3 6 мес ЦсА(р=0.165)

О 3 бмк АТГ»ЦсА(р-=0,001)

Рисунок 17. Динамика субпопуляций лимфоцитов КМ на фоне монотерапии ЦсА (слева) и комбинированной ИСТ (справа). Медиана, квартили, критерий Фридмана.

На рисунке 17 показана динамика субпопуляций лимфоцитов КМ в течение первых 6 месяцев терапии у больных на монотерапии ЦсА (п=9) и комбинированной ИСТ (п=40). Монотерапия ЦсА в течение 6 месяцев в отличие от терапии АТГ не вызывает статистически значимых изменений лимфоцитарного пула КМ (оценка повторных измерений внутри групп). В частности, не отмечается деплеции Т-клеток КМ и активированных СИ8+ лимфоцитов. ЧО на монотерапии ЦсА был достигнут лишь у 3 из 9 больных. Следовательно, функциональная ингибиция Т-клеток ЦсА в отсутствии деплетирующего эффекта не обеспечивает эффективный контроль Т-клеточной активации и пролиферации, что обуславливает недостаточную клиническую эффективность ЦсА в монорежиме.

сэз* (%)

Рисунок 18. Динамика субпопуляций Т-лимфоцитов КМ у больных, отвечающих (сплошная линия) и не отвечающих (пунктирная линия) на 1 -й курс АТГ+ЦсА.

Сравнительная оценка динамики количества Т-клеток и активированных субпопуляций в КМ у пациентов, ответивших и неответивших на стандартную ИСТ первой линии с включением АТГ и ЦсА представлена на рисунке 18. Как минимум 40 на первый курс АТГ и ЦсА к 6 месяцу был достигнут у 60% (27 из 45) больных. Соответственно 18 больных (40%) не ответили на ИСТ. Статистически достоверных отличий иммунофенотипической характеристики лимфоцитов КМ до начала курса АТГ в сравниваемых группах не выявлялось. В связи с этим дальнейший анализ прогностического значения базовых фенотипических характеристик лимфоцитов КМ в отношении вероятности достижения гематологического ответа не проводился. Контрольное обследование, проведенное через 3 месяца курса АТГ, выявило деплецию Т-клеток, в том числе активированных С08+НЬА-ВЯ+ лимфоцитов, в обеих группах пациентов. Однако степень деплеции СБЗ+ и С08+ клеток оказалась значительно более выраженной у ответивших.

Еще более выраженные различия фенотипической характеристики лимфоцитов КМ выявлены через 6 месяцев после курса АТГ. У отвечающих на ИСТ пациентов наблюдалось дальнейшее снижение уровня Т-клеток и активированных субпопуляций, тогда как у рефрактерных больных отмечалось восстановление этих показателей до уровня, близкого к исходному. Столь быстрая динамика восстановления лимфоцитарного пула КМ у рефрактерных пациентов отражает индивидуальную чувствительность к комбинации АТГ + ЦсА и создает патогенетические обоснования для интенсификации ИСТ.

Длительное (в течение 60 месяцев) мониторирование активированных Т-лимфоцитов КМ было проведено у 15 больных АА, ответивших на комбинированную ИСТ. Курс АТГ приводит к глубокой деплеции Т-клеток, в том числе активированных С04+НЬА-0К+ и СВ8+Н1.А-ОК+ лимфоцитов. Однако к 12 месяцам после курса АТГ у подавляющего большинства больных, несмотря на сохранение гематологического ответа, вновь выявляется повышение количества активированных С08+, но не СБ4+ клеток, которое впрочем, не достигает исходных значений. При проспективном наблюдении и обследовании больных с сохранением ПО или ЧО через 1-2 года (+48 и +60 мес) после отмены терапии ЦсА обнаруживается новое снижение активированных Т-лимфоцитов КМ (рисунок 19).

До 3 6 12 24 36 48 60 мае

лечения

Рисунок 19. Динамика уровня активированных Т-клеток КМ после комбинированной ИСТ

Базовые иммунофенотипические характеристики лимфоцитов КМ не обладали прогностической значимостью в отношении частоты ЧО. Однако при анализе качества достигнутого ответа было выявлена отчетливая тенденция к более раннему достижению ПО у

больных с высоким базовым уровнем активированных С08+НЬД-0Я+ лимфоцитов КМ. В качестве точки разделения использовалась медиана этого показателя в данной когорте (4.58%). Кумулятивная частота достижения ПО в течение 36 месяцев после курса АТГ составила 47.5% (95% ДИ, 28.1 - 80.1) и 64.2% (95% ДИ, 43.6 - 94.6) в группах с уровнем СЭ8+НЬЛ-ОЯ+ лимфоцитов КМ меньше и больше медианы соответственно (р=0.189).

Таким образом, активная фаза АА вне зависимости от степени тяжести заболевания характеризуется повышением количества Т-клеток КМ с экспансией активированных популяций. Комбинированная ИСТ, в отличие от монотерапии ЦсА, приводит к быстрой деплеции общего количества Т-лимфоцитов и активированных популяций. При этом базовые фенотипические характеристики лимфоцитов КМ не отличаются у ответивших и неответивших на ИСТ больных, однако отсутствие ответа на первый курс АТГ+ЦсА сопряжено с менее глубокой деплецией и более быстрым восстановлением пула Т-клеток КМ.

Частота и прогностическое значение укорочения теломерных районов ДНК

Потенциальным фактором биологической гетерогенности АА и эффективности ИСТ является длина теломерных районов ДНК. Кроме конституциональной АА вследствие мутаций генов теломеразного комплекса понятие теломеропатии включает приобретенные нарушения, отражающие репликативный стресс в резидуальном кроветворении, что наряду с резким дефицитом СКК обуславливает истощение кроветворного резерва при АА.

Проведено одномоментное исследование длины теломер у 53 больных с АА различной степени тяжести и длительностью анамнеза с дальнейшей проспективной оценкой долгосрочных результатов и исходов ИСТ. С учетом распределения пациентов по степени тяжести АА, возрастному составу и фазе заболевания, данная выборочная когорта репрезентативно отражала всю группу наблюдаемых пациентов. На первом этапе проанализирована частота выявления укорочения теломер во всей группе и в подгруппах с НТАА, ТАА и СТАА. Критерием укорочения теломер стала длина теломер в гранулоцитах со значением менее нижнего 99% ДИ в группе здоровых доноров. Данный феномен был выявлен у 24 из 53 обследованных больных (45%) (рисунок 20).

Рисунок 20. Длина теломер в гранулоцитах у больных с АА различной степени тяжести в сравнении с данными здоровых доноров (п=71, штрихованные линии - границы 99% ДИ).

