Автореферат и диссертация по медицине (14.00.40) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование применения тканевой инженерии в оперативной андрологии

На правах рукописи

)

Гарин Николай Николаевич

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ В ОПЕРАТИВНОЙ АНДРОЛОГИИ

14.00 40 - Урология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2007

003163464

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Щеплев Петр Андреевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Рапопорт Леонид Михайлович доктор медицинских наук, профессор Михайличенко Владимир Васильевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский Государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Защита диссертации состоится «/7»

в « ¡у » часов на заседании Диссертационного совета Д 208 040 11 при Московской медицинской академии им ИМ Сеченова (119991, Москва, ул Трубецкая, д 8, строение 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Московской медицинской академии им ИМ Сеченова 117998, Москва, Нахимовский проспект, 49

Автореферат разослан « // 200$ г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Тельпухов Владимир Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время тканевая инженерия и клеточная терапия (которая подразумевает применение стволовых клеток, клеток предшественников и дифференцированных клеток) начинает применяться в клинической практике для лечения дегенеративных заболеваний и пороков развития, при ожогах и травмах, при позднем гидро- и уретерогидронефрозе, а также при стоматологических и косметологических операциях [Аляев Ю Г, Григорян В А и соавт, 2007, Репин В С , Сухих Г Т , 1998, Бокерия Л А и соавт , 2004, Угрюмов М В и соавт, 2004, Бй-аввег Н й а1, 2004, И^Ьск К й а1, 2004, Уо81ика\уа Т й а1, 2004, всЬишпищ Я е1 а1, 2004, КавЪпуа N й а1, 2004] Вместе с тем, существующие протоколы лечения требуют дальнейшего совершенствования и развития Современные разработки биомедицины, и в частности тканевой инженерии, могут быть использованы с целью повышения результативности лечения при восстановлении утраченных функционально значимых тканей

Наибольший прогресс в развитии данных направлений достигнут в таких специальностях, как онкология, травматология, стоматология, хирургия, урология и андрология Оперативная андрология является важной составной частью урологии и представляет собой область знаний о хирургической коррекции органов мужской половой системы при различных заболеваниях или в эстетических целях В большей части случаев собственной ткани органа при его дефекте или поражении бывает недостаточно, и тогда встает вопрос о поиске материалов и способов, которые могли бы заменить или восстановить недостающую часть органа или ткани

Анализ заболеваемости и общей распространенности андрологической патологии среди населения России демонстрирует повышение потребности в оперативной помощи андрологическим больным, постоянное увеличение

выполнения эстетических корригирующих вмешательств на

мужских половых органах

Традиционно для восстановления и замещения тканей и органов в оперативной андрологии используются аутологичные материалы - кожные лоскуты и трансплантаты, аутологичный жир, препуций, фасциальные лоскуты и т п, однако при их использовании, особенно это касается неурологических тканей, наблюдаются различные неблагоприятные эффекты Другим распространенным подходом является использование различных синтетических нерассасывающихся материалов При использовании вышеупомянутых подходов не всегда достигается клинически благоприятный эстетический и функциональный результат из-за проблем механического, структурного, функционального плана либо по причине биологической несовместимости [Cartwnght PC et al, 1989, Atala A , 1997]

Основные проблемы при использовании синтетических нерассасывающихся материалов связаны с неотработанной хирургической техникой, формированием камней в областях их использования В большинстве случаев на месте трансплантации ауто- или аллологичного лоскута возникают контрактуры или происходит его рассасывание (резорбция) вследствие воспалительного ответа или недостатка нормальной регенерации мышечной ткани

Идеальный материал для замещения любого органа мочеполовой системы должен обладать следующими свойствами не вызывать фиброза и образования бляшек после операции, не вызывать фиброза подлежащих тканей, обладать хорошей гистосовместимостью, сохранять эластичность в процессе замещения дефекта

При анализе методик утолщающих фаллопластик отмечается, что при использовании аутологичного жира эстетические результаты являются непредсказуемыми в связи с резорбцией жира, использование сеток из синтетических нерассасывающихся материалов связано с повышением риска воспалительного процесса в послеоперационном периоде, использование перемещенных лоскутов характеризуются высокой технической сложностью

При повторной имплантации протезов полового члена часто наблюдается недостаточность и слабость белочной оболочки полового члена, что приводит к эрозии протезов, требующей хирургической коррекции В этом случае при повторной имплантации протезов обеспечить нормальные эстетические и функциональные результаты - значит восстановить структуру белочной оболочки Использование для этого перемещенных лоскутов, синтетических нерассасывающихся сеток в целом сложно и малоэффективно [Щеплев П А , Курбатов Д Г , 2002]

Анализ специальной литературы показал, что существует множество перспективных направлений в реконструкции полового члена при повторной имплантации протезов полового члена и для эстетической коррекции толщины пениса Однако перспективы повышения функциональной эффективности реабилитации пациентов полностью не исчерпаны Существующие методы недостаточно эффективны, так как они не позволяют восстанавливать все составляющие элементы органа с использованием однородного (близкого по морфологической, анатомической и функциональной структуре) материала Идеальным материалом для такого рода операций может стать только собственная ткань органа, а наиболее перспективным методом ее получения является тканевая инженерия Принцип тканевой инженерии - восстановление нормальной структуры органа или ткани путем использования специальных рассасывающихся полимеров либо в сочетании с аутологичными клетками, либо изолированно

Поэтому большой интерес как в практическом отношении, так и в научном плане представляет использование специальных синтетических рассасывающихся материалов в эстетической и реконструктивной хирургии полового члена

При обилии такого рода полимеров в экспериментальных исследованиях наблюдается различная их эффективность, даже при одинаковом строении, а алгоритм оценки полимеров с целью прогнозирования результатов их клинического использования не разработан

