Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Клинико-экспериментальное обоснование кросслинкинга коллагена роговицы в лечении начального кератоконуса

На правах рукописи

Поляк Анастасия Семёновна

КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ КРОССЛИНКИНГА КОЛЛАГЕНА РОГОВИЦЫ В ЛЕЧЕНИИ НАЧАЛЬНОГО КЕРАТОКОНУСА

14.03.03 - Патологическая физиология 14.01.07 - Глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005549752 5 """! 2014

Бишкек - 2014

005549752

Работа выполнена на кафедре офтальмологии и оториноларингологии Кыргызско-Российского Славянского университета на базе Национального Госпиталя при Министерстве здравоохранения Кыргызской Республики

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Тухватшин Рустам Романович

доктор медицинских наук Медведев Михаил Анатольевич

Аралбаев Тур алы Аралбаевич -

доктор медицинских наук, профессор, заведующий научно-организационным отделением Бишкекского научно-исследовательского центра травматологии и ортопедии, г. Бишкек

Сотникова Елена Владимировна -

кандидат медицинских наук, доцент, директор частной офтальмологической клиники, г. Бишкек

Новгородский Государственный университет им. Ярослава Мудрого, г. Великий Новгород, Российская Федерация

Защита состоится «6» июня 2014 г. в 1JL ■—часов на заседании диссертационного совета ДК-730.001.08 при Кыргызско-Российском Славянском университете (720021, Кыргызская Республика, г. Бишкек, ул. Киевская 44, e-mail: dissovetkrsu@mail.ru1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кыргызско-Российского Славянского университета (720021 Кыргызская Республика, г. Бишкек, ул. Киевская 44)

Автореферат разослан «5» апреля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, профессор,

Зарифьян А.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Кератоконус — невоспалительное эктатиче-ское заболевание роговицы, при котором роговица приобретает коническую форму вследствие истончения и протрузии, что клинически проявляется формированием миопической рефракции и нерегулярным астигматизмом (Krachmer J. с соавт., 2010).

Данные о распространенности кератоконуса сильно разнятся, в литературе можно встретить разброс данных от 50 до 230 на 100000 населения (Пучковская H.A., 1990; Owens Н., 2003; Севостьянов E.H., 2006; Krachmer J. с соавт., 2010). При анализе показаний к сквозной кератопластике за последние двадцать лет очевидно, что в некоторых странах кератоконус стал ведущей причиной такого рода вмешательств (Flowers C.W. с соавт., 1995; Leger F., 1995; Frucht-Pery J. с соавт., 1997; Pearson A.R. с соавт., 2000; Dobbins К. с соавт., 2000). Согласно исследованиям 80-х годов XX века, в Среднеазиатском регионе кератоконус встречался приблизительно в 1 случае из 20000 (Амансахатов Ш., 1981). Изменения в структуре заболеваемости кератоконусом обычно связывают с негативным влиянием экологии, повышением радиационного фона, общей аллергизацией населения, а также с улучшением методов диагностики кератэктазий (Дрожжина Г.И., 1987; Горскова E.H., 1998; Слонимский Ю.Б. с соавт., 2008).

Чаще всего первые проявления кератоконуса возникают у подростков или молодых людей. Однажды возникнув, заболевание прогрессирует и происходит это именно в тот период жизни, когда человек учится, приобретает профессиональные навыки, а также достигает расцвета в профессиональной деятельности (Каспарова Е.А., 2003). Снижение остроты зрения ухудшает качество жизни пациентов, лимитирует молодых людей в выборе профессии, приводит к психологическим проблемам, ограничивает социальную адаптацию (Семенова АЛ., 2009).

В патогенетической основе кератоконуса — ослабленные связи между молекулами коллагена и экстрацеллюлярного матрикса на фоне повышенной концентрации свободных радикалов в роговичной строме, что приводит к снижению биомеханической прочности ткани роговицы и клинически проявляется конусовидным выпячиванием (Gritchfield J.W., 1988; Wachler В., 2005; Dudakova L„ 2013).

Наиболее перспективным методом биомеханического и биохимического укрепления тканей роговицы является кросслинкинг коллагена роговицы. Суть метода заключена в эффекте фотополимеризации стро-мальных волокон под воздействием фоточувствительной субстанции (раствор рибофлавина) и ультрафиолета (Seiler Т., Spoerl Е., Wollensak G., 1998). При стандартном протоколе кросслинкинга для проникнове-

ния раствора фотосенсибилизатора в строму перед воздействием ультрафиолетом проводят предварительную деэпителизацию роговицы, что делает последнюю беззащитной перед инфекциями (РоИЬагшпег М. е1 а!., 2009; Рёгег-ЗапКиу'а Ы. е1 а!., 2009; ОаШат, Л1апр V., 2013). Процедура кросслиикинга коллагена роговицы противопоказана к применению при кератопахиметрии менее 400 нм (уже после предварительной деэпители-зации) (\Vollensak С., 2003). Поскольку прогрессирующее истончение центральных отделов роговицы является ключевым патогенетическим механизмом при кератэктазиях, роговицы с толщиной менее 400 нм (с эпителием), пораженные кератоконусом, далеко не редкость. Таким образом, данный критерий исключения заметно сужает круг пациентов с начальным кератоконусом и другими кератэктазиями, которые могли бы бьггь пролечены с применением стандартного протокола кросслиикинга.