Проведено сравнение больных с короткими (ТК) и нормальными (ТН) теломерами с целью выявления клинических и лабораторных характеристик, ассоциированных с ТК. Медиана скорректированной по возрасту длины теломер составила -1.715 т.п.н. и -0.009 т.п.н. у больных с ТК и ТН соответственно (р<0.001). Данные подгруппы достоверно не различались по возрасту, полу, частоте выявления клона ПНГ, гаплотипа НЬА-011Ш*15 и показателям гемограммы на момент тестирования. Ключевыми отличиями подгруппы с ТК оказались большая пропорция больных с НТАА (42% против 17%, р=0.0485) и отсутствием ответа на ИСТ (21% против 0%, р=0.047%). Обратная зависимость частоты выявления укорочения теломер от степени тяжести АА подтверждена при анализе показателя ВеКаТЕЬ при анализе всей когорты больных. Скорректированный по возрасту показатель был наименьшим при НТАА (медиана значения -1.177 т.п.н.) по сравнению с ТАА (-0.5921 т.п.н.) и СТАА (0.027 т.п.н.) (р=0.0528).

Среди больных, обследованных до начала ИСТ (п=13), ТК определялись в 4 случаях (31%) (НТАА-3, СТАА-1). В противоположность среди 9 первичных больных с ТН диагноз НТАА, ТАА и СТАА имелся у 2 (22%), 4 (45%) и 3-х (33%) больных соответственно.

Для оценки потенциального значения длины теломер в отражении кроветворного резерва было проведено сравнение базовых гематологических показателей и данных первого гистологического исследования КМ. Имелась тенденция к более высокому уровню АЧР в группе ТН. Другие базовые гематологические показатели и площадь кроветворной ткани в трепанобиоптате также достоверно не различались.

Гипотетически эффективная ИСТ купирует пролиферативный стресс компартмента СКК, что в свою очередь должно стабилизировать длину теломер. Однако анализ больных, обследованных в период ремиссии (п=35) не подтвердил это предположение. В сравнении с первичными больными не выявлено уменьшение пропорции больных с феноменом укорочения теломер — 15 случаев (43%). Это указывает на сохранение тенденции к прогрессирующей утрате длины теломер на всех этапах лечения. В пользу этого свидетельствует более длительный интервал между началом ИСТ и проведением тестирования у больных с ТК (медиана, 1842 дня, 170-3585) по сравнению с больными с ТН (915 дней, 30-2261) (р=0.0152).

Ретроспективный анализ динамики ответа на ИСТ показал статистически достоверные различия периода достижения трансфузионной независимости и критериев ЧО с медианой с 163 и 92 дня в группе с ТК и ТН соответственно (р=0.036). Однако качество достигнутого ответа не отличалось у больных с ТК и ТН (идентичная пропорция ПО и отсутствие различий показателей гемограммы на момент тестирования длины теломер).

Во всех 5 случаях с отсутствием ответа на ИСТ выявлялось укорочения теломер. Более того, эта группа характеризовалась наиболее выраженной утратой длины теломер, демонстрируемой показателем ОекаТЕЬ (рисунок 21). В 4 из 5 случаев первично имела место НТАА с длительным периодом цитопении до момента проведения первого курса АТГ.

Рисунок 21. ВекаТЕЬ в гранулоцитах у больных с АА до лечения, с ЧО, ПО и отсутствием ответа (НО) на ИСТ

Данные проспективного наблюдения и исходов ИСТ имеются для 52 больных, включая 24 пациента с ТК и 28 больных с ТН. Среди 13 первичных больных ответили на лечение с достижением как минимум ЧО 9 больных (69%), включая 6 из 9 (67%) в группе с ТН и 3 из 4 (75%) в группе ТК (р=1.00). Также отсутствовали различия в частоте достижения ПО (3 в группе ТН и 1 в группе ТК, р=1.00). Это позволяет отвергнуть гипотезу о прогностическом значении длины теломер у первичных больных для достижения ответа на ИСТ.

Анализ частоты рецидивов АА был проведен у 45 больных, достигших как минимум ЧО до и после момента срезового исследования. В обеих группах зарегистрировано по 3 случая рецидива АА с 10 летней кумулятивной частотой 13.7% (95% ДИ, 4.7-39.8%) и 16.1% (95% ДИ, 5.7-45.5%) в группах с ТН и ТК соответственно (р=0.905).

Укорочение теломер в СКК рассматривается как фактор риска клональной эволюции АА. В этом контексте проанализирована кумулятивная частота МДС/ОМЛ и гемолитической ПНГ в наблюдаемой когорте с момента начала ИСТ (рисунок 22).

1.0

0.6

о.о

МДС/ОМЛ

ТН: 0%

ТК: 15.4% (95»/

ДИ, 5.3-44.3)

1,0

0,6

0,4

Р=0.063

Гемолитическая ПНГ

ТН: 19.9% (95% ДИ, 9.04-43.7)

ТК: 27.7% (95% ДИ, 11.3-68.1)

А

Р=0.532

8 10 12

10 12 14

пвды

годы

Рисунок 22. Кумулятивная частота МДС/ОМЛ (А) и гемолитической ПНГ (Б) у больных с ТК и ТН

Все 3 случая развития МДС/ОМЛ произошли в группе ТК. С учетом конкурирующих рисков (ТКМ и смерть до развития события) кумулятивная частота развития МДС/ОМЛ составила 15.4% (95% ДИ, 5.3-44.8%) в группе больных с ТК и 0% в группе с ТН (р=0.063).

Кроме этих случаев МДС/ОМЛ, при проспективном наблюдении было диагностировано 3 случая цитогенетических аномалий (ёе1(13)(я12ц14) и 1(1;3)(ч31;я26) у 2-х больных с ТК, а также трисомия 6 у одной больной с ТН) при сохранении ответа на ИСТ и отсутствия критериальной миелодисплазии при повторных исследованиях КМ.

В отличие от МДС/ОМЛ риск прогрессии сПНГ в гемолитическую форму оказался идентичным в сравниваемых группах. Кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ в течение 10 лет составила 19.9% (95% ДИ, 9.04-43.7%) и 27.7% (95% ДИ, 11.3-68.1%) в группах с ТН и ТК соответственно (р=0.532) (рисунок 22Б).

К моменту проведения анализа живы 46 больных с медианой наблюдения за данной когортой от момента начала ИСТ 84 месяца (18-152, МКР 55-113) и от момента тестирования длины теломер 61 мес (18-61, МКР 41-60). За этот период погибли 5 пациентов: 3 с ТК (осложнения цитопении - 1, МДС и осложнения ТКМ - 1, ОМЛ-М7 -1) и 2 с ТН (осложнения цитопении - 2). В результате вероятность 10-летней ОВ составила 92.6% (95% ДИ, 82.7-100) и 86.9% (95% ДИ, 73.06-100) в группах с ТН и ТК соответственно (р=0.571). Высокий уровень ОВ обусловлен очевидной селекцией ответивших на ИСТ больных (62% всей когорты) при

включении в ерезовое исследование. Тем не менее, прогрессирующее укорочение теломер на данном этапе наблюдения не ассоциировано с существенным снижением ОВ.

БСВ также достоверно не различалась в сравниваемых группах. Однако в связи с меньшим числом поздних неудач лечения имеется тренд к формированию плато у больных с ТН после 4-5 лет наблюдения, при продолжающихся неудачах лечения в группе больных с ТК. Вероятность 10-летней БСВ составила 57.5% (95% ДИ, 38.1-76.9) и 38.5% (95% ДИ, 15.8-61.1) в группах с ТН и ТК соответственно (р=0.510).

