Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Клинико-функциональные, патоморфологические и молекулярные особенности тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы

□□34614Э2

СЕЛИВАНОВА Полина Александровна

КЛИНИКО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ, ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТЯЖЕЛОЙ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИ РЕЗИСТЕНТНОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

14.00.43 - пульмонология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 2 ФЕВ 2009

Томск - 2009

003461492

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАМН Огородова Людмила Михайловна

Научный консультант:

Кандидат биологических наук Фрейдин Максим Борисович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Бодрова Тамара Николаевна Кандидат медицинских наук, доцент Агеева Татьяна Сергеевна

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава

Защита состоится «/У» ^г^/па 2009 г. в 00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.02 при Сибирском государственном медицинском университете по адресу: 634050, г. Томск, Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Ученый секретарь диссертационного совета

Тюкалова Л.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения количество больных, страдающих бронхиальной астмой (БА), оценивается в 300 миллионов человек, распространенность астмы среди взрослого населения составляет от 1 до 18% в различных регионах (Burney Р., 2008; Masoü М., 2004). В России этот показатель колеблется от 4 до 6% (Балаганская М.А., 2008; Федосеев Г.Б., 2003; Чучалин А.Г., 1999). Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении астмы, внедрение в практику согласительных документов по БА (GINA, 2006 и др.), заболеваемость и смертность продолжают сохраняться на высоком уровне, особенно в случае тяжелой астмы.

Тяжелая БА является значимой медико-социальной проблемой, составляя в общей структуре заболевания 15-20% (Holgate S.T., 2003; Чучалин А.Г., Огородова JIM. 2004). Тяжелая БА ассоциирована с высоким риском смерти, частыми жизнеугрожающими обострениями болезни, высоким уровнем инвалидизации, резким снижением качества жизни таких пациентов. Именно на долю тяжелой астмы приходится 80% всех затрат, связанных с БА, сюда входят как прямые затраты на медикаментозное обеспечение, оказание дорогостоящей экстренной помощи, так и непрямые затраты в связи с длительными периодами нетрудоспособности пациентов (Чучалин А.Г., 1997; Ленская Л.Г., 2000; Медников Б.Л., 1998).

По результатам проведенных в последние годы эпидемиологических исследований (AIRE, AIRCEE, AIA, НАБАТ) контроль над заболеванием регистрируется лишь у 5-20% больных, что связано в первую очередь с неадекватным степени тяжести лечением. Однако у части больных формируется терапевтически резистентная астма, характеризующаяся сохранением симптомов болезни, несмотря на применение высоких доз базисных препаратов (Holgate S.T., 2006; Chung K.F., 1999; Barnes P.J., 1998). В литературе активно обсуждаются возможные причины, приводящие к терапевтической резистентности (персистенция эозинофильного воспаления, ремоделирование бронхов, формирование вторичной кортикостероидной резистентности, наследственная предрасположенность) (Wenzel S.E., 2006; Vignola A.M., 1999; Chetta A., 1997), но часто не принимается во внимание клиническая и патогенетическая гетерогенность терапевтически резистентной астмы. Так, на сегодняшний день выделяют три клинических фенотипа тяжелой неконтролируемой астмы (фатальная астма, фенотип «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией») (Holgate S., 1999), продемонстрированы и патогенетические различия этих клинических фенотипов (Кобякова О.С., 2005). Однако отсутствуют данные о морфологических и молекулярных особенностях, лежащих в основе клинической гетерогенности тяжелой астмы.

Таким образом, изучение патоморфологических и молекулярных характеристик тяжелой неконтролируемой астмы представляет значительный научный и практический интерес с точки зрения их вклада в формирование

терапевтической резистентности и разработки оптимальных патогенетически обоснованных терапевтических стратегий.

Цель: установить клинико-функциональные, патоморфологические и молекулярные особенности тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы (фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией») для разработки мероприятий патогенетически обоснованной терапии.

Задачи:

1. Оценить особенности формирования, поло-возрастные, клинические и функциональные характеристики у больных тяжелой терапевтически резистентной астмой фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» в различные периоды болезни. Дать сравнительный анализ параметров функции внешнего дыхания и бронхиальной гиперреактивности у пациентов с изучаемыми фенотипами тяжелой БА.

2. Представить характеристику цитологического состава бронхиальных смывов, морфометрических и цитологических параметров бронхиальных биоптатов у больных тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» в сравнении со среднетяжелой БА. Оценить вклад эффекторных клеток воспаления и явлений ремоделирования в формирование клинических фенотипов тяжелой терапевтически резистентной астмы.

3. Оценить экспрессию генов воспаления и бронхоконстрикции (CHRM3, H1R, ADRB2) в бронхиальных биоптатах пациентов с изучаемыми фенотипами тяжелой БА в сравнении со среднетяжелой астмой и проанализировать их вклад в клинико-функциональные и патоморфологические особенности фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной БА.

4. Исследовать динамику клинико-функциональных, патоморфологических и молекулярных показателей на фоне использования базисной ингаляционной терапии в дозах, соответствующих степени тяжести заболевания (у пациентов с тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» и среднетяжелой БА).

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка патоморфологических (цитологический состав бронхиальных смывов, морфометрия и плотность клеточного инфильтрата в слизистой оболочке бронхов) и молекулярных (уровень экспрессии генов рецепторов воспаления и бронхоконстрикции - МЗ-холинорецептора, (32-адренорецептора, HI-рецептора гистамина в бронхиальных биоптатах, полученных при фибробронхоскопии) показателей у пациентов с фенотипами «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной астмы. Доказано, что в основе клинико-функциональных различий изучаемых фенотипов лежат выявленные патоморфологические и молекулярные особенности.

Приоритетными являются результаты, полученные методом дискриминантного анализа, показавшие, что наибольший вклад в формирование

различий между обследованными группами вносят плотность нейтрофилов и высота эпителиального пласта в бронхиальных биоптатах, а также уровень экспрессии генов МЗ-холинорецептораи р2-адренорецептора.

Установлены взаимосвязи между основными показателями ремоделирования тканей (толщина базальной мембраны, высота эпителиального пласта и относительный объем соединительной ткани) и такими клинико-функциональными характеристиками, как тяжесть, стаж БА, ОФВ1. Приоритетными являются данные о наличии положительных корреляций между плотностью в слизистой оболочке бронхов таких эффекторных клеток, как макрофаги и эозинофилы и показателем суточной лабильности бронхов.

Впервые выявлено, что плотность гистио-макрофагальных элементов в слизистой оболочке бронхов ассоциирована с уровнем экспрессии гена МЗ-холинорецептора, а плотность эозинофилов — с экспрессией Н1-рецептора гистамина. Это служит подтверждением тесной взаимосвязи между морфологическими и молекулярными особенностями фенотипов БА и основными клинико-функциональными характеристиками заболевания.

Получены приоритетные данные с использованием цитологических, морфометрических и молекулярных методов об отсутствии динамики патоморфологических и молекулярных показателей у больных с тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» на фоне применения адекватных степени тяжести доз базисной ингаляционной терапии. Это реализуется в невозможность достижения критериев полного контроля и подтверждает базисный вклад выявленных патоморфологических и молекулярных изменений в формирование болезни и феномена терапевтической резистентности. Установлено, что на фоне использования базисной противовоспалительной терапии в группе среднетяжелых больных отмечается положительная динамика патоморфологических и молекулярных параметров, что приводит к достижению контроля над заболеванием.

Практическая значимость. Проведенное комплексное изучение клинико-функциональных, патоморфологических и молекулярных особенностей тяжелой терапевтически резистентной астмы позволяет обосновать наличие разных клинико-патогенетических фенотипов тяжелой терапевтически резистентной БА. Установлено, что «brittle» фенотип тяжелой астмы характеризуется преобладанием гистио-макрофагальных элементов и эозинофилов в составе инфильтрата слизистой оболочки бронхов, тогда как фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается нейтрофильным паттерном воспаления и выраженными явлениями ремоделирования бронхов, что позволяет рассматривать изученные патоморфологические характеристики в качестве дополнительных критериев диагностики фенотипов заболевания.

Патогенетически важные для фенотипов тяжелой терапевтически резистентной БА патоморфологические и молекулярные особенности, выявленные в исследовании, представляют большой практический интерес в

качестве потенциальных молекулярных мишеней для разработки индивидуальных режимов противовоспалительной терапии бронхиальной астмы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клинические фенотипы «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы характеризуются значительными различиями по клинико-функциональным параметрам болезни, в основе которых лежат патоморфологические особенности каждого фенотипа. Фенотип «brittle» тяжелой астмы ассоциирован с гистио-макрофагальной инфильтрацией и эозинофильным типом воспаления. Фенотип «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется преобладанием нейтрофилов и выраженными явлениями ремоделирования.