В последние годы появились новые методики получения ткани на трехмерных полимерных матриксах, которые можно использовать при трансплантации с целью восстановления утраченных тканей [Krettek С , 2002, Zimmermann WH, Eschenhagen Т, 2003, Cancedda R et al, 2003, Bosch U, Garner J P , 2004] Биосовместимые матриксы для создания тканеинженерных конструкций должны характеризоваться широким спектром параметров Для совершенствования существующих и разработки новых материалов для тканевой инженерии необходима разработка модели, которая позволила бы проводить изучение особенностей взаимодействия клеток с трехмерным внеклеточным матриксом в ходе формирования новых тканей В данной работе мы разработали такую модель и апробировали ряд подходов, которые позволяют изучать пролиферацию клеток и оценивать их функциональное состояние во время культивирования в трехмерном матриксе В качестве полимера был использован матрикс из сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛПГ), представляющий собой биодеградируемый синтетический материал, разработанный для тканевой инженерии

Цель исследования

Обоснование и разработка методики применения тканевой инженерии в оперативной андрологии

Задачи исследования:

1 Провести экспериментальное исследование взаимодействия культуры клеток HeLa с биополимером полилактогликолевой кислоты, оценить их жизнеспособность при культивировании, уровень окислительного стресса

2 Выработать методику, показания, противопоказания к использованию тканевой инженерии при эстетическом утолщении полового члена, провести анализ результатов

3 Сравнить эффективность использования рассасывающегося полимера полилактогликолевой кислоты для утолщения полового члена при

изолированном применении и в сочетании с культурой культивированных аутофибробластов

4 Выработать методику, показания, противопоказания к использованию тканевой инженерии при реконструкции белочной оболочки полового члена при реимплантации протезов полового члена, провести анализ результатов

5 Оценить стабильность результатов операций по эстетическому утолщению полового члена и реконструкции белочной оболочки полового члена

Научная новизна

Впервые в оперативной андрологии разрабатывается возможность применения тканевой инженерии в виде имплантации синтетических рассасывающихся полимеров Проводится экспериментальное обоснование возможности взаимодействия клеток человека с биоматериалами Проводится исследование по применению указанных принципов в эстетической и реконструктивной хирургии полового члена В представляемой работе были оценены закономерности прикрепления и пролиферации клеток линии НеЬа в полимерах полилактогликолевой кислоты, а также оценены некоторые параметры, отражающие состояние клеток в полимере и развитие в них окислительного стресса

На основании результатов проведенного клинико-экспериментального исследования разработана и научно обоснована методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена с применением метода тканевой инженерии

Предложена совершенно новая методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена

Практическая значимость работы

Разработанная методика оценки биополимерных материалов, используемых в оперативной андрологии, позволяет прогнозировать

клинические результаты их использования и разработать подходы для улучшения результатов применения таких материалов

Разработанная методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена у андрологических больных позволяет восстановить все составляющие элементы органа, а также функционально достаточный объем и форму

На основе проведенных исследований определены показания и противопоказания к данному методу реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена

Представленные результаты исследования могут служить основой для практического применения данного метода в клинической практике, а также позволяют продолжить разработку и усовершенствование методики для реконструкции других органов и тканей, что может быть использовано в других хирургических специальностях

Основные положения, выносимые на защиту

1 Для прогнозирования эффективности использования биополимеров в андрологии, они должны быть исследованы на предмет взаимодействия с клетками по универсальной методике культивирования с оценкой жизнеспособности и стрессоустойчивости Полимеры полилактогликолвой кислоты являются приемлемым субстратом для роста и развития клеток

2 Операция имплантации рассасывающихся полимеров является эффективной операцией выбора при необходимости выполнения утолщающей фаллопластики и позволяет добиться стабильного увеличения окружности полового члена

3 Эффективность утолщения полового члена при использовании полимера и полимера в комбинации с культурой аутофибробластов сопоставима и статистически не различается

4 У пациентов со слабостью белочной оболочки при повторной имплантации протезов полового члена использование трехмерных

рассасывающихся полимеров для корпоропластики является

эффективным методом укрепления белочной оболочки и позволяет добиться адекватной сексуальной функции

Внедрение результатов работы в практику

Результаты работы внедрены в практическое здравоохранение Смоленской областной клинической больницы, учреждений здравоохранения Клинского муниципального района, а также в практику ГУ Научный центр биомедицинских технологий РАМН

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на

1 8 Конгресс Европейского общества по сексуальной медицине Дания, Копенгаген, 3-5 декабря 2005 г

2 Международный мастер-класс по хирургической андрологии WORLD OF ANDROLOGY-3, Москва, 20-21 ноября 2006 г , ФГУ КБ УД Президента РФ

3 Первый конгресс Иорданского общества русскоговорящих врачей, 29-30 ноября 2006, Амман, Иордания

4 Конференция по поликлинической хирургии кафедры поликлинической хирургии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава», Институт им Вишневского, Москва, 13 декабря 2006

5 Международный Конгресс по андрологии, 27-29 апреля 2007, Сочи, ОК «Дагомыс» УД Президента РФ

6 Симпозиум Высокотехнологичная помощь в урологии проблемы и перспективы развития, Москва, 26 сентября 2007, ФГУ НИИ Урологии Росмедтехнологий

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них три в журналах, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий » ВАК Министерства образования и науки РФ

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 151 странице, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Работа снабжена 23 рисунками и 22 таблицами Литературный обзор содержит 45 отечественных и 181 иностранный источник

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Экспериментальный этап Реагенты. Для проведения экспериментального этапа были использованы следующие реагенты хлорид натрия, дигидрофосфат натрия и гидрофосфат натрия, Ы-ацетил-Ь-цистеин (NAC), глутатион, диметил сульфоксид, бычий сывороточный альбумин (БСА), сахароза, гексаметилдисилазан, гематоксилин, эозин Y, четырехокись осмия (OSO4) (Сигма, США), малеимидный реагент ThioGlol® 1 (Merck), среда DMEM для культивирования клеток, трипсин, буфер Хенкса (Панэко, Россия), сыворотка эмбрионов коров (БиолоТ), глютаровый альдегид (Реанал, Болгария), уранилацетат (EMS, США), какодилат натрия (BDH Chemical, Англия) Культура клеток Клетки линии HeLa (клетки эпителиоидной карциномы человека) выращивали на среде DMEM с 10%-ной сывороткой эмбрионов коров (СЭК) в атмосфере 5%-ного С02 при температуре 37°С Жизнеспособность клеток составляла не менее 98% Методы экспериментального исследования. В качестве трехмерного матрикса для культивирования клеток была использована губка толщиной 3 мм из сополимера молочной и гликолевой кислоты (ПЛПГ) (Innotechmedical Inc , Сеул, Южн Корея) После стерилизации и промывки матрикс заполняли

