Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование оптимизированной технологии УФ-кросслинкинга в лечении кератоконуса

На правах рукописи

МЕРЗЛОВ ДЕНИС ЕВГЕНЬЕВИЧ

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМИЗИРОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ УФ-КРОССЛИНКИНГА В ЛЕЧЕНИИ КЕРАТОКОНУСА

14.01.07 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

25 СЕН 2014

Москва - 2014

005552725

005552725

Работа выполнена в ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Малюгин Борис Эдуардович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор,

зав. кафедрой офтальмологии Факультета социальной медицины ГОУ ВПО ГКА им. Маймонида

Эскина Эрика Наумовна

доктор медицинских наук, профессор кафедры глазных болезней МГМСУ им. А.И. Евдокимова Калинников Юрий Юрьевич

Ведущая организация: ФГБУ «Научно-исследовательский институт

глазных болезней» РАМН

Защита диссертации состоится « 10 » ноября 2014 г. в_ часов на заседании

диссертационного совета Д. 208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, Москва, ул. Бескудниковский бульвар, дом 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России по адресу: 127486, Москва, ул. Бескудниковский бульвар, дом 59А.

Автореферат разослан «10 » сентября 2014 г. Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук И.А. Мушкова

Список сокращений

дптр диоптрия

ИК инфракрасный

МКОЗ максимально корригированная острота зрения

мкм микрометр

НКОЗ некорригированная острота зрения

ОКТ оптическая когерентная томография

ПЭК плотность эндотелиальных клеток

УФ ультрафиолетовый

ЦТР центральная толщина роговицы

Kave средняя кератометрия

Кшах максимальная кератометрия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Кератоконус - невоспалительное хроническое дистрофическое заболевание роговицы, которое характеризуется асимметричным прогрессирующим истончением, конусовидным выпячиванием и потерей ее прозрачности в далекозашедшей стадии, возникающими в результате структурной дезорганизации стромальных коллагеновых волокон (Каспаров A.A., 1979; Абугова Т. Д., 1986; Пучковская H.A., Титаренко З.Д., 1990; Rabinowitz YS., 1998; Burris Т.Е., 1998).

В последнее время все большее число хирургов с целью остановки прогрессирования кератоконуса применяют УФ-кросслинкинг. Данная операция представляет собой фотополимеразацию стромальных коллагеновых волокон роговицы, индуцированную комбинированным воздействием

фотосенсибилизирующего вещества (рибофлавин 0,1%) и ультрафиолетового излучения определенной длины волны, что ведет к повышению биомеханической прочности эктазированной роговицы. При этом отмечают, что за счет образования

QA

ковалентных связей происходит растяжение волокон коллагена и уплотнение слоев роговицы, подверженных УФ-кросслинкингу (Wollensak G., 2003,2004).

На сегодняшний день существует несколько технологий выполнения УФ-кросслинкинга, которые имеют как достоинства, так и недостатки и выбор наиболее оптимальной из них, позволяющей остановить прогрессирование кератоконуса и избежать послеоперационных осложнений, является актуальной проблемой.

Наиболее признанной является классическая технология, предложенная доктором Т. Seiler и коллегами (2003), включающая удаление эпителия в центральной 7-миллиметровой зоне, тридцатиминутное закапывание 0,1% раствора рибофлавина с последующим воздействием УФ с длиной волны 370 мкм и энергией излучения 3,0 mW/cm2. Его эффективность была неоднократно показана к клинических исследованиях (Spoerl Е, 2007; Wollensak G, 2003,2009).

Ряд зарубежных авторов отмечают, что удаление эпителия роговицы является серьезным недостатком стандартного протокола кросслинкинга, так как оно приводит к значительному послеоперационному дискомфорту, временному снижению зрения, также возрастает риск развития инфекционных осложнений. Кроме того, кросслинкинг с деэпителизацией не может быть проведен при толщине роговицы менее 400 мкм. В связи с этим была предложена технология трансэпителиального УФ-кросслинкинга, в ходе которой целостность эпителия роговицы нарушают химическим способом, путем нанесения на нее растворов местных анестетиков, содержащих в качестве консервант бензалкония хлорид (БАК) (Chan С, 2007; Wollensak G, 2010). Так, R. Pinelli коллегами не обнаружил достоверных различий в клинико-функциональны результатах между группами пациентов, в которых выполняли УФ - кросслинкинг п классической и трансэпителиальной технологиям (Chan С, 2007; Pinelli R, 2007,2009).

Проблема трансэпителиального УФ - кросслинкинга вызвала большой интерес научных кругах. Было проведено несколько исследований, направленных на изучени проникновения рибофлавина в роговицу после деэпителизации и через интактны эпителий. Спектрофотометрические исследования S. Heyes и соавторов (2008) и глазах животных показали, что базальный слой эпителия не пропускает рибофлавин

строму роговицы даже после предварительной инсталляции препаратов, содержащих бензалкония хлорид. Эти исследования ставят под сомнение целесообразность проведения трансэпителлиального УФ-кросслинкинга. Однако при этом, авторы отмечают необходимость в дальнейшем более углубленном изучении данного вопроса.

