Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Клинико-диагностическое значение показателей автоматизированного исследования ретикулоцитов

На правах рукописи

КОЛЕНКИН Сергей Миронович

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ РЕТИКУЛОЦИТОВ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в Медицинском центре Банка России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор СА Луговская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г.Н. Зубрихина

доктор медицинских наук, профессор В.М. Погорелое

Ведущее учреждение:

Главный военный клинический госпиталь имени академика Н.Н.Бурденко МОРФ

Защита состоится «/4 /У <7 2004 г. в /О' часов на заседании диссертационного Совета Д 208.071.04 при Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ по адресу: 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19.

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

Морозова В.Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование ретикулоцитов является основным гематологическим тестом, оценивающим активность костномозгового эри-тропоэза. Оно используется в диагностике, классификации и мониторинге лечения анемий, оценке восстановления эритропоэза после химиотерапии, трансплантации костного мозга или стволовых кроветворных клеток и в динамике терапии рекомбинантным эритропоэтином. До настоящего времени основным методом оценки ретикулоцитов является микроскопический с подсчетом относительного количества ретикулоцитов в суправи-тально окрашенном мазке крови. Однако указанный метод трудоемок, недостаточно стандартизирован, отличается низкой воспроизводимостью. Коэффициент вариации по данным различных авторов составляет от 25% до 50% [Gilmer P.R., Koepke JA, 1976; Lohmann R.C., Grawford L.N., 1994].

На протяжении последних 70 лет предпринимались попытки получения дополнительной информации о степени созревания ретикулоцитов при использовании микроскопического метода [Heilmeyer L., 1931; Кас-сирский И.А., Алексеев ГА, 1955], однако они не нашли практического применения в клинико-диагностических лабораториях.

На современном этапе все больше внимания уделяется автоматизированному анализу ретикулоцитов, что открывает новые перспективы для оценки состояния эритропоэза.

Автоматизированные методы исследования ретикулоцитов имеют значительно большую точность в подсчете, коэффициент вариации для количества ретикулоцитов составляет около 6% [Boven D., Bentley N., Cavill I., 1991]. Основными факторами повышения точности являются исследование большого количества эритроцитов (до 30 000 и более) и выявление незначительного количества РНК-содержащих структур в клетках.

Современные гематологические анализаторы позволяют получить

кроме классических (относительное - RET% и абсолютное - RET# количе-

<1_0 С, НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СПетербург /Я <2

о» vxrj «гч s ;

ство ретикулоцитов) дополнительные показатели, характеризующие клеточный объем (MRV, MSCV) и степень зрелости ретикулоцитов (IRF, HLR%, HLR#). Большинство из перечисленных ретикулоцитарных показателей недостаточно изучено, во многом неясной остается их интерпретация при различных анемических состояниях [Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др., 2002; Davis B.H., Bigelow N.C., 1995], что определяет актуальность изучаемой проблемы. Кроме того, до настоящего времени для новых ретикулоцитарных показателей не определены референтные величины и не изучено влияние условий и сроков хранения на стабильность проб крови.

Активное использование в клинике современных методов лечения (трансплантация почки и костного мозга, применение эритропоэтина и других факторов роста) требует внедрения новых; более информативных способов оценки эффективности терапии на ее ранних этапах.

Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи исследования.

Цель исследования: изучить информативность результатов автоматизированного исследования ретикулоцитарных показателей периферической крови для оценки состояния эритропоэза и мониторинга терапии при различных видах анемий. Задачи исследования;

1. Провести сравнительный анализ микроскопического - и автоматизированного методов исследования для изучения популяции ретикулоцитов в периферической крови.

2. Оценить влияние сроков и условий хранения проб крови на показатели ретикулоцитов.

3. Определить референтные величины ретикулоцитарных показателей для автоматизированного метода у взрослых мужчин и женщин.

4. Исследовать закономерности изменения ретикулоцитарных показателей в динамике проводимой терапии, при железодефицитной, Вл-

дефицитной, аутоиммунной гемолитической анемиях и анемии при хронической почечной недостаточности. 5. Определить оптимальные сроки проведения исследования показателей незрелых ретикулоцитов в современной схеме диагностики и оценке эффективности лечения анемий различного генеза. Научная новизна полученных результатов.

Впервые изучены и подробно охарактеризованы возможности автоматизированного метода исследования для оценки состояния эритропоэза.

Впервые исследовано влияние сроков и условий хранения проб крови на стабильность незрелых ретикулоцитов.

Впервые определены референтные величины для показателей незрелых ретикулоцитов.

Исследованы изменения ретикулоцитарных показателей при анемиях различного генеза до начала лечения и их значение для выявления степени выраженности неэффективного эритропоэза.

Впервые продемонстрированы закономерности изменения показателей ретикулоцитов, характеризующих клеточный объем и степень зрелости, в динамике терапии при различных видах анемий. Показана определяющая роль абсолютных величин ретикулоцитов и незрелых ретикулоци-тов для наиболее полной характеристики степени восстановления нарушенного эритропоэза.

Доказано, что при лечении анемий различного генеза повышение фракции незрелых ретикулоцитов и количества незрелых ретикулоцитов на 2-3 дня опережает увеличение общего количества ретикулоцитов в периферической крови. Предложены оптимальные сроки проведения автоматизированного анализа ретикулоцитов для мониторинга проводимой терапии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Исследование ретикулоцитов на гематологическом анализаторе превосходит по точности и воспроизводимости микроскопический метод под-

счета ретикулоцитов, что позволяет более точно оценить состояние эри-тропоэза и выявить изменения, характерные для различных видов анемий.

2. Для повышения достоверности результатов исследования ретикулоцитов следует строго соблюдать сроки и условия хранения проб крови.

3. Фракция незрелых ретикулоцитов, количество незрелых ретикулоцитов, средний объем ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов позволяют получить более точную информацию о состоянии эритропоэза.

4. Увеличение количества незрелых ретикулоцитов предшествует увеличению общего количества ретикулоцитов при повышении эритропоэтиче-ской активности костного мозга, что дает возможность раньше оценить эффективность проводимого лечения.

5. Для оценки активности эритропоэза при мониторинге течения анемии и результатов лечения более рациональным является использование всех дополнительных характеристик автоматизированного анализа ретикулоцитов, особенно их абсолютных значений.

Практическая значимость полученных результатов. В работе охарактеризованы преимущества автоматизированного анализа ретикулоцитов по сравнению с микроскопическим методом. Установлены референтные величины ретикулоцитарных показателей для взрослых мужчин и женщин. Определены оптимальные сроки и условия хранения проб крови для исследования ретикулоцитов. Показатели ретикулоцитов, характеризующие объем клеток и степень зрелости, предоставляют дополнительную информацию о состоянии эритропоэза, что позволяет использовать их для динамического мониторинга течения различных форм анемии и проводимой терапии. Возможности современных многопараметровых гематологических анализаторов диктуют необходимость широкого использования в клинической практике результатов автоматизированного анализа ретику-лоцитов. Применение показателей исследования ретикулоцитов дает воз-

можность более рационально подходить к диагностике и лечению больных с анемиями различного генеза.