суспензией клеток, инкубировали в течение 12, 48 часов и 7 суток В ряде экспериментов клетки культивировали в присутствии 0 5 mM NAC Измерения производились в гомогенате клеток Клеточные гомогенаты были приготовлены путем трехкратного повторения процедуры замораживания до -115°С с последующим оттаиванием Затем гомогенат с полимером центрифугировали 5 мин при 1500 g, удаляли полимер, ресуспендировали и замораживали гомогенат до измерений Все измерения проводились на образцах, приготовленных из кусочков полимера объемом около 150 мкл Для оценки роста и развития клеток в полимере применялись:

• Измерение общего белка в гомогенатах HeLa клеток

• Флуоресцентный анализ восстановленного глутатиона (GSH) в гомогенатах HeLa клеток По методу Kagan V Е , Yalowich J С et al, 1999

• Электронная микроскопия

• Световая микроскопия

Клинический этап

По разработанной методике проведено лечение 42 пациентам Выполнено 34 эстетические операции по утолщению полового члена (группа 1) и 8 реконструктивных операций (группа 2) при повторной имплантации протезов полового члена В качестве группы сравнения исследовались 73 пациента, которым выполнялись эстетические операции по утолщению полового члена с использованием биосовместимых рассасывающихся матриц и культуры аутофибробластов

Период включения пациентов в исследование - 2004-2007 гг Средний срок наблюдения составил 2,44 года

Всем пациентам при планировании лечения проводилось полное комплексное обследование

Таблица 1 Распределение оперированных больных основной

группы по возрасту

Возрастная группа Всего

До 30 31-40 41-50 51-60 61-70

Количество пациентов 15 17 7 2 1 42

% к общему числу 35,7% 40,5% 16,6% 4,8% 2,4% 100%

Возраст оперированных пациентов — от 19 до 62 лет Средний возраст 35,67±9,98 В 100% наблюдений оперированы больные трудоспособного возраста Это характерно и для пациентов первой группы, так как многочисленные эпидемиологические исследования показывают наибольший процент мужчин молодого возраста среди желающих увеличить половой член, и для пациентов второй группы, так как хирургическое лечение эректильной дисфункции так же, как правило, выполняется у мужчин трудоспособного возраста

Средний возраст в группе 1 составил 32,65 лет

Средний возраст в группе 2 составил 48,5 лет

Таблица 2 Распределение оперированных больных основной группы по

нозологическим формам и характеру выполненного оперативного лечения

Диагноз/состояние Количество пациентов % к общему числу Выполненное оперативное вмешательство

Органическая эректильная дисфункция Протез полового члена Эрозия протезом белочной оболочки полового члена 8 19,05 Корпоропластика при реимплантации протезов полового члена

Пенильная дисморфофобия 34 80,95 Первичное утолщение полового члена

ИТОГО 42 100

Пациенты с пенильной дисморфофобией вошли при анализе в группу 1, в которой выполнялось первичное утолщение полового члена Пациенты с

органической эректильной дисфункцией вошли при анализе в

группу 2, в которой пациентам выполнялась реконструкция белочной оболочки полового члена при реимплантации протезов полового члена

Методы диагностики. Методы оценки результатов

Всем пациентам, включенным в группы, независимо от нозологической формы в диагностических целях проводились следующие исследования

1 Сбор жалоб, анамнеза, физикальное исследование При этом тщательно собирался сексуальный анамнез

2 Измерение полового члена

3 Опросники - Международный индекс эректильной функции (МИЭФ), опросник качества жизни ЭБ-Зб

4 Общеклинические методы исследования общий анализ крови, мочи, биохимическое исследование крови (общий белок, мочевина, креатинин, билирубин общий и свободный, АлТ, АсТ, ЩФ, глюкоза, триглицериды, липопротеины низкой и высокой плотности, холестерин)

5 Инструментальные методы исследования допплрография сосудов полового члена, электрокардиография (по показаниям), рентгенография грудной клетки (по показаниям)

6 Консультации терапевта и прочих специалистов (по показаниям) Оценка результатов проводилась с использованием следующих методов

1 Визуальное исследование и измерение

2 Опросник качества жизни ЗБ-Зб

3 Опросник МИЭФ

Оперативное лечение Первичная увеличительная фаллопластика

Показанием для эстетического вмешательства по утолщению полового члена в группе 1 явилась субъективная неудовлетворенность пациента размерами полового члена (толщиной)

Т е всем пациентам первой группы были выполнены эстетические вмешательства

Среди общих противопоказаний были выделены

1 Тяжелые соматические заболевания любые соматические заболевания в стадии декомпенсации или субкомпенсации или оцениваемые как тяжелые или средней тяжести, общее состояния, оцениваемое как тяжелое или средней тяжести

2 Любое нестабильное терапевтическое или психиатрическое состояние, злоупотребление каким-либо веществом, которое, по мнению врача, может нарушить способность пациента объективно и адекватно оценивать свое состояние

3 Значимые отклонения лабораторных показателей повышение уровня креатинина, трансаминаз, нарушения КЩС крови, нарушение электролитного баланса и др

Специальные противопоказания

4 Указание в анамнезе, что пациент настаивает на операциюЬ по утолщению полового члена в связи с давлением сексуального партнера (объяснение см выше)

5 Нереалистичные ожидания пациента относительно результатов операции Нежелание пациента поверить в разумные возможности хирургического вмешательства приводит к неудовлетворенности результатами операции в дальнейшем