2. Тяжелая терапевтически резистентная астма ассоциирована с увеличением экспрессии в бронхиальных биоптатах генов МЗ-холинорецептора и [S2-адренорецептора, в сравнении со среднетяжелыми больными. Отличительной особенностью «brittle» фенотипа тяжелой БА на молекулярном уровне является существенное увеличение уровня экспрессии генов МЗ-холинорецептора и HI-рецептора гистамина, в сравнении как со среднетяжелой астмой, так и с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» и меньшая экспрессия гена (32-адренорецептора в сравнении с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией». Фенотип тяжелой терапевтически резистентной БА «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется максимальным уровнем экспрессии гена Р2-адренорецептора и статистически значимо меньшим уровнем экспрессии МЗ-холинорецептора в сравнении с «brittle» фенотипом.

3. У больных тяжелой терапевтически резистентной астмой фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» на фоне проводимой терапии отсутствует динамика патоморфологических параметров и уровня экспрессии изучаемых генов, не удается достичь критериев контроля астмы. При среднетяжелой астме положительная динамика патоморфологических и молекулярных параметров на фоне использования базисной ингаляционной противовоспалительной терапии приводит к достижению контроля над заболеванием.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII международном конгрессе молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), VIII международном конгрессе молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), XVIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), заседании областного научно-практического общества аллергологов-иммунологов (Томск, 2005), совещании кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины СибГМУ (Томск, 2008).

Внедрение результатов исследований. Полученные результаты используются в работе отделения пульмонологии ОГУЗ «Томская областная клиническая больница». Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава для студентов лечебного факультета, учебном процессе кафедры госпитальной терапии БУ ВПО «Ханты-Мансийского государственного медицинского института», учебном процессе кафедры аллергологии и пульмонологии ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» Росздрава.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 12 работ, в том числе 2 полнотекстовые журнальные статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, глав собственных наблюдений (главы 3-5), обсуждения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 31 рисунком и 19 таблицами. Список источников цитируемой литературы включает в себя 229 работ, из которых 25 отечественных и 204 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клинические группы

Согласно поставленным целям было обследовано 56 пациентов в возрасте от 18 до 65 лет, 29 из которых имели диагноз тяжелой персистирующей Б А (10 пациентов с «brittle» фенотипом тяжелой БА, 19 - с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией»), 27 - персистирующей астмы средней степени тяжести (группа сравнения). Работа выполнена на базе кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. каф,- д-р мед. наук, профессор Г.Э. Черногорюк), отделения пульмонологии ОГУЗ «Томская областная клиническая больница» (гл. врач - Б.Т. Серых), отделения пульмонологии МЛПУ «Городская больница №3» (гл. врач - М.А. Лукашов), кафедры внутренних болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. каф.- д-р мед. наук, профессор Л.И. Волкова). Молекулярные методы исследования проводились на базе ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (директор - д-р мед. наук, профессор, академик РАМН В.П. Пузырев). Функциональные методы исследования выполнены в лаборатории функциональной диагностики кафедры факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. каф. - д-р мед. наук, профессор, член-корр. РАМН Л.М. Огородова). Исследование выполнено на базе протокола, одобренного локальным комитетом по этике ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава г. Томска (заключение №383 от 31.01.2006).

Критерии включения пациентов с бронхиальной астмой

1. Ранее подтверждённый диагноз БА (не менее 1 года).

2. Возраст от 18 до 65 лет.

3. Для тяжелой БА:

a) Наличие у больного «brittle» фенотипа БА, подтвержденного медицинскими документами (диагноз лабильной астмы должен быть подтвержден не ранее чем за 1 год до включения больного в исследование): наличие суточной вариабельности уровня ПСВ с амплитудой >40% в течение более 50% времени за 5-ти месячный период, на фоне максимально интенсивного лечения с применением высоких доз ингаляционных стероидов (прием беклометазона в суточной дозе >1,5 мг/сут или будесонида >1,0 мг/сут или флютиказона пропионата (ФП) >0,75 мг/сут), частых ингаляций бронхолитиков;

b) Наличие у больного фенотипа «астма с фиксированной обструкцией»: постоянная персистенция симптомов БА, низкие показатели функции внешнего дыхания (ФВД) (ОФВ1<бО% от должного, ПСВ<60% от должного), с или без эпизодов внезапного ухудшения, требующие системной терапии ГКС (в дозах 5-20 мг/сут по преднизолону, в течение не менее 1 года), которая приводит к неполному ответу;

4. Для среднетяжелой неконтролируемой астмы: на фоне базисной терапии в дозах 500-750 мкг/сут по бекламетазону (ступень 3 по G1NA 2006) симптомы соответствуют легкой персистирующей БА.

5. Отсутствие острых респираторных заболеваний в течение последних 4-х недель перед исследованием.

6. Умение правильно пользоваться ингалятором, пикфлоуметром, способность адекватно оценивать своё состояние.

Методы исследования

Клинико-анамнестические методы. Диагностика БА, оценка степени тяжести, уровень контроля над БА, а также оценка клинической эффективности противовоспалительной терапии определялись согласно критериям документа GINA, 2006 г. (табл. 1) путем объективного осмотра, ежедневного мониторирования симптомов, потребности в бронхолитиках.

Исследование вентиляционной функции легких. Оценка функциональных тестов, уровня бронхиальной гиперреакнвности к гистамину проведена у всех пациентов, включённых в исследование на оборудовании MasterScope фирмы Erich Jaeger GMBH (условия проведения теста ATS Standardization of Spirometry, 1995). Пиковая скорость выдоха измерялась пикфлоуметрами Mini-Wright в утренние и вечерние часы до приёма любых лекарственных препаратов.

Цитоморфологические методы. С целью получения бронхиальных смывов (БС) и биоптатов всем пациентам проводилась БФС по стандартной методике (Robinson D.S., 1998) гибким фиброскопом (BF1T20, Olympus Corporation) в условиях эндоскопического кабинета. Процедура БС осуществлялась через тубус бронхоскопа путем введения 30-40 мл стерильного изотонического раствора Na С/, подогретого до 37°С, с немедленной аспирацией в специальный силиконизированный контейнер (Полосухин В.В., 1995). Биоптаты получали со

слизистой оболочки среднедолевого бронха методом количестве двух фрагментов.

щипковой биопсии, в Таблица 1

Уровни контроля астмы (GINA, 2006)

Характеристики Контролируемая БА (все критерии из нижеприведенных) Частично контролируемая БА (какая-либо из характеристик, присутствующая в любую неделю) Неконтролируемая БА

Дневные симптомы Нет (дважды или менее в неделю) Более 2-х в неделю Три и более признака частично контролируемой астмы, присутствующие в любую неделю

Ограничение активности Нет Любые

Ночные симптомы/пробуждения Нет Любые

Потребность в использовании [32-агонистов короткого действия в качестве средства скорой помощи Нет (дважды или менее в неделю) Более 2-х в неделю

Функция легких (ПСВ или ОФВ1) Норма <80% от должного или персонального лучшего значения

Обострения Нет Одно и более в год Одно в какую-либо из недель

Обработка БС включала центрифугирование и приготовление мазков из полученного осадка. Цитологическое исследование окрашенных препаратов проводилось при увеличении 1500 на светооптическом микроскопе, подсчитывалось не менее 300 клеток и определялось процентное содержание каждого типа клеток с последующим пересчетом на абсолютное значение.

Материал бронхобиоптатов фиксировался в 10% забуференном формалине. После стандартной проводки и заливки готовились срезы толщиной 5-7 мкм с последующей окраской гематоксилином и эозином (Лили Р., 1969). Под малым увеличением (х 200) проводилась обзорная микроскопия слизистой оболочки бронхов. При морфометрическом исследовании методом точечного счета сеткой Автандилова оценивалась объемная плотность покровного эпителия и отдельных клеток (мм3/мм3), относительный объем соединительной ткани и желез (%). С помощью окуляр-микрометра измерялась высота покровного эпителия, толщина базалыюй мембраны (мкм). Подсчет плотности различных клеточных популяций в 1 мм2 собственной пластинки слизистой оболочки проводился в графическом редакторе Adobe PhotoShop 7.0.