Таким образом, прогрессирующее укорочение теломер выявляется у 45% больных АА при срезовом обследовании когорты больных, находящихся на разных этапах лечения, и отражает состояние длительного стрессового кроветворения, в том числе до начала ИСТ при длительном анамнезе НТАА. Укорочение теломер ассоциировано с повышенным риском развития МДС/ОМЛ. Рефрактерная АА сопровождается выраженным укорочением теломер, что также отражает длительность подавления кроветворения, поскольку одновременно с этим, данный феномен не является самостоятельным прогностическим фактором ответа на ИСТ. Больные с ТК и ТН имеют одинаковый риск рецидива АА, прогрессии сПНГ в гемолитическую форму, а также вероятность длительной ОВ и БСВ.

Пароксизмальнан ночная гемоглобинурия

В анализ динамики клонов ПНГ были включены 85 больных с медианой числа тестирований клона ПНГ - 5 (3-12) и продолжительности наблюдения - 50 месяцев (6-156). Медиана размера клона в гранулоцитах составила 0.6% (0.01-67) и 0.53% (0-99.1) при первом и последнем измерениях соответственно (р-0.2459), что отражает не стабильность размера клона ПНГ у всех больных, а выраженную разнонаправленную динамику.

Уменьшение размера клона было обнаружено у 16 больных (19%), в том числе в 6 случаях (7%) имелось его исчезновение. В 5 из 6 указанных случаев исходный размер клона был менее 1%, и лишь в одном минимально превышал 1% (1.01%). Ни в одном из случаев с исходным размером клона более 10% не произошло его полное исчезновение при длительности динамического контроля до 12 лет. Медиана размера клона при последнем тестировании составила 0.3% (0-20.9%) при исходном 3.195% (0.02- 56.5) (р=0.0004). Таким образом, в среднем регресс размера клона составил 90%. Важной характеристикой этой группы является устойчивый ПО на ИСТ, продолжительность которого в 4 из 6 случаев превышает 5 лет.

В большинстве наблюдаемых случаев динамика клона ПНГ не соответствовала критериям его уменьшения или увеличения, и ситуация формально расценивалась как «стабильный» размер клона (п=49, 58%). Подавляющая часть больных (38 из 49, 78%) имела первичный размер клона ПНГ менее 1%, и он оставался в пределах 0.01-1% в течение всего периода наблюдения. Медиана размера клона при первом и последнем тестировании составила 0.19% (0.01-63.44%) и 0.22% (0.01- 54.0) соответственно (р=0.7266).

Критериальное увеличение размера клона ПНГ было документировано в 20 случаях (23%) с медианой размера клона при первом и последнем тестировании 4.16% (0.56-67.0%) и 41.3% (1.31- 99.1) соответственно (р=0.00009). В среднем имело место 10-кратное увеличение размера клона. За исключением 3-х случаев с устойчивым, но незначительным нарастанием клона, это сопровождалось повышением уровня ЛДГ более 1.5 ВГН, который в свою очередь был использован как критерий гемолитической ПНГ.

Сопоставление результатов всего массива измерений югона ПНГ (482) у 110 больных с соответствующим уровнем ЛДГ продемонстрировало прямую положительную корреляцию

размера клона ПНГ в гранулоцитах и уровня ЛДГ (г=0.630, р<0.0001). Как правило, повышение уровня ЛДГ более 1.5 ВГН обнаруживалось при размере клона более 10%. Оптимальный порог отсечения размера клона, связанный с выявления признаков гемолитической ПНГ, уточнен с помощью построения кривой операционной характеристики приемника. Данный анализ подтвердил высокую зависимость уровня ЛДГ 1.5 ВГН от размера клона ПНГ. Площадь под кривой (АиС) составила 0.97 (95% ДИ, 0.95; 0.98) (р<0.00001). Минимальное значение размера клона с уровнем чувствительности и специфичности выше 90% составило 10%.

Таким образом, диагноз гемолитической ПНГ устанавливался на основании устойчивого повышения уровня ЛДГ более 1.5 ВГН у больных с наличием клона ПНГ более 10% в

гранулоцитах. Согласно этим критериям гемолитическая ПНГ была констатирована у 32 больных (13%). Исключая 10 больных с одновременным установлением диагнозов гемолитической ПНГ и АА, кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ составила 10.08% (95% ДИ, 6.26-16.23%) и 18.30% (95% ДИ, 11.88-28.19) в течение 5 и 10 лет соответственно (рисунок 23).

Рисунок 23. Кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ

1,0

Ё 0,8 Н

0 га

; о,б

га

1 ш

Ё 0,4

о: &

! 0,2

Гемолитическая ПНГ

5 пег 10.08% (95% ДИ, 6.26-16.23) 10 лет: 18.30% (95% ДИ, 11.88-28.19)

8 10 12 14 16 18 годы

Первым этапом оценки факторов риска стала кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ при длительном наблюдении в зависимости от наличия или отсутствия клона ПНГ на момент установления диагноза АА.

Анализ был проведен в трех группах пациентов (рисунок 24):

1. Документированное отсутствие клона ПНГ в дебюте АА (п=87);

2. Первичный ПНГ статус не известен (п=31);

3. Документированное наличие клона ПНГ в дебюте АА (п=120)

1,0

га I 0,8

о

тт. 0,6

X

X 0,4

!.

2 0,2

0,0

Гемолитическая ПНГ (10 лет)

1 группа: 0%

2 группа: 20.30% (95% ДИ, 7.98-51.64)

3 группа: 29.16% (95% ДИ, 18.94-44.89)

1

8 10

годы

12 14 16 18

Рисунок 24. Кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ: значение наличия клона ПНГ на момент диагностики АА

Ни у одного из 87 больных из первой группы не произошло развитие гемолитической ПНГ, тогда как 18 из 120 больных третьей группы развили это осложнение с кумулятивной частотой 18.45% и 29.16% в течение 5 и 10 лет соответственно. В группе с неизвестным первичным ПНГ статусом кумулятивная частота занимала промежуточное значение (7.49% и 20.30%) вследствие априорного наличия в ней ПНГ+ и ПНГ- больных. Таким образом, во всех случаях гемолитической ПНГ клон присутствует с момента диагностики АА, что позволяет

отвергнуть самостоятельное значение ИСТ в развитии этого осложнения и делает актуальным идентификацию потенциальных факторах, приводящих к прогрессии сПНГ.

Анализ независимых факторов риска роста клона ИНГ с развитием критериальной гемолитической ИНГ был проведен в группе 120 больных с наличием клона ИНГ и уровнем ЛДГ менее 1.5 ВГН на момент диагностики АА в регрессионной модели Кокса. Распределение больных по полу, степени тяжести АА, первой линии ИСТ, маркеру НЬА-Б1Ш1*15, а также интервал диагноз — ИСТ и базовые показатели гемограммы достоверно не влияли на вероятность прогрессии ПНГ. Имелась тенденция к более частой прогрессии у больных старше 18 лет (16 из 18 случаев). Ключевыми характеристиками, отличавшими группу прогрессии ПНГ, явились больший исходный размер клона (3.15% против 0.51%, р=0.0006) и уровне ЛДГ: медиана индекса х ВГН 1.09 против 0.87 (р=0.0097). Оптимальный порог отсечения исходного уровня ЛДГ для развития в последующем гемолитической ПНГ составил 0.94 х ВГН (чувствительность 77%, специфичность 65%). Площадь под кривой составила 0.70 (95% ДИ,

0.52; 0.82) (р=0.0081).