Метод выполнения операции первичной утолщающей фаллопластики

Операция проводилась под эпидуральной анестезией Положение больного на спине Выполняется субкоронарный разрез кожи полового члена Кожа полового члена отводится проксимально Расширяется пространство между фасцией Бака и мясистой оболочкой, куда помещается матрица после коррекции ее размера ножницами Область уретры оставляется свободной Мясистая оболочка и кожа последовательно зашиваются Обычно дренаж не ставится В послеоперационном периоде половой член туго бинтуется эластичным бинтом Снятие швов осуществляется на 10 сутки Возможны модификации методики в виде имплантации полимера под дорсальный

сосудисто-нервный пучок полового члена, выполнения операции через комбинированный пеноскротальный и субкоронарный доступы

Реимплантация протезов полового члена. Корпоропластика При выполнении операции по реимплантации протезов полового члена с реконструкцией белочной оболочки показанием для операции была органическая эректильная дисфункция, протез полового члена, эрозия белочной оболочки протезом полового члена

Общие противопоказания - аналогичны таковым при выполнении увеличительной фаллопластики

Специальным противопоказанием являлось отсутствие у пациента желания корригировать имеющееся состояние

Метод выполнения операции по реимплантации протезов полового члена с корпоропластикой синтетическим рассасывающимся материалом

Положение больного на спине Операция проводилась через пенопубикальный доступ Выполняется разрез кожи, доступ к кавернозным телам Проводятся корпоротомии Стержни протезов полового члена удаляются При удалении трехкомпонентных протезов полового члена дополнительно удаляется резервуар и помпа из мошонки Проводится бужирование кавернозных тел и их измерение для подбора размера протеза Проводится имплантация протеза полового члена Ушивание корпоротомий Выполняется субкоронарный разрез кожи полового члена Кожа полового члена отводится проксимально Расширяется пространство между фасцией Бака и мясистой оболочкой, куда помещается матрица после коррекции ее размера ножницами Область уретры оставляется свободной Мясистая оболочка и кожа последовательно зашиваются

Результаты исследования и их обсуждение Экспериментальный этап. В эксперименте были разработаны алгоритмы оценки полимеров и культивирования на них клеток, что является универсальным способом оценки любых биосовместимых материалов, применяемых для тканевой инженерии При статическом исследовании полимера было выявлено, что по результатам сканирующей электронной

микроскопии матрикс ПЛПГ представлял собой пористый материал, образованный полыми ячейками овальной уплощенной формы. На поверхности стенок ячеек отмечалось наличие округлых или овальных углублений диаметром 1-10 мкм и глубиной до 10 мкм. Размеры ячеек варьировали от 120 до 900 мкм. Толщина стенок ячеек варьировала от 20 до 200 мкм, в среднем около 60 мкм. Объемная доля полимера в матриксе около 25%. При инкубации было зафиксировано отсутствие структурных изменений в течение всего времени наблюдения. Световая микроскопия выявила пустые ячейки, не заполненные раствором альбумина, объем которых составлял около 20% от объема всех ячеек.

На матриксе были культивированы клетки стандартизированной лабораторной культуры НеЬа. Через 12 часов культивирования на поверхности ячеек матрикса отмечалось наличие единичных клеток округлой формы. На 7 сутки культивирования поверхность стенок отдельных ячеек была покрыта большим количеством плотно расположенных друг к другу плоских, полигональных клеток. Была изучена зависимость между содержанием общего белка в гомогенате и количеством клеток при культивировании в стандартных условиях. Культивирование клеток в течение недели показало, что они успешно растут в полимере. К 7-му дню рост клеток существенно замедлялся (рис. 1).

70

0.5 2 3 7

Время культивирования, дни

Рис. 1. Динамика роста клеток в полимере.

Среднее время удвоения составляло около 60 часов. Количество пролиферирующих клеток имело сильную отрицательную корреляцию со временем культивирования.При оценке уровня внутриклеточного восстановленного глутатиона выявлено, что уровень вБИ достоверно не

изменялся в течение всего времени культивирования. Были проведены дополнительные эксперименты по культивированию клеток в присутствии >1-ацетил-цистеина. Внутриклеточный уровень вБН и рост не изменились под действием ЫАС (рис. 2).

Рис. 2. Уровень внутриклеточного глутатиона в присутствии/отсутствии Л-ацетил-цистеина.

Клинический этап. Из 42 мужчин удалось проследить за 40 пациентами. Двое пациентов сменили страну проживания и контроль их состояния проводился по телефону. Измерение окружности полового члена проводилось на 6, 12 (основная контрольная точка), 24, 36 месяц после операции (табл. 3).

Таблица 3. Средние значения окружности полового члена (в 1 и 2 группе) до и на 12 месяц после операции.

Группа Окружность полового члена до операции Окружность полового члена после операции Увеличение окружности, см.

Группа 1 7,82±1,5 11,64±1,9 3,82*

Группа 2 11,13±2,1 13±0,96 1,88*

Контрольная группа 7,58±1,4 10,87±2,2 3,29*

* - различия статистически значимы, Р<0,05.

Зависимость показателей увеличения окружности полового члена от различных факторов представлена в таблице 4.