Молекулярные методы (выполнены на базе ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН). Образцы ткани бронха для молекулярного исследования сразу

после забора помещались в эппендорфы и замораживались в жидком азоте при температуре -196 °С, где они хранились вплоть до момента выделения РНК. Выделение РНК производилось методом кисло-фенольной экстракции с помощью реактива Три-реагент (Molecular Research Center Inc., США). Далее выполнялась постановка реакции обратной транскрипции с целью накопления кДНК (комплект для обратной транскрипции РНК «Реверта», ООО «Амплисенс» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Синтезированную кДНК в дальнейшем использовали для постановки полимеразной цепной реакции. Генотипирование генов ADRB2, H1R, CHRM3, GAPDH осуществляли с помощью ПЦР в реальном времени, используя коммерческие наборы, разработанные и произведенные в ООО «Биосан», г. Новосибирск. Определение уровня экспрессии проводили путем сравнения пороговых уровней флюоресценции маркерного гена и гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), уровень экспрессии которого принимался за 100%.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакета программ "Statistica for Windows 6.0". Данные представлены в виде Х+х, где X - среднее арифметическое, х - ошибка среднего. Для оценки различия средних в попарно не связанных выборках применяли U-критерий Манна-Уитни, в связанных -критерий Вилкоксона. Для сравнения показателей в трех несвязанных группах проводили дисперсионный анализ ANOVA Крускала-Уоллиса. Степень взаимосвязи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Проводился многофакторный дисперсионный анализ изучаемых параметров. Разницу значений считали значимой при р<0,05. Данные группировались в соответствии с задачами исследования (Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клинко-функциональная характеристика больных, включенных в исследование.

Средний возраст обследованных пациентов составил 46,77±1,76 лет, статистически значимые различия по возрасту обнаружены только между группами пациентов со среднетяжелой и тяжелой БА фенотипа "астма с фиксированной обструкцией» (р<0,05). Стаж заболевания также различался у этих двух групп пациентов. Средний возраст манифестации болезни составил 34,86+1,99 лет, статистически значимых различий между группами не обнаружено, однако, среди пациентов с «brittle» астмой чаще встречались лица с так называемой early-onset БА (возникшей в возрасте до 12 лет), фенотип «brittle» сформировался к 18-20 годам. Исходная клинико-функциональная характеристика пациентов представлена в таблице 2.

Пациенты с тяжелой терапевтически резистентной астмой имели исходно статистически значимо более частые и выраженные дневные и ночные симптомы астмы. Основные показатели ФВД (ОФВ1, ПСВ, СЛБ) также статистически значимо отличались в группах среднетяжелых и тяжелых больных. Пациенты с тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипа «brittle» характеризовались

исключительно атопической формой заболевания, высокой среднесуточной лабильностью бронхов. Больные тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» отличались низким индексом атопии, монотонностью показателей функции легких.

Таблица 2

Сравнительная клинико-функциональная характеристика обследованных

групп пациентов с диагнозом БА (Х±х)

Показатели Больные БА

Средкетяжелые (п=27) Тяжелые, фенотип «brittle» (п=10) Тяжелые, фенотип «астма с фиксированной обструкцией»(п=19)

Средний возраст, лет 42,67±2,47 43,40±5,22 54,37±1,88*

Стаж заболевания, лет 8,15±1,34 15,50±3,57 13,89±2,35*

Средний возраст манифестации болезни, лет 34,51±2,85 27,10±5,99 39,42±2,57

Дневные симптомы, баллы* 1,53±0,15 3,72±0,40* 3,69±0,11*

Ночные симптомы, баллы* 0,12±0,01 2,06±0,25* 2,61±0,20*

Потребность в бронхолитиках, доз/сут 0,96±0,12 5,88±1,12* 8,28±0,94*'**

Обострения, число случаев в год 2,28±0,35 3,60±0,46* 6,50±1,33*'**

Утренние значения ПСВ, % 77,75±1,76 64,83±6,41* 54,61±2,07*

ОФВ1,% 74,54±1,82 55,06±4,33* 60,34±2,79*

СЛБ, % 20,12±1,12 45,82±1,22* 8,28±0,94*'**

ПК 20 мг/мл*" 3,34±0,73 0,24±0,19*

1дЕ МЕ/мл 272,68±53,00 309,60±34,90 107,34±24,68*'**

Примечание: * - оценка по шкале симптомов; ■

*"-тест выполнялся только пациентам с исходным уровнем ОФВ1>70% от должного; * - р<0,05 по сравнению с показателями группы среднетяжелых пациентов; ** -р<0,05 по сравнению с показателями группы тяжелой БА фенотипа «brittle».

Таким образом, установлено, что клинические фенотипы тяжелой терапевтически резистентной БА различаются по клинико-функциональным параметрам, при этом максимальный вклад в различия между группами вносят показатели бронхиальной реактивности.

2. Патоморфологическая характеристика фенотипов тяжелой терапевтически резистентной БА.

Обзор исследований БА с использованием бронхоскопических методик (бронхоальвеолярный лаваж, биопсия) продемонстрировал ряд различий в морфологической картине воспаления бронхов в случае разнородности клинических фенотипов заболевания. S.E, Wenzel и соавт. (1997) обнаружили, что в случае тяжелого персистирующего течения астмы преобладает нейтрофильная инфильтрация воздухоносных путей. У пациентов с преобладанием ночных симптомов было установлено значительное увеличение количества эозинофилов в тканях, полученных при трансбронхиальной биопсии в 4 часа утра (Martin R. J., 1996; Kraft M., 1998). Вероятно, в основе фенотипов БА лежат различные воспалительные реакции с преобладанием тех или иных

эффекторных клеток, однако комплексные исследования патоморфологических характеристик терапевтически резистентной астмы с учетом ее клинической гетерогенности отсутствуют.

С целью определения морфологических особенностей клинических фенотипов тяжелой БА в данной работе проведена оценка клеточного состава БС, морфометрических и цитологических параметров биоптатов слизистой оболочки бронха больных тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» в сравнении со среднетяжелой астмой.

При анализе полученных морфометрических данных установлено, что структурные изменения слизистой оболочки бронхов у больных тяжелой БА, независимо от фенотипа, носят преимущественно атрофический характер и выражаются в уменьшении толщины эпителиального пласта, снижении объемной плотности покровного эпителия, уменьшении относительного объема желез. Одновременно выявлен фиброз собственной пластинки, что проявлялось в увеличении относительного объема соединительной ткани, а также в утолщении базальной мембраны (табл. 3). Для больных «brittle» БА характерна гиперплазия гладкомышечных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки.

Статистически значимые различия между фенотипами тяжелой БА выявлены по высоте эпителиального пласта и толщине базальной мембраны.

Таблица 3

Показатели морфометрии у больных среднетяжелой и тяжелой БА (Х±х)

Исследуемые параметры Тяжесть БА

Среднетяжелая (п=22) Тяжелая, фенотип «brittle» (п=9) Тяжелая, фенотип «астма с фиксированной обструкцией» (п=14)

Объемная плотность всего покровного эпителия, мм3/ мм3 0,2б±0,01 0,12±0,01* 0,16±0,02*

Объемная плотность реснитчатых эшггелиоцитов, мм3/ мм3 0,12±0,01 0,05±0,002* 0,07±0,01 *

Объемная плотность бокаловидных эшггелиоцитов, мм3/ мм3 0,08±0,004 0,02±0,002* 0,04±0,01*

Объемная плотность базальных эшггелиоцитов, мм3/ мм3 0,06±0,005 0,05±0,01 0,05±0,01

Относительный объем желез, % 66,30±2,48 32,16±2,63* 26,76±5,56*

Относительный объем соед. ткани, % 34,58±2,25 68,12±2,67* 60Д8±5,03*

Высота эпителиального пласта, мкм 63,30±2,80 56,31±4,23 24,31±3,46*' **

Толщина базальной мембраны, мкм 8,47±0,64 18,77±2,74* 25,69±5,37*' **

Примечание: *~р<0,01 по сравнению с показателями |руппы среднетяжелой БА; **- р<0,05 по сравнению с группой тяжелой БА, фенотип «brittle».

Известно, что уменьшение толщины покровного эпителия в бронхиальных путях существенно снижает его защитные свойства, облегчая проникновение аллергенов (Абросимов В.Н., 1994; Vrugt В., 1993). Морфологическим подтверждением такой антигенной стимуляции является высокий уровень лимфоцитов и гистио-макрофагальных элементов в слизистой оболочке бронхов, имеющий место у больных с «brittle» БА. Значимость снижения толщины

эпителиального пласта слизистой оболочки бронхов в патогенезе персистенции симптомов у тяжелых больных подтверждают выявленные в ходе работы корреляционные связи. Отрицательная корреляция обнаружена между тяжестью заболевания, частотой дневных и ночных симптомов и высотой эпителиального пласта (г=-0,57; р=0,001), и положительная - между объемной плотностью покровного (г=0,67; р=0,0002), реснитчатого (г=0,67; р=0,0002) и бокаловидного эпителия (г=0,57; р=0,002) и уровнем ПК20 в тесте с гистамином.