В многофакторном анализе подтвердили значение только два предиктора: клон ПНГ в гранулоцитах >1% (ОР 5.33) и уровень ЛДГ > 0.94 ВГН (ОР 3.62). Кумулятивная частота гемолитической ПНГ при отсутствии или наличии одного предиктора не различалась и составила 11% в течение 10 лет. В противоположность сочетание исходного размера клона ПНГ >1% и уровня ЛДГ >0.94 ВГН обуславливает высокий риск развития гемолитической формы заболевания с кумулятивной частотой 61.82% в течение 10 лет.

Клиническая характеристика гемолитической ПНГ проведена в трех группах больных:

1. одновременное установление диагноза АА и гемолитической ПНГ (п=10); 2. прогрессия сПНГ в гемолитическую форму (п=22); 3. направленные на этапе сформировавшейся гемолитической ПНГ (п=27). Больные 2-й и особенно 3-й группы имели признаки более тяжелой ПНГ, включая максимальный размер клона и уровень ЛДГ и более высокую частоту тромбозов (26% против 5% и 0% во второй и первой группе соответственно, р-0.0366). Это отражает этапы прогрессии ПНГ с продолжительностью наблюдения с момента диагностики АА 49, 98 и 139 месяцев в 1-й, 2-й и 3-й группе соответственно.

Более полное представление о степени тяжести гемолитической ПНГ при АА дает сравнение с контрольной группой классической ПНГ (п=63). Больные с АА / ПНГ имели достоверно меньшие пиковые размер клона ПНГ и уровень ЛДГ и меньшую частоту тромбозов при анализе пропорций больных. Но в анализе кумулятивной частоты различие в вероятности тромбозов между больными с ААЛ1НГ и классической ПНГ достигало лишь пограничной достоверности (33% и 39% в течение 15 лет, р=0.0663).

Таким образом, при АА может наблюдаться разнонаправленная динамика размера клона ПНГ, включая уменьшение вплоть до полного исчезновения, стабильное состояние и устойчивый рост. Признаки гемолитической ПНГ с уровнем ЛДГ 1.5 ВГН проявляются при размере клона в гранулоцитах более 10%. Кумулятивная частота гемолитической ПНГ составляет 18.3% в течение 10 лет, и в качестве основного предиктора идентифицировано наличие клона ПНГ на момент диагностики АА. В качестве независимых предикторов прогрессии сПНГ в гемолитическую идентифицированы исходные размер клона > 1% и уровень ЛДГ > 0.94 ВГН. Гемолитическая ПНГ на фоне АА представляет собой спектр состояний, отличающихся по степени выраженности внутрисосудистого гемолиза с отчетливым нарастанием риска тромботических осложнений при длительном наблюдении.

Заключение

Рисунок 25 суммирует идентифицированные в исследовании ключевые клинические и биологические характеристики, влияющие на эффективность и исходы ИСТ при АА.

Рисунок 25. Клинические и биологические характеристики, определяющие эффективность и отдаленные исходы ИСТ при АА

Выявленные закономерности формирования ответа на ИСТ и клинической эволюции позволяют сформулировать оптимизированный алгоритм лечения АА при отсутствии родственного НЬА-совместимого донора (рисунок 26).

Идентификация предикторов ранней летальности и ответа на стандартную ИСТ определяет принципы и этапы риск-адаптированной стратегии, ключевой составляющей которой должна стать оценка баланса риска неудачи ИСТ и ТКМ от неродственного или родственного гаплоидентичного донора на всех этапах диагностики и лечения. Пациентам низкого риска показано проведение стандартной ИСТ 1-й и 2-й линии с рассмотрением ТКМ от неродственного донора в 3-й линии. При наличие 1 неблагоприятного предиктора также целесообразно проводить ИСТ 1-й и 2-й линии, однако поиск неродственного донора следует инициировать сразу после констатации отсутствия ответа на первый курс АТГ. Наличие более 1 неблагоприятного предиктора (промежуточный-2 и высокий риск) является показанием для начала поиска неродственного донора и оценки возможности гаплоидентичной ТКМ на момент диагностики АА и проведения ТКМ во 2-й линии терапии. У детей высокого риска при персистирующей нейтропении < 0.1x10% с тяжелыми инфекционными осложнениями, отсутствием ответа на стимуляцию Г-КСФ возникает необходимость рассмотрения экстренной ТКМ от гаплоидентичного донора (одного из родителей) в сроки до оценки эффективности ИСТ 1-й линии или вместо нее.

Продолжение ЦсА Мониторинг ответа

Риск-адаптарованная терапия 2-й линии

Поиск неродственного донора (<■ 40 лет) Оценка галлоидентичной ТКМ (< 20 лет)

4

Комбинированная ИСТ 2-й линии: АТГАМ 160 мг/кг/курс + ЦсА 5 мпкг/сут Оценка ответа через 3-4 месяца

Неродственная / гаплэ ТКМ во 2-й линии

Ответ (-)

т

Ответ (+Г) I Продолжение ЦсА у ! Мониторинг ответа

| Поиск неродственного донора (< 40 лег) | Оценка гаплоидентичной ТКМ (< 20 лет)

........1

Поддерживающее и экспериментальное лечение Неродственная / гапло ТКМ в 3-й линии

Рисунок 26. Алгоритм риск-адаптированного лечения пациентов с АА с отсутствием родственного НЬА-совместимого донора.

* - проведение ТКМ от гаплоидентичного донора может рассматриваться у детей со СТАА высокого риска (3 балла) до оценки эффективности ИСТ 1-й линии с тяжелыми инфекционными осложнениями

Выводы

1. ИСТ с включением АТГ и ЦеА является эффективным методом терапии приобретенных АА, обеспечивая достижение гематологического ответа у 74.5% больных и вероятность ОВ и БСВ в течение 10 лет 80.6% и 31.8% соответственно.

2. Частота ответа на ИСТ не зависит от степени тяжести АА, а ПО чаще достигается при СТАА и ТАА, чем при НТАА. Независимыми предикторами развития гематологического ответа являются наличие клона ПНГ и АЧР > 30хЮ9/л до начала лечения, позволяющие выделить три прогностические группы (0, 1, 2 предиктора) с кумулятивной частотой ответа на первую (36%, 69% и 85%) и вторую (0%, 33% и 71%) линию комбинированной ИСТ.

3. Значение степени тяжести АА для прогноза ОВ реализуется в краткосрочном периоде и нивелируется в отдаленные сроки вследствие поздних смертей при НТАА. Независимыми негативными предикторами ОВ являются уровень АЧН < 0.1 х 109/л, уровень АЧР < 30 х 109/л и отсутствие клона ПНГ, балансирующие прогноз ранней летальности и летальности при отсутствии ответа на ИСТ. Наличие всех негативных предикторов сопряжено с неблагоприятным прогнозом, что определяет необходимость ранней аллогенной ТКМ.

