Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клинико-диагностическое и прогностическое значение индукторов апоптоза-каспазы и sFAS-L в лечении больных хроническим миелолейкозом гливеком

На правах рукописи

Накстхоева Эсет Башировна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИНДУКТОРОВ АПОПТОЗА-КАСПАЗЫ И эРАЗ-Ь В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ ГЛИВЕКОМ

14.01.04- внутренние болезни

1 2 НДР Ш1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Астрахань -2012

005015074

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

кандидат медицинских наук, доцент Заклякова Людмила Владимировна

доктор медицинских наук, профессор Каменев Виктор Фёдорович

доктор медицинских наук, профессор Панов Анатолий Анатольевич

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « [Ь_ » иЩрТЦ2012 г. в £¿1. часов на заседании диссертационного совета Д 208,005.01 при ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (414000 г. Астрахань, ул. Бакинская, 121)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан « О^» О 2012 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 208.005.01 кандидат медицинских наук, доцент

Научный руководитель Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) - первое клональное миело-пролиферативыое заболевание, при котором была выявлена генетическая поломка, приводящая к его развитию - реципрокная транслокация t(9;22)(q34;ql 1.2) с образованием дериватной хромосомы der(22) t(9;22) с укороченным плечом - филадельфийской или Ph-хромосомы.

Доказано, что развитие XMJI и опухолевый рост являются результатом дисбаланса между пролиферацией клеток и программированной клеточной смертью (Барышников А.Ю., 2001; Бондарева В.А., 2007; Козлов A.B. и др., 2010). До настоящего века ХМЛ был фатальным заболеванием с неминуемым прогрессированием болезни и низкой выживаемостью. Только трансплантация костного мозга позволяла достичь относительно длительной ремиссии. В то же время, несмотря на установление множества существенных патогенетических деталей, удовлетворительной общей концепции патогенеза хронического мие-лолейкоза не существовало (Райхлин Н.Т 1996, Соколовская А А 2003, RowanS. 1997).

Расшифровка молекулярно - генетических механизмов ХМЛ дала ключ к пониманию, что лишь медикаментозная элиминация Ph-позитивного клона и восстановление нормального Ph-негативного гемопоэза могут привести к длительной ремиссии и увеличению выживаемости больных (Волкова М.А. 2007, Домрачева Е.В. 2005). Появление препаратов, ингибирующих тирозинкиназы (ИТК), играющих основную роль в развитии ХМЛ, коренным образом изменило тактику его лечения, сделав терапию патогенетически направленной. Это позволило получить полные гематологические, цитогенетические, молекулярные ответы, в несколько раз увеличить выживаемость^ снизить ежегодную летальность уже при применении первого ингибитора тирозинкиназ - гливека (Imatiniba mesylat, STI 571, «Novartis Pharma AG», Швейцария). Однако, ряд проблем, связанных с оптимизацией эффективности лечения гливеком, остаются не решенными. В связи с этим представляется интересным изучение вопросов апоптоза у больных ХМЛ, получающих лечение гливеком. Клинических работ по определение маркеров - индукторов апоптоза каспазы 9 и sFas - лиганда у больных хроническим миелолейкозом нет. Таким образом, работа является актуальной как в теоретическом плане, так и для практического здравоохранения.

Связь темы исследования с планом научных работ ГБОУВПОАГМЛ

Тема диссертационной работы является фрагментом комплексной темы: «Современные аспекты диагностики, мониторинга лечения и прогноза у больных хроническим миелолейкозом в отдельных популяциях Южного Федерального округа», номер госрегистрации -01201000902, протокол №45 Центральной проблемной комиссии от 26.10.2009 г., утверждена на Учёном совете 09.12.2009 г.

Комплексная тема выполняется в рамках Проблемы ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздрав-сопразвития России: «Белки-маркёры и молекулярные основы патологических процессов», Код ГРНТИ З 1.27.03.

Цель исследования

Определить клинико-диагностическое и прогностическое значение индукторов апоптоза каспазы 9 и зРаэ-Ь в лечении больных хроническим миелолейкозом гливеком.

Задачи исследования

1. Провести анализ достижения клинических ответов в стандартные -боки, цитогенетических и молекулярных ответов в сроки 24, 30, 36 месяцев терапии гливеком у больных ХМЛ

2. Выявить влияние предлеченности, прогностического риска по 18ока1 на достижение у больных ХМЛ положительных результатов

3. Определить концентрацию каспазы 9 и Браз-Ь в сыворотке крови в контрольной группе здоровых доноров

4. Дать клиническое толкование взаимосвязи концентрации каспазы 9 в сыворотке крови и достижения цитогенетических и молекулярных ответов у больных ХМЛ' на 24, 30, 36 месяцев терапии гливеком

5. Определить клинико - диагностическое и прогностическое значение концентрации индуктора апоптоза - эРаз-Ь в сыворотке крови у больных ХМЛ на 24, 30, 36 месяцев терапии гливеком в достижении цитогенетических и молекулярных ответов

Научная новизна исследования

Впервые определены нормальные значения концентрации индукторов апоптоза - каспазы 9 и БраБ-Ь в сыворотке крови у здоровых лиц Астраханской области и у больных ХМЛ в общей группе.

Доказано патогенетическое влияние концентрации индукторов апоптоза - каспазы 9 и sFas-L на достижение оптимального, полного цитогенетического и большого/полного молекулярного ответов.

Впервые определена прогностическая значимость низких и высоких концентраций каспазы 9 и sFas-L у больных на поздних этапах терапии гливеком (30-36 месяцев), отражающих наличие или отсутствие Ph-положительного клона.

Практическая ценность исследования

Пролонгация терапии гливеком с увеличением дозы до 600 мг в сутки при недостижении оптимального ответа к 18 месяцам способствует увеличению.количества ПЦО, БМО/ПМО на срок мониторинга до 36 месяцев.

Установлено, что сокращение сроков предлеченности у больных XMJI ведет к улучшению результатов терапии гливеком к сроку 36 месяцев: в группе с ОпО срок предлеченности в 2 раза ниже по сравнению с группой неудачи терапии; в группе больных с достижением БМО/ПМО тенденция аналогичная.

Доказано, что высокий риск прогноза XMJ1 по J. Sokal достоверно снижает количество ОпО, ПЦО, БМО/ПМО.

Повышенная концентрация индукторов апоптоза каспазы 9 и sFas-L в поздние сроки лечения - (30 - 36 месяцев) имеет положительное значение и ассоциируется с достижением ПЦО, БМО/ПМО.

Снижение концентрации индукторов апоптоза каспазы 9 и sFas-L в сроки лечения 30 - 36 месяцев исключает возможность достижения ПЦО, БМО/ПМО.

Личный вклад автора

Лично автором исследования выполнено теоретическое обоснование темы работы; проведено изучение всей первичной медицинской документации; заполнены тематические карты на каждого больного; сформулированы критерии включения и исключения больных хроническим миелолейкозом в группу обследуемых лиц; сформированы группы сравнения; проведена систематизация, статистическая обработка с применением компьютерной технологии и соответствующего программного обеспечения (прикладной пакет STATISTIKA-7, Microsoft Exel); проведены анализ результатов, их теоретическое обоснование и внедрение лечебную практику.

Внедрение результатов исследования: результаты исследования внедрены в практику работы гематологической службы ГУЗ «Александре - Мариинская областная клиническая больница» г. Аст-

рахани, в педагогический процесс на кафедре факультетской терапии и профессиональных болезней с курсом последипломного образования.

Основные положении диссертации, выносимые на защиту

1. У части больных ХМЛ эффективность терапии гливеком меняется в контрольных точках мониторинга (18, 24, 30, 36 месяцев терапии) в связи с развитием первичной или вторичной резистентности к препарату

2. На поздних сроках мониторинга (30-36 месяцев) выявлено, что на эффективность терапии больных ХМЛ гливеком влияют сроки пред-леченности и риск прогноза заболевания по J.Sokal

3. Концентрация каспазы 9 и sFas-L в сыворотке, крови отражает на изученных сроках мониторинга (24-36 месяцев терапии гливеком) патогенез ХМЛ (наличие или отсутствие Ph+ клона)

4. Увеличение количества ПЦО и БМО/ПМО на 30-36 месяцев терапии (медикаментозно индуцированное повышением дозы гливека) ассоциировано с активацией апоптоза по каспазозависимому и Fas-зависимому путям

5. Выявлено клинико-диагностическое и прогностическое значение концентрации в сыворотке крови каспазы 9 и sFas-L при достижении цитогенетических и молекулярных ответов

Публикации и апробации работы

Основные положения диссертации доложены и представлены на конференции «Лекарство и здоровье человека» (г. Астрахань, 2011г.), :-'.а научных итоговых научных сессиях АГМА (2010, 2011 гг.), на 7-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2010); конференции «Белки - маркеры» (г. Астрахань, 201 IrJ. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в т.ч. 3 работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы проведена на объединенном заседании кафедр ГБОУ ВПО АГМА Минздравсоцразвития России.

Структура работы

Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает в себя 87

отечественных и 123 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей, 24 рисунками, б клиническими примерами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Обследовано 54 больных хроническим миелолейкозом, находившиеся на лечении в поликлинике и гематологическом отделении ГУЗ «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г. Астрахани, в отделении гематологии ГУЗ «Волгоградский областной клинический онкологический диспансер №1» в период с 2007 по 2010 гг. Контрольную группу составили 30 практически здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с больными ХМЛ. Критерии включения в исследование:

- пациенты, получающие терапию гливеком сроком от 18 до 36 месяцев; пациенты, находившиеся на момент начала терапии гливеком в хронической фазе; пациента, у которых диагноз ХМЛ был подтвержден цитогенетическим и молекулярно-генетическим исследованием (количественное определение экспрессии химерного гена BCR-АВЬтнпа р210).

Критерии исключения из исследования:

- наличие в качестве сопутствующей патологии заболеваний, при которых может повышаться титр каспазы 9 и sFas-L: сахарный диабет, заболевания соединительной ткани, системные васкулиты, заболевания сердечно-сосудистой системы, онкозаболевания.

Всем больным при диагностике заболевания и мониторинге терапии гливеком проводились: исследование общего анализа крови, миелограмм, стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ), флуоресцентная in situ гибридизация (FISH), количественная оценка экспрессии химерного гена BCR-ABL типа р210 методом ПЦР в режиме реального времени.

Статистическая обработка данных проводилась при помощи статистической программы STATISTICA 7. Для каждого показателя и групп наблюдения вычисляли среднее значение, ошибку средней арифметической. Для проверки статистических гипотез при сравнении числовых данных двух не связанных групп использовали U-критернй Манна - Уитни. Учитывая небольшой объем наблюдений, при статистических расчетах использовались формулы для малых групп.

Все пациенты на 18 месяцев лечения были разделены на 3 группы в зависимости от ответа на лечение согласно критериям ELN -2009: группа 1 - оптимальный ответ (ОпО), группа 2 - субоптимальный ответ (СО), группа 3 - неудача терапии (НТ). В зависимости от резуль-

татов цитогенетического и молекулярного, ответов на последующие контрольные точки 24, 30, 36 месяцев больные разделились на 2 группы: 1. Больные с наличием полного цитогенетического и большого/полного молекулярного ответов согласно критериям ЕЬИ -2009. 2, Больные без достижения ПЦО, БМО/ПМО (у которых РЬ - хромосома г5ольше 0% и транскрипт гена ВСК/АВЬ больше 0,1%).

Пациенты, вошедшие в исследование, по тендерному признаку распределились следующим образом: мужчин - 24 (45,28%) женщин -29 (54,72%). Средний возраст больных на момент диагностики составил 52,09±1,72.

Из 54 больных ХМЛ - 52 имели предлеченность различными препаратами.

Анализируя таблицу 1, можно сделать вывод, что срок предле-ченности влияет на результат терапии гливеком: в группе с ОпО срок предлеченности в 2 раза ниже, чем в группе с неудачей терапии.

Таблица 1

Сравнительная характеристика ответа на лечение в зависимости от срока предлеченности на 18 месяцев терапии гливеком

Показатель ОпО СО НТ

п =20 п = 4 п = 29

Срок предлеченности П,98±8,96 28,63±5,65

(мес) 15,57±5,05 (р2<0,01) (р1<0,01)

(р2<0,01)

Примечание:

различия показателей значимы (р! <0,01) группы ОпО и НТ; различия показателей 'значимы (р2<0,01) группы СО и НТ

Проведённый нами анализ показал такую же статистически значимую тенденцию и в группе больных, достигших ПЦО и БМО/ПМО, по сравнению с группой, где отсутствовали данные ответы.

Согласно критериям Е1ЛЧ-2009, через 18 месяцев лечения гливеком у больных ХМЛ должен быть достигнут оптимальный ответ. Предиктором благоприятного прогноза является не только получение хорошего цитогенетического и молекулярного ответов, но и его раннее достижение. На рисунках 1, 2, 3, 4 представлен мониторинг терапии гливеком в исследуемой группе больных ХМЛ. В связи отсутствием на 18 месяцев у 29 (54,72%) больных ответа на лечение (НТ) и отсутствие возможности перевода больных на ИТК второго поколения, доза гливека была увеличена до 600 мг в сутки. Дальнейший анализ (24-30-36 месяцев) показал, что пролонгация

8

терапии гливеком с увеличением его дозы до 600 мг увеличивает количество достижения ПЦО и БМО/НМО.

О ОпО

□ со

ЯНЕ

Рис. 1 .Мониторинг через 18мес. лечения

Рис. 3. Мониторинг через Рис.4. Мониторинг через

30 мес. лечения 36 мес. лечения

Соответственно в каждые сроки мониторинга снизился процент частичного и малого цитогенетического ответов на лечение гливеком (Рис.5).

а пцо

ОБМО/ПМО В нетПЦО ■ нетБМО/ПМО

шж

М®.

I ез 18 месяцев | ' к 24 месяца : а 30 месяцев | ¡.В Збмесяцев |

Рис.5. Мониторинг цитогенетического ответа на терапию гливеком у больных ХМЛ

□ пцо а бмо/пмо

Я нетПЦО ■ нетБМО/ПМО

Рис.2. Мониторинг через 24 мес. лечения

а пцо

□ БМО/ПМО

■ нетПЦО

■ нетБМО/ПМО

У всех больных параллельно осуществлялся забор периферической крови для исследования маркеров индукций апоптоза - растворимого Fas-лиганда (sFas-L) и каспазы 9. Концентрацию sFas-L и кас-пазы 9 в сыворотке крови определяли методом твердофазного анализа (ИФА) при помощи наборов реагентов sFas-L и каспазы 9 (ELISA) фирмы Bender MedSystems (Австрия), используя аппаратуру (Universal Microplate Reader, Auto Strip Waiher , VORTEMP BIO-ТЕК INSTRUMENTS, INC).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Изучение концентрации индуктора апоптоза sFas-L в сыворотке крови у больных ХМЛ

Концентрации индуктора апоптоза sFas-L в сыворотке крови у 30 здоровых доноров, жителей Астраханской области составила 0,11±0,03 нг/мл (группа контроля).

При проведении статистической обработки мы объединили группу больных с неудачей терапии с группой субоптимального ответа. Основанием для объединения групп послужило то, что при субоптимальном ответе (как и при неудаче терапии) ведущий критерий -полный молекулярный ответ не достигается.

Таблица 2

Концентрация sFas-L j> больных ХМЛ в зависимости от ответа на лечение гливеком через 18 месяцев терапии

Показатель Контрольная группа (п = 30) Больные ХМЛ

Оптимальный ответ (п - .20) Неудача терапии (п =33)

Концентрация sFas-L в сыворотке крови (нг/мл) 0,П ±0,01 0,45±0,03 р<0,001 рКО.О! 0,16±0,07 р<0,05

Примечание:

р - достоверность различия показателей по. сравнению с контрольной группой; р1 -достоверность различия показателей группы оптимального ответа по сравнению с группой неудачи терапии .

Как представлено в таблице 2, концентрация вРаэ-Ь у больных с оптимальным ответом составила 0,45±0,03 нг/мл, что в 4 раза выше контрольных значений. Данные статистически значимы по сравнению с контролем. При сравнении группы оптимального ответа и неудачи

терапии выявлено, что у больных с оптимальным ответом концентрация 5рай-Ь в почти в 3 раза выше, чем у больных с неудачей терапии (р<0,05). Вероятнее всего, это связано с увеличением дозы гливека именно в этот период (69% больных ХМЛ стали получать гливек в дозе 600 мг, в срок б месяцев получали 18% больных).

Полученный результат указывает на активацию апоптоза у больных как с оптимальным ответом, так и с неудачей терапии. Оптимальный ответ на 18 месяцев сопровождается достижением БМО/ПМО, но сохраняется ещё остаточная (минимальная болезнь), поэтому активация апоптоза имеет положительное патогенетическое значение.

Далее мы изучили концентрацию БРаБ-Ь на 24 месяца терапии гливеком в зависимости от достижения ПЦО и БМО/ПМО (табл. 3).

Таблица 3

Средние значения концентрации яГая-Ь у больных ХМЛ

в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов на 24 месяца лечения гливеком

Показатель Контрольная 1-руппа (п = 30) Больные ХМЛ

ПЦО (п = 28). нет ПЦО (п = 25) ■ БМО/ ПМО (п=31) Нет БМО/ ПМО (п = 22)

Концентрация вРая-Ь в сыворотке крови (нг/мл) 0,11±0,01 0,12±0,01 р>0,05 0,19±0,01 р<0,01 р1<0,05 0,14±0,01 р>0,05 0,2±0,02 р<0,01 р2<0,05

Примечание:

р - достоверность различия показателей по сравнению контрольной группой р1 - достоверность различия показателей по сравнению с группой ПЦО р2 - достоверность различия показателей по сравнению с группой БМО/ПМО

Как представлено в таблице 3, у больных, достигших ПЦО по факту в более поздние сроки (24 месяца лечения гливеком), концентрация Браэ-Ь достоверно не отличалась от контроля. В группе больных с отсутствием цитогенетического ответа концентрация зРаэ-Ь значимо превышает значения как в контрольной группе, так и в группе полного цитогенетического ответа и достигает 0,19±0,01 нг/мл. Аналогичная закономерность прослеживается и при сравнении • значений концентрации в зависимости от молекулярного ответа: у больных,

достигших БМО/ПМО, концентрация вРаБ-Ь составила 0,14±0,01 нг/мл и достоверно не отличается от контроля. У больных, не достигших БМО/ПМО, концентрация эРаэ-Ь - 0,2±0,02 нг/мл, что достоверно выше значений в контрольной группе и в группе больных с достижением молекулярных ответов. Таким образом, сохранение РИ+ клона (нет ПЦО, нет БМО/ПМО) характеризуется, по-прежнему, активацией апоптоза, что говорит о патогенетическом значении данного маркёра.

Чтобы проследить, изменяется ли полученная нами закономерность в более поздние сроки лечения, мы проанализировали концентрацию эРаи-Ь у больных ХМЛ, получающих гливек в течение 30 месяцев. Данные отображены в таблице 4.

Таблица 4

Средние значения концентрации у больных ХМЛ

в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов на 30 месяцев лечения гливеком

Показатель Контрольная группа (п = 30) . Больные ХМЛ

ПЦО (п = 29) Нет ГЩО (п = 24) БМО/ ПМО (п - 33) Нет БМО/ ПМО (п = 20)

Концентрация зР^-Ь в сыворотке крови (нг/мл) 0,11±0,01 0,18±0,01 р<0,01 0,12±0,01 р>0,05 . р1<0,01 0,21±0,01 р<0,01 0,12±0,01 р>0,05 р2<0,01

Примечание:

^»-достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой :)1 - достоверность различия показателей по сравнению с группой ПЦО г>2 - достоверность различия показателей по сравнению с группой БМО/ПМО

Как представлено в таблице 4, у больных, достигших ПЦО, концентрация зРаэ-Ь повышена и составила 0,18±0,01 нг/мл,. что статистически значимо по сравнению с контрольной группой. В группе больных с отсутствием полного цитогенетического ответа концентрация эРаэ-Ь не превышает значений как в контрольной группе, так и в группе полного цитогенетического ответа и составляет 0,12±0,01 нг/мл.

При анализе молекулярного ответа имеются однотипные результаты: у больных, достигших БМО/ПМО, концентрация Браз-Ь составила 0,21±0,01 нг/мл, что достоверно выше контроля. У больных, не достигших БМО/ПМО, концентрация вРаэ-Ь не отличается от контроля (0,12±0,02 нг/мл) и статистически значимо ниже по сравнению с группой больных, достигших БМО/ПМО. Чтобы подтвердить или опровергнуть это предположение, мы проанализировали концентрацию вРаэ-Ь еще в более поздние сроки.

Таблица 5

Средние значения концентрации ьРая-Ь у больных ХШ1 в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов на 36 месяцев лечения гливеком

Показатель Группа контроль (п = 30) Больные ХМЛ

ПЦО 01 = 32) нет ПЦО (п = 21) БМО/ ПМО (п = 35) НетБМО/ ПМО (п=18)

Концентрация вРаз-Ь в сыворотке крови (нг/мл) 0,11±0,01 0,19±0,01 р<0,01 0,10±0,01 р>0,05 р1<0,01 0,2±0,01 р<0,01 0,1040,01 р>0,05 р2<0,01

Примечание:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой р1 - достоверность различия показателей по сравнению с группой ПЦО р2 - достоверность различия показателей по сравнению с группой БМО/ПМО

Из данной таблицы следует, что у больных, достигших ПЦО на 36 месяцев терапии гливеком, концентрация Брая-Ь составила 0,19±0,01 нг/мл, что статистически значимо превышает показатели контрольной группой. В группе больных с отсутствием ПЦО концентрация эРаБ-Ь не превышает показателей как в контрольной группе, так и в группе ПЦО и составляет 0,10±0,01 нг/мл. Абсолютно полное совпадение данной тенденции имеет концентрация вРавтЬ при анализе молекулярного ответа. У больных с; БМО/ПМО концентрация зРаэ-Ь составила 0,2±0,01 нг/мл, что достоверно выше контрольных значений. У больных, не достигших БМО/ПМО, концентрация эРаэ-Ь -0,10±0,02 нг/мл, что не выше значений в контрольной группе и двукратно ниже (р<0,01) по сравнению с больными, достигшими БМО/ПМО.

Проведённый анализ показывает, что на 24 месяца терапии достижение ПЦО и БМО/ПМО сопровождалось кратковременной нормализацией концентрации зРав-Ь. На более поздних этапах (до 36 месяцев) повышенные цифры эРаз-Ь, характеризующие запуск апоптоза по Раз-зависимому пути, имеют взаимосвязь с достижением ПЦО, БМО/ПМО. Нормальная концентрация Браэ-Ь при наличии РЬ+ клона (доказанного по цитогенетическим и молекулярно-генетическим исследованиям) не позволяет достигнуть ПЦО и БМО/ПМО.

Изучение концентрации индуктора апоптоза каспазы 9 в сыворотке крови у больных ХМЛ

Мы провели изучение концентрации каспазы 9 в сыворотке крови у 30 здоровых доноров. Результаты варьировали в диапазоне от 0,97 до 4,17 нг/мл. Среднее значение данного показателя составило 2,03±0,68 нг/мл. Таким образом, полученные нами показатели концентрации каспазы 9 в группе здоровых доноров оказались сопоставимыми с приведенными данными сопроводительной аннотации к набору реагентов.

Полученные нами в ходе исследования значения концентрации каспазы 9 в сыворотке крови у 53 обследованных больных ХМЛ варьировали в диапазоне от 0,84 нг/мл до 15,84 нг/мл. Нами определена концентрация каспазы 9 в каждой контрольной точке лечения больных ХМЛ - 18, 24, 30, 36 месяцев терапии гливеком.

На данном этапе работы мы сравнили концентрацию каспазы 9 на 18 месяцев терапии гливеком у больных с оптимальным ответом и с неудачей терапии (таблица 6).

Таблица 6

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ в зависимости от ответа на лечение гливеком в срок 18 месяцев терапии

Показатель Группа контроль (п-30) Больные ХМЛ

Оптимальный ответ (п = 20) Неудача терапии (п =33)

Концентрация каспазы

9 в сыворотке крови 2,03±0,68 2,09±0,03 3,21±0,07

(нг/мл)

р>0,05 р<0,01

р1<0,01

Примечание:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой

р1 - достоверность различия показателей группы оптималыюго ответа по сравнению с

группой неудачи терапии.

Как представлено в таблице 6, концентрация каспазы 9 у больных с оптимальным ответом составила 2,09±0,03 нг/мл, у больных с неудачей терапии 3,21±0,07 нг/мл, т.е. отмечено значительное повышение концентрации каспазы 9 в группе неудачи терапии. Результаты статистически значимы по сравнению с группой контроля и группой оптимального ответа (р<0,01). Полученные данные говорят об активации процессов ano птоза на 18 месяцев терапии гливеком в группе неудачи терапии.

Далее мы продолжили анализ: в контрольной точке 24 месяца терапии гливеком мы проанализировали различия концентрации каспазы 9 в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов (табл.7).

Таблица 7

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ, в зависимости

от цитогенетического и молекулярного ответов, _ в срок 24 месяца лечения гливеком_

Показатель Группа контроль (п = 30) Больные ХМЛ

ПЦО (п =28) НетПЦО (п = 25) БМО/ ПМО (п = 31) НетБМО/ ПМО (п-22)

Концетрация каспазы 9 в сыворотке крови (нг/мл) 2,03±0,06 2,05±0,07 р>0,05 2,63±0,03 р<0,05 pl<0,05 1,96±0,0б р>0,05 3,80±0,02 р<0,01 р2<0,01

Примечание:

р - достоверность различия показателей по сравнению с кошрольной группой

р1 - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО

р2 - достоверность различия показателей группы БМО/ПМО и нет БМО/ПМО

Как представлено в таблице 7, у больных ХМЛ, достигших ПЦО в срок 24 месяца терапии гливеком, концентрация каспазы 9 достоверно не отличается от контрольной группы.

Аналогичная тенденция характерна и при анализе молекулярных ответов.

Таким образом, наличие ПЦО и БМО/ПМО свидетельствует об элиминации опухолевого РЬ-позитивного клона. Этому состоянию соответствует концентрация каспазы 9, не отличающаяся от нормальных значений (р>0,05). Эта концентрация каспазы 9 свидетельствует

об отсутствии в организме «стимула» для повышенной работы данного индуктора апоптоза.

В группе больных ХМЛ, не достигших ПЦО в срок 24 месяца терапии гливеком, концентрация каспазы 9 значительно выше контроля, что подтверждается и данными в группе отсутствия БМО/ПМО (2,63±0,03 и 3,80±0,02 нг/мл соответственно). При статистическом анализе показаны достоверные различия концентрации каспазы 9 между группами ПЦО и нет ПЦО, так же, как и между группами БМО/ПМО и нет БМО/ПМО (р1<0,05; р2<0,01). Высокие цифры индуктора апоптоза каспазы 9 при отсутствии ПЦО и БМО/ПМО сопряжены с наличием РЬ- позитивного клона клеток у больных ХМЛ.

Далее мы изучили концентрацию каспазы 9 через 30 месяцев лечения у больных ХМЛ в зависимости от достижения цитогенетиче-ского и молекулярного ответов (табл.8).

Таблица 8

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов в срок 30 месяцев лечения гливеком

Показатель Группа ■ Контроль (п = 30) Больные ХМЛ

ПЦО (п =29) Нет ПЦО (п = 24) БМО/ пмо (п = 33) НетБМО/ ПМО (п = 20)

Концентрация каспазы 9 в сыворотке крови (нг/мл) 2,03±0,06 2,92±0,06 р<0,01 р1<0,01 2,02±0,02 р>0,05 2,62±0,05 р<0,05 р2<0,05 2,09±0,04 р>0,05

Примечание: -

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой

р1 - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО

р2 - достоверность различия показателей группы БМО/ПМО и нет БМО/ПМО

Как представлено в таблице 8, у больных, достигших ПЦО, концентрация каспазы 9 составила 2,92±0,0б нг/мл, что статистически значимо по сравнению с контрольной группой. В группе больных с отсутствием ПЦО концентрация каспазы 9 не превышает значения в контрольной группе и составляет 2,02±0,02. Различия между группами ПЦО и нет ПЦО достоверны (р<0,01).

При анализе молекулярного ответа выявляется аналогичная закономерность: у больных, достигших БМО/ПМО, концентрация кас-пазы 9 повышена и составила 2,62±0,02 нг/мл, что достоверно отличается от контроля. У больных, не достигших БМО/ПМО концентрация каспазы 9 - 2,09±0,04 нг/мл, что сопоставимо с контрольной группой (р>0,05). Различия между группами БМО/ПМО и нет БМО/ПМО достоверны (р<0,05).

Следующий этап работы: изучить концентрацию каспазы 9 в конечной точке нашего исследования - 36 месяцев терапии гливеком. Полученные данные представлены в таблице 9.

Таблица 9

Концентрация каспазы 9 у больных ХМЛ в зависимости от цитогенетического и молекулярного ответов в срок 36 месяцев лечения гт веком

Показатель Группа К01ГТрОЛЬ (п = 30) Больные ХМЛ

ПЦО (п=32) Нет ПЦО (п = 21) БМО/ пмо (п = 35) Нет БМО/ПМО (п= 18)

Концентрация каспазы 9. в сыворотке крови (нг/мл) 2,03±0,06 4,04±0,1 р<0,001 р1<0,01 2,41±0,03 р>0,05 3,98±0,15 р<0,001 ■ р2<0,01 2,21±0,02 р>0,05

Примечание:

р - достоверность различия показателей по сравнению с контрольной группой

р! - достоверность различия показателей группы ПЦО и нет ПЦО

р2 - достоверность различия показателей группы БМО/ПМО и нет БМО/ПМО

Из данной таблицы следует, что у больных, достигших ПЦО на 36 месяцев терапии гливеком, концентрация каспазы 9 составила 4,04±0,1 нг/мл, что статистически значимо по сравнению с контрольной группой. В группе больных с отсутствием ПЦО концентрация каспазы 9 не превышает значения в контрольной группе и составляет 2,41±0,03 нг/мл.

Такую же закономерность концентрации каспазы 9 мы видим при анализе молекулярного ответа. У больных, достигших БМО/ПМО концентрация каспазы 9 составила 4,04±0,1 нг/мл, что достоверно выше контроля. У больных, не достигших БМО/ПМО, концентрация

17

каспазы 9 - 2,41 ±0,03 нг/мл, что не отличается от значений в контрольной группе.

Здесь мы видим достоверное увеличение концентрации каспазы 9 у больных с ПЦО и БМО/ПМО по сравнению с группами больных, не достигшими этих ответов (р1<0,05; р2<0,05). Прогрессирующее увеличение концентрации каспазы 9 у больных, которые достигли ПЦО и БМО/ПМО, указывает на выраженность гибели РЬ+ клеток и говорит о выраженности апоптогенного эффекта в отношении опухолевой массы. Низкие цифры концентрации индуктора апонтоза - каспазы 9 на более поздних сроках лечения, а именно на 36 месяцев терапии, не реагирующих на лечение гливеком свидетельствует об угнетении фазы индукции апоптоза патологическим РЬ+ клоном.

Нами проведена сравнительная оценка концентрации вРая-Ь и каспазы 9. Проведённый выше анализ (таблицы 2 и 6) на 18 месяцев терапии выявил кратковременное разнонаправленное поведение изучаемых маркёров при оценке оптимального ответа и неудачи терапии гливеком. В поздние сроки терапии (24-36 месяцев) выявлена их однонаправленная реакция у больных ХМЛ с достижением/ недостижением ПЦО, БМО/ПМО.

При стабильном положительном результате - достижение ПЦО и БМО/ПМО на 24 месяца терапии отмечена нормализация концентрации индукторов апоптоза эРаз-Ь и каспазы 9, что патогенетически оправдано и следует расценивать как «адекватное поведение» данных индукторов: они работают «по требованию» (есть опухоль -> запуск апоптоза, опухоль элиминирована -> отпала потребность к активной работе).

В группе больных, не достигших ПЦО и БМО/ПМО на более поздних сроках терапии (30 и 36 месяцев) отмечено снижение концентрации БРаБ^Ь и каспазы 9 до нормы и ниже ее. Из этого анализа следует, что у больных при наличии Р11+ клона клеток (доказанного цито-генетическими и молекулярно-генетическими методами) по какой-то причине не происходит запуска индукторов апоптоза - $Ра5-Ь и каспазы 9. Это свидетельствует о патогенезе ХМЛ в сторону прогрессиро-вания и неблагоприятном прогнозе заболевания.

Проведённый анализ выявил достоверное повышение концентрации каспазы 9 и зРаз-Ь на 30-36 месяцев терапии в группе больных с достижением ПЦО и БМО/ПМО (к этим срокам увеличилось количество данных ответов за счёт пролонгации терапии и увеличения дозы гливека до 600 мг). Без активации апоптоза как первопричины успеха по достижению положительных результатов лечения ХМЛ данных ответов не было бы получено.

выводы

1. К 18 месяцам терапии гливеком достинуты: ОпО - у 37,74%, СО-7,55%, неудача терапии - у 62,26% больных ХМЛ. Пролонгация терапии и увеличение дозы гливека к 36 месяцам последовательно способствует повышению ПЦО и БМО/ПМО.

2. На 36 месяцев терапии больных ХМЛ гливеком установлено, что при ОпО срок предлеченности в 2 раза короче по сравнению с группой неудачи терапии. Низкий риск прогноза заболевания по 1.5ока1 увеличивает процент достижения ОпО, ПЦО и БМО/ПМО.

3. У здоровых лиц (контроль) концентрация каспазы 9 и БраБ-Ь в сыворотке крови составила 2,03±0,68 нг/мл и 0,11 ±0,01 нг/мл соответственно.

4. Концентрация каспазы 9 в сыворотке крови является переменной величиной: наличие ПЦО, БМО/ПМО на 24 месяца терапии характеризуется нормализацией показателей, свидетельствует об элиминации РЬ+ клона. На 30 - 36 месяцев регистрируется увеличение достигнутых ПЦО (54,72%; 60,38% соответственно) и БМО/ПМО (62,26%; 66,04% соответственно). Данный результат ассоциируется с активацией каспазо-зависимого пути апоптоза (повышение концентрации данного индуктора апоптоза в сыворотке крови), что имеет патогенетическое значение при ХМЛ и прогностически благоприятно. Нормальная/ниже нормы концентрация каспазы 9 на 30-36 месяцев ассоциируется с недостижением ПЦО, БМО/ПМО.

5. Индуктор апоптоза эРаз-Ь при мониторинге терапии ХМЛ гливеком ведёт себя на поздних сроках терапии аналогично каспазе 9. У больных с ПЦО, БМО/ПМО по факту достижения на 24 месяца терапии выявлены нормальные показатели Браэ-Ь (элиминация РЬ+ клона). Достоверное повышение концентрации БРаэ-Ь по сравнению с контролем на 30-36 месяцев медикаментозно индуцировано повышением дозы гливека до 600 мг (на 6 мес. у 18% , на 24 мес. у 69% больных), в связи с первичной или вторичной резистентностью к препарату и привело к увеличению достигнутых ПЦО, БМО/ПМО. Низкая концентрация БРаБ-Ь не способствует достижению ПЦО и БМО/ПМО.

Практические рекомендации

1 .У больных ХМЛ при отсутствии оптимального ответа в контрольные точки мониторинга терапии гливеком при отсутствии возможности перевода больных на ингибиторы тирозинкиназ II поколения следует проводить эскалацию дозы гливека и продолжать терапию. Пролонгация терапии увеличивает количество больных с достижением ПЦО, БМО/ПМО в более поздние сроки (30-36 месяцев).

2. Количество оптимальных ответов можно увеличить за счёт снижения срока предлеченности у больных ХМЛ. В группе неудачи терапии срок предлеченности составил 29,65±8,27 лет, что в 2 раза больше по сравнению с группой ОпО.

3. Низкий прогностический риск по 1.8ока1 способствует увеличению оптимальных ответов к 18 месяцам терапии гливеком. В связи с этим, важно диагностировать ХМЛ на ранних этапах его развития.

4. Следует считать нормальными значения концентрации индукторов апоптоза - каспазы 9 и БРаБ- Ь в сыворотке крови, равными 2,03±0,68 нг/мл и 0,11 ±0,01 нг/мл соответственно.

5. На 24 месяца терапии гливеком: для ПЦО, БМО/ПМО характерны нормальные показатели как каспазы 9, так и Браз-Ь, что указывает на элиминацию РЬ+ клона. Повышенные значения регистрируются при отсутствии данных ответов и свидетельствует о наличии РЬ+ клона.

6. Повышение количества ПЦО и БМО/ПМО к сроку 30-36 месяцев терапии ведёт к активации апоптоза и повышению концентрации каспазы 9 и БРаБ-Ь, что прогностически благоприятно. Без активации апоптоза (повышения концентрации каспазы 9 и БраБ-Ь), как основы успешных результатов, - достижение ПЦО и БМО/ПМО было бы невозможным.

7. Снижение каспазы 9 и ьРаэ-Ь на поздних сроках терапии (30-36 »месяцев) при отсутствии ПЦО, БМО/ПМО свидетельствует о наличии РЬ+ клона и характеризуют неблагоприятный прогноз.

Список научных работ по теме диссертации

1. Опыт применения ингибитора тирозинкиназы первого поколения у больных хроническим миелолейкозом / Овсянникова Е.Г., Заклякова Л.В., Сарсенгалиева А.К., Лунёв Д.А., Ковалинская И.С., Накстхоева Э.Б., Исрапилова З.М.// Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова.- 2009,- № 2/1.-С.-278.

2. Анализ цитогенетического ответа у больных хроническим миело-лейкозом в Астраханской области / Е.Г. Овсянникова, И.Н Ковалин-ская, З.М. Исрапилова, Д.А.Лунёв, Э.Б. Накстхоева, Заклякова Л.В., А.К Сарсенгалиева // Астраханский медицинский журнал,- 2010.-№3,- С.96-98.

3. Роль каспазы 9 в реализации процессов апоптоза у больных хроническим миелолейкозом / Овсянникова Е.Г., Накстхоева. Э.Б., Заклякова Л.В., Левитан Б.Н. // Фундаментальные исследования.- 2012.-. №1,-С. 76-80.

4. Эффективность применения гливека у больных хроническим миелолейкозом в Волгоградской области / Заклякова Л.В., Овсянникова Е.Г., Капланов К.Д., Клиточенко Т.Ю.; Сарсенгалиева А.К., Лунёв Д.А.., Накстхоева Э.Б., Исрапилова З.М., Ковалинская И.С.// Материалы VIII межрегиональной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека».- Астрахань, 2009.-С.-64-65.

5. Концентрация маркёров апоптоза р53 и РАБ-Ь у больных хроническим миелолейкозом / А.К. Сарсенгалиева, Е.Г. Овсянникова, И.С.Ковалинская, Д.А. Лунёв, З.М. Исрапилова, Э.Б.Накстхоева, Л.В. Заклякова//Вестник гематологии.-2010.-Т. VI,-№2,- С.79-80.

6. Инновационные подходы к диагностике и прогнозированию течения хронического миелолейкоза: возможность применения генов НЬА И класса и маркёров апоптоза каспазы 9, цитохрома С / Е.Г. Овсянникова, А.К. Сарсенгалиева, З.М. Исрапилова, И.С.Ковалинская, Д.А. Лунёв, Э.Б.Накстхоева, Л.В Заклякова // Вестник гематолоши.-2010,-Т. У1.-№2.-С.71-72.

7. Результаты лечения больных, хроническим миелолейкозом: оценка через 24 месяца терапии Гливеком / Овсянникова Е.Г., Ковалинская И.Н., Лунёв Д.А., Сарсенгалиева А.К., Исрапилова З.М., Накстхоева Э.Б.// Бюллетень Федерального центра Сердца, Крови и Эндокринологии им. В.А.Алмазова.- Тезизы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов».-С.-Пб, №2.- апрель 2010.-С.157.

8. Роль маркеров апоптоза в диагностике и прогнозировании течения хронического миелолейкоза/ Е.Г.Овсянникова, И.С.Ковалинская, А.К.Сарсенгалиева, З.М.Исрапилова, Д.А.Лунев, Э.Б.Накстхоева, Л.В.Заклякова, Т.Ю.Клиточеко, К.Д.Капланов, П.А.Иванов, И.Ю.Петелина// Астраханский медицинский журнал/. Приложение/ Материалы 7-ой международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» том 5.- № 1 .-г.Астрахань, С. 58-60.

9. Оценка прогноза течения хронического миелолейкоза и токсичности гливека./ А.К.Сарсенгалиева, Е.Г. Овсянникова, И.С. Ковалинская, Э.Б. Накстхоева, З.М.Исрапилова // «Актуальные вопросы медицины», Труды АГМА, Том 41,материалы 87- итоговой научно-практической конференции,- 2010г.-С.57.

10. Оценка достижения оптимального, субоптимального ответа и неудачи терапии иматинибом у пациентов хроническим миелолейкозом: данные пятилетнего наблюдения в Астраханской облас-ти./И.С.Ковалинская, Е.Г.Овсянникова, З.М.Исрапилова, Д.А.Лунев,Э.Б.Накстхоева// Вестник гематологии.-2011.- Т. VII.-№1,- С,-26.

11. Значение маркёра апоптоза каспазы 9 в диагностике и прогнозировании хронического миелолейкоза / Овсянникова Е.Г., Ковалинская И.С., Исрапилова З.М, Накстхоева Э.Б. Капланов К.Д., Заклякова Л.В., Попов Е.А.// Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Алмазовские чтения 2011», посвященной 80-летию со дня рождения академика РАМН В. А. Алмазо-ва». - Санкт-Петербург, С.-7.

12. Прогностическое значение концентрации маркёра апоптоза зРАБ-Ь у больных хроническим миелолейкозом, получавщих лечение гливе-ком более 24 месяцев/ Е.Г.Овсянникова, Нактсхоева Э.Б, Лунев Д.А, Л.В.Заклякова// Материалы X Международной научно-практической конференции «Лекарство и здоровье человека» 13-14 октябрь 2011г.-С.-81-82.

13. Значение концентрации маркера апоптоза зРАв-Ь в оценке исходов терапии хронического миелолейкоза/ Э.Б. Накстхоева, Е.Г.Овсянникова, И.С. Ковалинская, Д.А.Лунев, Л.В Заклякова// Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Том 42 (ЬХУ1).- Актуальные вопросы современной медицины. - Астрахань, 2011,-С,-66.

14. Новые возможности диагностики и прогнозирования исходов высокотехнологичного лечения хронического миелолейкоза /Е.Г.Овсянникова, З.М.Исрапилова, • Э.Б.Накстхосва, Клиточенко Т.Ю., Д.А.Лунев, И.С.Ковалинская, Капланов К.Д., Л.В.Заклякова, Е.А.Попов, Б.Н.Левитан//тезисы международной научно-практической конференции: Многопрофильная клиника XXI века. Передовые медицинские технологии. 14-16 сентября 2011 г. С-Петербург. -С. 145-146. Под ред. Алексанина С.С.; -СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье».-2011.-С.-278.

Список сокращений

БК - бластный криз

БМО - большой молекулярный ответ

НТ - неудача терапии

ОпО - оптимальный ответ

ПГО - полный гематологический ответ

ПМО - полный молекулярный ответ

ПЦО - полный цитогенетический ответ

СО - субоптимальный ответ

ФА - фаза акселерации

ХМЛ — хронический миелоидный лейкоз

ХФ - хроническая фаза

Накстхоева Эсет Башировна

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ИНДУКТОРОВ АПОПТОЗА-КАСПАЗЫ И sFAS-L В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ ГЛИВЕКОМ

14.01.04- внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Подписано к печати 06.02.2012. Заказ №. 3179. Бумага офсетная. Тираж 100 экз.

Издательство ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121