В настоящее время представляется актуальным усовершенствование стандартного протокола кросслиикинга в лечении кератоконуса для минимизации связанных с ним рисков, сокращения сроков послеоперационной реабилитации, расширения показаний к применению процедуры на роговицах с толщиной менее 400 нм. Социальная значимость и необходимость полноценной реабилитации пациентов молодого трудоспособного возраста подтверждают актуальность проблемы лечения начального кератоконуса.

Цель исследования. Патогенетическое обоснование метода кросс-линкинга коллагена роговицы для лечения пациентов с начальным кератоконусом путем инграстромального введения раствора фотосенсибилизатора

Задачи исследования:

1. Патогенетически обосновать в эксперименте усовершенствованную методику кросслиикинга коллагена роговицы с интрастромаль-ным введением раствора фотосенсибилизатора на роговицах с толщиной менее 400 нм.

2. Изучить в эксперименте морфофункциональные особенности процесса кросслиикинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора.

3. Провести исследование клинико-функционального состояния глаз пациентов с начальным кератоконусом в динамике после лечения с применением усовершенствованной методики коллагенового кросслиикинга на «тонких» роговицах (400 нм и менее).

4. Провести сравнительную оценку методик кросслиикинга коллагена роговицы по стандартному протоколу с предварительной деэпи-телизацией и кросслиикинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора.

Научная новизна. Применение интрастромальных инъекций раствора фотосенсибилизатора без предварительной деэпителизации роговицы в эксперименте приводило к сокращению сроков реабилитации, улучшению биомеханических свойств роговицы, стимулировало процессы перестройки клеточного состава стромы роговицы, вызывало увеличение диаметра коллагеновых волокон, способствовало укреплению связей между молекулами коллагена и протеогликана без сопутствующих воспалительных процессов. Продемонстрировано отсутствие повреждающих воздействий на глубжележащие структуры глаз (хрусталик, сетчатку) экспериментальных животных со средней толщиной роговиц 330±25 нм.

Наблюдение за пациентами с начальным кератоконусом в сроки до 24 месяцев включительно после применения усовершенствованной методики кросслинкинга коллагена роговицы показало, что использование интрастромальных инъекций позволяет избежать рисков, связанных с предварительной деэпителизацией роговицы, необходимой для проведения процедуры по стандартному протоколу. Кросслинкинг коллагена роговицы с применением интрастромальных инъекций раствора фотосенсибилизатора корригирует коническую деформацию роговицы, предотвращает прогрессирование начального кератоконуса при толщине роговиц 400 нм и менее, что значительно расширяет показания к применению кросслинкинга при начальном кератоконусе и других кератэктазиях.

Внедрения в практику. Результаты работы внедрены в клиническую практику отделения микрохирургии глаза № 2 Национального Госпиталя при Министерстве здравоохранения Кыргызской Республики (заведующий отделением — доктор медицинских наук М.А. Медведев), а также глазного отделения Бишкекского научно-исследовательского центра травматологии и ортопедии. По теме диссертации получен 1 патент Кыргызской Республики «Способ лечения кератоконуса» № 1376 от 31 мая 2010 года.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработанная методика фотомодификации роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора позволяет не только снизить риски, связанные с деэпителизацией, но и проводить фотомодификацию роговиц толщиной 400 нм и менее.

2. Усовершенствованная методика позволяет добиться высоких функциональных результатов (повышение остроты зрения, стабилизация процесса) в раннем и позднем послеоперационных периодах.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложенная усовершенствованная методика фотомодификации роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора в эксперименте показала улучшение биомеханических свойств

роговичной ткани при отсутствии воспалительной реакции со стороны роговицы и глубжележащих структур.

2. Оставление собственного эпителия роговицы позволяет добиться быстрой реабилитации и показывает преимущество проведения кросслинкинга роговичного коллагена с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора в сравнении с использованием стандартного протокола при сохранении патогенетической направленности процедуры фотомодификации.

3. Применение кросслинкинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора позволяет добиться стабилизации процесса на ранних стадиях на основании оценки визо-метрии, рефрактометрии, топографии роговичной поверхности.