При сравнении клеточного состава инфильтрата слизистой оболочки бронхов обнаружено преобладание эозинофилов и нейтрофилов при БА средней степени тяжести, тогда как в случае «brittle» БА превалировали гистио-макрофагальные элементы, а при тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» выявлено значительное число нейтрофилов (рис. 1).

Q БА среднетяжелая (п=22)

□ Тяжелая БА, фенотип "brittle" (п=9)

Ы Тяжелая БА, фенотип "астма с фиксированной обструкцией" (п=14)

Рис. 1. Характеристика клеточного состава инфильтрата в слизистой оболочке бронхов у больных среднетяжелой и тяжелой (фенотипы «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией») БА.

Примечание: * -р<0,05 по сравнению с группой среднетяжелой БА;

# -р<0,05 по сравнению с группой тяжелой БА, фенотип «brittle»;

Г-М - гистио-макрофагальные элементы;

JT-лимфоциты;

НФ - нейтрофилы;

Э-эозинофилы.

На сегодняшний день нет единого мнения о преобладании какого-либо типа эффекторных клеток в воспалительном инфильтрате, особенно в случае тяжелой БА. В проведенном исследовании наибольшее количество нейтрофилов (79,42±9,26 в 1 мм2), инфильтрирующих слизистую оболочку бронха, выявлено у пациентов с тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией», именно в этом случае можно говорить о нейтрофильном паттерне воспаления. Необходимо отметить, что все эти пациенты получали в качестве базисной терапии БА системные кортикостероиды, для которых показан эффект подавления апоптотической гибели нейтрофилов у больных с БА (Сох G., 1995; Nguyen L.T., 2005).

В случае «brittle» БА отмечена относительно высокая плотность эозинофилов в слизистой бронхов (15,35±2,13 в 1 мм2) в сравнении с БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» (р=0,003), что позволяет характеризовать данное воспаление как эозинофильное. Полученные данные соответствуют результатам S.E. Wenzel с соавт. (1999 г.), которые в группе

больных с тяжелой БА, не разделяя их на клинические фенотипы, выделили два морфологических подтипа, характеризующихся различным паттерном воспаления в слизистой бронха: при эозинофильном фенотипе количество эозинофилов, инфильтрирующих стенку бронха, составляет от 16 до 31 клетки в 1 мм2 (медиана = 20), при нейтрофильном - количество нейтрофилов - 39-273 клетки в 1 мм2 (медиана = 65), число эозинофилов - 0-2 клетки в 1 мм2.

Результаты дискриминантного анализа свидетельствуют о достоверном различии йатоморфологических характеристик для отдельных фенотипов тяжелой БА и среднетяжелых больных, что подтверждает их значимый вклад в формирование фенотипической гетерогенности пациентов (табл. 4, рис. 2).

Таблица 4

Результаты дискриминантного анализа патоморфологических характеристик при сравнении групп больных среднетяжелой и тяжелой

терапевтически резистентной астмой

Показатели Среднетяжслая БА Тяжелая БА, фенотип «brittle» Тяжелая БА, фенотип «астма с фиксированной обструкцией»

Число больных 22 9 14

Правильная классификация, % 100 100 93

Включенные в уравнение ЛДФ характеристики ФВД, К Уилкса и уровень значимости Плотность нейтрофилов, кл. в 1мм2; А.=0,04; р<0,001

Высота эпителиального пласта, мкм; >.=0,05; р<0,0001

Характеристики уравнения ЛДФ Х=0,29; F=12,63; р<0,0001

Примечание: ЛДФ - линейная днскриминантная функция.

Корень 1 vs. Корень 2

♦ о0°° ♦ ° CP О. о О ° 8 о О в о | о

□ CD D ......

БА средней степени тяжести Тяжелая БА, фенотип "brittle" Тяжелая БА, фенотип "астма с фиксированной обструкцией"

-8 -5 -4-3-2-10123 Корень 1

Рис. 2. Рассеяние значений дискриминантной функции при сравнении групп больных с тяжелой БА фенотипы «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» и среднетяжелой астмой по изучаемым патоморфологическим характеристикам.

Изменение клеточного состава БС у обследованных групп больных в целом отражает клеточный паттерн воспаления в слизистой оболочке бронхов. Так, у пациентов с тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» преобладающими клетками БС являются нейтрофилы (0,73±0,05х106 в 1 мл), в

группе среднетяжелых больных - наряду с клетками бронхиального эпителия, одинаково часто встречались эозинофилы (0,47±0,06х106 в 1мл) и нейтрофилы (0,4б±0,11 х 10б в 1мл). Для пациентов с «brittle» фенотипом тяжелой астмы характерно меньшее абсолютное количество клеток (1,73±0,10х106в 1 мл) в связи с более низким содержанием лимфоцитов, эозинофилов и эпителиальных клеток.

Таким образом, основной патоморфологической характеристикой «brittle» фенотипа БА является персистирующее воспаление в ответ на постоянную стимуляцию аллергенами, проявляющееся в высокой плотности гистио-макрофагальных элементов, лимфоцитов и эозинофилов, что подтверждает важный вклад активно персистирующего воспаления в манифестное течение заболевания у этой группы больных.

У пациентов с тяжелой Б А фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» воспаление носит качественно иной характер, что отражается в клинико-функциональных параметрах болезни. Так, преобладание нейтрофилов ассоциировано с выделением ферментов, обладающих деструктивным и ремоделирущим действием на ткани (Cundall М„ 2003; Simpson J.L., 2005; Pepe С., 2005), что приводит к необратимым структурным изменениям ткани бронхов, имеющим крайнюю степень выраженности у этой группы больных, и может быть реализовано в наблюдаемый у них феномен фиксированной обструкции.

3. Особенности экспрессии генов воспаления и бронхоконстрикции у больных тяжелой терапевтически резистентной БА.

Изучаемые клинические фенотипы тяжелой астмы значительно различаются по показателям гиперреактивности бронхов. Одним из факторов, принимающих участие в формировании феномена БГР, является нарушение нейрогенного контроля тонуса гладких мышц бронхов больных БА (Barnes P.J., 1999; Smith Н., 2002). В рамках настоящей работы проведен анализ экспрессии генов, задействованных в воспалении и механизмах бронхоконстрикции (ген МЗ-холинорецептора, ген р2-адренорецептора, ген HI-рецептора гистамина), в образцах ткани бронхов больных со среднетяжелой БА и тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией».

Исходная характеристика уровня мРНК исследуемых генов представлена в табл. 5.

Таблица 5

Исходные показатели экспрессии генов в бронхиальных биоптатах у __больных среднетяжелой и тяжелой БА___

Исследуемые параметры Тяжесть БА

Среднетяжелая (п=16) Тяжелая, фенотип «brittle» (п=10) Тяжелая, фенотип «астма с фиксированной обструкцией»(п=14)

мРНК CHRM3, % 45,76±1,76 57, №0,94* 50,54±1,61*-**

мРНК ADRB2, % 28,92±1,31 51,70±0,56* 71,41±2,43*'**

мРНК H1R, % 34,36±0,59 38,82±1,26* 34,65±0,98**

Примечание: *-р<0,05 по сравнению с показателями группы среднетяжелой БА;

** - р50,05 по сравнению с группой тяжелой БА, фенотип «brittle».

Максимальное повышение уровня экспрессии гена МЗ-холинорецептора наблюдалось в группе пациентов тяжелой БА с «brittle» фенотипом как в сравнении со среднетяжелыми больными (р=0,0002), так и с группой тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» (р=0,008). Уровень мРНК Н1-рецептора гистамина статистически значимо повышен в группе больных БА с «brittle» фенотипом, как в сравнении со среднетяжелыми пациентами (р=0,005), так с пациентами с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» (р=0,03). Установлена положительная корреляционная связь между уровнем экспрессии H1R и CHRM3 и СЛБ (г=0,67; р=0,002 и г=0,86; р=0,0006, соответственно).

Известно, что рецепторы гистамина активно экспрессируют клетки воспаления (лимфоциты, эозинофилы), поэтому повышение уровня экспрессии H1R у больных с «brittle» БА может быть следствием активно протекающего аллергического воспаления в слизистой оболочке бронхов. Это отражается в положительной корреляционной взаимосвязи между уровнем мРНК H1R и плотностью эозинофилов в слизистой оболочке бронхов в группе пациентов с «brittle» БА (г=0,92; р=0,002).

В ряде работ установлено, что МЗ-холинорецептор активно экспрессируется макрофагами, опосредуя их хемотаксис (Mita Y., 1996; Sato Е., 1998). По результатам проведенного исследования, количество макрофагов, инфильтрирующих слизистую оболочку бронхов, максимально у больных «brittle» БА; у пациентов с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» инфильтрация гистио-макрофагальными элементами слизистой оболочки выше по сравнению со среднетяжелой астмой, но ниже этого показателя у больных «brittle» БА. Это согласуется с установленным уровнем экспрессии МЗ-холинорецептора и подтверждено корреляцией между количеством макрофагов и уровнем экспрессии CHRM3 (г=0,41; р=0,043).