Таблица 4 Зависимость показателей увеличения окружности полового члена от различных факторов

Группа Корреляция с возрастом Корреляция с наличием сопутствующих заболеваний Корреляция с объемом полимера

Группа 1 0,035 - 0,67

Группа 2 0,4 0,013

Контрольная группа 0,032 - 0,55

Были проанализированы данные об интервальной характеристике результативности операций в первой группе (табл 5)

Таблица 5 Результаты оперативного лечения в 1 группе

Увеличение 1 группа (кол-во 2 группа (кол- Контрольная

окружности, см пациентов) во пациентов) группа (кол-

во

пациентов)

<2 2 3 2

2-3* 3 5 6

3-4* 6 - 28

>4* 23 - 37

ИТОГО 34 8 73

* - различия статистически значимы, Р<0,05

Для оценки субъективной неудовлетворенности пациентов размерами полового члена до операции и на 12 мес пациентам задавался вопрос «Удовлетворяет ли вас размер вашего полового члена9» Результаты представлены в таблице 6

Таблица 6 Удовлетворенность пациентов размерами полового члена

До операции После операции

Группа 1 0 из 34 (0%) 29 из 34 (85,3%)*

Группа 2 5 из 8 (62,5%) 7 из 8 (87,5%)*

Контрольная группа 0 из 73 (0%) 70 из 73 (95,9%)*

* - различия статистически значимы, Р<0,05

При оценке МИЭФ в первой группе средние значения составили 28,94±0,99 до операции и 28,70±1,21 после операции Различия не являются статистически достоверными Сходная ситуация наблюдалась и в группе контроля, где значения соответственно составили 29,1±0,73 и 29,23±0,52 (различия статистически недостоверны) У десяти пациентов первой группы было произведено допплерографическое исследование кровотока в сосудах полового члена Было зафиксировано, что показатели статистически значимо не изменялись (табл 7)

Таблица 7 Допплерографические показатели кровотока в сосудах полового члена у 10 пациентов 1 группы до и на 12 мес после операции (М±ш, после интракавернозного введения Юмкг простагландина El)

Показател и Пациенты 1 группы (п=10), до операции Пациенты 1 группы (п=10), 12 мес после операции

Кавернозные артерии Кавернозные артерии

Vmax, см/с 29,1±1,5 31,0±2,1

Vmm, см/с 0,41 ±0,4 0,44±0,6

Vmed, см/с 4,9±0,5 4,7±0,7

RI 0,91±0,07 0,89±0,09

PI 2,23±0,18 2,38±0,26

Во всех случаях различия статистически недостоверны

Данные, полученные в ходе анкетирования пациентов по опроснику 36 представлены в таблице 8

Таблица 8 Оценка качества жизни (ЗБ-Зб) в группах 1 и 2

Показатели Минимальное и максимальное значения Группа 1 Группа 2

До операции После операции До операции После операции

Физическое функционирование(РБ) 10-30 30 30 28,857143 28,71429

Ролевое (физическое) функционирование(ЯР) 4-8 8 8 7,571429 7,714286

Боль (Р) 2-12 2 2 2 2

Общее здоровье (ОН) 5-25 20,58824 22,26471 17,71429 19,57143

Жизнеспособность (УТ) 4-24 15,64706 15,676471 17,14286 17,142857

Социальное функционирование(ЭР) 2-10 6 6,352941 6 6,714286*

Эмоциональное функционирование (КЕ) 3-6 4,36571 5,45332* 5,285714 5,428571

Психологическое здоровье (МН) 5-30 20,94118 25,91176* 18,71429 25,28571*

различия статистически достоверны

Осложнения операций

Осложнения после операции были незначительными Осложнение в основной и контрольной группе представлены соответственно в таблицах 9 и 10

Таблица 9 Осложнения оперативного лечения в исследуемой группе

Осложнение Кол-во %

Накопление жидкости под кожей полового члена 2 4,76%

Продолжительные выделения через фистулы в местах швов 2 4,76%

ИТОГО 4 9,52%

В целом осложнения расценивались как легкие и не представляли серьезной опасности для пациентов

Таблица 10 Осложнения оперативного лечения в контрольной группе

Осложнение Количество %

Некроз 2 2,7%

Продолжительная экссудация через фистулы в местах швов 4 5,4%

ИТОГО 6 8,2%

Отдаленные результаты

Для оценки отдаленных результатов оперативного лечения и оценки динамики утолщения полового члена окружность полового члена была измерена у пациентов во всех контрольных точках Средний период наблюдения составил 2,44 года В точке 36 месяцев были оценены 100% контрольной группы (73 пациента), а также 6 пациентов группы 2 (72,5%) и 28 пациентов группы 1 (77,8%) Результаты представлены в таблице 11

Таблица И Отдаленные результаты оперативного лечения, окружность полового члена, см

Группа До операции 6 мес. 12 мес. 24 мес 36 мес.

Группа 1 7,82±1,5 12,3±2,6 11,65±1,9 11,5±1,9 11,53±2,1

Группа 2 11,13±2,1 12,6±2,0 13±0,96 13,2±0,9 13,2±1,1

Контрольная группа 7,58±1,4 11,58±2,2 10,87±2,2 10,6±2,0 10,8±1,2

Результаты оперативного лечения на 6 месяц после операции в целом превышали таковой на 12 месяц Толщина полового члена, которая была зафиксирована на 12 месяц оставалась стабильной до 3-го года наблюдения, что свидетельствует о стабильности результата операции

Обсуждение

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что клетки организма человека растут на биологических совместимых материалах При этом рост клеток обусловлен наличием самого полимера Клетки тканей, стремясь к заполнению доступных пространств полимера прорастают его и приобретают межклеточные связи, которые сохраняются и после рассасывания полимера

Подобные процессы обеспечивают стабильный результат при применении тканевой инженерии для моделирования роста тканей в условиях, когда требуется наращивание определенного слоя ткани

Для доказательства эффективности тканевой инженерии в оперативной андрологии мы использовали данный метод для наращивания соединительной ткани под кожей или под фасцией полового члена Результаты оказались стабильными и весьма значительными При этом было доказано, что применение культивированных аутофибробластов для этих целей не является строго необходимым и для достижения результатов достаточно использования биосовместимых полимеров

Второй областью, в которой была обоснована эффективность тканевой инженерии в андрологии стала корпоропластика при реимплантации протезов полового члена у пациентов с эрозией белочной оболочки пениса протезами Было показано, что универсальный принцип наращиваний ткани может быть применен и для реконструкции белочной оболочки и предотвращений эрозии протеза

1 В литературе показана и доказана способность клеток уротелия к росту на биологических носителях Это может использоваться при лечении коротких стриктур уретры путем имплантации биоматериалов в область иссечения пораженного участка уретры