Кроме того, была описана технология УФ-кросслинкинга с механическим нарушением целостности эпителия роговицы, в ходе которой производят скарификацию эпителия различными инструментами без его удаления. Данная процедура направлена на обеспечение прохождения в строму роговицы достаточного количества рибофлавина без применения дополнительных препаратов и удаления эпителия. Однако сообщения о клиническом применении данной технологии являются единичными и экспериментальных доказательств, свидетельствующих о полном пропитывании стромы роговицы раствором рибофлавина при ее применении нами не обнаружено (0'ЬЕтеасЬа1п Я, 2012).

В связи с этим, целью нашего исследования стало проведение сравнительного анализа эффективности различных технологий выполнения операции УФ-кросслинкинга роговицы при лечении пациентов с кератоконусом.

Задачи исследования

1. Оптимизировать технологию УФ-кросслинкинга на основе разработки нового инструмента для дозированной скарификции эпителия роговицы и в эксперименте на кадаверных глазах оценить глубину и степень повреждения структур роговицы при его применении.

2. В эксперименте на кроликах оценить скорость восстановления целостности эпителиального покрова роговицы при выполнении субтотальной деэпителизации и дозированной скарификации эпителия роговицы.

3. В эксперименте на кадаверных глазах изучить пропитывание роговицы фотосенсибилизатором (рибофлавином) при различных технологиях выполнения УФ-кросслинкинга (с деэпителизацией, с дозированной скарификацией эпителия и трансэпителиального).

4. Сравнить выраженность и продолжительность болевого синдрома, а также клинико-функциональные результаты после выполнения УФ-кросслинкинга в исследуемых группах пациентов.

5. При помощи оптической когерентной томографии переднего отрезка глаза оценить послеоперационную динамику состояния роговицы пациентов в исследуемых группах.

6. Методом конфокальной микроскопии оценить в динамике морфологию роговицы in vivo после выполнения УФ-кросслинкинга по различным технологиям.

Научная новизна результатов исследования

1. Впервые для определения проникновения рибофлавина в строму роговицы в эксперименте была применена ИК-Фурье спектроскопия. Данный метод позволил определить, что после выполнения субтотальной деэпителизации и дозированной скарификации эпителия роговицы в ИК-спектре, регистрируемом со стороны эндотелия, происходит достоверное увеличение относительной интенсивности полосы, характерной для рибофлавина, что свидетельствует о полном пропитывании им стромы роговицы, в то время как после инсталляции 0,5% раствора проксиметакаина, содержащего бензаклония хлорид, показатели ИК-спектров достоверно не изменяются, что свидетельствует об отсутствии проникновения рибофлавина через эпителий, обработанный таким способом.

2. В эксперименте на кроликах доказано ускоренное восстановление целостности эпителия роговицы после выполнения его дозированной скарификации, наблюдавшееся на следующие сутки после вмешательства по сравнению с технологией, предполагающей полное удаление эпителия, при которой реэпителизация наступает в среднем лишь на 5-е сутки.

3. Впервые с помощью конфокальной микроскопии выявлено, что после проведения УФ-кросслинкинга по классической технологии и по технологии с дозированной скарификацией эпителия происходят схожие по характеру и глубине изменения морфологии стромы роговицы, а именно: образование выраженного отека, гибель кератоцитов и стромальных нервов на глубине до 310 ± 9 (от 290 до

335) мкм в 1-й группе (после УФ-кросслинкинга с деэпителизацией) и 300 ± 8 (от 280 до 330) мкм во Н-й группе (после УФ-кросслинкинга с дозированной скарификацией эпителия роговицы), связанные с комбинированным воздействием рибофлавина и ультрафиолета.

4. Анализ динамики клинико-функциональных показателей пациентов 1-й и II-й групп выявил отсутствие прогрессирования кератоконуса, при этом через 2 года после операции было отмечено достоверное уменьшение максимальной (на 2,7 ± 0,6 дптр и 2,2 ± 0,4 дптр соответственно) и средней (на 2,6 ± 0,5 дптр и 2,4 ± 0,3 дптр соответственно) кератометрии, временное снижение центральной пахиметрии (к 3-му месяцу после операции) с последующим ее увеличением, статистически значимое увеличение максимально корригированной остроты зрения (на 0,11 ± 0,04 и 0,1 ± 0,04 соответственно) и некорригированной остроты зрения (на 0,07±0,03 и 0,08 ± 0,02 соответственно).