Внедрение результатов исследования. Основные положения диссертационной работы нашли практическое применение в работе лабораторий Медицинского центра Банка России, 574 военного клинического госпиталя, 25 Центрального военного клинического госпиталя РВСН. Апробация работы. Материалы диссертации доложены, на совместной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО МЗ РФ, кафедры иммунологии РМАПО МЗ РФ, Медицинского центра Банка России, Лабораторного центра Главного военного клинического госпиталя имени акад. Н.Н.Бурденко и клинико-диагностической лаборатории ГКБ им.СП.Боткина 31 октября 2003 года, на научно-практическом симпозиуме «Принципы и способы лабораторного обеспечения внеболь-ничной помощи и актуальные проблемы лабораторной медицины» 8 октября 2001 года, на научно-практическом симпозиуме «Рациональное применение лабораторных тестов в диагностике и мониторинге наиболее распространенных форм патологии» 8 октября 2002 года. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, пяти1 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 157 источников, из которых 34 отечественных и 123 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 41 рисунком и 20 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе представлены результаты исследования 296 лиц в возрасте от 20 до 60 лет (122 мужчины, 174 женщины), из них 61 больных различными видами анемий, 235 практически здоровых лиц.

Диагноз анемий различного генеза был установлен на основании клинико-лабораторного обследования больных.

Анализ биохимических показателей крови проводился на анализаторе ADVIA 1650 (Bayer) наборами фирмы Roche, определение ферритина -иммуноферментным «сэндвич»-методом на анализаторе COBAS CORE (Roche), витамина Вп и эритропоэтина - на хемолюминесцентном анализаторе IMMULITE (DPC).

Для гематологического исследования использовали венозную кровь, взятую в моноветы объемом 2,7 мл, содержащие КзЭДТА в концентрации -1,5 мг/мл крови.

Исследование крови проводилось у больных до начала лечения и в течение 1-го - 2-х месяцев терапии.

Лечение больных с железодефицитной анемией (ЖДА) проводилось ТАРДИФЕРОНОМ (Робафарм, Швейцария), в дозе 150 мг 2 раза в день в течение 4 — 6 недель до нормализации концентрации гемоглобина и сывороточного железа. Поддерживающая длительная терапия до полугода проводилась препаратом СОРБИФЕР-ДУРУЛЕС (Эгис, Венгрия) по 320 мп в день.

Терапия пациентов, страдающих Вл-дефицитной анемией, проводилась витамином Bi2. Препарат вводился в дозе 500 мкг подкожно через день до 20 инъекций, затем проводилась поддерживающая терапия и профилактика рецидивов.

Лечение больных с анемией при хронической почечной, недостаточности (ХПН) проводилось препаратом. РЕКОРМОН (бета-эритропоэтин) фирмы Roche Diagnostics GmbH (Германия), по 2000 ME подкожно 3 раза в неделю перед сеансом гемодиализа. Для восполнения дефицита железа использовался препарат ВЕНОФЕР (Швейцария), по 100 мг внутривенно 1 раз в неделю.

Больные аутоиммунной гемолитической анемией (АИГА) получали преднизолон из расчета 1 мг на 1 кг веса в день до снижения количества

ретикулоцитов и нормализации эритроцитарных показателей с последующим постепенным уменьшением дозы препарата.

Подсчет количества ретикулоцитов в мазке крови осуществлялся унифицированным микроскопическим методом с использованием бриллиантового крезилового синего путем подсчета 5000 эритроцитов и определения относительного и абсолютного количества ретикулоцитов..

Для автоматизированного, исследования крови- использовался гематологический анализатор GEN-S (Beckman-Coulter). При исследовании ретикулоцитов в приборе используется принцип проточной цитометрии, который заключается в том, что анализ эритроцитов (после их подготовки и добавления краски) происходит во время поочередного прохождения через гидродинамически сфокусированную проточную кварцевую кювету. При этом. в пробе крови анализируется около 32000 эритроцитов. Исследование клеток производится с помощью уникальной технологии VCS (Volume - объем, Conductivity - электропроводимость, Scatter -светорассеяние), включающей в себя одновременную детекцию' клеток тремя методами: измерение импеданса при прохождении постоянного тока, электропроводимости клеток при прохождении тока высокой частоты и определение рассеивающей способности клеток с использованием луча гелий-неонового лазера. Для\идентификации;ретикулоцитов используется, нефлюорохромный краситель - новый метиленовый синий, окрашивающий остаточную РНК. Таким образом, на основании определения объема клеток и плотности внутриклеточных окрашенных структур прибор анализирует количественные и качественные характеристики ретикулоцитов и представляет их в виде семи показателей:

1) классические:

RET% - относительное количество ретикулоцитов (все ретикулоци-ты: общее количество эритроцитов х 100), %;

RET# - абсолютное количество ретикулоцитов (RET% x общее количество эритроцитов: 100), 1012 клеток/л;

2) объемные:

MRV - Mean Reticulocyte Volume - средний объем ретикулоцитов (средняя величина объемов всех ретикулоцитов), фемтолитр (фл);

MSCV - Mean Sphered Cell Volume - средний объем сферических клеток (средняя величина объемов сферулированных эритроцитов после воздействия закисленного гипотонического раствора), фл;

3) характеризующие степень зрелости ретикулоцитов:

IRF - Immature Reticulocyte Fraction - фракция незрелых ретикуло-цитов (количество незрелых ретикулоцитов : общее количество ретикуло-цитов), отношение;

HLR% - High Light Scatter Reticulocyte - относительное количество незрелых ретикулоцитов с высоким светорассеиванием (количество незрелых ретикулоцитов: общее количество эритроцитов х 100), %.

HLR# — High Light Scatter Reticulocyte - абсолютное количество незрелых ретикулоцитов с высоким светорассеиванием (HLR% x общее количество эритроцитов : 100), 1012 клеток/л.

С целью сравнения результатов двух методов осуществлялся подсчет количества ретикулоцитов с помощью светового микроскопа AXIOLAB (Zeiss) и параллельное измерение на анализаторе по 20 проб крови пациентов в 3-х диапазонах количества ретикулоцитов: < 0,6%; 0,6 - 1,5%; > 1,5%.

Исследование межсерийной воспроизводимости производилось путем измерения 3-х уровней контрольного материала 5С CELL CONTROL и RETIC-C CELL CONTROL (Beckmann Coulter), внутрисерийной воспроизводимости - при измерении проб крови 3-х пациентов с разным содержанием ретикулоцитов.

С целью определения влияния сроков и условий хранения проб крови на результаты анализа ретикулоцитов была исследована кровь в трех диапазонах количества ретикулоцитов: < 0,6%; 0,6 - 1,2% и > 1,2% через 1, 3, 6, 24 и 48 часов после ее взятия при хранении в условиях комнатной

температуры (по 20 проб каждого диапазона) и в холодильнике от 4° до 8° С (по 20 проб каждого диапазона).

Для получения референтных значений ретикулоцитарных показателей изучалась кровь практически здоровых взрослых 115 мужчин

и 120 женщин (мужчины 41,2+11,3 года, женщины 39,6+12,1 года). Статистическая обработка. Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием- пакетов М8 Ехсе1-97 и "Статистика" путем применения описательной статистики (определение коэффициента вариации), линейного регрессионного анализа (коэффициент корреляции), двухвыборочного ^теста с различными дисперсиями (достоверность различий между сериями).

Результаты исследования и их обсуждение. При сравнении микроскопического и автоматизированного методов нами была получена довольно низкая корреляция (табл.1), что объясняется прежде всего невысокой точностью микроскопического метода.