4. Рецидивы АА развиваются с кумулятивной частотой 21.8% в течение 10 лет. Факторами риска развития рецидива является диагноз НТАА и продолжительность терапии ЦсА менее 38 месяцев. Повторный ответ на противорецидивную ИСТ достигается у 86.4% больных.

5. Исход АА в МДС/ОМЛ развивается с кумулятивной 10-летней частотой 7.9% в общей группе и 17.2% при НТАА, имеет неблагоприятный прогноз с 34.1% вероятностью 2-летней ОВ, которая достигается только при проведении аллогенной ТКМ. Транзиторные или стойкие нарушения кариотипа за исключением аномалии 7 хромосомы без морфологических критериев МДС/ОМЛ наблюдаются у 6.9% больных, часто ассоциированы с наличием клона ПНГ (77%) и не влияют на вероятность достижения ответа на ИСТ и ОВ.

6. Дозовый режим лошадиного АТГ 160 мг/кг/курс превосходит таковой 100 мг/кг/курс в достижении ответа после первого курса (69% против 51%), потребности во второй-третьей линии терапии (23% против 47%) и БСВ (65% против 43% в течение 5 лет) и рекомендован в качестве стандартного.

7. Хроническое течение НТАА с отсрочкой курса АТГ ассоциировано с низкой частотой и качеством гематологического ответа, повышенным риском рецидива, низкой БСВ. Комбинированная ИСТ должна проводиться во всех случаях вновь диагностированной НТАА вне зависимости от выраженности цитопении и потребности в трансфузиях компонентов крови.

8. АА характеризуется экспансией Т-лимфоцитов и активированных СВ8+НЬА-ВЯ+ лимфоцитов в костном мозге, выраженность которой в дебюте заболевания не коррелирует со степенью тяжести заболевания и не влияет на вероятность развития гематологического ответа на ИСТ. Курс АТГ вызывает транзиторную деплецию Т-лимфоцитов с более быстрой реконституцией у больных, не достигших ответа на ИСТ.

9. Ускоренное укорочение теломер характерно для 45% больных в срезовом исследовании, чаще выявляется при длительном течение НТАА и у больных с отсутствием ответа на ИСТ. При проспективном наблюдении укорочение теломер не влияет на частоту

достижения ответа на ИСТ, рецидивов и выживаемость и является фактором риска развития МДС/ОМЛ.

10. Клоны ПНГ с медианой размера 0.6% в гранулоцитах выявляется у 59% первичных пациентов, в том числе 44% детей и 65% взрослых, вне зависимости от степени тяжести АА. Динамика размера клона ПНГ носит разнонаправленный характер с его уменьшением у 19%, стабильным размером у 58% и увеличением у 23% больных при длительном наблюдении.

11. Размер клона ПНГ более 10% в гранулоцитах ассоциирован с повышением уровня ЛДГ более 1.5 ВГН. Кумулятивная частота развития гемолитической ПНГ достигает 18.3% в течение 10 лет и зависит от размера клона и уровня ЛДГ в дебюте АА. Тромботические осложнения гемолитической ПНГ у больных АА развиваются с кумулятивной частотой 32.6% в течение 15 лет, близкой к таковой при классической ПНГ (39.3%).

Практические рекомендации

1. При планировании и проведении ИСТ у больных АА, не подлежащих аллогенной ТКМ в первой линии, должны учитываться прогностические факторы ответа и выживаемости для ранней идентификации пациентов из групп риска неудач лечения и проведения ТКМ от неродственного или гаплоидентичного родственного донора:

a. В группе низкого ответа на комбинированную ИСТ с АЧР < 30 х 10/л и отсутствием клона ПНГ показана ранняя инициация поиска неродственного донора и при отсутствии ответа на первый курс АТГ+ ЦсА проведение ТКМ во второй линии терапии, оптимально в течение 6 месяцев от момента установления диагноза АА.

b. При наличие одного или двух предикторов ответа на ИСТ (АЧР > 30 х 109/л, присутствие клона ПНГ) аллогенная ТКМ от неродственного донора показана в третьей линии терапии при отсутствии ответа на 2 курса АТГ и ЦсА, оптимально в течение 12 месяцев от момента установления диагноза АА.

c. В группе высокого риска ранней летальности и отсутствия ответа на ИСТ (АЧН < 0.1 х Ю9/л, уровень АЧР < 30 х 10% и отсутствие клона ПНГ) необходимо инициировать поиск неродственного донора на момент постановки диагноза АА или рассматривать возможность ранней гаплоидентичной ТКМ.

2. Дозовый режим лошадиного АТГ (АТГАМ) 160 мг/кг/курс превосходит по эффективности режим 100 мг/кг/курс и должен использоваться в первой и второй линии комбинированной ИСТ.

3. В случаях НТАА вне зависимости от выраженности цитопении и трансфузионного статуса рекомендуется раннее назначение комбинированной ИСТ без использования тактики наблюдения и неинтенсивной ИСТ (монотерапии ЦсА).

4. Тестирование длины теломер показано при подозрении на конституциональную АА в дебюте заболевания и при отсутствии ответа на ИСТ, а также для выявления и целевого мониторирования группы высокого риска клональной эволюции АА в МДС/ОМЛ.

5. При оценке риска развития гемолитической ПНГ целесообразно учитывать исходный размер клона >1% и уровень ЛДГ > 0.94 ВГН. При наличии данных предикторов рекомендовано целевое мониторирование с контролем размера клона ПНГ и маркеров внутрисосудистого гемолиза каждые 6 месяцев, в остальных случаях - каждые 12 месяцев.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кулагин, АД. Экспрессия GPI-связанных белков на клетках крови у больных с гемобластозами после химиотерапии / А.Д. Кулагин, И.В. Крючкова, С.А. Саломатина, И.Б. Ковынев, А.В. Гилевич, И.А. Лисуков // Гематология и трансфузиология. - 1998. - Т.43, №5. - С.17-19.

2. Лисуков, И.А. Клинический случай пароксизмальной ночной гемоглобинурии с ответом на терапию циклоспорином А / И.А. Лисуков, И.В. Крючкова, А.Д. Кулагин, А.В. Гилевич // Гематология и трансфузиология. - 1999. - №3. - С.41-42.

3. Kulagin, A. Impaired expression of GPI-linked proteins on blood cells in patients with lymphomas after dose-intensive chemotherapy and BMT / A. Kulagin, I. Kruchkova, S. Salomatina, V. Kozhevnikov, I. Lisukov // Bone marrow transplantation. - 1999. - Vol. 23, Suppl.l. - P.128.

4. Кулагин, А.Д. Взаимосвязь нарушений гемопоэза и иммунных дефектов у больных злокачественными лимфомами с тяжелой цитостатической предлеченностью / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, С.В. Киселев, Л.В. Сахно, П.Н. Филимонов, Е.В. Булгакова, В.В. Денисова, И.В. Крючкова, С.А. Сизикова, А.В. Гилевич, Е.Р. Черных, В.А. Козлов // Гематология и трансфузиология. - 2001. - Т.46, №6. - С.6-10.