2 Разработанный подход может применяться при операциях по поводу гипоспадии, для реконструкции полового члена особенно при дистальных формах гипоспации

3 Имплантация биологически совместимых матриц может найти применение для создания каркаса для имплантации протезов полового члена при формировании неофаллоса

4 Очевидна потенциальная эффективность применения тканевой инженерии для моделирования роста кожи, в том числе при оперативных пособиях по поводу иссечения олеогранулем полового члена

Таким образом обоснованное применение тканевой инженерии в оперативной андрологии является перспективным и оправданным методом при использовании в сочетании с эстетическими и реконструктивными вмешательствами

Выводы

1 При культивировании в биополимере полилактогликолевой кислоты стереоультраструктурная организация клеток, выращенных в полимере не отличается от таковой клеток, выращенных во флаконах, динамика роста клеток на полимере близка к скорости роста в стандартных условиях во флаконах Клетки НеЬа не подвержены стрессорным воздействиям в матриксе в течение всего времени культивирования

2 Методика имплантации трехмерного рассасывающегося полимера для первичного утолщения полового члена является эффективным и безопасным способом утолщающей фаллопластики, среднее приращение окружности полового члена составляет 3,8 см, процент осложнений составляет 9,52%, при этом тяжелых осложнений не отмечается

3 Статистически значимые преимущества применения биоматериалов и культуры культивированных аутофибробластов по сравнению с применением биоматериалов отсутствуют При применении первого метода среднее приращение окружности полового члена составляет 3,8 см, второго - 3,29 см

4 Методика имплантации трехмерного рассасывающегося полимера для корпоропластики при реимплантации протезов полового члена является эффективным способом корпоропластики и позволяет добиться укрепления белочной оболочки у 100% пациентов, восстановления нормального положения протеза и адекватной сексуальной функции

5 Результаты операций по эстетическому утолщению полового члена и реконструкции белочной оболочки полового члена остаются стабильным на протяжении трехлетнего периода наблюдения

Практические рекомендации

1 Все полимеры, использование которых планируется при оперативном лечении пациентов, должны быть исследованы на предмет взаимодействия с клетками по разработанной методике

2 При оценке полимерных биоматериалов следует исследовать жизнеспособность и проявления стрессорного воздействия на клетки при культивировании

3 Для первичного утолщения полового члена предлагается использовать трехмерны© рассасывающиеся полимеры по разработанной методике

4 Достоверных данных о преимуществе использования тканевой культуры в комбинации с трехмерными рассасывающимися полимерами по

сравнению с изолированным использованием полимера не выявлено Оба метода имеют одинаковую эффективность

5 У сложного контингента больных со слабостью белочной оболочки при повторной имплантации протезов полового члена целесообразно использовать трехмерные рассасывающиеся полимеры для корпоропластики по разработанной методике, что улучшает результаты оперативного лечения таких больных

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Scheplev Р, Gvasalia В, Garin N, Perovic S Use of synthetic biodegradable polymer for corporeal reconstruction during penile reimplantation // Journal of Sexual Medicine Book of abstracts 8th ESSM Congress - Copenhagen -2005 -p 15

2 Гусев С A , Щеплев П A , Гарин H Н , Борисенко Г Г Разработка подходов к оценке имплантируемых трехмерных полимерных материалов для тканевой инженерии // Перспективные материалы - №6 - 2005 - с 49-56

3 Щеплев П А , Гарин Н Н , Гвасалия Б Р , Сидорова Ю В Статистическая обработка данных в урологии // Андрология и генитальная хирургия -№2 -2006 - с 53-61

4 Nikolay Garin, Peter Scheplev, Badn Gvasaliya, Sergey Gusev, Gngory Bonsenko Development of approaches to estimate the implanted three-dimensional polymeric materials for tissue engineering in genital surgery // Journal of Sexual Medicine Book of abstracts 9th ESSM Congress - Vienna -2006 - p 85

5 Щеплев П A , Гарин H H , Гвасалия Б P , Сидорова Ю В Применение статистических методов обработки данных в урологии // Кремлевская медицина - №3 - 2006 - с 52-57

6 Щеплев П А , Гарин Н Н , Захарченко А В Опыт применения тканевой инженерии в эстетической и реконструктивной урологии (обзор литературы) //Андрология и генитальная хирургия -№4 -2006 - с 15-25

7 Щеплев П А , Гарин Н Н , Гвасалия Б Р , Меньщиков К А Осложнения при применении вакуумных устройств после увеличительной фаллопластики с применением тканевой инженерии // Тезисы научных трудов Всероссийского конгресса по андрологии, 27-29 апреля 2007 -Сочи, Дагомыс - с 92

8 Щеплев П А, Гарин Н Н, Гвасалия Б Р , Sava Perovic, Jae-Eon Jung, Jae-Sang Byun, Miroslav Djordjevic, Jin-Hong Kim Увеличительная фаллопластика с использованием тканевой инженерии // Тезисы научных трудов Всероссийского конгресса по андрологии, 27-29 апреля 2007 -Сочи, Дагомыс - с 94

Подписано в печать 24 12 2007 Формат 60x90 1/16 Печать цифровая Бумага «Performer» Печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ 8029

Отпечатано в ФГУП «Производственно-издательский комбинат ВИНИТИ», 140010, г Люберцы Московской обл, Октябрьский пр-т, 403 Тел 554-21-86

Актуальность темы

В настоящее время тканевая инженерия и клеточная терапия (которая подразумевает применение стволовых клеток, клеток предшественников и дифференцированных клеток) начинает применяться в клинической практике для лечения дегенеративных заболеваний и пороков развития; при ожогах и травмах, при позднем гидро- и уретерогидронефрозе, а также при стоматологических и косметологических операциях [Аляев Ю.Г., Григорян В.А. и со-авт., 2007; Репин B.C., Сухих Г.Т., 1998; Бокерия Л.А. и соавт., 2004; Угрю-мов М.В. и соавт., 2004; Strasser Н. et al., 2004; Nishida К. etal., 2004; Yoshi-kawa Т. et al., 2004; Schimming R. et al., 2004; Kashiwa N. et al., 2004]. Вместе с тем- существующие протоколы лечения требуют дальнейшего совершенствования и развития. Современные разработки биомедицины, и в частности тканевой инженерии; могут быть использованы с целью повышения результативности лечения при восстановлении утраченных функционально значимых тканей. Оперативная андрология является важной составной частью урологии и представляет собой область знаний о хирургической коррекции органов мужской половой системы при различных заболеваниях или в эстетических целях. В большей части случаев собственной ткани органа при его дефекте или поражении бывает недостаточно, и тогда встает вопрос о поиске материалов и способов, которые могли бы заменить или восстановить недостающую часть органа или ткани.