Практическая значимость результатов исследования

1. Разработан инструмент, применение которого во время УФ-кросслинкинга позволяет одним движением выполнить дозированную скарификацию эпителия и обеспечить последующее пропитывание всей толщины стромы роговицы рибофлавином без полной ее деэпителизации.

2. Применение инфракрасной Фурье-спектроскопии достоверно подтвердило отсутствие проникновения рибофлавина в строму роговицы после применения раствора анестетика (проксиметакаин), содержащего бензалкония хлорид и, тем самым, обосновало нецелесообразность применения трансэпителиальной технологии УФ-кросслинкинга в практической деятельности.

3. Клинические исследования показали отсутствие прогрессирования кератоконуса у всех пациентов, которым провели УФ-кросслинкинг по технологии с дозированной скарификацией эпителия роговицы, а динамика показателей некорригированной остроты зрения, максимально корригированной остроты зрения, средней кератометрии, максимальной кератометрии, центральной толщины роговицы,

плотности эндотелиальных клеток и морфологии роговицы была сопоставима с таковой после УФ-кросслинкинга по классической технологии.

Основные положения, выносимые на защиту Выполнение дозированной скарификации эпителия роговицы характеризуется альтерацией всех его слоев, вплоть до Боуменовой мембраны, без нарушения целостности последней, что способствует проникновению рибофлавина в строму роговицы и является фактором, создающим предпосылки для достижения высокого эффекта при выполнении последующих этапов УФ-кросслинкинга, обеспечивая ускоренное восстановление целостности эпителиального покрова, приводящее к снижению выраженности и продолжительности дискомфорта в послеоперационном периоде по сравнению с классической технологией, а так же последующую остановку прогрессирования кератоконуса при 2-х летнем сроке наблюдения.

Внедрение в практику Оптимизированная технология УФ-кросслинкинга на основе разработанного инструмента-скарификатора внедрена в практику головной организации и филиалов ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России. Материалы работы включены в курс обучающих лекций Научно-педагогического центра ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова» Минздрава России.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XI

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Федоровские чтения - 2013», на ежегодных заседаниях Европейского общества Катарактальных и рефракционных хирургов ЕБСНЗ: Прага, 2012; Любляна, 2014; Амстердам, 2013; Варшава, 2013, на еженедельных научно-клинических конференциях ФГБУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова (Москва 2012).

Публикации

По теме исследования опубликовано 10 печатных работ, из них 5 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объём работы

Диссертация изложена на 110 листах текста и состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 18-ю рисунками и 14-ю таблицами. Список литературы содержит 190 источников, из них 52 публикации отечественных и 138 - зарубежных авторов.

Клинические исследования выполнены на базе отдела трансплантационной и оптико-реконструктивной хирургии глаза ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Фёдорова» Минздрава России. Экспериментальные и клинические разделы работы выполнены совместно с к.м.н. Измайловой С. Б.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальный этап исследования.

С целью оптимизации технологии УФ-кросслинкинга со скарификацией эпителия роговицы, нами был разработан новый инструмент, который благодаря особенностям своей конструкции, позволяет одним нажатием на его кнопку выполнять равномерную дозированную скарификацию эпителия роговицы, не повреждая Боуменову мембрану и передние слои стромы (Рис. 1). Длину шипов (60 мкм.) рассчитали после выполнения исследования 30-ти глаз 19-ти пациентов, в результате которого после трехкратной инсталляции 0,5% раствора проксиметакаина толщина эпителия составила в среднем 55,3±4,7 мкм. Центрирование инструмента на роговице пациента во время операции осуществляли устанавливая его внутрь посадочного фланца градуированного вакуумного кольца, предварительно наложенного концентрично лимбу на поверхность глазного яблока.

Рисунок 1. Инструмент для дозированной скарификации эпителия роговицы А - поперечный срез рабочей части инструмента; Б - общий вид инструмента, установленного на градуированное вакуумное кольцо

Задачами экспериментальной части последовательно явились определение эффективности этапов доставки рибофлавина в строму роговицы при различных технологиях УФ-кросслинкинга, морфологическое исследование глубины и характера повреждения эпителия роговицы при использовании инструмента -скарификатора, а также сравнение скорости восстановления эпителия при моделировании начальных этапов различных технологий УФ-кросслинкинга.

С целью определения глубины и характера воздействия на роговицу разработанного инструмента для дозированной скарификации эпителия роговицы, нами выполнено морфологическое исследование на 3-х кадаверных глазах не пригодных для целей трансплантации. В результате выявили, что при применении нового скарификатора происходит альтерация всех слоев эпителия роговицы вплоть до Боуменовой мембраны без нарушения целостности последней (Рис. 2).

Рисунок 2. Гистологические препараты человеческой кадаверной роговицы после применения инструмента для дозированной скарификации эпителия роговицы. Видна альтерация всех слоев эпителия роговицы, Боуменова мембрана не повреждена (окраска гематоксилин-эозин. Ув. X 200.)