Активность гена ADRB2 достоверно различалась во всех трех группах, наибольший уровень отмечен в группе больных тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» (р<0,0001, в сравнении со среднетяжелой Б А), у пациентов с «brittle» БА показатель уровня мРНК гена р2-адренорецептора был достоверно выше, чем в группе среднетяжелой БА (р=0,00002), однако ниже уровня пациентов с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» (р=0,00003). Это может быть объяснено с позиции влияния проводимой терапии. Так, по данным литературы, ГКС способны повышать экспрессию гена ADRB2 через инактивацию транскрипционного NF-kB (Szefler S. J., 1997; Nelson H. S., 2003), возможно, именно это оказывает влияние на полученные результаты, так как пациенты группы БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» исходно получали в качестве базисной терапии системные стероиды.

При оценке значимости вклада уровня экспрессии изучаемых генов в формирование различий между группами больных со среднетяжелой и фенотипами тяжелой БА установлено, что наибольший вклад вносят активность гена р2-адренорецептора и МЗ-холинорецептора (рис. 3, табл. 6).

Таблица б

Результаты дискриминантного анализа уровня мРНК генов воспаления и бронхоконстрикции при сравнении групп больных среднетяжелой и тяжелой

Показатели 4 Среднетяжелая БА Тяжелая БА, фенотип «brittle» Тяжелая БА, фенотип «астма с фиксированной обструкцией»

Число больных 16 10 14

Правильная классификация, % 100 100 85

Включенные в уравнение ЛДФ показатели экспрессии генов бронхоконстрикции, X Уилкса и уровень значимости мРНК ADRB2, %; к 0,43; р<0,0001

мРНК CHRM3, %■ Х.=0,06; р=0,03

Характеристики уравнения ЛДФ Х=0,039; F=22,82; р<0,0001

Примечание: ЛДФ - линейная дискриминантная функция.

Корень 1 vs. Корень 2

О БА средней

степени тяжести □ Тяжелая БА,

фенотип "brittle" • Тяжелая БА, фенотип "астма с фиксированной обструкцией" Корень 1

Рис. 3. Рассеяние значений дискриминантной функции при сравнении групп больных с тяжелой БА фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» и среднетяжелой астмой по показателям уровня экспрессии генов рецепторов воспаления и бронхоконстрикции.

Таким образом, у пациентов с тяжелой терапевтически резистентной астмой с фенотипами «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» выявлены различия в уровне экспрессии генов, вовлеченных в воспалительный и бронхоконстрикторный ответ (CHRM3, H1R, ADRB2).

4. Динамика клинико-функциональных, патоморфологических и молекулярных показателей на фоне использования базисной противовоспалительной терапии у пациентов с различной степенью тяжести БА.

В ходе проведенной работы всем пациентам назначена базисная ингаляционная терапия в дозах, соответствующих степени тяжести заболевания (рис. 4).

Эффективность назначаемой базисной терапии оценивали на основании клинико-функциональных и патоморфологических критериев. Клиническую оценку эффективности выполняли с учетом соответствия пациента критериям контроля GINA, 2006 (табл. 1).

Скрининг 2 нед

12 нед

12 нед

БФС

Пациенты с БА (п=56)

Лечебный период

Среднетяжеляя БА(п=27): ФП 500 мкг/сутки + Салъметерол Тяжелая БА(п=29): ФП 1000 мкг/сутки + Сальметерол

Рис. 4. Дизайн исследования пациентов с БА различной степени тяжести.

На фоне проводимой противовоспалительной терапии отмечена положительная динамика клинико-функциональных показателей во всех группах обследуемых пациентов (табл. 7).

Таблица 7

Клинико-функциональная характеристика больных с различной степенью

Показатель Больные БА (п=56)

Средней степени тяжести (п=27) Тяжелой БА, фенотип «brittle» (п=10) Тяжелой БА, фенотип «астма с фиксированной обструкцией» (п=19)

Исходно После лечения Исходно После лечения Исходно После лечения

Дневные симптомы, баллы 1,53±0,15 0,72±0,12 3,72±0,40 1,11±0,4 4* 3,69±0,11 1,78±0,25

Ночные симптомы, баллы 0,12±0,01 0,04±0,00 * 2,06±0,25 0,25±0,1 4* 2,61±0Д0 0,57±0,14 *

Потребность в р2-агонистах (количество ингаляций/сутки) 0,96±0,12 0,02±0,01 * 5,88±1,12 2,43±0,9 0* 8,28±0,94 2,34±0,78 ♦

ОФВ1, % от должного 74,54±1,8 2 80,12±1,6 6* 55,0б±4,3 3 74,50±3, 18* 60,39±2,7 9 73,55±2,2 8*

ПСВ, % от должного 77,75±1,7 6 84,36±1,9 5* 64,83±6,4 1 77,49±4, 00* 54,б1±2,0 7 73,22±2,2 8*

СЛБ, % 20,12±1,1 2 10,48±0,7 2* 45,82±1,2 2 41,16±1, 06* 8,28±0,94 8,34±0,59

ПК20 в тесте с гистамином (мг/мл)# 3,34±0,73 6,66±1,33 * 0,24±0,19 1,18±0,4 6* # 2,66±0,42

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с исходными показателями; # - тест выполнялся только пациентам с исходным уровнем ОФВ1>70% от должного.

В группе больных БА средней степени тяжести по окончании лечебного периода критериев полного и частичного контроля по ОГЫА 2006 достигли все обследованные пациенты. Параллельно с восстановлением клинико-функциональных показателей наблюдали достоверные изменения морфологической картины воспаления в слизистой оболочке бронхов (табл. 8, рис. 5).

Таблица 8

Динамика морфометрических показателей больных среднетяжелой БА на фоне _базисной терапии, соответствующей степени тяжести_

Исследуемые параметры Больные БА средней степени тяжести (п=12)

Исходно На фоне адекватной базисной терапии

Объемная плотность всего покровного эпителия, мм3/ мм3 0,26±0,01 0,34±0,03*

Объемная плотность реснитчатых эпителиоцитов, мм3/ мм3 0,12±0,01 0,17+0,01*

Объемная плотность бокаловидных эпителиоцитов, мм3/ мм3 0,08±0,004 0,07+0,01

Объемная плотность базальных эпителиоцитов, мм3/ мм3 0,06±0,005 0,09+0,01*

Относительный объем желез, % 66,30±2,48 64,17±3,35

Относительный объем соед. ткани. % 34,58+2,25 33,79±2,79

Высота эпителиального пласта, мкм 63,30±2,80 53,00±3,65*

Толщина базальной мембраны, мкм 8,47+0,64 10.25+0,58

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с исходными показателями.

41.6 ,, „* 40,1

24, 22,6] т ¡¡Р- 1 15,9*

щ

Г-М-гистио-макрофагальные элементы; Л - лимфоциты; НФ- нейтрофилы; Э - эозинофилы.

0 Исходно ЕЗ На фоне терапии

Рис. 5. Динамика клеточного состава инфильтрата в слизистой оболочке бронхов у больных БА средней степени тяжести на фоне адекватной базисной терапии. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с исходными значениями.

Восстановление клинико-функциональных и патоморфологических параметров сочеталось со снижением уровня экспрессии генов МЗ-холинорецептора и Н1-рецептора гистамина и повышением уровня экспрессии гена р2-адренорецептора (табл. 9), что может быть отражением эффективного подавления воспаления в тканях бронхов у этих пациентов.

Таблица 9

Динамика экспрессии генов в бронхиальных биоптатах у больных среднетяжелой

Исследуемые параметры Больные БА

Среднетяжелые (п=10) Тяжелые, фенотип «астма с фиксированной обструкцией» (п=14)

До лечения После лечения До лечения После лечения

мРНК СИКМЗ, % 46,58±3,19 41,77±2,62* 50,54+1,61 49,72±1,20

мРНКАОКВ2,% 24,91 ±0,90 30,29±1,47* 71,41 ±2,43 59,21 ±6,41

мрнк нт, % 33,06±0,97 29,75+1,75* 34,65±0,98 34,37±0,96

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с исходными показателями.

Бронхиальный эпителий

+ ИЛ-8 МСР-1 СМСЭР

ЭЗИНОфи/7

Парасимпатический нерв

Спазм

Расслабление

1л Н1 рецептор

МЗ холинорецептор \_/ 32-адренорецептор

Гладкомышечная клетка

Указанные на рисунке 6 и изученные в данной работе рецепторы задействованы в воспалительном и бронхоконстрикторном ответе, что отражает тесную взаимосвязь между клинико-функциональными, морфологическими и молекулярными особенностями фенотипов тяжелой терапевтически резистентной астмы.