5. Kulagin, A.D. Expansion of activated CD8+ T-cells in bone marrow (BM) of the lymphoma patients after high dose chemotherapy (HDC) and ABMT: a possible role of myelosuppression / A.D. Kulagin, I.A. Lisukov, S.V. Kiselev, I.V. Kruchkova, S.A. Sizikova, A.V. Gilevich, H.R. Chernykh, V.A. Kozlov // Bone marrow transplantation. - 2001. - Vol. 27, Suppl.l. - P.222.

6. Сизикова, С.А. Высокодозная иммуносупрессивная терапия с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток при аутоиммунных заболеваниях / И.А. Лисуков, А.Д. Кулагин, И.В. Крючкова, А.В. Гилевич, Е.Р. Черных, О.Ю. Леплина, Л.П. Коненкова, Е.В. Зонова, B.C. Ширинский, Т.Н. Сентякова, А.А. Демин, В.А. Козлов // Терапевтический архив. - 2002. - №7. - С. 22-26.

7. Кулагин, А.Д. Современные методы лечения миелодиспластических состояний. Часть I / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.А. Козлов // Гематология и трансфузиология. - 2003. - Т.48, №3. - С.41-46.

8. Кулагин, А.Д. Современные методы лечения миелодиспластических состояний. Часть II / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.А. Козлов // Гематология и трансфузиология. - 2003. - Т.48, №4. - С.32-39.

9. Лисуков, И.А. Иммунопатогенез и современная иммунотерапия приобретенной апластической анемии / И.А. Лисуков И.А., А.Д. Кулагин, И.В. Крючкова //Иммунотерапия аллергических, аутоиммунных и других заболеваний. Методическое руководство / Под ред. акад. РАМН, проф. В.А.Козлова. - Новосибирск: Агро-Сибирь, 2004. - С. 112-116.

10. Lisukov, I.A. High-dose immunosuppression with autologous stem cell transplantation in severe refractory systemic lupus erythematosus / I.A. Lisukov, S.A. Sizikova, A.D. Kulagin, I.V. Kruchkova, A.V. Gilevich, L.P. Konenkova, E.V. Zonova, E.R. Chernykh, T.N. Sentyakova, A.A. Demin, V.A. Kozlov // Lupus. - 2004. - Vol. 13. - P. 89-94.

П.Кулагин, АД. Диагностика и лечение приобретенной апластической анемии / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, И.В. Крючкова, С.А. Сизикова, А.В. Гилевич, В.В. Денисова, П.Н. Филимонов, Е.В. Меняева, Н.В. Пронкнна, B.C. Кожевников, Е.Р. Черных, В.А. Козлов // Терапевтический архив. - 2006. - Т.78, № 11. - С. 48-54.

12. Kulagin, A.D. Cell cycle state of hematopoietic progenitors cells and bone marrow lymphocyte phenotype in patients with acquired aplastic anemia / A.D. Kulagin, N.V. Pronkina, I.V.

Kruchkova, S.A. Sizikova, V.V. Denisova, A.V. Gilevich, V.S. Kozhevnikov, I.A. Lisukov, V.A. Kozlov // Haematologica / The hematology Journal. - 2006. - Vol.91, Suppl.l - P. 455.

13. Денисова, B.B. Цитокинсинтезирующая активность эритрокариоцитов костного мозга и ее регуляция в норме / В.В. Денисова, А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, И.В. Крючкова, С.А. Сизикова, C.B. Сенников, В.А. Козлов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т.143, №2. - С. 179-182.

14. Risitano, A.M. Subcutaneous alemtuzumab is a safe and effective treatment for global and single-lineage immune mediated marrow failures: A survey from the EBMT-WPSAA / A.M. Risitano, E. Seneca, L. Marando, B. Serio, C. Selleri, G. Scalia, L. Del Vecchio, A. Iori, A. Kulagin, S. Maury, J. Halter, V. Gupta, A. Bacigalupo, G. Socie, A. Tichelli, J. Marsh, H. Shrezenmeier, J.R. Passweg,

B. Rotoli // Blood. - 2008. - Vol. 112, №11. - P. 381-382.

15. Kulagin, A. Severe pancytopenia associated with minor paroxysmal nocturnal haemoglobinuria clone and response to ciclosporin A in a heavily pretreated multiple myeloma patient / A. Kulagin, I. Lisukov, V. Denisova, I. Kruchkova, S. Sizikova, A. Gilevich, N. Pronkina, V. Kozhevnikov, V. Kozlov // British journal of haematology. - 2008. - Vol. 141, №. 1. - P. 122-123.

16. Kulagin, A. Immunosuppressive treatment of acquired aplastic anemia: A single-center study of 45 patients / A. Kulagin, I. Lisukov, I. Kruchkova, V. Sergeevicheva, S. Sizikova, A. Gilevich, V. Kozhevnikov, V. Kozlov // Bone marrow transplantation. - 2008. - Vol. 41, Suppl.l. - P.436.

17. Лисуков, И.А. Высокодозная иммуносупрессивная терапия с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток в лечении тяжелых аутоиммунных заболеваний / И.А. Лисуков, А.Д. Кулагин, В.В. Сергеевичева, С.А. Сизикова, И.В. Крючкова, А.В. Гилевич,

C.Э. Сизиков // Клеточные технологии: Теоретические и прикладные аспекты: сб. науч. тр. / Под ред. В.А. Козлова, C.B. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина. - Новосибирск: Наука, 2009.-С. 155-170.

18. Kulagin, A. A pilot study of anti-interleukin-2 receptor antibody daclizumab combined with cyclosporine as salvage immunosuppressive therapy for refractory or relapsed aplastic anemia / A. Kulagin, I. Lisukov, I. Kruchkova, V. Sergeevicheva, A. Gilevich, S. Sizikova, O. Korolkova, V. Kozhevnikov, V. Kozlov // Bone maiTow transplantation. - 2009. - Vol. 43, Suppl.l. -P.271.

19. Kulagin, A.D. The severity of acquired aplastic anemia (AA) and long-term prognosis: lessons from current results of immunosuppressive treatment (1ST) / A.D. Kulagin, I.A. Lisukov, V.I. Borisov, I.V. Kruchkova, V.V. Sergeevicheva, S.A. Sizikova, A.V. Gilevich, V.S. Kozhevnikov, V.A. Kozlov // Cellular therapy and transplantation (CTT). - 2009. - Vol.2, №5. - P.74.

20. Кулагин, А.Д. Поликлональный кроличий антитимоцитарный глобулин тимоглобулин: иммуномодулирующие эффекты и новые аспекты клинического использования / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, И.А. Милосердое, Б.В. Афанасьев // Терапевтический архив. - 2010. - Т.82, №7. - С. 65-72.

21. Шевела, Е.Я. Апластическая анемия: фенотип и функции мезенхимальных клеток костного мозга / ЕЛ. Шевела, А.Д. Кулагин, М.А. Тихонова, Л.В. Сахно, И.В. Крючкова, И.А. Орловская, А.А. Останин, Е.Р. Черных // Гематология и трансфузиология.- 2010. - №6. - С. 14-21.

22. Шевела, Е.Я. Цитокин-секреторная автивность мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных апластической анемией / Е.Я. Шевела, А.Д. Кулагин, А.А. Останин, Е.Р. Черных // Цитокины и воспаление. - 2010. - Т.9, №3. - С.79.