Таблица 1

Коэффициент корреляции для относительного (ЯЕТ%) и абсолютного (ЯЕТ#) количества ретикулоцитов

Диапазон RET% < 0,6% 0,6-1,5% > 1,5%

Коэффициент корреляции RET% 0,81 0,55 0,68

Коэффициент корреляции RET#(10IJ/n) 0,83 0,57 0,67

Самая низкая корреляция получена для диапазона ретикулоцитов от 0,6% до 1,5%, что согласуется с опубликованными в литературе данными [Brugnara С, Hipp M.J., Irving P.J. et al., 1994; van-Houte A.J.', Bartels P.C., Schoorl M., 1994]. Существенный разброс результатов подтверждает график корреляции (Рис. 1).

1.8 1.6 1.4

i'r

i

| 0,8 -

s 0,6 -

0,4 -0,2 0 — 0,5

GEN-S

Рис.1. Корреляция автоматизированного и микроскопического методов подсчета относительного количества ретикулоцитов (RET%) в диапазоне RET% 0,6 -1,5%.

Исследование воспроизводимости прибора по основным гематологическим параметрам показало, что она близка к опубликованным в литературе данным [Байдун Л.В., Логинов А.В., 1996; Козинец Г.И., Макаров, В.А., 1997; Почтарь М.Е., 1996]. Коэффициент вариации составил от 0,6% для гемоглобина (HGB) до 2,4% для тромбоцитов (PLT).

При исследовании межсерийной воспроизводимости результатов исследования ретикулоцитов путем измерения 3-х уровней контрольного материала выявлено, что наибольшей вариации подвержены показатели фракции незрелых ретикулоцитов (IRF) и относительного количества незрелых ретикулоцитов (HLR%) (табл.2). Наименьшая вариация характерна для средних объемов ретикулоцитов (MRV) и сферулированных эритроцитов (MSCV). Для количества ретикулоцитов при увеличении их содержания в крови коэффициент вариации снижается с 9,2% до 2,3%.

Аналогичные результаты получены при изучении внутрисерийной воспроизводимости в пробах крови с тремя уровнями количества ретику-лоцитов.

Таблица 2,

Межсерийная воспроизводимость (п = 30x3)

Пока- Ы5Т% = 0,9% ЮЕТ% = 3,0% КЕТ% = 10,9%

затели Хср У,% Хср Хср У,%

ЯЕТУо 0,93 0,085 9,2 2,99 0,133 4,5 10,87 0,27 2,5

ШТ# 0,04 0,003 7,3 0,14 0,01 5,0 0,5 0,01 2,3 ;

мю/ 90,7 2,49 2,7 93,0 1,65 1,8 94,7 2,6 2,8 1

МБСУ 58,3 0,66» 1,1 59,9 0,65 1,1 61,8' 0,69 1,1 |

ИШ 0,35 0,025 7,1 0,5 0,04 7,3 0,68 0,041 6,1 ■

0,32 0,03- 9,4 1,4 0,14 9,8 7,24" 0,58 8,0

0,015 0,001 7,0 0,068' 0,005 6,5 0,338 0,025 7,3

Примечание: Хср - среднее значение, SD - стандартное отклонение, V - коэффициент вариации.

Таким образом, воспроизводимость результатов измерения ретикулоцитов на приборе существенно превосходит таковую для микроскопического метода и позволяет выявить незначительные изменения со стороны характеристик ретикулоцитов.

При изучении влияния сроков и условий хранения проб крови на показатели ретикулоцитов выявлено, что при хранении крови в холодильнике все показатели в трех диапазонах практически не изменялись в течение 48 часов, в то время как в условиях комнатной температуры отмечалась тенденция к снижению относительного и абсолютного количества ретикулоцитов. Средний объем ретикулоцитов снижался с 24-го до 48-го часа хранения, а показатели фракции незрелых ретикулоцитов и количества незрелых ретикулоцитов достоверно уменьшались с 6-го до 24-го часа хранения (табл.3). Подобная динамика характерна для проб крови во всех 3-х диапазонах количества ретикулоцитов.

Таким образом, для получения достоверных результатов автоматизированного исследования ретикулоцитов оптимальные сроки хранения крови в условиях комнатной температуры не должны превышать 6-ти ча-

сов после ее взятия. При хранении в холодильнике (4°-8° С) стабильность проб крови для ретикулоцитарных показателей сохраняется в течение 48 часов.

Таблица 3.

Динамика ретикулоцитарных показателей при хранении проб крови в условиях комнатной температуры (диапазон RET% 0,6-1,5%)

Сроки (час) Показатели ретикулоцитов (Хср±80

МЯУ М8СУ пи? Н1Л% Н1Д#

1 112,9 ±6,5 94,6 ±5,2 0,299 ±0,082 0,336 ±0,121 0,015 ±0,006

3 111,6 ±6,9 93,6 ±5,3 0,288 ± 0,074 0,311 ±0,114 0,014 ±0,005

6 111,5 ±6,8 93,6 ±5,3 0,283 ±0,069 0,309 ±0,117 0,014 ±0,005

24 110,4 ±6,9 92,9 ±5,4 0,267 ±0,063 0,253 ± 0,099 0,012 ±0,005

48 108,4 ±7,1 92,1 ±4,9 0,250 ±0,073 0,228 ±0,081 0,011 ±0,004

Р <0,05(24-48) <0,05(24-48) <0,05(6-24) <0,05(6-24) <0,05(6-24)

Примечание: Р - уровень статистической значимости различий.

Результаты определения -референтных величин ретикулоцитарных показателей для взрослых мужчин и женщин представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Референтные величины показателей ретикулоцитов

Показатели Мужчины! 41,2 ±11,3 года (п-115) Женщины 39,6 ± 12,1 года (п-120)

Хер Хер ± 2БП Хер Хср±2БО

11ЕТ% 0,95 0,24- 1,67 1,08 0,12-2,05

ИЕТ# (10"/л) 0,05" 0,01 - 0,09 0,05 0,01-0,09'

МКУ(фл) 114,9 101,1 - 128,8 113,2 101,4-125,0

МБСУ (фл) 96,3 85,5 - 106,9 94,6 85,9 - 103,3

Ш7 0,30 0,19-0,41 0,29* 0,17-0,40

НЬЯ% 0,29 0,07 - 0,53 0,31 0,02-0,61

Н1Л1#(10и/л) 0,015 0,003 - 0,027 0,014 0,001 - 0,028

Нами показано, что при близких средних «значениях референтные диапазоны у женщин несколько шире, чем у мужчин. Следует отметить, что нормальные величины количества ретикулоцитов при автоматизированном исследовании отличаются от общепринятых для микроскопического метода, что обусловлено более высокой разрешающей способностью аппарата, позволяющего уловить незначительное количество окрашенного внутриклеточного материала. Полученные нами референтные величины для всех показателей ретикулоцитов позволяют правильно оценить и интерпретировать результаты исследования.

При исследовании крови 35 больных с железодефицитной анемией (ЖДА) до начала лечения была выявлена микроцитарная, гипохромная анемия. Диагноз ЖДА подтвержден сниженным уровнем сывороточного железа, ферритина и коэффициента насыщения трансферрина железом (табл.5).