В связи с тем, что длительное восстановление целостности эпителия после оперативного вмешательства увеличивает риск послеоперационных инфекционных осложнений и вызывает у пациента выраженный дискомфорт, задачей эксперимента in vivo на кроликах явилось сравнение скорости восстановления эпителия при моделировании начальных этапов различных технологий УФ-кросслинкинга. В ходе данного эксперимента нами определена значительно большая скорость восстановления целостности эпителия после дозированной скарификации эпителия роговицы (на 2-й день наблюдения) по сравнению с полной деэпителизацией (на 5-й день наблюдения). Данное наблюдение нашло свое последующее подтверждение в ходе клинике, что выражалось в значительно меньшей степени и продолжительности роговичного синдрома у пациентов, которым выполняли УФ-кросслинкинг с дозированной скарификацией эпителия роговицы.

Для точного определения возможности проникновения рибофлавина в строму роговицы в ходе выполнения различных технологий УФ-кросслинкинга нами впервые в мировой практике применена инфракрасная Фурье-спектроскопия, позволяющая достоверно обнаруживать химические вещества в биологических жидкостях и тканях. Исследование проводили на ИК - микроскопе Hyperion 2000 с кристаллом германия (Ge), совмещенным с вакуумным ИК - Фурье спектрометром модели IFS 66v/s (Bruker). Эксперимент выполнили на базе Института нефтехимического синтеза им. А. В. Топчиева РАН и Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем МНТК «Микрохирургия глаза».

Исследование проводили на 9 донорских глазах человека (3 группы по 3 глаза) не пригодных для целей трансплантации. В первой группе моделировали этап доставки рибофлавина в строму роговицы по классической технологии УФ-кросслинкинга с полным удалением эпителия, во второй — по трансэпителиальной технологии, в третьей - по технологии с дозированным механическим нарушением целостности эпителия при помощи разработанного инструмента. Во второй группе для разрыхления контактов между клетками эпителия роговицы, в течении 30-ти минут (по 1 капле в минуту) инсталлировали 0,5% раствор проксиметакаина,

содержащий в качестве консерванта бензаклония хлорид. Перед проведением Фурье-спектроскопии, на исследуемые роговицы инсталлировали 0,1% раствор риблофлавина на протяжении 30 минут (по 1 капле в минуту). Для определения полноценного пропитывания стромы роговицы рибофлавином, регистрацию ИК-спектров в режиме нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО) проводили со стороны эндотелия и оценивали изменение полос спектра, характерных для рибофлавина. При исследовании порошковой формы рибофлавина на ИК-микроскопе, было выявлено, что самой интенсивной в его спектре является полоса 1542 см-1. Количественной характеристикой изменения ИК-спектров служило изменение относительной интенсивности полос 1542 см-1 и 1640 см-1, выраженное в процентах. Полоса 1640 см-1 была выбрана в качестве контроля в виду того, что она относится к той же пептидной связи что и полоса 1542 см-1 и отражает в ней исключительно различный тип колебаний. Следовательно, в одинаковых условиях относительная интенсивность обеих полос остается постоянной. Регистрацию ИК-спектров отражения проводили многократно с разных участков эндотелиальной стороны роговицы для выявления возможных флуктуаций. Контролем служил ИК-спектр роговиц, зарегистрированный до нанесения на них рибофлавина.

При анализе усредненного инфракрасного спектра отражения роговиц первой группы выявили достоверное увеличение относительной интенсивности полосы 1542 см-1 по сравнению с контролем на 7,3±0,5% (таблица 1), что свидетельствовало о проникновении рибофлавина через все слои стромы роговицы после полной ее деэпителизации. Анализ усредненного спектра роговиц третьей группы показал сходные результаты, относительная интенсивность его полосы 1542 см-1 была выше на 7,8±0,6% по сравнению с контролем (таблица 1), что доказывает пропитывание всей толщи роговицы после выполнения скарификации эпителия. Относительная интенсивность полосы 1542 см-1 усредненного ИК-спектра роговиц в условиях интактного эпителия (2 группа) не имела статистически значимой разницы по сравнению с контролем (таблица 1). Данный факт указал на отсутствие

проникновения рибофлавина через эпителий роговицы после инсталляции на него раствора бензалкония хлорида и обосновывает нецелесообразность использования трансэпителиальной технологии УФ-кросслинкинга в клинической практике.

Таблица 1.