Анализ заболеваемости и общей распространенности андрологической патологии среди населения России демонстрирует повышение потребности в оперативной помощи андрологическим больным, постоянное увеличение выполнения эстетических корригирующих вмешательств на мужских половых органах.

Традиционно для восстановления и замещения тканей и органов в оперативной андрологии используются аутологичные материалы - кожные лоскуты и трансплантаты, аутологичный жир, препуций, фасциальные лоскуты и т.п., однако при их использовании, особенно это касается неурологических тканей, наблюдаются различные неблагоприятные эффекты. Другим распространенным подходом является использование различных синтетических не-рассасывающихся материалов. При использовании вышеупомянутых подходов не всегда достигается клинически благоприятный эстетический и функциональный результат из-за проблем механического, структурного, функционального плана либо по причине биологической несовместимости [Cart-wright Р.С., Snow B.W., 1989; Gorham S.D., 1989; Gleeson M.J., Griffith D.P., 1992; Atala A., 1997].

Основные проблемы при использовании синтетических - нерассасы-вающихся материалов связаны с неотработанной хирургической техникой, формированием камней в областях их использования. В большинстве случаев на месте трансплантации ауто- или аллологичного лоскута возникают контрактуры или происходит его рассасывание (резорбция) вследствие воспалительного ответа или недостатка нормальной регенерации мышечной ткани.

Идеальный материал для замещения любого органа мочеполовой системы должен обладать следующими свойствами: не вызывать фиброза и образования бляшек после операции, не вызывать фиброза подлежащих тканей, обладать хорошей гистосовместимостью, сохранять эластичность в процессе замещения дефекта.

Мы сфокусировали свое внимание на проблеме эстетической коррекции толщины полового члена и реконструкции белочной оболочки при повторной имплантации протезов полового члена.

Проанализировав данные литературы, мы сформулировали ряд проблем, возникающих при эстетической реконструкции полового члена -утолщении полового члена:

- при использовании для утолщения полового члена аутологичного жира возникает необходимость одномоментной липосакции, а эстетические результаты являются непредсказуемыми в связи с резорбцией жира;

- использование сеток из синтетических нерассасывающихся материалов связано с повышением риска воспалительного процесса в послеоперационном периоде; кроме того, степень утолщения полового члена незначительна;

- утолщение полового члена с использованием перемещенных лоскутов характеризуются высокой технической сложностью. Адаптация неоднородных тканей обуславливает высокую частоту несостоятельности швов. Использование микрохирургической техники возможно в немногочисленных специализированных центрах; эти операции отличаются чрезвычайной длительностью, превышая 6-8 часов.

При повторной имплантации протезов полового члена часто наблюдается недостаточность и слабость белочной оболочки полового члена, что приводит к эрозии протезов, требующей хирургической коррекции. В этом случае при повторной имплантации протезов обеспечить нормальные эстетические и функциональные результаты - значит восстановить структуру белочной оболочки. Использование для этого перемещенных лоскутов, синтетических нерассасывающихся сеток в целом сложно и малоэффективно [Ще-плев П.А., Курбатов Д.Г., 2002].

Анализ специальной литературы показал, что существует множество перспективных направлений в реконструкции полового члена при повторной имплантации протезов полового члена и для эстетической коррекции толщины. Однако перспективы повышения функциональной эффективности реабилитации пациентов полностью не исчерпаны. Существующие методы недостаточно эффективны, так как они не позволяют восстанавливать все составляющие элементы органа с использованием однородного (близкого по морфологической, анатомической и функциональной структуре) материала, особенно с применением метода тканевой инженерии. Поэтому огромный интерес как в практическом отношении, так и в научном плане представляет использование специальных синтетических рассасывающихся материалов, по которым бы происходило восстановление нормальной структуры полового члена.

Цель замещения дефекта - восстановление нормального функционирования и, в идеале, строения ткани.

Идеальным материалом для такого рода операций может стать только собственная ткань органа, а наиболее перспективным методом ее получения является тканевая инженерия. Принцип тканевой инженерии - восстановление нормальной структуры органа или ткани путем использования специальных рассасывающихся полимеров либо в сочетании с аутологичными клетками, либо изолированно.

При обилии такого рода полимеров в экспериментальных исследованиях наблюдается различная их эффективность, даже при одинаковом строении, а алгоритм оценки полимеров с целью прогнозирования результатов их клинического использования не разработан.

В последние годы появились новые методики получения ткани на трехмерных полимерных матриксах, которые можно использовать при трансплантации с целью восстановления утраченных тканей [Krettek С., 2002; Zimmermann W.H., Eschenhagen Т., 2003; Cancedda R. et al., 2003; Bosch U., Garner J.P., 2004]. Биосовместимые матриксы для создания тканеинже-нерных конструкций должны характеризоваться широким спектром параметров. Ключевыми параметрами являются отсутствие цитотоксичности, воспалительного и иммунного ответа на материал и продукты его распада [Репин B.C., Сухих Г.Т., 1998], обеспечение адгезии, пролиферации и дифференци-ровки клеток [Бокерия JI.A. и соавт., 2004], а также механическая прочность в соответствии с назначением [Волова Т.Г. и соавт., 2003; Угрюмов М.В. и соавт., 2004; Bostman О.М., 1991; Attawia M.A. et al., 1995; Mort E., 1997; Williams D.F., Athanasiou K.A. et al., 1998].