Таблица 5,

Лабораторные показатели у больных с железодефицитной анемией

Показатели ЖДА (п-35) Хер ± SD Контрольная группа (п-20) Хср± SD Р

HGB (г/л) 107 ±16 141 ±5 < 0,001

RBC (101!/л) 4,47 ±0,39 4,58 ±0,18 >0,05

HCT (%) 33,9 ±4,2 42,5 ±1,5 < 0,001

MCV (фл) 76,3 ± 7,4 92,5 ±3.9 <0,061

МСН (т) 23,9 ±3,0 30,7 ±1,2 <ö,ööl

МСНС (%) 31,3 ±1,1 33,1 ±0,5 > 0,05

RÖW (%) 18,7 ±3,6 13.2 ±0.7 < 0,001

RET% 1,37 ±0,6 1,12 ±0,2 >0,05

R£W(10'7u) 0,05 ± 0,02 0,06 ±0,02 >0,05

MRV (фл) 110,9 ±8,1 117.2 ±5.9 <0,05

MSCV (фл) 85,4 ±7,5 96,5 ±5,1 <0,05

IRF 0,34 ±0,08 0,32 ±0,06 >0,05

HLR% 0,41 ±0,11 0,39 ±0,13 >0,05

HLR#(10u/n) 0,018 ±0,007 0,018 ±0,006 >0,05

Сывороточное железо (мкмоль/л) 2,7 ±1,8 12,7 ±3,4 <0,001

Трансферрин (г/л) 3,93 ±0,24 2,6 ±0,21 <0,001

Коэффициент насыщения трансфершшз С/о) 2,7 ±1,6 29,0 ±6,0 <0,001

Ферритин (нг/мл) 9,7 ±1,8 127,0 ±15,0 < 0,001

Относительное и абсолютное содержание ретикулоцитов имели недостоверные различия. Фракция незрелых ретикулоцитов (IRF), относительное (HLR%) и абсолютное (HLR#) количество незрелых ретикулоцитов были практически не изменены (р > 0,05). Отсутствие изменений со стороны показателей незрелых ретикулоцитов свидетельствует о нормальной эритропоэтической активности костного мозга, что характерно для регенераторной стадии ЖДА. По сравнению с контрольной группой отмечалось снижение средних объемов ретикулоцитов (MRV) и сферулированных эритроцитов (MSCV), коррелирующее со > снижением среднего объема эритроцитов (МСУ), г = 0,94 (Рис.2).

95 -

65 -

60 --,-1-.-1-,

90 100 110 120 130 140

МДО.фл

Рис.2. Корреляция среднего объема эритроцитов (МСУ) и среднего объема ретикулоцитов (MRV) при ЖДА (г = 0,94).

В процессе лечения препаратами железа у исследованных больных ЖДА происходило увеличение в крови НОВ, МСУ, МСН, МСНС, снижение RDW (показателя анизоцитоза), количество эритроцитов (ИВС) практически не изменялось (табл.6). Средний объем ретикулоцитов (MRУ) постепенно увеличивался на протяжении всего периода лечения и к 30-му дню достиг нормальной величины.

Таблица 6.

Динамика гематологических показателей при лечении больных с ЖДА

Показатели Исходные результаты Дни лечения

7 день 14 день 16 день 18 день 21 день 30 день

HGB (г/л) 107 ± 16 116± 14 122 ± 15 126 ± 17 128 ±21 134± 19 130 ± 18

RBC (10и/л) 4,47 ±0,39 4,38 ±0,41 4,51 ±0,47 4,46 ±0,51 4,41 ±0,63 4,34 ±0,57 4,53 ±0,53

НСТ(%) 33,9 ±4,2 35,3 ±4,3 35,8 ±4,1 36,7 ±4,5 38,1 ±5,1 38,5 ±4,7 39,1 ±4,9

MCV (фл) 76,3 ±7,4 81,4 ±8Д 83,5 ±7,7 85,4 ±7,3 86,3 ±8,1 86,7 ±7,9 86,5 ±7,6

МСН (пг) 23,9 ±3,0 24,6 ±3,1 26,3 ± 3,6 27,8 ±2,9 28,4 ±3,3 28,6 ±3,5 28,7 ±3,4

МСНС (%) 31,3 ± 1,1 31,5 ±0,9 32,1 ±0,8 32,3 ±0,7 32,5 ±0,8 32,7 ±0,7 32,8 ±0,6

RDW (%) 18,7 ±3,6 17,9 ±2,9 17,7 ±3,3 17,5 ±2,7 16,9 + 3,1 16,3 ±2,6 16,1 ±2,8

RET% 1,37 ±0,6 1,43 ±0,4 1,67 ±0,7 2,12 ±0,8 3,21 ±1,1* 2,87 ±0,9 1,75 ±0,5**

RET# 0,05 ±0,02 0,06 ±0,01 0,0610,01 0,08 ±0,01 0,1 ±0,01* 0,07 ±0,01 0,06 ±0,01**

MRV (фл) 110,9±8,1 112,6 ±9,2 114,4 ±9,3 116,1 ±9,7 121,3 ±10,1 120,6 ±9,9 121,1 ±9,8

MSCV (фл) 85,4 ±7,5 86,9 ±8,1 87,4 ±8,2 88,7 ±8,5 89,3 ±9,0 88,8 ±8,3 88,6 ±8,7

IRF 0,34 ±0,08 0,36 ±0,07 0,38 ±0,06 0,73 ±0,11* 0,62 ±0,09 0,41 ±0,10 0,38 ±0,07**

HLR% 0,41 ±0,11 0,43 ±0,09 0,46 ±0,08 0,97 ±0,12* 0,56 ±0,07 0,48 ±0,09 0,43 ±0,11**

НЫ1#(10^/л) 0,018 ±0,007 0,019 ±0,006 0,031 ±0,008 0,039 ±0,011* 0,027 ±0,009 0,021 ±0,011 0,018 1 0,006"

Примечание. * - Р (1-16,1-18 дни) < 0,05; ** - Р (16-30,18-30 дни) < 0,05.

Максимальный подъем ретикулоцитов приходился на 18-й день лечения, в то время как показатели количества незрелых, ретикулоцитов (ИЬЯ%, ИЬЯ#) и фракции незрелых ретикулоцитов (1ЯР) увеличивались на 16-й день, что позволяет использовать их для более ранней оценки активации эритропоэза в мониторинге терапии больных ЖДА. Динамика основных ретикулоцитарных показателей у больных ЖДА продемонстрирована на сравнительной диаграмме (Рис.3).

« 5 10 15 20 25 30

ДНИ ЛЕЧЕНИЯ

Рис.3. Динамика основных ретикулоцитарных показателей у больных ЖДА на фоне лечения

При исследовании крови 12 больных с Ви-дефицитной анемией была выявлена макроцитарная, гиперхромная анемия с выраженным анизоцито-зом (табл.7). Диагноз подтвержден снижением концентрации витамина В12 в сыворотке крови.

Анализ ретикулоцитов показал, что их относительное количество у больных и в контрольной группе существенно не различались, однако абсолютное содержание ретикулоцитов у больных было достоверно снижено (р < 0,01). Средние объемы клеток (МЯУ и МБСУ) были повышены (р < 0,05) и соответствовали увеличенному среднему объему эритроцитов. Фракция незрелых ретикулоцитов (1ЯБ) и относительное количество незрелых ретикулоцитов (ИЬЯ%) были достоверно повышены (р < 0,05), в то

время как абсолютное количество незрелых ретикулоцитов (ИЬЯ#) было сниженным (р < 0,05).