Относительная интенсивность полос ИК-спектра в исследуемых группах

Исследуемый материал Относительная интенсивность полос 1542 см"'/1640 см"1 (отн. ед.) Изменение относительной интенсивности (%)

Контроль 0,667±0,003 -

Группа I 0,716±0,003 +7,3±0,5*

Группа II 0,668±0,003 +0,2±0,5

Группа III 0,719±0,004 +7,8±0,6*

Примечание: *Статистически значимые изменения по отношению к контролю (р<0,05)

Клинический этап исследования Нами проанализированы клинико-функциональные результаты послеоперационного наблюдения 117 пациентов (130 глаз) с кератоконусом 1-Ш стадии. Критерии отбора пациентов включали: прогрессирование кератоконуса, отсутствие помутнений роговицы, толщина роговицы в самой тонкой точке не менее 400 мкм, максимальная сила преломления по данным кератотопографии не более 65 дптр. Пациентов разбили на 2 группы в зависимости от технологии выполнения УФ-кросслинкинга. В I группу вошли 57 человека (65 глаз), которым проводили кросслинкинг по стандартной технологии. Во II группу были включены 60 человек (65 глаз), которым проводили кросслинкинг с дозированной скарификацией эпителия роговицы.

Перед операцией и в послеоперационном периоде всем пациентам проводили биомикроскопию, рефрактометрию и офтальмометрию, определение НКОЗ и

МКОЗ, кератотопографию, ОКТ переднего отрезка глаза и конфокальную микроскопию.

НКОЗ и МКОЗ перед операцией характеризовались значительным разбросом и коррелировали со стадией кератоконуса. Процентное соотношение пациентов с различными стадиями кератоконуса, а также средние дооперационные показатели зрительных функций были сопоставимы во всех группах.

Ранний послеоперационный период у пациентов 1-й группы характеризовался наличием выраженного болевого синдрома (в среднем 6,9 балла по 10 бальной шкале) купирование которого происходило в среднем через 3-е суток после вмешательства. Пациенты И-й группы оценивали болевые ощущения в среднем на 2,9 балла из 10, а их купирование наступало в среднем через сутки после операции. Кроме того, пациенты I и II группы после операции жаловались на «туман» перед оперированным глазом, который постепенно уменьшался и пропадал через 1-1,5 месяца. Данная жалоба коррелировала с наличием так называемого «хейза» (облаковидное помутнение стромы роговицы), выявляемого при биомикроскопии.

В раннем послеоперационном периода мы наблюдали осложнение у одного пациента после проведенного УФ-кросслинкинга по классической технологии (1,6%), что выражалось в замедленной эпителизации роговицы, по нашему мнению это было связано с наличием синдрома «сухого глаза» у пациента. Полная эпителизация наступила на 4-й день после операции. В группе пациентов после проведения УФ-кросслинкинга со скарификацией эпителия роговицы послеоперационных осложнений не наблюдали.

Динамика остроты зрения в 1-й и Н-й группах оказалась схожей. Через 1 месяц после проведения кросслинкинга по классической технологии (1-я группа), отмечали снижение средних значений НКОЗ на 0,1±0,03 и МКОЗ на 0,09 ± 0,02. Через 3 месяца после операции данные показатели возвращались к дооперационным значениям. Через 2 года после операции наблюдали достоверное увеличение средних показателей НКОЗ и МКОЗ на 0,07 ± 0,03 и 0,11 ± 0,04 соответственно.

После проведения кросслинкинга с применением инструмента-скарификатора (Н-я группа) через 1 месяц также отмечали снижение НКОЗ на 0,11 ± 0,04 и МКОЗ -на 0,07 ± 0,03. Через 3 месяца они вернулись к дооперационному уровню. При обследовании пациентов данной группы через 2 года после операции выявили достоверное увеличение среднего показателя НКОЗ на 0,08 ± 0,02, средняя МКОЗ достоверно увеличилась на 0,1 ± 0,04.

Средние показатели Кмах и Кауе в обеих группах на протяжении периода наблюдения изменялись схожим образом.

В 1-й группе показатель Кмах через 2 года после операции достоверно снизился по сравнению с дооперационным значением на 2,7 ± 0,4 дптр, показателья Кауе снизился на 2,6 ± 0,5 дптр. Во И-й группе через 2 года после проведения УФ-кросслинкинга отметили снижение Кмах на 2,2 ± 0,4 дптр и Кауе на 2,4 ± 0,3 дптр.

Среднее значение ЦТР у пациентов 1-й и П-й групп через 3 месяца после операции достоверно уменьшилась (на 17,3±5,8 мкм и 15,1±6,4 мкм соответственно), в дальнейшем мы отмечали постепенное увеличение ЦТР, однако даже через 2 года после операции данный показатель оставался ниже дооперационных значений.