4. Разработанная методика фотомодификации с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора может проводиться на «тонких» роговицах (менее 400 нм).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 1П Центральноазиатской конференции по офтальмологии с международным участием (Кыргызстан, Исык-Куль, 2011); научно-практической конференции «Инновационные технологии реабилитации больных с социально-значимой офтальмопатологией» (Казахстан, Астана, 2011); научно-практическом международном семинаре «Офтальмо-хирургия сегодня» (Кыргызстан, Бишкек, 2012); конференции «Физиология, морфология и патология человека и животных в условиях Кыргызстана» (Кыргызстан, Бишкек, 2012); на заседаниях общества офтальмологов (Кыргызстан, Бишкек, 2009-2012); на XXXI Конгрессе Европейского Общества Катарактальной и Рефракционной Хирургии (Нидерланды, Амстердам, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 6 — в зарубежной печати, 4 — в рекомендуемых ВАК РФ изданиях, издано 1 методическое пособие.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами, 41 рисунком. Работа состоит из введения, 3 глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Список литературы включает 299 источников, из них 47 -русскоязычных и 252 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы экспериментальных исследований

В качестве материала экспериментальных исследований были использованы глаза 25 кроликов породы шиншилла, средней массой от 2,5 до 3,5 кг, серо-черной масти. Глаза были разделены на группы: ин-тактная группа - левые глаза (25 глаз) экспериментальных животных, контрольная группа - 12 правых глаз, на которых была проведена процедура кросслинкинга коллагена роговицы по стандартному протоколу, опытная группа - 13 глаз были подвергнуты процедуре кросслинкинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора. Экспериментальное исследование проведено с соблюдением международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (Готова О.О., 2003). Хирургическое вмешательство осуществлялось стерильным инструментарием в условиях стерильного операционного поля под общей анестезией, которую осуществляли путем внутримышечного введения смеси из диазепама и атропина (из расчета по 15 мг/кг).

Особенности проведения процедуры фотомодификации кросслинкинга коллагена роговицы по стандартному протоколу

Кросслинкинг роговичного коллагена проводился под местной инсталляционной анестезией с раствором оксибупрокаина гидрохлорида 0,4 %. В оптической зоне производили деэпителизацию заданного диаметра (8-9 мм). Затем настраивалась фокусировка излучения (расстояние между лампой и роговицей — 5 см). Выполнялось воздействие ультрафиолетом с длиной волны 365 - 370 нм, мощностью излучения - 3,0 мВт/см2 (5,4 Дж/см2) с использование лампы собственной конструкции. Мощность воздействия определялась с помощью ультрафиолетметра (Waldmann) для достижения желаемой дозы в 5,4 Дж/см Одновременно продолжались инсталляции раствора рибофлавина 0,1 % (1-2 капли каждые 2 минуты). Воздействие ультрафиолетом осуществлялось в течение 30 минут, по окончании процедуры в конъюнктивальную полость инсталлировали антибактериальный препарат левофлоксацин 0,5 %. Инсталляции продолжали в течение последующих 3 дней.

Особенности проведения кросслинкинга коллагена роговицы с иитрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора

Без предварительной деэпителизации роговицы на фоне терминальной анестезии с оксибупрокаина гидрохлоридом 0,4 % через ин-тактный эпителий при помощи инсулинового шприца с запрессованной иглой интрастромально (внугрироговично) вводили 0,1 % водный раствор фотосенсибилизатора рибофлавина на глубину 0,1-0,15 мм из 3-4 вколов, проводили полное насыщение роговицы раствором фотосенсибилизатора (Патент KP N° 1376 от 31.05.2010). Контроль полноты и интенсивности насыщения фотосенсибилизатором осуществляли при увеличении микроскопа *8-10 с дополнительной подсветкой. После достижения адекватного прокрашивания роговицы проводили кросс-линкинг с применением фокусированного луча ультрафиолетового света: 3 мВт/см3 (в дозе 5,4 Дж/см2) в 5 см от поверхности роговицы с использованием излучающего диода с длиной волны 365-370 нм. В послеоперационном периоде в конъюктивальную полость закапывали 0.5% раствор левофлоксацина в течение на протяжении трех дней.

Методы исследования роговиц экспериментальных животных (кроликов) после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы

Осмотр и биомикроскопию проводили на щелевой лампе SL-120 Carl Zeiss (Германия). Проводилась оценка состояния конъюнктивы, роговицы и глубжележащих отделов глаза.

Исследование биомеханических свойств роговиц проводили при помощи способа прижизненного определения упругих свойств роговицы, предложенного С.Э. Аветисовым с соавт. в 2008 г. При значении эластоподъема более 11 мм рт. ст. определяли упругие свойства роговицы как сниженные, при значении от 9 до 11 мм рт. ст. - как нормальные, при значении менее 9 мм рт. ст. - как повышенные.

Морфологические исследования роговиц экспериментальных животных (кроликов) после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы проводились в лаборатории Республиканского патологического бюро г. Бишкек, Кыргызской Республики. Изготавливали препараты общепринятым методом. Исследования проводились с применением световой микроскопии полутонких (4—5 мкм) срезов, которые окрашивались полихромным красителем гематоксилином и эозином в сроки: 1 сутки, 1, 3, 6 и 12 месяцев. Исследовали все 5 слоев роговиц. Для контроля исследован топографически аналогично расположенный участок неповрежденного (интактного) левого глаза.