23. Королькова, О.Ю. Экспрессия теломеразы в интактных и стимулированных лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях / О.Ю. Королькова, Т.Я.

Абрамова, А.Д. Кулагин, В.М. Непомнящих, А.Э. Сизиков, B.C. Кожевников, В.А. Козлов // Российский иммунологический журнал. - 2010. - Т.4, № 2. - С. 145-154

24. Kulagin, A. Biological characteristics influencing long-term outcomes in patients with acquired aplastic anaemia after immunosuppressive treatment / A. Kulagin, I. Lisukov, V. Borisov, N. Pronkina, I. Kruchkova, V. Sergeevicheva, A. Gilevich, V. Kozhevnikov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. - 2010. - Vol. 45, Suppl.2. - P. 168.

25. Kulagin, A.D. Bone marrow transplantation and immunosuppressive therapy for acquired aplastic anemia: A 15-year two-center experience / A.D. Kulagin, A.A. Ganapiev, I.K. Golubovskaya, I.V. Kruchkova, N.V. Stancheva, S.N. Bondarenko, V.V. Vavilov, I.A. Lisukov, B.V. Afanasyev // Cellular therapy and transplantation (CTT). - 2010. - Vol.3, №9. - P.74.

26. Golubovskaya I.K. Myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia (MDS/AML) in long-term survivors of aplastic anemia / I.K. Golubovskaya, A.A. Ganapiev, A.D. Kulagin, S.N. Bondarenko, N.V. Stancheva, V.V. Vavilov, I.A. Lisukov, B.V. Afanasyev // Cellular therapy and transplantation (CTT). - 2010. - Vol.3, №3. - P.44.

27. Risitano, A.M. Alemtuzumab is safe and effective as immunosuppressive treatment for aplastic anaemia and single-lineage marrow failure: a pilot study and a survey from the EBMT WPSAA / A.M. Risitano, C. Selleri, B. Serio, G.F. Torelli, A. Kulagin, S. Maury, J. Halter, V. Gupta, A. Bacigalupo, G. Socie, A. Tichelli, H. Shrezenmeier, J. Marsh, J. Passweg, B. Rotoli // British journal of haematology. - 2010. - Vol. 148, №5. - P. 791-796.

28. Kulagin, A. Prognostic value of minor PNH clones in aplastic anaemia patients treated with ATG-based immunosuppression: results of a two-centre prospective study / A. Kulagin, I. Golubovskaya, A. Ganapiev, E. Babenko, A. Sipol, N. Pronkina, I. Kruchkova, S. Bondarenko, N. Stancheva, V. Vavilov, I. Lisukov, V.A. Kozlov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. -2011. - Vol. 46, Suppl.l. - P. 83-84.

29. Kulagin, A. Long-term outcomes after immunosuppressive treatment for moderate aplastic anemia / A. Kulagin, I. Golubovskaya, I. Kruchkova, S. Bondarenko, N. Stancheva, I. Lisukov, B. Afanasyev // Haematologica. - 2011. - Vol. 96, Suppl.2. - P. 351.

30. Golubovskaya I.K. Hematopoietic stem cell transplantation from alternative donors for patients with Fanconi anemia and Diamond-Blackfan anemia: A single center experience / I.K. Golubovskaya, A.D. Kulagin, N.V. Stancheva, E.V. Semenova, S.N. Bondarenko, A.A. Alyanskiy, E.V. Babenko, L.S. Zubarovskaya, B.V. Afanasyev // Cellular therapy and transplantation (CTT). - 2011. - Vol.3, №12. - P.45.

31. Кулагин, А.Д. Факторы прогноза долгосрочной эффективности иммуносупрессивной терапии при апластической анемии / А.Д. Кулагин, И.К. Голубовская, М.О. Иванова, Т.А. Рудакова, Е.С. Борзенкова, Е.С. Павлюченко, А.А. Сипол, Е.В. Бабенко, Т.Д. Гиндина, В.М. Кравцова, Е.М. Харланова, С.Н. Бондаренко, Н.В. Станчева, В.Н. Вавилов, И.В. Крючкова, Н.В. Пронкина, И.А. Лисуков, В.А. Козлов, Б.В. Афанасьев // Гематология и трансфузиология. -2012. -Т.57, №3. - С. 11-12.

32. Михайлова, Е.А. Эффективность комбинированной иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией по данным многоцентрового исследования Национального гематологического общества (2005-2011 гг.) / Е.А. Михайлова, А.Д. Кулагин, Т.С. Капорская, Н.А. Вопилина, Т.С. Тикунова, В.В. Войцеховский, М.А. Плоских, А.В. Коробкин, А.Д. Мозес, Т.В. Чагорова, Т.С. Константинова, В.А. Лапин, В.Г. Савченко // Гематология и трансфузиология. - 2012. - Т.57, №3. - С.14-15.

33. Лисуков, И.А. Лечение пароксизмальной ночной гемоглобинурии / И.А. Лисуков, А.Д. Кулагин, Б.В. Афанасьев // Онкогематология. - 2012. - №3. - С. 49-54.

34. Kulagin, A. Second-line ATG-based immunosuppression for refractory aplastic anemia: predictive factors of response and long-term results / A. Kulagin, I. Golubovskaya, T. Rudakova, A. Sipol, E. Babenko, T. Gindina, N. Pronkina, I. Kruchkova, S. Bondarenko, M. Ivanova, V. Vavilov, N. Stancheva, I. Lisukov, V. Kozlov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. - 2012. - Vol.

47, Suppl.l. - P. 222-223.

35. Sergeevicheva, V. Rapid recovery from chronic PRCA by MSC infusion in patient after major ABO-mismatched alloSCT / V. Sergeevicheva, I. Kruchkova, E. Chernykh, E. Shevela, A. Kulagin, A. Gilevich, I. Lisukov, D. Sergeevichev, V. Kozlov // Case reports in medicine. - 2012. - Article ID 862721, doi: 10.1155/2012/862721

36. Kulagin, A. The horse ATG (ATGAM) total dose of 160 mg/kg as compared with 100 mg/kg is superior in achieving haematological response in aplastic anaemia patients / A. Kulagin, M. Ivanova, I. Golubovskaya, E. Babenko, I. Kruchkova, N. Pronkina, S. Bondarenko, V. Vavilov, N. Stancheva, I. Lisukov, V. Kozlov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. - 2013. - Vol.

48, Suppl.2. - P. 43.

37. Lisukov, I. Overview of Russian PNH registry / I. Lisukov, A. Kulagin, A. Maschan, E. Shilova, K. Abdulkadyrov, A. Zaritskiy, V. Ivanova, Y. Bogdanova, S. Volkova, A. Gavrilenko, T. Kaporskaya, S. Meresiy, T. Schneider, S. Yakupova, L. Anchukova, B. Bakirov, N. Kosacheva, T. Krinitsina, V. Ustyantseva, Y. Shatokhin, A. Rumyantsev, B. Afanasyev // Haematologica. - 2013. -Vol.98, Suppl.l.-P. 581.