Таблица 7.

Лабораторные показатели у больных с Вл-дефицитной анемией

Показатели В ^-дефицит (п-12) Хер ± ББ Контрольная группа 1 (а-20) Хер ± БЭ Р

НОВ (г/л) 67 ±21 148 ±9 <0,001-

ИВС (10и/л) 1,78 ±0.96 4.89 + 0,35 <0,001

НСТ (%) 20,3 ± 9,5 45,1 ±2.9 <0,001

МСУ (фл) 114.5 ±9.9 91.9 ±2.7 <0,001'

МСН(пг) 37,7 ±2,9 30,4 ± 0,9 <0,01

ШЖ (%) 34.6 ±7.4 13.2 ±0.7 <0,001

ЯЕТ% 1,12 ±0,52 0,97 ±0,40 >0,05

ЫЕТ# (10ы/л) 0,03 ± 0,01 0,05 ±0,02 <0,01

МЯУ (фл) 152.9 ±14.8 113.4 ±6.7 <0,001

МБСУ (фл) 102.7 ±7.9 94.7 ±4,9 <0,05

1ЯБ 0.41 ±0.05 0.28 ±0.05 " <0,01

Н1Л% 0.64 ±0,08 0,29 ±0.13 <0,001

Н1Л#(10и/л) 0,012 ± 0,002 0,014 ±0,007 <0,05

Витамин Вп (пмоль/л) 84,6 ±16,3 321 ±48 <0,001

Низкие значения абсолютного количества ретикулоцитов и незрелых ретикулоцитов свидетельствуют о снижении скорости продукции эритроцитов в костном мозге при дефиците витамина В12, что согласуется с известными литературными данными о низкой пролиферативной активности клеток эритроидного ряда и повышенном неэффективном эритропоэзе при этом заболевании [Воробьев П.А., 2001; Долгов В.В., Луговская С.А., Морозова В.Т. и др., 2002; Воробьев А.И;, 2002]. Увеличение фракции незрелых ретикулоцитов (1ЯР) может свидетельствовать об ускоренном выбросе. клеток из костного мозга, как компенсаторной реакции в ответ на тканевую гипоксию.

Сравнительный анализ результатов гематологического исследования на фоне лечения витамином Bi2 показал, что у исследованных больных при положительной динамике со стороны эритроцитарных показателей рети-кулоцитарный криз наблюдался на 6-й день терапии, однако к концу 1-го месяца абсолютное количество ретикулоцитов не нормализовалось, что свидетельствует о еще недостаточно восстановленной регенераторной способности костного мозга. В то же время фракция незрелых ретикулоцитов (IRF) и количество незрелых ретикулоцитов (HLR%, HLR#) повышались уже на 3-й день лечения и опережали подъем ретикулоцитов (Рис.4).

1« 15 20

ДНИ ЛЕЧЕНИЯ '

Рис.4. Динамика эритроцитов и основных ретикулоцитарных показателей у больных В^-дефицитной анемией на фоне лечения

Таким образом, данные автоматизированного исследования ретику-лоцитов указывают, что наиболее чувствительными маркерами состояния эритропоэтической активности костного мозга и эффективности лечения витамином В12 являются фракция незрелых ретикулоцитов, их относительное и абсолютное количество.

У 9-ти больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН), находящихся на системном гемодиализе, на фоне сниженного эндогенного

эритропоэтина (эЭПО) в крови была выявлена нормоцитарная, нормо-хромная анемия и незначительный ретикулоцитоз (табл.8).

Таблица 8.

Лабораторные показатели у больных с хронической почечной недостаточностью

Показатели ХПН (п-12) Хер ± SD Контрольная группа (п-20) Хер ± SD Р

НвВ (г/л) 93 ±9 145 ±12 < 0,001

ИВС (Ю^/л) 3,02 ± 0,28 4,76 ±0,38' <0,001.

НСТ (%) 28,6 ±2,9 43,9 ±3,5 <0,001

МО/ (фл) 94,7 + 5,1 91,5 ±3,0 >0,05

МСН (пг) 31,4 ± 1,1 ЗОЛ ±2,1 >0,05

(%) 14.9 ±1.5 13,2 ±0,7 <0,05

11ЕТ% 1,88 ±0,77 0,89 ±0,39 <0,001

КЕТ#(1012/л) 0,06 ± 0,02 0,05 ±0,02 <0,05

МЯУ (фл) 122,7 + 7,3 116,5 ±4,2 <0,01

МЗСУ(фл)- 100.4 ±6.4 96,7 ±3.7 > 0,05

1ЯР 0.35 ± 0.03 0,30 ±0,04 <0,001

ЙШ4 0,59 ±0.26 0,29 ±0,14 <0,001

Н1Л#(10"/л) 0,021 ±0.006 0,012 ±0,004 <0,001

Креатинин (мкмоль/л) 467 ±69 87 ±7 <0,001-

Мочевина (ммоль/л) 22,1 ±5,3 6,1 ± 1,3 <0,001

Эритропоэтин (МЕ/л) 1,8 + 0,4 18,2 ±3,7 <0,001

Средний объем ретикулоцитов (МЯУ) был достоверно повышен (р < 0,01), что свидетельствует о преобладании среди них незрелых форм. Отмечалось достоверное повышение фракции незрелых ретикулоцитов (1ЯБ), их относительного (ИЬЯ%) и абсолютного количества (ИЬЯ#), что характеризует наличие активного эритропоэза в костном мозге, несмотря на дефицит эЭПО. Возможно, это объясняется реакцией костного мозга на гемолиз и постоянные кровопотери, связанные с гемодиализом.

На фоне коррекции анемии рекомбинантным эритропоэтином и препаратами железа при положительной динамике эритроцитарных показателей относительное и абсолютное количество ретикулоцитов достигли максимальной величины к 8-му дню лечения, затем постепенно снизились к

концу 2-го месяца ниже первоначального уровня. Относительное (HLR%) и абсолютное количество незрелых ретикулоцитов (HLR#), а также фракция незрелых ретикулоцитов (IRF) максимально повысились на 6-й день лечения, опережая на 2 дня пик увеличения общего количества ретикулоцитов (Рис.5).

4,5»

«,•0 I-----1 I-■

О 3 1» 15 20.. 25 3«

ДНИ ЛЕЧЕНИЯ

Рис.5. Динамика эритроцитов и основных ретикулоцитарных показателей у больных ХПН на фоне лечения <

Интересно отметить, что у двух исследованных больных ХПН на фоне лечения был выявлен более поздний ретикулоцитарный криз. Максимальное повышение относительного и абсолютного количества ретикулоцитов произошло на 10-й день терапии и составило около 10% от исходных значений, то есть имел место слабый эффект от лечения рЭПО. Полученные результаты могут свидетельствовать о недостаточной дозе препарата или развитии резистентности к ЭПО и подтверждают сложность патогенеза анемии при ХПН, обусловленной не только дефицитом эритро-поэтина.

Таким образом, показатели незрелых ретикулоцитов (IRF, HLR%, HLR#) могут быть использованы для более ранней оценки биологического эффекта рЭПО на эритропоэз.

При аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) до начала лечения выявлена макроцитарная, гиперхромная анемия с резко выраженным анизоцитозом, относительным и абсолютным ретикулоцитозом, что характеризует высокую эритропоэтическую активность костного мозга (табл.9).