Материалы и методы клинических исследований

Исследование проведено на базе отделения микрохирургии глаза № 2 Национального Госпиталя при Министерстве здравоохранения Кыргызской Республики (заведующий отделением - доктор медицинских наук М.А. Медведев) с 2010 по 2013 гг.

Общая характеристика групп пациентов с начальным кератоконусом

Исследование основано на клиническом анализе результатов обследования и лечения 36 пациентов (50 глаз) с установленным диагнозом начального кератоконуса (стадии I—II по Амслер). У пациентов было подтверждено увеличение данных кератометрии на 1,0 D в течение последнего года, а также необходимость изменений очковой или контактной коррекции в течение предшествовавших двух лет. От всех пациентов было получено информированное согласие на проведение процедуры после подробного объяснения сути предстоящего лечения. Пациентов с операциями на роговице, интрастромальными кольцами или длительно незаживающими воспалительными процессами на роговице в анамнезе из исследования исключали. Пациенты были рандомизированы в группы:

1 группа (контрольная) — 17 пациентов (23 глаза) были подвергнуты лечению методом кросслинкинга по стандартной методике (Wollensak G. с соавт., 2003).

2 группа (основная) - 19 пациентов (27 глаз), которым была проведена процедура кросслинкинга коллагена роговицы по модифицированной методике с интрастромальным введением 0,1 % раствора рибофлавина.

Методы исследования, использованные для оценки состояния роговиц пациентов с начальным кератоконусом

Биомикроскопия проводилась на щелевой лампе Carl Zeiss SL-200 (Германия). Фотосъемка на фотощелевой лампе Topcon SL 7 (Япония) и на операционном микроскопе Carl Zeiss OPMI б CFR (Германия) при помощи фотокамеры, входящей в комплект.

Визометрия проводилась при помощи проектора оптотипов комбайна Carl Zeiss О АР 211 (Германия) и набора стекол, входящего в комплект для определения остроты зрения без коррекции и с максимальной коррекцией.

Офтальмометрия (кератометрия) - на офтальмометре ОАР 211 офтальмологического комбайна (Cari Zeiss, Германия) для измерения оптической силы роговицы.

Авторефрактометрия — на приборах ARK-530A, RKT-7700 (Nidek, Япония) применялась для объективной оценки клинической рефракции глаза.

Тонометрия - измерение внутриглазного давления при помощи тонометра Маклакова весом 10 г.

Оптическая когерентная томография роговицы проводилась на когерентном томографе Cirrus HD 300 Cari Zeiss (Германия) для оценки кератопахиметрии.

Компьютерная топография роговицы (Humphrey Atlas 990 Corneal Topography System, США) применялась для исследования топографии роговичной поверхности.

Исследование биомеханических свойств роговицы проводили методом дифференцированной тонометрии на приборе Glau Test-60 (Россия) для оценки коэффициента ригидности роговицы (CRF).

С помощью Specular Microscope Topcon SP-2000P (Япония) проводился анализ клеток эндотелия роговицы до и после процедуры кросслинкинга в динамике.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическая обработка проводилась с использованием профессионального пакета SPSS 16. Нормальность распределения исследуемых параметров проверялась с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Проводился расчет статистических показателей (средние значения, ошибки средних, среднеквадратические отклонения). Для сравнения средних применяли t-тест. Оценку линейных связей между параметрами проводили при помощи корреляционного и регрессионного анализов с расчетом коэффициентов корреляции Пирсона и Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты экспериментальных исследований

Результаты исследования биомеханических свойств роговиц экспериментальных животных (кроликов) после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы

В интактной группе, в которой глаза подопытных животных не подвергались процедуре кросслинкинга коллагена роговицы, в сроки наблюдений 3 и 12 месяцев значения эластоподьема оставались неизменными в сравнении с исходными значениями (р>0,05). В контрольной

группе с применением стандартного протокола кросслинкинга к 3 месяцу после процедуры увеличение прочностных свойств роговицы происходило в 2,36 раза, в опытной группе с применением интрастромальных инъекций раствора фотосенсибилизатора - в 4,12 раза (р<0,001). К 12 месяцу в контрольной и опытной группах прочностные свойства увеличивались в 3,93 раза, и в 6,7 раза соответственно (р<0,001).

Полученные результаты указывают на значимый укрепляющий эффект проводимой процедуры кросслинкинга при применении модифицированной методики с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора. Укрепляющий эффект процедуры кросслинкинга в опытной группе был более выраженным (р<0,001). Вероятнее всего, это объясняется достаточной дозой рибофлавина, участвующего в процессе фотополимеризации. Происходило это благодаря тому, что ультрафиолетовое излучение в комбинации с раствором рибофлавина вызывает формирование межмолекулярных связей коллаген-коллаген и протеогликан-протеогликан, а также небольшое число связей между протеогликанами и коллагеном, так называемых связей-мостиков (crosslinks) между коллагеном I типа, который отвечает за эластические свойства тканей.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о статистически достоверном и пролонгированном во времени эффекте улучшения биомеханических свойств роговой оболочки экспериментальных животных (кроликов) после проведения процедуры кросслинкинга с использованием интрастромальных инъекций раствора фотосенсибилизатора.