Рис. б. Локализация и биологические эффекты изучаемых рецепторов.

Известно, что Н1-рецепторы гистамина локализованы, помимо гладких миоцитов бронхов, на лимфоцитах, участвуя в их дифференцировке по ТЬ2 пути, и эозинофилах, опосредуя их хемотаксис в очаг воспаления. МЗ-холинорецептор экспрессируется тучными клетками, макрофагами, стимулирует секрецию ими медиаторов воспаления, провоспалительных цитокинов, хемоаттрактантов. МЗ-холинорецептор представлен также на эффекторных клетках - эозинофилах и нейтрофилах, обеспечивая хемотаксис и накопление их в очаге воспаления. Локализованный на эпителиальных клетках подслизистых желез бронха, МЗ-холинорецептор способствует усилению продукции слизи.

(32-адренорецептор, не только участвует в расслаблении гладких мышц бронхов, но и экспрессируется провоспалительными клетками - лимфоцитами, тучными, макрофагами, эозинофилами, нейтрофилами, оказывая при стимуляции противовоспалительное действие - блокирует выброс медиаторов, выработку провоспалительных цитокинов и приводит к синтезу противовоспалительных цитокинов.

Концепция работы

В процессе выполнения исследования показан дифференцированный вклад экспрессии генов в развитие фенотипов терапевтически резистентной БА, как

доказательство биологически закрепленных механизмов клинического полиморфизма тяжелой неконтролируемой БА.

Персистенция аллергического воспаления - базисный механизм «brittle» фенотипа тяжелой терапевтически резистентной астмы, что обосновано высокой активностью экспрессии генов МЗ-холинорецептора, HI-рецептора гистамина, Р2-адренорецептора в слизистой бронхиальной стенки больных «brittle» БА. Уровень мРНК МЗ-холинорецептора, HI-рецептора гистамина был значительно выше у пациентов с «brittle» астмой, в сравнении с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией», что характеризовалось высокой суточной лабильностью бронхов и патоморфологическими особенностями - высокой плотностью лимфоцитов, макрофагов и эозинофилов, выявленных у данной группы больных.

Тяжелая БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» отличается нейтрофильным паттерном воспаления, значительными явлениями ремоделирования бронхов, что приводит к необратимым структурным изменениям у этой группы больных и реализуется в феномен фиксированной бронхообструкции. Установленная статистически значимо более высокая экспрессия гена р2-адренорецептора в этой группе больных, вероятно, обусловлена влиянием терапии системными стероидами.

Предположительно, высокий уровень экспрессии р2-адренорецептора, выявленный в группе пациентов с тяжелой терапевтически резистентной БА и не приводящий к ожидаемым противовоспалительным и бронходилатационным эффектам, может быть следствием синтеза функционально неполноценной формы рецептора (Audet М., 2008; McGraw D.W., 2005), однако это требует дальнейшего изучения.

Терапевтическая резистентность пациентов доказана отсутствием контроля над заболеванием в ответ на назначение высоких доз базисной противовоспалительной ингаляционной терапии, а также отсутствием динамики патоморфологических и молекулярных параметров у пациентов с тяжелой астмой фенотипа «астма с фиксированной обструкцией», что подтверждает базисный вклад этих изменений в формирование терапевтической резистентности.

Таким образом, клинический полиморфизм тяжелой терапевтически резистентной астмы подтвержден новыми фундаментальными данными, раскрывающими дифференцированный вклад морфологических и молекулярных механизмов воспаления и бронхоконстрикции.

ВЫВОДЫ

1. Тяжелая терапевтически резистентная бронхиальная астма фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется значительными различиями по клинико-функциональным, патогенетическим, морфологическим и молекулярным параметрам болезни: «brittle» фенотип характеризуется обязательным наличием атопии, ранним началом заболевания (у 30% пациентов астма развивалась в возрасте до 12 лет), высокой среднесуточной лабильностью бронхов; фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается низким индексом атопии

(больший удельный вес эндогенной астмы, существенно более низкие значения сывороточного IgE), монотонностью показателей функции легких (пониженные показатели среднесуточной лабильности бронхов).

2. В бронхиальных смывах пациентов с «brittle» фенотипом Б А снижен общий цитоз за счет более низкого содержания лимфоцитов, эозинофилов и эпителиальных клеток по сравнению со среднетяжелой астмой. В бронхиальных смывах больных с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» преобладают нейтрофилы.

3. У больных «brittle» фенотипом тяжелой БА в составе клеточного инфильтрата слизистой оболочки бронхов преобладают гистио-макрофагальные элементы, лимфоциты и эозинофилы, в случае фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» — нейтрофилы.

4. В слизистой оболочке бронхов пациентов с тяжелой терапевтически резистентной БА в сравнении со среднетяжелыми больными выражены явления ремоделирования (уменьшение объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов, снижение относительного объема желез, значительное увеличение толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани). Фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается от «brittle» БА более выраженным утолщением базальной мембраны и снижением высоты эпителиального пласта.

5. Повышена экспрессия ряда генов воспаления и бронхоконстрикции ('CHRM3 и ADRB2) у пациентов с тяжелой БА по сравнению с группой среднетяжелых больных; «brittle» фенотип тяжелой БА характеризуется увеличением активности генов CHRM3 и H1R в сравнении со среднетяжелой БА и фенотипом тяжелой БА «астма с фиксированной обструкцией», и меньшей активностью гена ADRB2 по сравнению с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией».

6. Плотность гистио-макрофагальных элементов статистически значимо взаимосвязана с экспрессией CHRM3, плотность эозинофилов в слизистой бронхиальной стенки - с экспрессией гена H1R.

7. Пациенты среднетяжелой БА на фоне применения базисной терапии, в дозах соответствующих степени тяжести, достигли критериев контроля, что ассоциировано с достоверными изменениями морфологической картины воспаления в слизистой оболочке бронхов, а также снижением экспрессии генов CHRM3 и H1R, и увеличением уровня экспрессии ADRB2 в бронхиальных биоптатах.

8. Установлено улучшение клинико-функциональных показателей у больных с тяжелой БА на фоне применения адекватных степени тяжести доз базисной терапии, но критерии полного контроля достигнуты не были: у пациентов с «brittle» фенотипом частичный контроль достигнут у 30% пациентов, при этом сохранялся высокий уровень гиперреактивности бронхов по показателям ПК20 в тесте с гистамином и СЛБ; назначение адекватной степени тяжести базисной терапии у пациентов с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» не сопровождалось динамикой

патоморфологических показателей и статистически значимыми изменениями экспрессии изучаемых генов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для индивидуализации режимов базисной противовоспалительной терапии у пациентов с терапевтически резистентной бронхиальной астмой принципиально важным является тщательная диагностика фенотипов терапевтически резистентной бронхиальной астмы.

2. Пациентам с терапевтически резистентной бронхиальной астмой фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» с целью контроля воспаления в дыхательных путях и снижения его вклада в терапевтическую резистентность, рекомендовано использовать долговременную базисную терапию в стабильно высоких дозах в течение как минимум б месяцев. Конечной целью лечения должно быть достижение максимально возможного контроля тяжелой астмы.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Особенности течения тяжелой неконтролируемой бронхиальной астмы в сочетании с гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью / О.С. Кобякова, У.В. Рудык, Г.Э. Черногорюк, П.А. Селиванова // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2005. - №19. - С. 40-43.

2. Костная прочность у больных бронхиальной астмой по данным ультразвуковой остсометрии / O.II. Зоркальцсва, В.Д. Завадовская, О.С. Кобякова, О.Ю. Килина, П.А. Селиванова и др. // Материалы IV региональной конференции, посвященной 50-летию кафедры лучевой диагностики и Лучевой терапии ГОУ BIIO СибГМУ Росздрава. - Томск,- 2006. - С. 301-306.

3. Изменение биологических маркеров атопического воспаления на фоне базисной терапии бронхиальной астмы у детей / Д.В. Козырицкая, Е.В. Деева, Е.А. Старовойтова, H.A. Селиванова // Материалы Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 2007. - С. 703.

4. Геренг, Е.А. Морфологическая характеристика бронхобиоптатов у больных различными фенотипами тяжелой бронхиальной астмы / Е.А. Геренг, П.А. Селиванова // Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». - Москва. - 2007. -С. 195-196.

5. Геренг, Е.А. Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки бронхов у больных различными формами тяжелой бронхиальной астмой / Е.А. Геренг, П.А. Селиванова// Сибирский консилиум. -2007. -№7(62). - С. 30-31.