Таблица 2

Динамика клинико-функциональных показателей пациентов I группы

Сроки наблюдения Исследуемый параметр

НКОЗ МКОЗ Кауе, дптр Кмах, ДПТр ЦТР, мкм

до операции 0,21±0,11 0,49±0,14 46,1±1,7 49,8±2,2 469,1±23,4

1 месяц 0,11±0,12* 0,4±0,11* 44,9±1,5 48,7±2,4 454,2±23,1*

3 месяца 0,19±0,11 0,46±0,13 44,5±1,5* 47,9±2Д* 451,8±22*

6 месяцев 0,21±0,12 0,52±0,12 44±1,8* 47,7±1,8* 455,1±23,9*

12 месяцев 0,24±0,09 0,57±0,14* 43,7±1,7* 47,3±2,1* 456,5±23,7*

24 месяца 0,28±0,1* 0,6±0,12* 43,5±1,6* 47,1±2* 458,4±24,4*

Примечание: * Статистически значимые изменения по отношению к дооперационным показателям (р<0,05)

Таблица 3

Динамика клинико-функциональных показателей пациентов II группы

Сроки наблюдения Исследуемый параметр

НКОЗ МКОЗ Кауе, ДПТр Кмах, ДПТр ЦТР, мкм

до операции 0,22±0,09 0,48±0,12 4б,7±1,4 51,1±1,6 475,2±28,5

1 месяц 0,11±0,09* 0,41±0,12* 45,5±1,2 50,7±1,7 460,2±26,8*

3 месяца 0,21 ±0,09 0,47±0,12 45,1±1,6* 50,3±1,3* 460,1±23,9*

6 месяцев 0,23±0,09 0,51±0,12 44,6±1,9* 49,4±1,2* 464,6±27,2*

12 месяцев 0,25±0,09 0,54±0,12* 44,5±1,5* 49,3±1,7* 466,1±29,4*

24 месяца 0,28±0,09* 0,58±0,12* 44,3±1,5* 49,1±1,4* 467,2±27,9*

Примечание: * Статистически значимые изменения по отношению к

дооперационным показателям (р<0,05)

По данным ОКТ переднего отрезка глаза, у пациентов как 1-й, так и Н-й групп, с первого по шестой месяцы наблюдения обнаруживали увеличение оптической плотности передних 2/3 стромы роговицы и наличие демаркационной линии, выраженность которых постепенно уменьшалась. Средняя глубина залегания демаркационной линии в группе I составила 327±11 мкм, в группе II - 318±13 мкм, величина данного показателя в исследуемых группах не имела статистически значимых отличий (р>0,05).

При проведении конфокальной микроскопии у пациентов 1-й и И-й групп через 1 месяц после проведения кросслинкинга в передних и средних слоях стромы наблюдали выраженный отек, ацеллюлярность и отсутствие стромальных нервов. В средних слоях стромы также имел место отек, стромальные нервы отсутствовали, отмечали единичные активированные кератоциты. В глубоких слоях роговицы была видна зона перехода от гипоцеллюлярных слоев к слоям с нормальной плотностью кератоцитов. Средняя глубина послеоперационных изменений составила в среднем 310 ± 9 мкм (от 290 до 335) в 1-й группе и 300 ± 8 мкм (от 280 до 330) во Н-й группе.

Исследования, проведенные через 3 месяца в 1-й и П-й группах, выявили начальную репопуляцию передних и средних слоев стромы активированными кератоцитами. Причем в средних слоях количество кератоцитов возросло, выраженность отека значительно снизилась, однако по-прежнему отсутствовали стромальные нервы. При обследовании через 6 месяцев были видны полная репопуляция роговицы активированными кератоцитами, отсутствие отека и увеличенная плотность стромальных волокон. Также через 6 месяцев мы наблюдали полную реиннервацию роговицы.

У всех пациентов тем не менее, имели место плеоморфизм и полимегатизм клеток эндотелия, статистически значимого снижения средних показателей ПЭК не выявляли.

Низкий процент послеоперационных осложнений и тот факт, что единственное осложнение наблюдалось после проведения УФ-кросслинкинга по классической технологии и было связано с удалением эпителия во время операции, указывает на высокую безопасность данного вмешательства в целом и ее модификации с дозированной скарификацией эпителия роговицы в частности.

ВЫВОДЫ

1. Разработанный оригинальный инструмент для скарификации эпителия роговицы с рабочей частью, представляющий собой пластину с кривизной, соответствующей форме передней поверхности роговицы, снабженную микроиглами, обеспечивающими дозированное проникновение через все слои эпителия, позволяет оптимизировать технологию УФ-кросслинкинга. В эксперименте на донорских глазах обоснован принцип действия данного инструмента, отсутствие повреждений Боуменовой мембраны и передних слоев стромы роговицы.

2. В эксперименте на животных (кролики породы Шиншилла) установлено, что дозированная скарификация эпителия роговицы с использованием разработанного инструмента завершается полным восстановлением эпителиального

пласта на 1-е сутки после операции, в то время, как субтотальная деэпителизация (диаметром 7,5 мм) - лишь к 5-м суткам поле вмешательства.