Биомикроскопическое исследование роговиц экспериментальных животных (кроликов) после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы

Глаза экспериментальных животных интактной группы выглядели спокойными весь период наблюдений (до 12 месяцев включительно). Течение раннего послеоперационного периода в контрольной группе с применением стандартного протокола кросслинкинга отличалось выраженным роговичным синдромом с альтеративно-экссудативными процессами в деэпителизированной роговице. В те же сроки в опытных глазах с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора послеоперационный период характеризовался ареактивным течением, отек роговиц был незначительным (1 балл), умеренная сосудистая реакция (перикорнеальная инъекция бульбарной конъюнктивы) носила быстро проходящий характер.

Морфологические исследования роговиц экспериментальных

животных (кроликов) после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы

Данные, полученные при морфологическом исследовании срезов глаз экспериментальных животных (кроликов) контрольной группы с использованием стандартного протокола кросслинкинга показали, что процесс заживления роговичного эпителия после проведенной деэпите-лизации проходил через 3 фазы (рис. 1). Первая фаза (латентная или альтеративная) заключалась в миграции клеток базального эпителия с краев раны (деэпителизированной зоны). За латентной фазой следовала вторая фаза клеточной миграции, во время которой эпителиальные клетки уплощались, делились, увеличивались в объеме и мигрировали к раневой поверхности, чтобы закрыть ее. Скрепление эпителиальных клеток с базальной мембраной происходило за счет десмосом, содержащих коллаген VII типа. Укрепление связей между эпителием и стромой заканчивалось к первому месяцу после проведения процедуры. Процесс полного восстановления клеточной архитектоники поврежденного эпителия заканчивался к третьему месяцу пролиферативной фазой.

В отличие от контрольной группы в опытной группе с интрастро-мальным введением раствора фотосенсибилизатора в раннем послеоперационном периоде на фоне сохранного эпителия наблюдался активный апоптоз стромальных кератоцитов (рис. 2).

Постепенное нарастание популяции кератоцитов в обеих группах начиналось с третьего месяца после процедуры и полностью завершалось к шестому месяцу (рис. 3, 4). Гистологически в указанные сроки строма выглядела гиперрефлективной с нарастающей плотностью клеточного матрикса, ядра кератоцитов с активными митозами. При кросс-линкинге одновременно происходят фотохимические реакции 2 типов: анаэробная реакция I типа и аэробная реакция II типа. Фотосенсибилизатор рибофлавин абсорбирует энергию ультрафиолетового излучения, в результате чего приобретает триплетную форму. При анаэробном I типе реакции триплетный рибофлавин напрямую вступает в реакцию с протеинами коллагена, в результате переноса электронов образуются свободные радикалы супероксид-анион, перекись водорода и гидроксиль-ные радикалы. При аэробном II типе фотохимической реакции триплетный рибофлавин, вступая в реакцию с молекулами кислорода, образует синглетный кислород, а также супероксид-анион. Образующиеся формы кислорода затем вступают в реакции с молекулами коллагена и способствуют формированию химических ковалентных связей-мостиков между молекулами коллагена и протеогликанами. Спустя 6 месяцев после процедуры кросслинкинга гиперрефлективность передней стромы сме-

нялась гипорефлективностью, завершался процесс восстановления популяции кератоцитов.

Рис. 2. Гистологический препарат

Рис. 1. Гистологический препарат роговицы. Контрольная группа. 1 сутки. Десквамация эпителия, апоптоз кератоцитов передней 1/3 стромы, расширение межпластинчатых щелей. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.х 180

Рис. 3. Гистологический препарат роговицы. Контрольная группа. 6 месяцев. Пролиферация кератоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. хЗЮ

роговицы. Опытная группа. 1 сутки.

Базальные, шиповатые и плоские клетки эпителия роговицы. Фрагмен-тированные кератоциты передней 1/3 стромы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 180

Рис. 4. Гистологический препарат роговицы. Опытная группа. 6 месяцев. Пролиферация кератоцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение хЗЮ

Результаты клинических исследований Общая характеристика клинического материала

Часть больных с начальным кератоконусом была пролечена стационарно - 12 больных (18 глаз - 36 %), а остальные - амбулаторно - 24 больных (32 глаза - 64 %). Распределение пациентов по полу: 20 мужчин и 16 женщин. Средний возраст мужчин - 21,5±5,6 лет; средний возраст женщин - 23,4±4,1 года.

Биомикроскопическое исследование роговиц пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга роговичного коллагена Ранний послеоперационный период в контрольной группе после проведения кросслинкинга по стандартной методике протекал следующим образом: выраженный болевой синдром с первых часов после процедуры до 5,5±0,9 суток включительно. Подавляющее большинство пациентов 16 из 17 (94,1 %) принимали для купирования болевого синдрома таблетированные анальгетики. Выраженный роговичный синдром в раннем послеоперационном периоде вызван тем фактом, что после де-эпителизации на поверхности роговицы образовалась раневая поверхность, покрытая фрагментами деструктивных эпителиальных клеток. В опытной группе по сравнению с контрольной с первых дней течение послеоперационного периода было ареактивным. Глаза выглядели спокойными, явлений раздражения не отмечалось. Ни в одном случае (0 %) не отмечено прокрашивания, даже точечного, флюоресцеином.