6. Селиванова, П.А. Особенности морфологической картины различных фенотипов тяжелой бронхиальной астмы / П.А. Селиванова, Е.А. Геренг, Е.С. Куликов // Материалы VIII конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о Человеке». - Томск. - 2007. - С. 22-24.

7. Оценка влияния вентиляционных нарушений на костную прочность при бронхиальной астме по данным ультразвуковой остеометрии / О.П. Зоркальцева, В.Д. Завадовская, О.С. Кобякова, В.М. Шевелев, О.Ю. Килина, П.А. Селиванова и др. // Материалы Невского радиологического форума «Новые горизонты». -Санкт-Петербург. - 2007. - С.139-140.

8. Показатели костной прочности у больных бронхиальной астмой с наличием и различным стажем базисной терапии / О.П. Зоркальцева, О.С. Кобякова, В.Д. Завадовская, Д.В. Капитанова, П.А. Селиванова // Сборник трудов Томской областной клинической больницы. - Томск. - 2007. - выпуск 14. - С. 60-64.

9. Огородова, JI.M. GINA 2006: контроль астмы как основная цель лечения и критерий эффективности терапии / JI.M. Огородова, И.А. Деев, П.А. Селиванова // Пульмонология. - 2007. - №6. - С. 98-103.

10. Клеточный состав бронхиальных смывов у больных тяжелой бронхиальной астмой / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Р.И. Плешко, П.А. Селиванова // Морфология (Материалы докладов IX конгресса МАМ). - 2008. - №2. - С. 31.

П.Патоморфологическая характеристика нестабильной бронхиальной астмы (фенотип brittle) / JI.M. Огородова, П.А. Селиванова, Е.А. Геренг и др. // Терапевтический архив. - 2008. - №3. - С. 39-43.

12. Геренг, Е.А. Тканевые изменения слизистой оболочки бронхов при лечении больных тяжелой бронхиальной астмой / Е.А. Геренг, Е.В. Константинова, П.А. Селиванова //Материалы XI межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины». - Абакан. - 2008. - С. 41-43.

Условные сокращения

БА - бронхиальная астма

БГР - бронхиальная гиперреактивность

БС - бронхиальный смыв

БФС - бронхофиброскопия

ГКС - глюкокортикостероиды

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 секунду

ПК20 - предельная концентрация гистамина, вызывающая падение ОФВ1 на 20%

ПСВ - пиковая скорость выдоха

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СЛБ - среднесуточная лабильность бронхов

ФВД - функция внешнего дыхания

ФП - флутиказона пропионат

ФЖЕЛ - форсированная жизненная емкость легких

ADRB2 - ген (й-адрснорецегстора

CHRM3 - ген МЗ-холинорецсптора

GINA - Global Initiative for Asthma

H1R - ген Н1-рецептора гистамина

IgE - иммуноглобулин класса Е

Подписано в печать ¿g,o( .200 5г. Усл.печ.листов О. £ ó" Печать на ризографе. Отпечатано в лаборатории оперативной полиграфии Си 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, тел. 53-04-( Заказ № ¿2__Тираж /О О экзе»

АКТУАЛЬНОСТЬ

Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) количество больных, страдающих бронхиальной астмой (БА), оценивается в 300 миллионов человек, распространенность астмы среди взрослого населения составляет от 1 до 18% в различных регионах [60, 158]. В России этот показатель колеблется от 4 до 6% [5, 19, 20]. Несмотря на значительные достижения в диагностике и лечении БА, внедрение в практику согласительных документов по БА (GINA, 2006 и др.), заболеваемость и смертность продолжают сохраняться на высоком уровне, особенно в случае тяжелого течения болезни.

Тяжелая БА является значимой медико-социальной проблемой, составляя в общей структуре заболевания 15-20% [3, 46, 207]. Тяжелая БА ассоциирована с высоким риском смерти, частыми жизнеугрожающими обострениями болезни, высоким уровнем инвалидизации, резким снижением качества жизни таких пациентов. Именно на долю тяжелой астмы приходится 80% всех затрат, связанных с БА, сюда входят как прямые затраты на медикаментозное обеспечение, оказание дорогостоящей экстренной помощи, так и непрямые затраты в связи с длительными периодами нетрудоспособности пациентов [46, 47].

По результатам проведенных в последние годы эпидемиологических исследований (AIRE, AIRCEE, AIA, НАБАТ) контроль над заболеванием регистрируется лишь у 5-20% больных, что связано в первую очередь с неадекватным степени тяжести лечением. Однако у части больных формируется терапевтически резистентная астма, характеризующаяся сохранением симптомов болезни, несмотря на применение высоких доз базисных препаратов [40, 80]. В литературе активно обсуждаются возможные причины, приводящие к терапевтической резистентности у тяжелых больных (персистенция эозинофильного воспаления, ремоделирование бронхов, формирование вторичной кортикостероидной резистентности, наследственная предрасположенность) [10, 15, 37, 56, 106, 223], но часто не принимается во внимание клиническая и патогенетическая гетерогенность терапевтически резистентной астмы. Так, на сегодняшний день выделяют три клинических фенотипа тяжелой неконтролируемой астмы (фатальная астма, фенотип «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией») [88], продемонстрированы и I патогенетические различия этих клинических фенотипов [10]. Однако отсутствуют данные о морфологических и молекулярных особенностях, лежащих в основе клинической гетерогенности тяжелой астмы.

Таким образом, изучение патоморфологических и молекулярных I характеристик тяжелой неконтролируемой астмы представляет значительный научный и практический интерес с точки зрения их вклада в формирование терапевтической резистентности и разработки оптимальных патогенетически обоснованных терапевтических стратегий.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установить клинико-функциональные, патоморфологические и молекулярные особенности тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы (фенотипы «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией») для разработки мероприятий патогенетически обоснованной терапии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Оценить особенности формирования, поло-возрастные, клинические и функциональные характеристики у больных тяжелой терапевтически резистентной астмой фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» в различные периоды болезни. Дать сравнительный анализ параметров функции внешнего дыхания и бронхиальной гиперреактивности у пациентов с изучаемыми фенотипами тяжелой БА.

2. Представить характеристику цитологического состава бронхиальных смывов, морфометрических и цитологических параметров бронхиальных биоптатов у больных тяжелой терапевтически резистентной БА феиотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» в сравнении со среднетяжелой БА. Оценить вклад эффекторных клеток воспаления и явлений ремоделирования в формирование клинических фенотипов тяжелой терапевтически резистентной астмы.

3. Оценить экспрессию генов воспаления и бронхоконстрикции (CHRM3, H1R, ADRB2) в бронхиальных биоптатах пациентов с изучаемыми фенотипами тяжелой БА в сравнении со среднетяжелой астмой и проанализировать их вклад в клинико-функциональные и патоморфологические особенности фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной БА.

4. Исследовать динамику клинико-функциональных, патоморфологических и молекулярных показателей на фоне использования базисной ингаляционной терапии в дозах, соответствующих степени тяжести заболевания (у пациентов с тяжелой БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» и среднетяжелой БА).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведена комплексная оценка патоморфологических (цитологический состав бронхиальных смывов, морфометрия и плотность клеточного инфильтрата в слизистой оболочке бронхов) и молекулярных (уровень экспрессии генов рецепторов воспаления и бронхоконстрикции - МЗ-холинорецептора, (32-адренорецептора, HI-рецептора гистамина в бронхиальных биоптатах, полученных при фибробронхоскопии) показателей у пациентов с фенотипами «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной астмы. Доказано, что в основе клинико-функциональных различий изучаемых фенотипов лежат выявленные патоморфологические и молекулярные особенности.

Приоритетными являются результаты, полученные методом дискриминантного анализа, показавшие, что наибольший вклад в формирование различий между обследованными группами вносят плотность нейтрофилов и высота эпителиального пласта в бронхиальных биоптатах, а также уровень экспрессии генов МЗ-холинорецептора и (32-адренорецептора.

Впервые при исследовании бронхиальных биоптатов установлены взаимосвязи между основными показателями ремоделирования тканей (толщина базальной мембраны, высота эпителиального пласта и относительный объем соединительной ткани) и такими клинико-функциональными характеристиками, как тяжесть, стаж БА, ОФВ1. Приоритетными являются данные о наличии положительных корреляций между плотностью в слизистой оболочке бронхов таких эффекторных клеток, как макрофаги и эозинофилы и показателем суточной лабильности бронхов.

Впервые выявлено, что плотность гистио-макрофагальных элементов в слизистой оболочке бронхов ассоциирована с уровнем экспрессии гена МЗ-холинорецептора, а плотность эозинофилов - с экспрессией HI-рецептора гистамина. Это служит подтверждением тесной взаимосвязи между морфологическими и молекулярными особенностями фенотипов БА и основными клинико-функциональными характеристиками заболевания.