Таблица 9.

Лабораторные показатели у больных с аутоиммунной гемолитической анемией

Показатели АИГА (п-5) Хер ± ББ Контрольная группа (п-20) Хсо ± 8Б Р

ШВ (г/л) 71 ±18 149 ± 10 < 0,001

ЯВС (10|2/л) 1,59 ±0,27 4,91 ±0,35 <0,001

НОТ (%) 18.5 ±з:4 44,912,7 <0,001

МСУ (фл) 116.4110.1 91,613,9 <0,001

МСН(пг) 44,5 + 4,7 30,511.5 <0,001

1Ш\У (%) 20.714.4 13.210,7 <0,01

1ШТ% 33,415,2 1,3110,54 <0,001

КЕТ#(1012/л) 0,5310,21 0.0610,02 <0,001

МЯУ (фл) 123,816,1 112,9 ±5,8 <0,05

МБСУ (фл) 95.313,4 94,513.7 <0,05

ШБ 0.7610,27 0,27 ±0,06 <0,001

И1Л1% 25.2213,6 0.3810,14 <0,001

Н1Л#(10'7л) 0,40110,121 0,01910,006 < 0,001

Свободный гемоглобин плазмы (мг/дл) 32,319,1 7,2 ±2,4 < 0,001

Билирубин общий (мкмоль/л) 43,6 ±7,8 12,3 ±2,1 <0,001

Билирубин непрямой (мкмоль/л) 33,7 ±6,4 2,310,6 <0,001'

Анализ ретикулоцитарных параметров показал увеличение среднего объема ретикулоцитов (MRV), значительное повышение фракции незрелых ретикулоцитов (IRF), их относительного и абсолютного количества

В динамике лечения больных АИГА преднизолоном на фоне возрастания эритроцитарных показателей отмечалось снижение относительного и абсолютного количества ретикулоцитов к 10-13-му дню наблюдения до

нормального уровня. К этому же сроку выявлено значимое снижение фракции незрелых ретикулоцитов (IRF), относительного (HLR%) и абсолютного количества (НЬЯ#) незрелых ретикулоцитов (Рис.6).

Рис.6. Динамика концентрации гемоглобина и основных * ретикулоцитарных показателей у больных АИГА на фоне лечения

Таким образом, наиболее выраженные изменения среди других гематологических показателей при АИГА касались параметров незрелых рети-кулоцитов (ШБ, HLR%, HLR#), которые могут служить индикаторами активности эритропоэза.

Сравнительная характеристика показателей автоматизированного анализа ретикулоцитов при различных анемиях представлена в таблице 10.

Таким образом, ретикулоцитарные показатели автоматизированного исследования периферической крови, особенно показатели незрелых рети-кулоцитов, отражают состояние эритропоэтической активности костного мозга и могут быть использованы в качестве ранних критериев эффективности проводимой терапии при анемиях различного генеза.

Таблица 10.

Сравнительная характеристика ретикулоцитарных показателей прианемиях

Вид анемии Показатели

ЯЕТ% ЯЕТ# МЯУ МЭСУ пш Н1Л1#

Железодефицитная N,1 N 1 1 ьг,Т N N

В|2-дефицитная 4. Т Т Т Т

Анемия при ХПН Т Т Т Т,н ТТ ТТ ТТ

Гемолитическая аутоиммунная» тт ТТ Т Т,ы ТТ ТТ ТТ

Примечание: Т - повышение; гг - значительное повышение; N. Т - тенденция к повышению; 1 - снижение; N - без изменений.

выводы

1. Автоматизированный метод исследования ретикулоцитов периферической крови, основанный на определении объема клеток и содержания остаточной РНК в эритроцитах, позволяет с достаточной воспроизводимостью получить количество ретикулоцитов и новые информативные показатели, характеризующие их объем и степень зрелости. Коэффициент вариации для количества ретикулоцитов составляет 2,1-9,2 %. Достоверность результатов исследования ретику-лоцитов определяется оптимальными сроками хранения проб крови (при комнатной температуре не более 6-ти часов, в холодильнике -48-ми часов после взятия).

2. Определены референтные диапазоны для относительного и абсолютного количества ретикулоцитов, средних объемов ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов, фракции незрелых ретикулоцитов, относительного и абсолютного количества незрелых ретикулоцитов у взрослых мужчин и женщин, позволяющие правильно оценивать и интерпретировать полученные результаты.

3. Регенераторная стадия железо дефицитной анемии характеризует-

ся нормальными значениями относительного и абсолютного содержания ретикулоцитов и незрелых ретикулоцитов, что свидетельствует об активном эритропоэзе, а также сниженным средним объемом ретику-лоцитов и сферулированных эритроцитов, коррелирующим со средним объемом эритроцитов.

4. Наиболее информативными данными при В12-дефицитной анемии являются: снижение абсолютного количества ретикулоцитов и незрелых ретикулоцитов, что отражает изменение пролиферативного потенциала эритрокариоцитов; увеличение среднего объема ретику-лоцитов и сферулированных эритроцитов, соответствующее макроци-тозу эритроцитов.

5. Анемия при ХПН и аутоиммунная гемолитическая анемия характеризуются повышением фракции незрелых ретикулоцитов, их относительного и абсолютного количества, что может служить индикатором эритропоэтической активности костного мозга.

6. В динамике лечения анемий увеличение фракции незрелых рети-кулоцитов, относительного и абсолютного их количества на 2 — 3 дня опережает подъем общего числа, ретикулоцитов крови, что позволяет использовать данные показатели как более чувствительные индикаторы оценки эффективности терапии.

7. Оптимальными сроками проведения исследования показателей незрелых ретикулоцитов являются при ЖДА - 14-16 дни лечения, при Вп-дефицитной анемии - 3-4 дни лечения, при ХПН — 6-7 дни лечения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выборе метода исследования ретикулоцитов необходимо отдавать предпочтение автоматизированному методу, имеющему существенные преимущества перед микроскопическим.

2. С целью оптимизации'дифференциальной диагностики анемий следует производить автоматизированное исследование ретикулоцитов у всех пациентов, имеющих сниженные эритроцитарные показатели.

3. Для получения качественных и наиболее достоверных результатов при автоматизированном исследовании ретикулоцитов требуется строго соблюдать сроки и условия хранения проб крови.

4. С целью оценки результатов исследования ретикулоцитов рекомендуем использовать разработанные нами референтные величины для взрослых мужчин и женщин.

5. При проведении дифференциальной диагностики анемических состояний необходимо широко использовать показатели, характеризующие степень зрелости и средний объем ретикулоцитов, в первую очередь их абсолютные величины.

6. Более ранняя оценка состояния эритропоэза с помощью дополнительных ретикулоцитарных показателей при лечении анемий диктует необходимость широкого использования в клинической практике современных высокотехнологичных гематологических анализаторов, позволяющих производить исследование ретикулоцитов.

7. Рекомендуем включать в оптимальную схему комплексной диагностики и оценки эффективности лечения анемий многопараметровый анализ ретикулоцитов, что наиболее адекватно отвечает современным требованиям.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коленкин СМ., Кишкун А.А Автоматизация исследования крови с использованием гематологической системы GEN-S // Клиническая лабораторная диагностика.- 2001,- №9.- С. 15-16.