Нежные пылевидные роговичные помутнения (хейз) в опытной группе появлялись несколько позднее (на 13±1,7 сутки), чем при использовании стандартного протокола. Интенсивность помутнений была выражена меньше по шкале от 0 до 4 в сроки от 1 до 3 месяцев, не превышала значения 1,5±0,07 (р<0,05), тогда как при использовании стандартного протокола достигала 2,5±0,03. Необходимо отметить, что в обеих сравниваемых группах наблюдалась определенная корреляция между хейз и другими изучаемыми параметрами. Чем более выраженные были помутнения, тем ниже визометрия (г=0,85), меньше толщина роговицы (г=0,91) и выше кератометрия (г=0,87).

Исследование визометрии у пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы Проведенное исследование показало стабильность данных визометрии в контрольной группе с применением стандартного протокола кросслинкинга в 56,5 % случаев, прибавка 1-2 линий остроты зрения отмечена в 34,8 % случаев, а также зафиксировано ухудшение остроты зрения на 1 строчку в 8,7 %. В опытной группе с применением модифицированной методики кросслинкинга стабильная визометрия сохранялась в 55,6 %, прибавка 1-2 строчек в 44,4 % . Динамика остроты зрения

характеризовалась незначительным снижением в обеих группах к 1 и 3 месяцам, что принято связывать с проявлениями хейз в этот период. В позднем послеоперационном периоде средняя острота зрения возрастала, при чем НКОЗ в опытной группе замено отличалась в лучшую сторону от контрольной группы (р<0,001). Значения КОЗ к 12 и 24 месяцам наблюдений по группам сравнимы, что, вероятнее всего, связано с трудностями очковой коррекции пациентов с кератоконусом.

Исследование кератометрии

В контрольной группе с использованием стандартного протокола кросслинкинга постепенное снижение оптической силы роговицы отмечалось в течение всего периода наблюдений до 24 месяцев включительно. К 24 месяцу после проведения процедуры достоверно снижалось на 2,3 Б в сравнении с исходными данными кератометрии (р<0,001). Между исходной кератометрией и следующими сроками наблюдений в опытной группе также значительно менялись значения средней оптической силы роговицы (р<0,001). К окончанию наблюдений (к 24 месяцу) в среднем преломляющая сила роговицы уменьшилась на 3,9 О (р<0,001) (рис. 5).

" Изменение оптической силы роговицы в контрольной группе (п=23) и Изменение оптической силы роговицы в опытной группе (п=27)

Рис. 5. Динамика средней (Mim) кератометрии (оптической силы роговицы), измеренная в диоптриях (D), пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы. Примечание: *р < 0,001 -статистически достоверные изменения в сравнении с исходными данными, /чр < 0,001 - статистически достоверные изменения в сравнении с предыдущим визитом

Таким образом, данные демонстрируют, что предложенная нами модификация кросслинкинга с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора позволяет получить достаточно выраженное уменьшение преломляющей силы роговицы, пролонгированное во времени.

Исследование рефрактометрии

Отмечалось снижение сферического компонента рефракции в контрольной группе к 24 месяцу наблюдений на 1,2 Б (р < 0,05). В опытной группе уменьшение сферического компонента рефракции было на 1,76 Б р<0,05. Данные рафрактометрии отличались широкой вариабельностью показателей при редкой повторяемости на фоне нерегулярной роговичной топографии. Равно как и сферический компонент рефракции средний уровень астигматизма в обеих сравниваемых группах характеризовался широким разбросом величин и направления осей.

Исследование внутриглазного давления у пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга коллагена роговицы Заметных изменений внутриглазного давления не претерпело за весь период наблюдений как в опытной, так и в контрольной группах (р>0,05), что показывает, что интрастромальные инъекции раствора фотосенсибилизатора не вызывали повышения внутриглазного давления. Весь период наблюдений значения внутриглазного давления находились в пределах статистической нормы (15 - 26 мм рт.ст.).

Исследование кератопахиметрии у пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга Динамика пахиметрии характеризовалась следующими особенностями. В контрольный период между 1 и 3 месяцами наблюдали истончение роговиц (р<0,05). Считается, что в раннем послеоперационном периоде подобное истончение связано с перестройкой эпителия после деэпителизации. В отличие от контрольной группы, в опытной группе к 24 месяцу наблюдений происходило достоверное (р<0,05) увеличение средней пахиметрии. Если в контрольной группе наблюдалась некоторая тенденция к уменьшению толщины роговицы (р<0,05), то в опытной группе толщина роговиц увеличивалась (р<0,05) и это особенно важно с учетом того факта, что в группу с использованием интрастромальных инъекций фотосенсибилизатора были включены пациенты с толщиной роговиц менее 400 нм, а средняя пахиметрия в наиболее тонком месте к окончанию исследований составила 437,54±48,68 нм. Наблюдалась определенная зависимость между изменениями толщины роговиц и проявлениями хейз (роговичных помутнений). На пике помутнений между 1

и 3 месяцами роговицы обнаруживали наименьшую толщину (г=0,63). Данную зависимость принято связывать с процессами реконструкции роговичной стромы.