38. Kulagin, A. Preceding chronic course and watch and wait practice for moderate aplastic anemia (MAA) are associated with low response rate and poor long-term outcome after immunosuppressive therapy (1ST) / A. Kulagin, I. Lisukov, M. Ivanova, I. Golubovskaya, I. Kruchkova, S. Bondarenko, V. Vavilov, N. Stancheva, E. Babenko, N. Pronkina, V. Kozlov, B. Afanasyev // Blood. - 2013. - Vol. 122, №21. - P. 1232.

39. Lisukov, I. Data from russian cohort of the international disease registry for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH) / I. Lisukov, A. Kulagin, A. Maschan, E. Shilova, K. Abdulkadyrov, A. Zaritskiy, V. Ivanova, Y. Bogdanova, S. Volkova, A. Gavrilenko, T.S. Kaporskaya, S. Meresiy, T. Schneider, S. Yakupova, L. Anchukova, B. Bakirov, N. Kosacheva, T. Krinitsina, V. Ustyantseva, Y. Shatokhin, A. Rumyantsev, B. Afanasyev // Blood. - 2013. - Vol.122, №21. - P. 4866.

40. Babenko, E. Observational study of PNH clone size by high sensitivity flow cytometry in high-risk patients in a large Russian population / E. Babenko, A. Sipol, V. Borisov, E. Naumova, E. Boyakova, D. Yakunin, T. Glazanova, Z. Chubukina, N. Pronkina, A. Popov, L. Saveliev, E. Partylova, L. Vlasova, I. Mustafin, B. Ramazanov, I. Galtseva, Z. Fidarova, S. Lugovskaya, I. Lisukov, A. Kulagin // Blood. - 2013. - Vol. 122, №21. - P. 4867.

41. Кулагин, А.Д. Частота и прогностическое значение укорочения теломерных участков ДНК при апластической анемии / А.Д. Кулагин, В.И. Борисов, Н.В. Пронкина, И.А. Лисуков, В.А. Козлов, Б.В. Афанасьев // Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т.59, №1. - С.20.

42. Голубовская, И.К. Недостаточность трансплантата при трансплантации аллогенного костного мозга у больных апластической анемией / И.К. Голубовская, Т.А. Рудакова, А.С. Боровкова, О.С. Успенская, Е.В. Бабенко, И.М. Бархатов, А.Л. Алянский, А.Д. Кулагин, Б.В. Афанасьев // Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т. 59, №1. - С. 40.

43. Kulagin, A. Incidence and risk factors for hemolytic paroxysmal nocturnal hemoglobinurea (PNH) in aplastic anemia patients / A. Kulagin, I. Golubovskaya, M. Ivanova, E. Babenko, N. Pronkina, I.

Kruchkova, I. Lisukov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. - 2014. - Vol. 49, Suppl.l. -P. 42-43.

44. Golubovskaya, I. Graft failure after allogeneic haemtopoietic stem cell transplantation for acquired aplastic anemia / I. Golubovskaya, A. Kulagin, T. Rudakova, K. Ekushov, O. Uspenskaya, S. Bondarenko, N. Stancheva, V. Vavilov, I. Kruchkova, V. Kozlov, B. Afanasyev // Bone marrow transplantation. - 2014. - Vol. 49, Suppl. 1. - P. 440.

45. Kulagin, A. Prognostic value of paroxysmal nocturnal haemoglobinurea clone presence in aplastic anaemia patients treated with combined immunosuppression: results of two-centre prospective study / A. Kulagin, I. Lisukov, M. Ivanova, I. Golubovskaya, I. Kruchkova, S. Bondarenko, V. Vavilov, N. Stancheva, E. Babenko, A.Sipol, N. Pronkina, V. Kozlov, B. Afanasyev // British journal of haematology. - 2014. - Vol. 164, №4. - P. 546-554.

46. Кулагин, А.Д. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению пароксизмальной ночной гемоглобинурии / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.В. Птушкин, Е.Р. Шилова, Н.В. Цветаева, Е.А. Михайлова // Онкогематология. - 2014. - №2. - С. 20-28.

47. Kulagin, A. Long-Term Outcomes of Accelerated Telomere Shortening in Acquired Aplastic Anemia / A. Kulagin, V. Borisov, N. Pronkina, I. Kruchkova, I. Lisukov, B. Afanasyev // Blood. — 2014. — Vol. 124, №21. — P. 4396.

48. Sipol, A.A. An inter-laboratory comparison of PNH clone detection by high-sensitivity flow cytometry in a Russian cohort / A.A. Sipol, E.V. Babenko, V.l. Borisov, E.V. Naumova, E.V. Boyakova, D.I. Yakunin, T.V. Glazanova, Z.V. Chubukina, N.V. Pronkina, A.M. Popov, L.I. Saveliev, S.A. Lugovskaya, I.A. Lisukov, A.D. Kulagin, A.J. Illingworth // Hematology. - 2015. -Vol. 20, №1,-P. 31-38.

Монография

1. Кулагин, А.Д. Апластическая анемия: иммунопатогенез, клиника, диагностика, лечение / А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.А. Козлов. - Новосибирск: Наука, 2008. - 236 с.

Список сокращений

АА апластическая анемия

ЛИГА аутоиммунная гемолитическая анемия

АТГ антитимоцитарный глобулин

АЧЛ абсолютное число лимфоцитов

АЧН абсолютное число нейтрофилов

АЧР абсолютное число ретикулоцитов

БСВ бессобытийная выживаемость

ВГН верхняя граница нормы

Г-КСФ гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ДИ доверительный интервал

ЗФР забуференный физиологический раствор

ист иммуносупрессивная терапия

ИТП иммунная тромбоцитопеническая пурпура

км костный мозг

лдг Лактатдегидрогеназа

МДС миелодиспластический синдром

МКР межквартильный размах

МКА моноклональное антитело

МНК мононуклеарные клетки

НТАА нетяжелая апластическая анемия

ОВ общая выживаемость

ОР отношение рисков

ош отношение шансов

ИНГ пароксизмальная ночная гемоглобинурия

ПО полный ответ (ремиссия)

РТПХ реакция трансплантат против хозяина

СКВ системная красная волчанка

скк стволовая кроветворная клетка

сПНГ субклиническая пароксизмальная ночная гемоглобинурия

СТАА сверхтяжелая апластическая анемия

ТАА тяжелая апластическая анемия

ТКМ трансплантации костного мозга

ТК теломеры короткие

ТН теломеры нормальные

ЦсА циклоспорин А

ЧО частичный ответ (ремиссия)

ASH Американское общество гематологии

CD кластер дифференцировки

DeltaTEL скорректированный по возрасту показатель длины теломер

ЕВМТ Европейское общество трансплантации костного мозга

ЕНА Европейская гематологическая ассоциация

Flow-FISH проточная флюоресцентная in situ гибридизация

GPI гликозилфосфатидилинозитоловый якорь

HLA человеческие лейкоцитарные антигены

PIG-A phosphatidylinositol glycan-class А ген

TEL абсолютная длина теломер

Подписано в печать 18.02.2015 Формат 60x84 '/16 Цифровая Печ. л. 2.0 Тираж 100 Заказ № 27/02 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)