3. В эксперименте на донорской роговице при помощи инфракрасной Фурье-спектроскопии доказано, что субтотальная деэпителизация и дозированная скарификация эпителия обеспечивают пропитывание всей толщины стромы роговицы рибофлавином (при инсталляции его 0,1% водного раствора по 1-й капле в минуту на протяжении 30-и минут), о чем свидетельствует достоверное увеличение относительной интенсивности полосы 1542 см-1 ИК спектра, а трансэпителиальная доставка 0,1% водного раствора рибофлавина на протяжении 30 минут (1 капля в минуту) путем предварительной инсталляции на нее 0,5% раствора проксиметакаина, содержащего бензалкония хлорид (1 капля в минуту в течение 30 минут) не сопровождается изменением параметров ИК-спектра и не обеспечивает оптимальных условий для проведения УФ-кросслинкинга.

4. Результаты клинико-функциональных исследований показали, что оптимизированная технология УФ-кросслинкинга с частичной дозированной скарификацией эпителия роговицы обеспечивает существенное снижение степени выраженности и продолжительности послеоперационного дискомфорта по сравнению с классической технологией УФ-кросслинкинга, предполагающей субтотальную деэпителизацию, в 1-й группе дискомфорт составил в среднем 6,9 ± 1,3 балла (из 10-и) и купировался через 3 ± 1,2 суток, во Н-й группе - в среднем 2,8 ± 1,1 балла (из 10-и), купировался через 1,1 ± 0,4 суток.

5. В результате выполнения клинико-функциональных исследований установлено, что после выполнения УФ-кросслинкинга как по классической, так и по модифицированной технологии в раннем послеоперационном периоде у пациентов биомикроскапически обнаруживается умеренно выраженное облаковидное помутнение роговицы, прозрачность которой полностью восстанавливается к 3-му месяцу после операции, что сопровождается постепенным уменьшением среднего показателя кератометрии роговицы (Кауе) по отношению к

исходному на 2,6 ± 0,5 дптр (р<0,05) и 2,4 ± 0,3 дптр (р<0,05) в 1-й и Н-й группах соответственно с его стабилизацией через 12 месяцев после операции.

6. В соответствии с увеличением прозрачности роговицы и уменьшением ее кератометрических индексов, происходит восстановление и дальнейшее плавное нарастание показателей остроты зрения в обеих группах так, ко 2-му году наблюдения, некорригированная острота зрения в 1-й группе оказалась выше, чем до операции на 0,07 ± 0,03 (р<0,05), а максимально корригированная острота зрения выше на 0,11 ± 0,04 (р<0,05), аналогичный прирост показателей во Н-й группе составил 0,08 ± 0,02 (р<0,05) и 0,1 ± 0,04 (р<0,05) соответственно.

7. При помощи оптической когерентной томографии переднего отрезка глаза к 2-м годам после операции было установлено снижение средних показателей центральной кератопахиметрии относительно дооперационных на 2,36 ± 0,57% (р<0,05) в 1-й группе и 3,17 ± 0,88 % (р<0,05) во Н-й группе, при этом демаркационная линия в глубоких слоях стромы роговицы в обеих группах была максимально выражена через 1 месяц после операции на глубине в среднем 327 ± 11 мкм в I группе и 318 ± 13 мкм во второй группе и полностью исчезла к 12-му месяцу после операции.

8. Конфокальная микроскопия после УФ-кросслинкинга позволила выявить следующую закономерность гистоморфологических изменений в роговице in vivo: через 1 месяц после операции в передних и средних слоях стромы имеет место выраженный отек, ацеллюлярность и отсутствие стромальных нервов, а на глубине в среднем 310 ± 9 (от 290 до 335) мкм в 1-й группе и 300 ± 8 (от 280 до 330) мкм во Н-й группе - наличие зоны перехода от гипоцеллюлярных слоев к слоям с нормальной плотностью кератоцитов; через 3 месяца после операции в передних и средних слоях стромы констатировали наличие частичной репопуляции активированными кератоцитами, а также значительное снижение отека и отсутствие стромальных нервов; через 6 месяцев после операции были достигнуты полноценная репопуляция роговицы активированными кератоцитами, стромальная и субэпителиальная реиннервация а также отсутствие отека и увеличение плотности

стромальных волокон на фоне отсутствия достоверного снижения плотности эндотелиальных клеток. Существенных отличий между группами по выше указанным параметрам не наблюдали.

Практические рекомендации

1. На основе комплекса экспериментальных исследований рекомендуем воздержаться от применения в клинике трансэпителиальной технологии УФ-кросслинкинга, основанной на предварительных инсталляциях 0,5% раствора проксиметакаина, содержащего бензаклония хлорид (1 капля в минуту на протяжении 30 минут с последующей инсталляцией 1% водного раствора рибофлавина также на протяжении 30 минут по 1-й капле ежеминутно), поскольку это не обеспечивает полноценного пропитывания всей толщи роговицы фотосенсибилизатором (ребофлавин).