2. Коленкин СМ. Использование показателей автоматизированного анализа ретикулоцитов для оценки эффективности эритропоэза // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002.- №9.- С.18.

3. Коленкин СМ. Автоматизация исследования крови с использованием гематологической системы GEN-S // Клиническая лабораторная диагностика.- 2002. - №11.- С. 14-17.

4. Коленкин СМ. Референтные величины параметров автоматизированного анализа ретикулоцитов // Клиническая лабораторная диагностика. -2003.-№1.-С40-42.-

5. Коленкин СМ. Автоматизированный анализ ретикулоцитов // Клиническая лабораторная диагностика.- 2003.- №3.- С.36-39.

6. Кишкун А.А., Миколаускас В.П., Коленкин СМ. и др. Значение показателей автоматизированного анализа ретикулоцитов для диагностики и оценки эффективности лечения анемии у больных с хронической почечной недостаточностью // Сборник тезисов докладов Научно-практической конференции "Заместительное лечение и детоксикация в специализированной интенсивной терапии", Москва, 23 окт. 2003 г.-ГВКГ им. Н.Н.Бурденко.-М., 2003.- С.5-8.

7. Луговская СА., Коленкин СМ. Автоматизированный анализ ретикулоцитов: информативность и клинико-диагностическое значение новых показателей // Лаборатория.- 2003.- № 4.- С.3-5.

Диссертант искренне благодарит за помощь, оказанную при выполнении работы, директора Медицинского центра Банка России, Заслуженного деятеля науки РФ, член-корреспондента РАН, профессора Назаренко Г.И., заместителя директора МЦ Банка России по лечебной работе, д. м. н., профессора Полубенцеву Е.И., заместителя директора - руководителя Диагностического центра МЦ Банка России, д. м. н. Кишкуна А.А., заведующего кафедрой КЛД РМАПО МЗ РФ, д. м. н., профессора Долгова В.В.

Перечень принятых сокращений

АИГА - аутоиммунная гемолитическая анемия

ЖДА - железодефицитная анемия

рЭПО - рекомбинантный эритропоэтин

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ЭПО - эритропоэтин

эЭПО - эндогенный эритропоэтин'

НСТ - гематокрит

HGB - гемоглобин

HLR% - относительное количество незрелых ретикулоцитов

HLR# - абсолютное количество незрелых ретикулоцитов

IRF - фракция незрелых ретикулоцитов

МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах

МСНС — средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах

MRV - средний объем ретикулоцитов

MSCV - средний объем сферулированных эритроцитов

Р - уровень статистической значимости различий

PLT - количество тромбоцитов'

г - коэффициент корреляции

RBC - количество эритроцитов

RDW - ширина распределения эритроцитов

RET% - относительное количество ретикулоцитов

RET# - абсолютное количество ретикулоцитов

SD—стандартное отклонение

V - коэффициент вариации;

VCST- технология автоматизированного исследования клеток (Volume-объем, Conductivity-проводимость, Scatter- рассеивание) Хер - среднее значение

КОЛЕНКИН Сергей Миронович

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ РЕТИКУЛОЦИТОВ

(Автореферат)

Подписано в печать29.01.04 г. Бумага «Kym Lux» Ризография. Тираж 100 экз. Зак. 10

Издано научно-методическим центром ГВКГ им. академика Н.Н. Бурденко (Лицензия серия ЛР, № 040846 от 23.09.97 г.) 105229, Москва, Госпитальная пл., 3

»- 3074

Актуальность исследования

Анемия является наиболее распространенным симптомом, сопровождающим течение различных заболеваний. Распознавание патогенетического варианта анемий базируется на данных лабораторного исследования и зависит во многом как от уровня и качества этих исследований, так и от правильной интерпретации полученных результатов.

Одним из основных гематологических тестов, оценивающих активность костномозгового эритропоэза, является исследование рети-кулоцитов периферической крови. Оно используется в диагностике, классификации и мониторинге лечения анемии, оценке восстановления эритропоэза после химиотерапии и в динамике лечения реком-бинантным эритропоэтином. До настоящего времени основным методом оценки ретикулоцитов является микроскопический с подсчетом их относительного количества в суправитально окрашенном мазке крови. Однако указанный метод трудоемок, недостаточно стандартизирован, отличается низкой воспроизводимостью из-за подсчета небольшого числа ретикулоцитов. Коэффициент вариации по данным различных авторов составляет от 25% до 50% [79,112]. Кроме того, визуальная оценка ретикулоцитов является достаточно субъективной и зачастую не позволяет уловить слабо выраженные зернисто-сетчатые структуры [52], что необходимо для динамического мониторинга активности эритропоэза.

На протяжении последних 70 лет предпринимались попытки получения дополнительной информации о степени созревания ретикулоцитов при использовании микроскопического метода с целью более глубокой оценки состояния эритропоэза у больных анемией, однако они не нашли практического применения в клинико-диагностических лабораториях [10,88].

На современном этапе все больше внимания уделяется автоматизированному анализу ретикулоцитов, открывающему новые перспективы для оценки состояния эритропоэза.

Автоматизированные методы имеют значительно большую точность в подсчете, коэффициент вариации составляет около 6% [42]. Основными факторами повышения точности являются исследование большого числа эритроцитов (до 30 ООО и более) и четкое улавливание незначительного количества РНК-содержащих структур в клетках. Современные гематологические анализаторы позволяют получить кроме классических относительного и абсолютного количества ретикулоцитов дополнительные показатели, характеризующие клеточный объем и степень зрелости ретикулоцитов. Большинство из этих показатели недостаточно изучено, во многом неясной остается их интерпретация при различных анемических состояниях [13,63,68].

Кроме того, до настоящего времени для новых ретикулоцитар-ных показателей не определены референтные величины и не изучено влияние условий и сроков хранения на стабильность проб крови.

Активное использование в клинике современных методов лечения (трансплантация почки и костного мозга, применение эритропо-этина и других факторов роста) требует внедрения новых, более доступных и дешевых способов оценки эффективности терапии на ее ранних этапах.

Все вышеизложенное определяет актуальность проблемы и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.

- 8

Цель исследования

Изучить информативность результатов автоматизированного исследования ретикулоцитарных показателей периферической крови для оценки состояния эритропоэза и мониторинга терапии при различных видах анемий.

Задачи исследования

1. Провести сравнительный анализ результатов микроскопического и автоматизированного методов исследования ретикулоцитов в периферической крови.

2. Изучить влияние сроков и условий хранения проб крови на показатели ретикулоцитов.

3. Определить референтные величины показателей ретикулоцитов автоматизированного метода для взрослых мужчин и женщин.

4. Исследовать закономерности изменения ретикулоцитарных показателей в динамике проводимой терапии при железодефицитной, В12-дефицитной, аутоиммунной гемолитической анемиях и анемии при хронической почечной недостаточности.

5. Определить оптимальные сроки проведения исследования показателей незрелых ретикулоцитов в современной схеме диагностики и оценке эффективности лечения анемий различного генеза.

Научная новизна работы

Научная новизна настоящего исследования заключается в том, что впервые изучены и подробно охарактеризованы возможности автоматизированного метода исследования для оценки состояния эритропоэза в костном мозге.

Впервые изучено влияние сроков и условий хранения проб крови на результаты исследования незрелых форм ретикулоцитов.

Впервые определены референтные величины для показателей незрелых ретикулоцитов.