Для совершенствования существующих и разработки новых материалов для тканевой инженерии необходима разработка модели, которая позволила бы проводить изучение особенностей взаимодействия клеток с трехмерным внеклеточным матриксом в ходе формирования новых тканей. В данной работе мы разработали такую модель и апробировали ряд подходов, которые позволяют изучать пролиферацию клеток и оценивать их функциональное состояние во время культивирования в трёхмерном матриксе. В качестве полимера был использован матрикс из сополимера молочной и глико-левой кислот (ПЛПГ), представляющий собой биодеградируемый синтетический материал, разработанный для тканевой инженерии. Сравнительно недавно, матриксы на основе ПЛПГ были одобрены Агентством по контролю за лекарствами и продуктами питания США (FDA) [Gunatillake Р.А., Adhikari R., 2003] и в настоящее время уже нашли широкое применение в клинической практике за рубежом. В нашей стране исследования по созданию тканей, на основе ПЛПГ стали проводиться сравнительно позднее.

Цель

Обоснование и разработка методики применения тканевой инженерии в оперативной андрологии.

Задачи

1. Провести экспериментальное исследование взаимодействия культуры клеток HeLa с биополимером полилактогликолевой кислоты, оценить их жизнеспособность при культивировании, уровень окислительного стресса.

2. Выработать методику, показания, противопоказания к использованию тканевой инженерии при эстетическом утолщении полового члена, провести анализ результатов.

3. Сравнить эффективность использования рассасывающегося полимера полилактогликолевой кислоты для утолщения полового члена при изолированном применении и в сочетании с культурой культивированных аутофиброб ластов.

4. Выработать методику, показания, противопоказания к использованию тканевой инженерии при реконструкции белочной оболочки полового члена при реимплантации протезов полового члена, провести анализ результатов.

5. Оценить стабильность результатов операций по эстетическому утолщению полового члена и реконструкции белочной оболочки полового члена.

Научная новизна

Впервые в оперативной андрологии разрабатывается возможность применения тканевой инженерии. Проводится экспериментальное обоснование возможности взаимодействия клеток человека с биоматериалами. Проводится исследование по применению указанных принципов в эстетической и реконструктивной хирургии полового члена. В представляемой работе были оценены закономерности прикрепления и пролиферации клеток линии НеЬа в полимерах полилактогликолевой кислоты, а также оценены некоторые параметры, отражающие состояние клеток в полимере и развитие в них окислительного стресса.

На основании результатов проведенного клинико-экспериментального исследования разработана и научно обоснована методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена с применением метода тканевой инженерии.

Предложена совершенно новая методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена.

Практическая значимость

Разработанная методика оценки биополимерных материалов, используемых в оперативной андрологии, позволяет прогнозировать клинические результаты их использования и разработать подходы для улучшения результатов применения таких материалов.

Разработанная методика реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена у андрологических больных позволяет восстановить все составляющие элементы органа, а также функционально достаточный объем и форму.

На основе проведенных исследований определены показания и противопоказания к данному методу реконструкции белочной оболочки полового члена и утолщения полового члена.

Представленные результаты исследования могут служить основой для практического применения данного метода в клинической практике, а также позволяют продолжить разработку и усовершенствование методики для реконструкции других органов и тканей, что может быть использовано в других хирургических специальностях.

Выводы

1. При культивировании в биополимере полилактогликолевой кислоты сте-реоультраструктурная организация клеток, выращенных в полимере не отличается от таковой клеток, выращенных во флаконах, динамика роста клеток на полимере близка к скорости роста в стандартных условиях во флаконах. Клетки НеЬа не подвержены стрессорным воздействиям в мат-риксе в течение всего времени культивирования.

2. Методика имплантации трехмерного рассасывающегося полимера для первичного утолщения полового члена является эффективным и безопасным способом утолщающей фаллопластики, среднее приращение окружности полового члена составляет 3,8 см, процент осложнений составляет 9,52%, при этом тяжелых осложнений не отмечается.

3. Статистически значимые преимущества применения биоматериалов и культуры культивированных аутофибробластов по сравнению с применением биоматериалов отсутствуют. При применении первого метода среднее приращение окружности полового члена составляет 3,8 см, второго — 3,29 см.

4. Методика имплантации трехмерного рассасывающегося полимера для корпоропластики при реимплантации протезов полового члена является эффективным способом корпоропластики и позволяет добиться укрепления белочной оболочки у 100% пациентов, восстановления нормального положения протеза и адекватной сексуальной функции.

5. Результаты операций по эстетическому утолщению полового члена и реконструкции белочной оболочки полового члена остаются стабильным на протяжении трехлетнего периода наблюдения.

Практические рекомендации

1. Все полимеры, использование которых планируется при оперативном лечении пациентов, должны быть исследованы на предмет взаимодействия с клетками по разработанной методике.

2. При оценке полимерных биоматериалов следует исследовать жизнеспособность и прояления стрессорного воздействия на клетки при культивировании.

3. Для первичного утолщения полового члена предлагается использовать трехмерные рассасывающиеся полимеры по разработанной методике.

4. Достоверных данных о преимуществе использования тканевой культуры в комбинации с трехмерными рассасывающимися полимерами по сравнению с изолированным использованием полимера не выявлено. Оба метода имеют одинаковую эффективность.

5. У сложного контингента больных со слабостью белочной оболочки при повторной имплантации протезов полового члена целесообразно использовать трехмерные рассасывающиеся полимеры для корпоропластики по разработанной методике, что улучшает результаты оперативного лечения таких больных.

6. Результаты лечения при применении тканевой инженерии остаются стабильными, что позволяет рекомендовать ее использование для эстетических и реконструктивных вмешательств в оперативной андроло-гии.

7. Анализ литературных данных и собственные исследования обосновывают необходимость разработки применения тканевой инженерии в других областях оперативной андрологии - при стриктурах уретры, ги-поспадии.

101