Исследование упруго-прочностных свойств роговой оболочки

Сила поперечной связанности коллагеновых волокон роговицы определяет ее биомеханическую стабильность (прочность). Динамика усредненного фактора резистентности роговицы представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Данные среднего фактора резистентности роговицы до и после (до 24 месяцев включительно) процедуры кросслинкинга коллагена роговицы у пациентов с начальным кератоконусом (М±т). Единица измерения - мм рт.ст.

Сроки Контрольная группа, n=23 | Опытная группа, п=27

Значения фактора резистентности роговицы (М±т)

До процедуры 9,04±0,72 9,07±0,77

1 месяц 10,09±0,83 11,12±0,73*

3 месяца 14,51±0,52*Л 11,47±0,83

6 месяцев 14,76±0,42* 13,81±0,32*л

12 месяцев 15,08±0,43* 14,89±0,49*л

24 месяца 14,98±0,62* 15,96±0,32*л

Примечание: *р<0,001, <0,05 — статистически достоверные изменения в сравнении с исходными данными, лр<0,001, <0,05 -статистически достоверные изменения в сравнении с предыдущим визитом.

Постепенное улучшение прочностных свойств было растянуто во времени и для контрольной группы с применением стандартного протокола к 24 месяцу фактор резистентности роговицы (СИР) увеличился на 5,94 по сравнению с исходным уровнем, а в опытной группе с использованием модифицированной методики кросслинкинга увеличился на 6,89. Фактор резистентности роговицы более значительно увеличивался в опытной группе с использованием модифицированной методики кросслинкинга. Кроме того, в опытной группе была выявлена корреляция (г=0,68) между повышением прочностных свойств роговиц и наиболее низкими значениями кератометрии и индексом асимметрии поверхности.

Эндотелиальная биомикроскопия у пациентов с начальным кератоконусом после процедуры кросслинкинга

Для определения возможного токсического повреждения эндотелия при использовании предложенной 1 модификации кросслинкинга проводилась оценка эндотелия с помощью эндотелиальной микроскопии. Полученные данные показали, что заметных изменений за весь период наблюдений эндотелий не претерпел. Данные плотности клеток эндотелия находились в пределах нормальных границ - около 3500 клеток/мм2. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствии токсического воздействия ультрафиолета на роговичный эндотелий при интратромальном введении раствора фотосенсибилизатора.

ВЫВОДЫ

1. В эксперименте патогенетически обосновано применение усовершенствованной методики кросслинкинга коллагена роговицы с ин-трастромальным введением раствора фотосенсибилизатора на роговицах с толщиной 400 нм и менее, что подтверждается ремоделированием тканей роговицы с формированием связей-мостиков между молекулами коллагена при сохранении эпителия интакгным и отсутствием повреждающего действия на глубжележащие структуры глаза.

2. Экспериментально установлено, что процесс кросслинкинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора сокращает сроки реабилитации при сохранении эпителия, приводит к значимому улучшению биомеханических свойств роговицы благодаря активному нарастанию числа кератоцигов, увеличению плотности экстрацеллюлярного матрикса и укреплению связей между волокнами коллагена.

3. Установлено, что динамика клинико-функционального состояния глаз пациентов с начальным кератоконусом после лечения усовершенствованной методикой кросслинкинга коллагена роговицы характе-ризвалась ареактивным течением раннего послеоперационного периода, в дальнейшем достоверным ростом остроты зрения, уменьшением оптической силы роговицы, стабильными данными рефрактометрии, внутриглазного давления и увеличении фактора резистентности роговицы при приросте пахиметрии на «тонких» роговицах (400 нм и менее).

4. Проведение кросслинкинга коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора в отличие от использования стандартного протокола с предварительной деэпителизаци-ей сокращало сроки реабилитации, приводило к прибавке остроты зрения больше чем в 44 % случаев, снижению оптической силы роговицы в

среднем на 1,6 D, приросту толщины роговицы на 23±9,2 мкн, увеличению фактора резистентности роговицы в 1,76 раза, позволяло добиться стойкой ремиссии в 92.1 % случаев.

Практические рекомендации:

1. Разработанная патогенетически обоснованная технология кросслинкинга без деэпителизации роговицы позволяет полноценно и равномерно насытить роговицу раствором фотосенсибилизатора.

2. Применение интрастромальных инъекций раствора фотосенсибилизатора при процедуре кросслинкинга коллагена роговицы может применяться для лечения пациентов с начальным кератоконусом и другими кератэктазиями при толщине роговиц 400 нм и менее.