Впервые исследованы изменения ретикулоцитарных показателей при анемиях различного генеза до начала лечения и их значение для выявления степени выраженности неэффективного эритропоэза.

Впервые продемонстрированы закономерности изменения показателей ретикулоцитов, характеризующих клеточный объем и степень зрелости, в динамике терапии при различных видах анемий. Показана определяющая роль абсолютных величин ретикулоцитов и незрелых форм ретикулоцитов для наиболее полной характеристики степени восстановления нарушенного эритропоэза.

Впервые доказано, что при лечении анемий различного генеза повышение фракции незрелых ретикулоцитов и количества незрелых ретикулоцитов на 2-3 дня опережает увеличение общего количества ретикулоцитов в периферической крови.

Впервые предложены оптимальные сроки проведения автоматизированного анализа ретикулоцитов для мониторинга проводимой терапии.

Практическая значимость работы

В работе охарактеризованы преимущества автоматизированного анализа ретикулоцитов по сравнению с микроскопическим методом.

Установлены референтные величины ретикулоцитарных показателей для взрослых мужчин и женщин.

Определены оптимальные сроки и условия хранения проб крови для исследования ретикулоцитов.

Показатели ретикулоцитов, характеризующие объем клеток и степень зрелости, предоставляют дополнительную информацию о состоянии эритропоэза, что позволяет использовать их для динамического мониторинга течения различных форм анемии и проводимой терапии.

Возможности современных многопараметровых гематологических анализаторов диктуют необходимость широкого использования в клинической практике результатов автоматизированного анализа ретикулоцитов.

Применение показателей исследования ретикулоцитов дает возможность более рационально подходить к диагностике и лечению больных с анемией различного генеза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Исследование ретикулоцитов на гематологическом анализаторе превосходит по воспроизводимости микроскопический метод подсчета ретикулоцитов, что позволяет более точно оценить состояние эритропоэза и выявить изменения, характерные для различных видов анемии.

2. Для повышения достоверности результатов исследования ретикулоцитов следует строго соблюдать сроки и условия хранения проб крови.

3. Показатели автоматизированного исследования ретикулоцитов (фракция незрелых ретикулоцитов, количество незрелых ретикулоцитов, средний объем ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов) позволяют получить более точную информацию о состоянии эритропоэза.

4. Увеличение количества незрелых ретикулоцитов предшествует увеличению общего количества ретикулоцитов при повышении эритропоэтической активности костного мозга, что дает возможность раньше оценить эффективность проводимого лечения.

5. Для оценки активности эритропоэза при мониторинге течения анемии и результатов лечения более рациональным является использование всех дополнительных характеристик автоматизированного анализа ретикулоцитов, особенно их абсолютных значений.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на совместной конференции кафедры клинической лабораторной диагностики РМАПО МЗ РФ, кафедры иммунологии РМАПО МЗ РФ, Медицинского центра Банка России, Лабораторного центра Главного военного клинического госпиталя имени акад. Н.Н.Бурденко и клинико-диагностической лаборатории ГКБ им.С.П.Боткина 31 октября 2003 года, на научно-практическом симпозиуме «Принципы и способы лабораторного обеспечения внебольничной помощи и актуальные проблемы лабораторной медицины» 8.10.2001 года, на научно-практическом симпозиуме «Рациональное применение лабораторных тестов в диагностике и мониторинге наиболее распространенных форм патологии» 8.10.2002 года. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Реализация и внедрение результатов работы Результаты исследования внедрены в Медицинском центре Банка России, 574 Военном клиническом госпитале, 25 Центральном военном клиническом госпитале РВСН.

Клинические и лабораторные исследования, связанные с решением поставленных задач, проведены на базе Медицинского центра Банка России.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, иллюстрирована 41 рисунком и 20 таблицами. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический указатель включает 157 источников, из которых 34 отечественных и 123 зарубежных авторов.

- 105 -ВЫВОДЫ

1. Автоматизированный метод исследования ретикулоцитов периферической крови, основанный на определении объема клеток и содержания остаточной РНК в эритроцитах, позволяет с достаточной воспроизводимостью получить количество ретикулоцитов и новые информативные показатели, характеризующие их объем и степень зрелости. Коэффициент вариации для количества ретикулоцитов составляет 2,1-9,2 %. Достоверность результатов исследования ретикулоцитов определяется оптимальными сроками хранения проб крови (при комнатной температуре не более 6-ти часов, в холодильнике — 48-ми часов после взятия).

2. Определены референтные диапазоны для относительного и абсолютного количества ретикулоцитов, средних объемов ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов, фракции незрелых ретикулоцитов, относительного и абсолютного количества незрелых ретикулоцитов у взрослых мужчин и женщин, позволяющие правильно оценивать и интерпретировать полученные результаты.

3. Регенераторная стадия железодефицитной анемии характеризуется нормальными значениями относительного и абсолютного содержания ретикулоцитов и незрелых ретикулоцитов, что свидетельствует об активном эритропоэзе, а также снижнным средним объемом ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов, коррелирующим со средним объемом эритроцитов.

4. Наиболее информативными данными при В^-дефицитной анемии являются: снижение абсолютного количества ретикулоцитов и незрелых ретикулоцитов, что отражает изменение пролиферативного потенциала эритрокариоцитов; увеличение среднего объема ретикулоцитов и сферулированных эритроцитов, соответствующее макроцитозу эритроцитов.

5. Анемия при ХПН и аутоиммунная гемолитическая анемия характеризуются повышением фракции незрелых ретикулоцитов, их относительного и абсолютного количества, что может служить индикатором эритропоэтической активности костного мозга.

6. В динамике лечения анемий увеличение фракции незрелых ретикулоцитов, относительного и абсолютного их количества на 2 — 3 дня опережает подъем общего числа ретикулоцитов крови, что позволяет использовать данные показатели как более чувствительные индикаторы оценки эффективности терапии.

7. Оптимальными сроками проведения исследования показателей незрелых ретикулоцитов являются при ЖДА - 14-16 дни лечения, при В^-дефицитной анемии - 3-4 дни лечения, при ХПН — 6-7 дни лечения.

- 107

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При выборе метода исследования ретикулоцитов необходимо отдавать предпочтение автоматизированному методу, имеющему существенные преимущества перед микроскопическим.

2. С целью оптимизации дифференциальной диагностики анемий следует производить автоматизированное исследование ретикулоцитов у всех пациентов, имеющих сниженные эритроцитарные показатели.

3. Для получения качественных и наиболее достоверных результатов при автоматизированном исследовании ретикулоцитов требуется строго соблюдать сроки и условия хранения проб крови.

4. С целью оценки результатов исследования ретикулоцитов рекомендуем использовать разработанные нами референтные величины для взрослых мужчин и женщин.

5. При проведении дифференциальной диагностики анемических состояний необходимо широко использовать показатели, характеризующие степень зрелости и средний объем ретикулоцитов, в первую очередь их абсолютные величины.

6. Более ранняя оценка состояния эритропоэза с помощью дополнительных ретикулоцитарных показателей при лечении анемий диктует необходимость широкого использования в клинической практике современных высокотехнологичных гематологических анализаторов, позволяющих производить исследование ретикулоцитов.

7. Рекомендуем включать в оптимальную схему комплексной диагностики и оценки эффективности лечения анемий многопараметровый анализ ретикулоцитов, что наиболее адекватно отвечает современным требованиям.