Получены приоритетные данные с использованием цитологических, морфометрических и молекулярных методов об отсутствии динамики патоморфологических и молекулярных показателей у больных с тяжелой терапевтически резистентной БА фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» на фоне применения адекватных степени тяжести доз базисной ингаляционной терапии. Это реализуется в невозможность достижения критериев полного контроля и подтверждает базисный вклад выявленных патоморфологических и молекулярных изменений в формирование болезни и феномена терапевтической резистентности. Установлено, что на фоне использования базисной противовоспалительной терапии в группе среднетяжелых больных отмечается положительная динамика патоморфологических и молекулярных параметров, что приводит к достижению контроля над заболеванием.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Проведенное комплексное изучение клинико-функциональных, патоморфологических и молекулярных особенностей тяжелой терапевтически резистентной астмы позволяет обосновать наличие разных клинико-патогенетических фенотипов тяжелой терапевтически резистентной БА. I

Установлено, что «brittle» фенотип тяжелой астмы характеризуется преобладанием гистио-макрофагальных элементов и эозинофилов в составе инфильтрата слизистой оболочки бронхов, тогда как фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается нейтрофильным паттерном воспаления и выраженными явлениями ремоделирования бронхов, что позволяет рассматривать изученные патоморфологические характеристики в качестве дополнительных критериев диагностики фенотипов заболевания.

Полученные в настоящей работе знания о динамике патоморфологических и молекулярных параметров в бронхиальных биоптатах на фоне использования базисной противовоспалительной терапии позволяют использовать их в качестве дополнительных показателей эффективности лечения БА, что предоставляет возможность использования полученных данных непосредственно в клинической практике.

Патогенетически важные для фенотипов тяжелой терапевтически резистентной БА патоморфологические и молекулярные особенности, выявленные в исследовании, представляют большой практический интерес в качестве потенциальных молекулярных мишеней для разработки индивидуальных режимов противовоспалительной терапии бронхиальной астмы.

Результаты работы могут быть использованы в аллергологических, соматических, пульмонологических и функциональных отделениях научно-исследовательских институтов и учреждений практического здравоохранения, а также в материалах курсов усовершенствования врачей пульмонологов, аллергологов и терапевтов.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Клинические фенотипы «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» тяжелой терапевтически резистентной бронхиальной астмы характеризуются значительными различиями по клинико-функциональным параметрам болезни, в основе которых лежат патоморфологические особенности каждого фенотипа. Фенотип «brittle» тяжелой астмы ассоциирован с гистио-макрофагальной инфильтрацией и эозинофильным типом воспаления. Фенотип «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется преобладанием нейтрофилов и выраженными явлениями ремоделирования.

2. Тяжелая терапевтически резистентная астма ассоциирована с увеличением экспрессии в бронхиальных биоптатах генов МЗ-холинорецептора и р2-адренорецептора, в сравнении со среднетяжелыми больными. Отличительной особенностью «brittle» фенотипа тяжелой БА на молекулярном уровне является существенное увеличение уровня экспрессии генов МЗ-холинорецептора и HI-рецептора гистамина, в сравнении как со среднетяжелой астмой, так и с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» и меньшая экспрессия гена [32-адренорецептора в сравнении с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией». Фенотип тяжелой терапевтически резистентной БА «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется максимальным уровнем экспрессии гена р2-адренорецептора и статистически значимо меньшим уровнем экспрессии МЗ-холинорецептора в сравнении с «brittle» фенотипом.

3. У больных тяжелой терапевтически резистентной астмой фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» на фоне проводимой терапии отсутствует динамика патоморфологических параметров и уровня экспрессии изучаемых генов, не удается достичь критериев контроля астмы. При среднетяжелой астме положительная динамика патоморфологических и молекулярных параметров на фоне использования базисной ингаляционной противовоспалительной терапии приводит к достижению контроля над заболеванием.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Результаты работы применяются в учебном процессе кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, в учебном процессе кафедры госпитальной терапии БУ ВПО «Ханты-Мансийского государственного медицинского института», в работе пульмонологического отделения ОГУЗ «Томская областная клиническая больница», в учебном процессе кафедры аллергологии и пульмонологии ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» Росздрава.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы доложены и обсуждены на VII международном конгрессе молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2006), VIII международном конгрессе молодых учёных и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), XII Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), XVIII национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Екатеринбург, 2008), заседании Томского областного научно-практического общества иммунологов и аллергологов (Томск, 2005), совещании кафедры госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины СибГМУ (Томск, 2008).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 2 публикации «Перечня.» ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц, иллюстрирована 31 рисунком и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материалов и методов исследования (глава 2), результатов исследования (главы 3, 4, 5), обсуждения (глава 6), выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Библиографический указатель содержит 229 источников литературы, из которых 25 на русском языке, 204 на английском языке.

выводы

1. Тяжелая терапевтически резистентная бронхиальная астма фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» характеризуется значительными различиями по клинико-функциональным, патогенетическим, морфологическим и молекулярным параметрам болезни: «brittle» фенотип характеризуется обязательным наличием атопии, ранним началом заболевания (у 30% пациентов астма развивалась в возрасте до 12 лет), высокой среднесуточной лабильностью бронхов; фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается низким индексом атопии (больший удельный вес эндогенной астмы, существенно более низкие значения сывороточного IgE), монотонностью показателей функции легких (пониженные показатели среднесуточной лабильности бронхов).

2. В бронхиальных смывах пациентов с «brittle» фенотипом БА снижен общий цитоз за счет более низкого содержания лимфоцитов, эозинофилов и эпителиальных клеток по сравнению со среднетяжелой астмой. В бронхиальных смывах больных с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» преобладают нейтрофилы.

3. У больных «brittle» фенотипом тяжелой Б А в составе клеточного инфильтрата слизистой оболочки бронхов преобладают гистио-макрофагальные элементы, лимфоциты и эозинофилы, в случае фенотипа «астма с фиксированной обструкцией» - нейтрофилы.

4. В слизистой оболочке бронхов пациентов с тяжелой терапевтически резистентной БА в сравнении со среднетяжелыми больными выражены явления ремоделирования (уменьшение объемной плотности и высоты покровного эпителия, реснитчатых и бокаловидных эпителиоцитов, снижение относительного объема желез, значительное увеличение толщины базальной мембраны и относительного объема соединительной ткани). Фенотип «астма с фиксированной обструкцией» отличается от «brittle» БА более выраженным утолщением базальной мембраны и снижением высоты эпителиального пласта.

5. Повышена экспрессия ряда генов воспаления и бронхоконстрикции (CHRM3 и ADRB2) у пациентов с тяжелой БА по сравнению с группой среднетяжелых больных; «brittle» фенотип тяжелой БА характеризуется увеличением активности генов CHRM3 и H1R в сравнении со среднетяжелой БА и фенотипом тяжелой БА «астма с фиксированной обструкцией», и меньшей активностью гена ADRB2 по сравнению с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией».

6. Плотность гистио-макрофагальных элементов статистически значимо взаимосвязана с экспрессией CHRM3, плотность эозинофилов в слизистой бронхиальной стенки - с экспрессией гена H1R.

7. Пациенты среднетяжелой БА на фоне применения базисной терапии, в дозах соответствующих степени тяжести, достигли критериев контроля, что ассоциировано с достоверными изменениями морфологической картины воспаления в слизистой оболочке бронхов, а также снижением экспрессии генов CHRM3 и H1R, и увеличением уровня экспрессии ADRB2 в бронхиальных биоптатах.

8. Установлено улучшение клинико-функциональных показателей у больных с тяжелой БА на фоне применения адекватных степени тяжести доз базисной терапии, но критерии полного контроля достигнуты не были: у пациентов с «brittle» фенотипом частичный контроль достигнут у 30% пациентов, при этом сохранялся высокий уровень гиперреактивности бронхов по показателям ПК20 в тесте с гистамином и СЛБ; назначение адекватной степени тяжести базисной терапии у пациентов с фенотипом «астма с фиксированной обструкцией» не сопровождалось динамикой патоморфологических показателей и статистически значимыми изменениями экспрессии изучаемых генов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для индивидуализации режимов базисной противовоспалительной терапии у пациентов с терапевтически резистентной бронхиальной астмой принципиально важным является тщательная диагностика фенотипов терапевтически резистентной бронхиальной астмы.

2. Пациентам с терапевтически резистентной бронхиальной астмой фенотипов «brittle» и «астма с фиксированной обструкцией» с целью контроля воспаления в дыхательных путях и снижения его вклада в терапевтическую резистентность, рекомендовано использовать долговременную базисную терапию в стабильно высоких дозах в течение как минимум 6 месяцев. Конечной целью лечения должно быть достижение максимально возможного контроля тяжелой астмы.