3. Кросслинкинг коллагена роговицы с интрастромальным введением раствора фотосенсибилизатора позволяет радикально уменьшить число осложнений

Список публикаций по теме диссертации:

1. The medium term results of corneal cross-linking in patients with initial keratokonus // TOD 43 Ulusal kongresi. - Istanbul, 2009. - P. 295 (соавт. Tajibaev Т., Medvedev M.).

2. Фотомодификация роговицы у пациентов с начальным кератоконусом // 1Хсъезд офтальмологов России: тез. докл. - М., 2010. - С. 320 (соавт. Тажибаев Т.Дж., Тургунбаев H.A., Эсенгельдиева Н.М., Медведев М.А.).

3. Кросслинкинг коллагена роговицы с интрастромальным введением рибофлавина в лечении кератоконуса // Физиология, морфология и патология человека и животных в условиях Кыргызстана: сб. науч. статей. - Бишкек, 2010. - С. 218-223 (соавт. Тажибаев Т.Дж., Тургунбаев H.A., Медведев М.А.).

4. Фотомодификация (кросслинкинг) роговицы как патогенетически ориентированный метод лечения кератоконуса // Здравоохранение Кыргызстана. - Бишкек, 2011. - № 2 - С. 82-85 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев H.A.).

5. Фотомодификация роговицы (кросслинкинг) при кератокону-се. Отдаленные результаты // Инновационные технологии реабилитации больных с социально значимой офтальмопатологией: материалы научно-практической конференции с международным участием. - Астана, 2011. - С. 165-167 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев ILA,, Тажибаев Т.Дж.).

6. Способ лечения кератоконуса // Патент KP № 1376 от 31.05.2010. — Интеллектуалдык менчик. — Бишкек, 2011. — № 8. —

С. 13 (соавт. Медведев М.А., Тажибаев Т.Дж., Тургунбаев H.A., Ди-камбаева М.К.).

7. Corneal crosslinking with intrastromal riboflavin injection for initial keratoconus // TOD 46 Ulusal kongresi. — Istanbul, 2012. - P. 295 (соавт. Bekboeva K.).

8. Перспективы применения фотомодификации (кросслинкинга) роговицы в лечении кератоконуса // Медицина Кыргызстана. - Бишкек, 2012. -№ 4. - С. 74-76 (соавт. Дикамбаева М.К., Медведев М.А.).

9. Патогенетически ориентированный метод лечения начального кератоконуса // Вестник Кыргызско-Российского Славянского университета. - 2012. - Том 12. - № 9. - С. 110-112.

Ю.Кросслинкинг роговичного коллагена как миниинвазивный способ лечения начального кератоконуса // Невские горизонты 2012: материалы научной конференции офтальмологов. — Санкт-Петербург, 2012.-С. 365-366.

11. Ранняя тектоническая послойная кератопластика при ожогах роговицы с применением фотомодификации (кросслинкинга). Предварительное сообщение // Вестник Кыргызско-Российского Славянского университета. - 2013. - Том 13. - № 6. - С. 158-159 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев H.A., Дикамбаева М.К.).

12. Комбинированное лечение острого кератоконуса // Вестник Кыргызско-Российского Славянского Университета. — 2013. — Том 13. — № 11. - С. 103-106 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев H.A.).

13. Глубокая послойная пересадка роговицы после ранее перенесенного кросслинкинга на глазах с кератоконусом // Материалы офтальмологического конгресса «Инновационные технологии в повседневной офтальмологической практике». — Алматы, 2013. - С. 127—128 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев H.A.).

14. Первый опыт применения фотомодификации при глубокой послойной пересадке роговицы в лечении рецидивирующего герпетического кератита Н Вестник Кыргызско-Российского Славянского университета. — 2013. — Том 13. — № 6. - С. 160-161 (соавт. Медведев М.А., Тургунбаев H.A., Дикамбаева М.К.).

15. Кератоконус. Диагностика. Лечение. Метод. Рекомендации / сост: М.А. Медведев, P.P. Тухватшин, М.К. Дикамбаева, НА. Тургунбаев. -Бишкек, 2013. - 20 с.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВГД — внутриглазное давление Д (D)- диоптрия

КОЗ - корригированная острота зрения КР — Кыргызская Республика мВт/см2 — миллиВатг/сантиметр в квадрате Мг — миллиграммы

мДж/см2 - миллиДжоуль/сантиметр в квадрате Мкм — микрометр Мкн — микрон Мл — миллилитры

Мм рт.ст. — миллиметры ртутного столба НКОЗ - не корригированная острота зрения нм — нанометры

УЗ пахиметрия — ультразвуковая пахиметрия

CRF (Corneal Resistance Factor) — фактор резистентности роговицы

UVA (ultraviolet А) - ультрафиолет

Подписано в печать 6.05.2013. Формат 60x90 !/8 Печать офсетная. Объем 1,5 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 409.

Отпечатано в типографии КРСУ. 720048, г. Бишкек, ул. Горького, 2.