2. Применение инструмента для дозированной скарификации эпителия при УФ-кросслинкинге целесообразно, так как позволяет существенно снизить выраженность и продолжительность послеоперационного дискомфорта оперированных пациентов.

3. Пациент должен быть предупрежден о временном снижении зрительных функций в раннем послеоперационном периоде, вплоть до 3-го месяца, когда происходит их повышение до исходных значений.

4. Учитывая что окончательная стабилизация формы роговицы происходит к исходу 1-го года послеоперационного периода, проведение в более ранние сроки керато-рефракционных вмешательств с целью коррекции аметропий представляется нецелесообразным.

Список публикаций

1. Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Авраменко С.А., Мерзлов Д.Е. Лечение парацентральных кератэктазий различного генеза методом интрастромальной кератопластики с имплантацией роговичного сегмента в зону наибольшей эктазии // Офтальмохнрургия. - 2011. - № 4. - С. 16-22

2. Мороз З.И., Измайлова С.Б., Легких СЛ., Мерзлов Д.Е. Кросслинкинг как метод лечения прогрессирующего кератоконуса // Практическая медицина. - 2012. -Т. 1.-№4.-С. 104-107.

3. Мороз З.И., Измайлова С.Б., Легких С.Л., Мерзлов Д.Е. Интрастромальная кератопластика с имплантацией сегментов в сочетании с кросслинкингом роговичного коллагена// Офтальмохирургия. - 2013. -№ 3. - С. 17-22

4. Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Шацких А.В., Мерзлов Д.Е., Авраменко С.А. Экспериментальное обоснование эффективности различных методов доставки рибофлавина в строму роговицы как начального этапа выполнения УФ-кросслинкинга // Офтальмохирургия. - 2014. - № 1. - С. 24-29

5. Измайлова С.Б., Малюгин Б.Э., Пронкина С.А., Мерзлов Д.Е., Поручикова Е.П. Тактика лечения и исходы осложнений имплантации роговичных сегментов при кератэктазиях различного генеза// Офтальмохирургия. - 2014. - № 2. - С. 16-23.

6. Izmaylova S., Takhchidi К., Malyugin В., Avramenko S., Merzlov D. Crosslinking after ICRS implantation by progressive keratectasia // ESCRS Winter Meeting, 16-th. - Prague, 3-5 February 2012 (электронный ресурс)

7. Izmaylova S., Malyugin В., Merzlov D., Pokrovskij D., Branchevskaya E. Comprehensive complex treatment of progressive keratectasia of different types: the future without keratoplasty? // Congress of the ESCRS, 31-rd. — Amsterdam,2013. -http://www.escrs.org/amsterdam2013/programme/posters-details.asp?id=19308

8. Izmaylova S., Malyugin В., Merzlov D., Poruchikova E. Analysis on the efficacy of non-laser post-lasik keratectasia treatment by implantation of intracorneal ring segments using a new device // ESCRS Winter Meeting, 17-th. — Warsaw, 2013; http://escrs.org/abstracts/details.asp?confid=12&sessid=388&type=free&paperid=14612

9. Измайлова С.Б., Мороз З.И., Авраменко С.А. и др. Кросслинкинг после имплантации роговичных сегментов в лечении прогрессирующих кератэктазий различного генеза - целесообразность или необходимость? // Федоровские чтения -2012: Всерос. научно-практ. конф. с междунар. участием, 10-я. — М., 2012. — С. 44-45.

10. Мороз З.И., Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Мерзлов Д.Е. Лечение прогрессирующего кератоконуса методом интрастромальной кератопластики с имплантацией сегментов в сочетании с кросслинкингом роговичного коллагена // Федоровские чтения - 2012: Всерос. научно-практ. конф. с междунар. участием, 10-я: -М., 2012.-С.51.

Патенты РФ на изобретения по теме диссертации

Инструмент для дозированной скарификации эпителия роговицы (заявка на патент № 2013130332 от 04.07.2013 г., положительное решение о выдаче патента от 02.07.2014 г.). Соавторы: Малюгин Б.Э., Измайлова С.Б., Латыпов И.А., Мерзлов Д.Е.

Биографические данные

Мерзлов Денис Евгеньевич в 2006г. окончил медико-профилактический факультет Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова. С 2008 по 2009 г. проходил переподготовку по специальности «лечебное дело» на базе специальности «медико-профилактическое дело».

С 2008 по 2010 год проходил обучение в клинической ординатуре по специальности «Офтальмология» на базе ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

С 2010 по 2013 год обучался в очной аспирантуре на базе отдела трансплантационной и оптико-реконструктивной хирургии глаза ФГБУ «МНТК «МГ» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.

Подписано в печать: 09.09.14 Тираж: 150 экз. Заказ № 1198 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru