Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Клинико-биохимическое исследование взаимодействия наночастиц меди с бактериальной флорой и ферментами ротовой жидкости у больных кариесом и изучение биологического действия наночастиц в экспериментальных исследованиях

На правах рукописи

СакаллаМохамедМохамед-Файез-Абдель-Халик

Клинико-биохимическое исследование взаимодействия наночастиц меди с бактериальной флорой и фермептами ротовой жидкости у больных кариесом иизучение биологического действия наночастиц в экспериментальных исследованиях

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации па соискание ученой сгспепи кандидата медицинских наук

Саратов-2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Бородулин Владимир Борисович.

Официальные оппонецты:

Глалилнн Геннадий Павлович - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздравсоцразвигия России.кафедра клинической и лабораторной диагпостики.заведуюший; Федотова Ольга Васильевна - доктор химических наук, профессорХБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Минобрнауки РФ.кафедра органической химии,заведующая.

Ведущая организация - Государствешюе бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный университетМинобрнауки РФ.

Зашита состоится « / » ^^Лй^ 2012 года в_ часов на эаседапии

диссертационного совета Д208.094.04 при ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. РазумовскогоМинздравсоцразвития России по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО СаратовскийГМУ им. В.И. Разумовского Мипздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «_»_2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Музурова Л.В.

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _I'O 1 2

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость исследования

Стремительное развитие нанотсхнологий в настоящее время приводит к внедрению в медицинскую практику новых материалов и методов. Наночастицы находят широкое применение в различных областях химии, биологии, экологии.

Использование микроэлементов в виде биологически активных добавок в ветеринарии и сельском хозяйстве способствует увеличению продукции растительной и животной биомассы. Металлы в виде наночастиц обладают пролонгированным действием и высокой биологической активностью (Глущенко H.H. и соавт., 2002).

Использование наночастиц несет потецциальнуго опасность вредного воздействия на здоровье человека и природные экосистемы (Колесниченко A.B. и соавт., 2008).

Взаимодействие наночастиц с нуклеиновыми кислотами, белками и клетками приводит к измепепиям в метаболизме последних и возможному иммунному ответу со стороны целого организма (Zieziulewiez T.J., 2003;Fischer Н.С., 2007; Geze А., 2007; Hall J.B., 2007; Jain Т.К., 2008;).

В медицинской практике и биологии наночастицы наиболее часто используют п форме биосовмсстимых магнитных жидкостей, которые представляют собой взвесь магнитных частиц в водных буферных растворах разного состава, иногда-в водно - масляных эмульсиях (Звездина Н.Д., 2007).

Изучение воздействия на организм нанопорошков биогенных металлов меди, цинка, железа, биологическая ценность которых определяется многогранностью функций в сложных биохимических процессах и активным участием в клеточном метаболизме, обеспечивающем нормальное функционирование организма,требует особо пристального внимания.

Лечение кариеса часто сопровождается введением в структуру зуба композитных материалов, которые могут содержать различные благородные металлы в сочетании с ионами биогенных элементов, меди или железа. Развитие нанотехнологий будет способствовать и развитию различных композитных материалов. Исследование влияния наночастиц на ферменты и бактериальную флору ротовой полости представляет собой отдельную важную задачу. Необходимо отметить, что вырабатываемая слюнными железами и смешиваемая с другими компонентами ротовой полости слюна постоянно попадает в желудок и другие отделы желудочно-кишечного тракта. Вследствие этого наночастицы могут псасыватъся в различных отделах желудочно-кишечного тракта и попадать в

печень и другие органы, что требует изучения подобных процессов на экспериментальных моделях.

Цель исследования - исследование взаимодействия наночастнц меди с бактериальной флорой и ферментами ротовой жидкости у больных кариесом и изучение биологического действия наночастнц меди в экспериментальных исследованиях.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние напопастиц меди в различных концентрациях на активность, скорость и константу Михаэлиса ферментов ротовой жидкости (амилазы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы) у лиц с кариесом ит^о. 2. Разработать прогностический коэффициент активности ЛДГ/амилаза и оценить его значение для диагностики кариеса на различных его стадиях.

3. Исследовать антибактериальное действие папочастиц меди на бактериальную флору у больных кариесом.

4. Изучить влияние папочастиц меди в различных концентрациях на биохимические показатели у белых беспородных мышей имуо.

Научная иовпзиа работы Исследовано взаимодействие наночастнц меди с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости у лиц с кариесом ту кто. Обнаружено изменение активности ферментов, принимающих участие в углеводном обмене. Исследовано изменение скорости фермснтатнвпои реакции ферментов ротовой жидкости при их взаимодействии с иапочастнцамн меди.

Исследовано влияние наночастнц меди на активность ферментов и содержание ключевых метаболитов белкового, липилного, углеводного обменов в сыворотке крови белых мышей.

Изучено антибактериальное действие наночастнц меди на бактериальную флору у больных кариесом.

Теоретическая н практическая значимость работы Выявлена биологическая активность нанопорошка меди. Установленные аспекты токсического действия наночастиц металла свидетельствуют о необходимости проведения тщательной оценки возможных рисков для применения малоразмерных материалов в стоматологии.

Внедрение результатов диссертационного исследования Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе кафедр биохимии, гигисиы медико-профилактического факультета, общей гигиены и экологии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского

Мннзлравсоцразвптия России и в стоматологической поликлинике «Жемчужина» г. Саратова.

Апробация работы.Основные положения работы доложены па научных конференциях кафедры биохимии ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского МинздравсоцразвитияРФ (Саратов, 2010, 2011, 2012);па X межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-н\Д, 2011).

Положения, выноснмыена защиту:

1.Выявлено увеличение индекса ЛДГ/амилаза ротовой жидкости у больных кариесомв зависимости от тяжести кариозного процесса.Наночастицы медивзаимодействугот с ферментами ротовой жидкости.

Ферменты ротовой жидкости обнаруживают различную чувствительность к напочастицам меди.

2.Выявлена антибактериальная активность напочастиц меди в отношении флоры ротовой жидкости у больных кариесом.

3. Наночасттшы в концентрациях 2 - 200 мкг/20г при пероралыюм введении проявляют выраженную биологическую активность на организм лабораторных животных, что подтверждается анализом биохимических показателей сыворотки крови. Исследуемые металлические наночастицы оказывают схожее действие, выражающееся в нарушении процессов утилизации глюкозы, активации процессов глюкопеогенеза, катаболизма белков.

Личный вклад автора. Диссертантом определены основные идеи и дизайн исследования. Проведены обследование пациентов, забор и исследование ротовой жидкости, исследовано взаимодействие напочастиц меди с ферментами, содержащимися в ротовой жидкости. Автору принадлежат результаты исследования влняпиянаночастиц меди па активность ферментов и содержание ключевых метаболитов белкового, липндного, углеводного обменов в сыворотке крови белых мышей. Статистическая обработка и анализ полученных данных проведены автором самостоятельно. На основе полученных результатов сделаны достоверно обоснованные выводы и представлены практические рекомендации.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы, отражающей результаты собственных исследований, пмполов и списка использованной литературы, включающего 107 отечественных и 45 иностранных источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 15 таблицами.

Публикацнн.По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 3 и изданиях, рекомендованных ВАК МинобрнаукиРФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

D работе представлены результаты обследования 74 пациентов, находившихся на лечении в стоматологической поликлинике. Возраст лиц варьировал от 28 до 46 лет (48 мужчин и 26 женщин) с диагнозом кариес различной степени тяжести.

Материалом для исследования служила ротовая жидкость, полученная без стимуляции методом сплевывания в стеклянные пробирки утром натощак, которая сразу после забора подвергалась биохимическому исследованию.

Собранную ротовую жидкость в количестве 2-3 мл использовали для исследования параметров углеводного обмена (а-амилазы. лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы). Данную часть исследования проводили с помощью готовых наборов химических реагентов и биохимического анализатора Hospitex (Швейцария). Для получения разведений образцов ротовой жидкости использовали биднетиллированную воду.

Исследование ферментов ротовой жидкости

Принципом определения активности лактатдегидрогеназы является спсктрофотометрнческий метод. оптимизированный в соответствии с требованиями Немецкого Общества Клинической Химии. Активность фермента выражалась в Е/л (WeisshaarD., 1975).

Активность а-амилазы определяли колориметрическим ферментативным методом. Результаты выражались в Е/л (Ткачук В.А. и соапт., 2002).

Щелочную фосфатазу определяла!! кинетическим ультрафиолетовым методом, который разработан в соответствии с рекомендациями Немецкого Общества Клинической Химии. Активность фермента выражалась в Е/л (KublcrW., 1973;ThomasL.. LaborU., 1978).

Клинические данные регистрировали в разработанных нами формализованных историях болезни. При клиническом осмотре отмечали зубную формулу, состояние слизистой оболочки полости рта, наличие некариозных поражений, мягкий зубной налет, над- и поддесиевые зубные отложения, наличие или отсутствие аномалий зубов и прикуса.

Оценку гигиенического состояния полости рта и тканей пародопта проводили с помощью следующих тестов: определение упрощенного индекса гигиены (GreeneJ.C., VermillonR.L., 1964); паппллярно-маргиналыю-альвеолярного индекса (РагтаС., 1960) - РМА; пародопталыюго индекса (RusselA.L., 1956) - ПИ; индекса интенсивности поражения зубов кариозным процессом (Комитет экспертов ВОЗ по стоматологии, 1962) - КПУ.

Напочастицы, использованные в работе

Объектами исследования в работе являлись высокодисперсные нанопорошки меди, синтезированные на плазмохимическом комплексе филиала Федерального государственного управления РФ «Государственный научно-исследовательский институт химии и технологии элемептоорганнческих соединений» (ФГУП РФ ГНЦ ПШИХТЭОС, г. Москва), лаборатория №33, г.Саратов. Средний размер паночастиц колебался в пределах 50-80 им.

Биохимические методы исследования

Исследования были выполнены па белых беспородных мышах. Контрольные и экспериментальные группы формировали из 2-3-месячных самцов массой 20г. Мышей распределяли в одну контрольную группу (15 мышей), которая не подвергалась воздействиям нанопорошков.и экспериментальную группу (60 мышей). Экспериментальная группа состояла из четырех подгрупп по 15 мышей в каждой подгруппе в зависимости от концентрации вводимого исследуемого панопорошка. Первой подгруппе вводили 2 мкг/20г ; второй - 20 мкг/20г .третьей -150 мкг /20г .четвертой - 200 мкг/20г . Выбранные концентрации напочастиц не превышают максимальных переносимых доз для данных металлов (Venugopal В., 1978). Все нанопорошки вводили в течение 6 дней в виде масляных суспензий в количестве 10 мкл однократно в сутки пероралыю с использованием зонда. По oKoipianmi эксперимента производили забор крови в количестве 2 мл от каждой мыши. Образцы крови от 3 мышей объединяли. Проводили 5 повторов для каждой группы мышей. Экспериментальная часть работы выполнена в соответствии с протоколами Жеисвской конвенции и припципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российский Федерации.ГОСТ Р 53434-2009; Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях, 2007; Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедиципских исследованиях( Грачев С. В., 2010).

Определение биохимических показателей крови проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора «Hospilex» (Швейцария), оборудованного термостатом, фотометром и микропроцессором. Для работы па анализаторе использовали стандартные наборы реактивов производства ЗАО «Диакон-ДС» и 10 - 20 мкл сыворотки мышей для определения одного фермента или одного метаболита. В сыворотке крови определяли активность АсАТ, АлАТ, ЛДГ, ГТТ, ЩФ,

а-амилазы, концентрацию глюкозы, лактата, ПВК, общего холестерина, общего белка, альбумина, мочевины, билирубина. Методы являются унифицированными (Карпшцснко А.И., 1999).

Микроорганизмы,использованные о работе

Лабораторные эксперименты проводили в бактериологической лаборатории САРНИИТО в период с 2009 по 2011г.

Объектом исследования служили бактерии Е. Coli (музейный штамм). Slreptococcussalivarius. 7 * 105 КОЕ\мл , Stafilococcusepidermidis, 5 * 103 КОЕ\мл, выделенные от больных кариесом в различных стадиях.

Штаммы Streplococcussalivarius и Stafilococcusepidermidis были выделены от больных с диагнозом кариес зубов в стадиях компенсации, субкомпепсации и декомпенсации. Штамм Е. coli 113-13 предоставлен музейной коллекцией Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН.

Методы исследования влияния ияпочастнц на микроорганизмы

Для получения исходного разведения вещества на аналитических весах взвешивали навески наиочастиц меди 1мг и растворяли их в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Затем готовили последовательные разведения препарата до 10"2 мг/мл. Таким образом, получали следующие концентрации наночастнц: 1.0; 0.1; 0.01 мг/мл

Микроорганизмы выращивали на МПА в чашках Петри. Твердую питательную среду готовили из дистиллированной воды и агара "DacloMacConceyAgarBasc" (фирма "Difco") в пропорции 20 г агара па 1 л дистиллированной воды и автоклавировали в течение 30 мин при 2 атм, разливали в чашки Петри диаметром 90 мм (по 20 мл). Посеянные культуры инкубировали в термостате при температуре 37 °С 1 сутки.

Суспензию бактерий приготавливали из выращенной культуры с содержанием на 1 мл дистиллированной воды миллиарда бактериальных клеток, что определяли по оптическому стандарту мутности па 10 единиц. Рялом последовательных разведений суспензии получали конечную концентрацию бактерий в 500 клеток на 1 мл.

В пробирки с разведениями смеси панопорошков добавляли по 100 мкл конечной суспензии микроорганизмов, встряхивали и оставляли па полчаса. После этого с каждого из разведений производили посев по 20 мкл па каждую чашку Петри с агаром. Для контроля па такой же среде сеяли исходную суспензию культуры бактерии. Все чашки помещали в термостат (37 °С) па 24 часа. Результат учитывали на второй день. Тогда же ставили пробу на биохимические показатели жизнедеятельности микроорганизмов до и после воздействия исследуемой смеси веществ. Для биохимических тестов использовали специальную дифференциально-диагностическую CHCTCMyENTEROlesl 16 (LaCliema).

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с использованием методов вариационной статистики с выявлением достоверности различии по критерию Фишера - Стьюдента. Оценку точности и надежности числовых характеристик определяли по 95%-ному доверительному интервалу истинного среднего значения. Графики и диаграммы в работе построены с использованием стандартных приложений «MicrosoftExcel». Вычисление показателей проводили с помощью программ статистического анализа па PC «Pentium 4».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование активности ферментов ротовой жидкости при кариесе.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с иптактпым пародоптом (invitro).

В результате проведенного исследования изменения активности ферментов (амилаза, ЩФ, ЛДГ) ротовой жидкости у пациентов с иптактпым пародонтом invitro установлено незначительное снижение активности всех вышеназванных ферментов (табл. 1). В присутствии напочастиц отмечается более выраженный эффект снижения активности ЛДГ и ЩФ, потому что являясь гидрофобными соединениями, наночастицы, по всей видимости, разрушают гидрофобные связи между субъедишшами ЛДГ (тетрамер) и ЩФ (димер), что приводит к снижению активности ферментов. Фермент амилаза представляет собой полипептид с молекулярной массой примерно 55 килодальтон, хорошо растворим в воде. Известно, что гидрофобные соединения хорошо взаимодействуют друг с другом; по всей вероятности, происходят менее выраженное взаимодействие гидрофобных частиц с амилазой и меньшее подавление ее активности по сравнению с другими ферментами, хотя нельзя исключить возможности проникновения наночаепщ в гидрофобные домены полипептидной цепочки амилазы.

При разработке прогностического коэффициента активности ЛДГ/амилаза и оценке его значения для диагностики кариеса па различных его стадиях следует обратить внимание на то, что концентрация ионов водорода будет зависеть от активности ЛДГ прямопропорцнопалыю, в то время как активность амилазы слюны будет снижаться при уменьшении значений рН меньше 6,8.

Таблица 1

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у пациентов с

ЛДГ ЩФ Амилаза

Норма (ш[тактныйпародо1гт) 335±12 22±1.3 35±1.2

Компенсированный кариес 365±11* 26±1.2* 31±1.4*

Субкомпенснрованный кариес 425±15** 34±1.9** 28±1.7**

Декомпепсироваппый кариес 453±17** 41±1.2** 25±1.2**

Примечание: * - достоверность при сравнении активности ферментов ротоцой жидкости у пациентов с иптактпым пародоптом и кариесом р> 0,05; * - р < 0.05; ** -р< 0,01.

Анализ проведенных исследований показал, что в контроле ( при интактпом пародонте) данный показатель составляет 9,6 безразмерных единиц, на стадии компенсации индекс составил 11,8 безразмерных единиц, на стадии субкомпсисацин - 15.2 и на стадии декомпенсации 18.1 безразмерных единиц активности. Таким образом, для диагностики степени кариозного процесса можно использовать соотношение активности ферментов ЛДГ и амилазы.

Изменение активности ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в присутствии ианичастиц меди В результате проведенных исследований ротовой жидкости лиц с кариесом в стадии обострения установлено, что при поражении пародоита отмечается увеличение активности ЛДГ и щелочной фосфатазы ротовой жидкости на фоне резкого снижения активности амилазы. Вероятно. это происходит, с одной стороны, в результате активизации бактериальной микрофлоры, содержащей большое количество ЛДГ и ЩФ, а с другой стороны, это обусловлено разрушением тканей пародоита и выходом в ротовую жидкость вышеназванных ферментов из клеток соединительной ткани и клеток, участвующих в поддержании структуры зуба, - остеокластов и остеобластов.

Снижение активности амилазы обусловлено, по всей видимости, поражением секреторных клеток слюнных желез продуктами жизнедеятельности микроорганизмов. Анаэробные процессы, инициируемые бактериальными клетками, приводят к увеличению концентрации молочной кислоты в ротовой жидкости. В свою очередь, лактат является слабой кислотой и, следовательно, поставляет в раствор ноны водорода, которые закнеляют ротовую жидкость, сдвигают рН в кислую сторону, что приводит к снижению активности амилазы, поскольку известно, что активность амилазы проявляется или при нейтральных значениях рН, или при слабощелочных.

Таблица 2

Изменение активности ЛДГ ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с напочастицами меди (шуНго) (ЕД/л)_

Концентрация папочастиц мели Норма Компенсирован ный кариес Субкомпенсирован ный кариес Декомпенсировап-ный кариес

0 мкг/мл 335±12 365±11 425±15 453±17

2 мкг/мл 285±10* * 326±10* 402±13** 439±13**

20 мкг/мл 164±13* * 303±13** 361±19** 420±15**

150 мкг/мл 113±14* * 240±14** 294±14** 381±11**

200 мкг/мл 95±11** 231±17** 280±15** 353±10**

Примечание: * - достоверность при сравнении активности ЛДГ ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом в сравнении с активностью ЛДГ при воздействии наночастицр> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0,01.

Наночастицы влияли на активность всех ферментов ротовой жидкости. Снижение активности ферментов можно объяснить подавлением роста бактерий в присутствии препаратов из-за их липофилыюсти, то есть способности растворяться в мембранах бактериальных клеток, а, следовательно, и лучше проникать в клетки микроорганизмов (табл. 2-4).

В процессе метаболизма бактерий выделяется лактат (слабая органическая кислота), который сдвигает значение рН в кислую сторону; подобный эффект приводит к закисленню среды и снижению активности амилазы, так как известно, что активность амилазы максимальна в диапазоне рН = 6,8-7,2.

Таблица 3

Изменение активное™ щелочной фосфатазы ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с наночастицами меди (шуйго) (ЕД/л)_

Копнентрация папочастиц меди Норма Компенсирован ный кариес Субкомпенсирован ный кариес Декомпепсирован-пый кариес

0 мкг/мл 22±1.3 26±1.2 34±1.9 41±1.2

2 мкг/мл 18±1.1* 23,4±1.4* 30,6±1.2** 36,9±1.4**

20 мкг/мл 14±1.0** 22,1±1.1** 28,9±1.1** 34,8±1.0**

150 мкг/мл 8±1.7** 20,8±1.6** 27,2±1.0** 32.8±1.1**

200 мкг/мл 7±1.3** 20±1.3** 26±1.2** 31,5±1.2**

Примечание: * - достоверность при сравнении активности ЩФ ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом и кариесом в сравнении с активностью ЩФ при воздействии наночастицр> 0,05; * -р < 0,05; ** -р< 0,01.

Изменение активности амилазы ротовой жидкости у пациентов с кариесом в сочетании с иапочастицами меди (in vitro) (ЕД/л)_

Концентрация напочастнц меди Норма Компенсирован ный кариес Субкомпенсировац ный кариес Декомпепсирован-нын кариес

0 мкг/мл 35±1.2 31±1.4 28±1.7 25±1.2

2 мкг/мл 32±1.4 27±1.3* 19,5±1.9** 14.2±1.6**

20 мкг/мл 30±1.3* 26.1 ±1.1 * 18.2±1.5** 13±1.3**

150 мкг/мл 28±1.7** 24,6±1.5* 17±1.3** 12,5±1.4**

200 мкг/мл 25±2.0** 23±1.3 17,2±1.9** 12,3±1.3**

Примечание: * - достоверность при сравнении активности амилазы ротовой жидкости у пациентов с ннтактпым пародоптом и кариесом в сравнении с активностью амилазы при воздействии наиочастицр> 0,05; * - р < 0,05; ** - р<

0.01.

Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости при кариесе

Скорость реакции определяется как количество вещества, превращенного (образовавшегося или распавшегося) в единицу времени. Она является функцией концентрацнй.участвуюишх в реакции веществ, которые непрерывно меняются по мере протекания реакции в присутствии фермента, поэтому однозначное определение скорости реакции может быть дано только в случае, если конечное изменение количества вещества в единицу времени заменить па дифференциальную разность, относящуюся к бесконечно малому времени с//. Количество превращенных веществ обычно выражают в виде изменения объемной концентрации годного или нескольких реагентов.

Скорость реакции не может быть измерена непосредственно, возможно только определение концентрации с. относящейся к разным моментам времени Г. Зная пары значений с-/, определенные с достаточной частотой, можно построить функциональную зависимость. Диагностическое значение определения скорости биохимической реакции заключается в выяснении основных факторов, влияющих па активность ферментов: концентрации ферме!гта в среде или изменение его удельной активности вследствие появления в среде активаторов или ингибиторов ферментативной реакции.

Наблюдается изменение скорости реакции приразличных стадиях кариозного процесса (табл. 5).

При действии напочастнц меди отмечается наиболее выраженное по сравнению с контролем снижение скорости реакции ферментов ДДГ (табл. 6) и

ЩФ (табл. 7). В то же время отмечается уменьшение скорости реакции амилазы (табл. 8). Также обнаруживаются изменения константы Михаэлиса - она увеличивается для ферментов ЛДГ, ЩФ и амилазы при применении наночастиц (табл. 9- 11).

На общую активность фермента влияют две величины: концентрация фермента и его удельная активность. При лизисе бактериальных клеток и распаде тканей пародонта концентрация ферментов ЛДГ и ЩФ в ротовой жидкости резко увеличивается, соответственно возрастает и скорость биохимических реакций, катализируемых ЛДГ и ЩФ, так как величина скорости биохимической реакции прямо пропорциональна концентрации фермента.

При действии наночастиц уменьшается число бактериальных клеток в растворе, что приводит к снижению концентрации ЛДГ и ЩФ, и соответственно -к снижению скорости биохимической реакции, катализируемой ЛДГ и ЩФ.

Обнаружено уменьшение скорости биохимической реакции, катализируемой ферментом амилазой при увеличении концентрации наночастиц, что указывает на снижение активности данного фермента в ротовой жидкости.

Таблица 5

Изменение скорости биохимической реакции ферментов ротовой жидкости с

ЛДГ ЩФ Амилаза

Норма 24±1.3 58±2.5 31 ±2.0

Компенсированный кариес 31±2. ] * 69±3.1* 25±1.8*

Субкомпенсированный кариес 43±2.3** 87±3.0** 19±1.7**

Декомпенсированпый кариес 54 ±3.2*» 115±4.7** 14.3±2.0**

Примечание: * - достоверность при сравнении скорости реакции ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом:р> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0,01.

Таблица 6

Изменение скорости биохимической реакции ЛДГ ротовой жидкости с

Концентрация наночастнц меди Норма Компенсирован пый кариес Субкомпенсирован ный кариес Декомпенсирован ный кариес

0 мкг/мл 24±1.4 31±1.9 43 ±2.4 54±3.1

2 мкг/мл 21,б±2.1 27.9±2.0* 38.7±2.6** 48,6±2.5**

20 мкг/мл 19,2±1.6* 24.8±2.1* 34.4±3.1** 43,2±2.6**

150 мкг/мл 16,8±2.2* * 21,7±1.8* 30.1±3.0** 37,8±3.0**

200 мкг/мл 15,6±1.8* * 20,1 ±2.2* 27,5±2.5** 35,1±2.9**

Примечание: * - достоверность при сравнении скорости реакции ЛДГ ротовой жидкости у больных с кариесом:р> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0,01.

Таблица 7

Изменение скорости биохимической реакции ЩФ ротовой жидкости с кариесом в сочетании с наиочастицамн меди (in vitro) (М/л*с)_

Концентрация наночастнц меди Норма Компенсирован ный кариес Субкомпенсирован ный кариес Декомпенсирован пын кариес

0 мкг/мл 58±2.3 69±2.1 87±3.5 115±5.6

2 мкг/мл 52.2±2.5* 62.1 ±3.2** 78,3±4.1** 102,3 ±6.2**

20 мкг/мл 49,1 ±1.4** 58.5±2.5** 73,5±2.6** 97,5±4.1**

150 мкг/мл 46.7±1.6** 55,2±3.5** 69±3.2** 92.2±5.2**

200 мкг/мл 44,2±1.7** 53.3±3.3** 66,3 ±2.5** 88±3.2**

Примечание: * - достоверность при сравнении скорости реакции ЩФ ротовой жидкости у больных с кариссом:р> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0,01.

Таблица 8

Изменение скорости биохимической реакции амилазы ротовой жидкости с кариесом в сочетании с наиочастицамн меди (in vitro) (М/л*с)

Концентрация папочастиц меди Норма Компенсирован пый кариес Субкомпенсирован пый кариес Дскомпенсирован-ный кариес

0 мкг/мл 31±1.2 25±1.1 19±0.2 14,3±0.1

2 мкг/мл 29±0.4 23.4±0.7* 18±0.7** 13,5±0.3**

20 мкг/мл 27±0.5* 22,5 ±0.8* 17,1±0.3** 12.7±0.4**

150 мкг/мл 25±1.1* 21,2±0.5* 16.U0.2** 12± 0.3**

200 мкг/мл 23±1.3** 20.1 ±0.4* 15.8±0.1** 11,2±0.2**

Примечание: * - достоверность при сравнении скорости реакции амилазы ротовой жидкости у больных с карнесом:р> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0.01.

Изменение константы Михаэлиса (Km) ферментов ротовой жидкости у больных кариесом

В ходе проведенных исследований обнаружено изменение константы Михазлиса биохимических реакций, катализируемых ЛДГ, ЩФ и амилазой (табл. 9 -11). Установлено, что Кш увеличивается для ЛДГ и ЩФ при использовании паночастиц, что указывает на снижение удельной активности фермента; этот факт можно расценивать как прямое ингибирующее действие наиочастнц на ЛДГ и ЩФ. Кш для амилазы также увеличивается в процессе проводимого воздействия напочастицами, что указывает па прямое действие наиочастнц на фермент (эти эффекты были обнаружены (in vitro).

Таблица 9

Изменение константы Михаэлиса (Кш) ферментов ротовой жидкости с кариесом в стадии компенсации (* 10"3 М)_

ЛДГ, ЩФ, Амилаза,

М±ш М±ш М±т

Интактный пародонт 1.25±0.03 3.12±0.11 5.17±0.14

2 мкг/мл паночастиц меди 1.29±0.05 3.23±0.10 5.25±0.15

20 мкг/мл наиочастнц меди 1.36±0.04* 3.47±0.21* 5.67±0.18*

150 мкг/мл наиочастнц меди 1.47 ±0.06* 3.68±0.14* 5.87±0.17*

200 мкг/мл паночастиц меди 1.67±0.08** 3.89±0.23** 6.02±0.15**

Примечание: * - достоверность при сравнении Кш фермеров ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии компснсации:р> 0,05; * - р < 0,05; ** - р< 0,01.

Таблица 10

Изменение константы Михаэлиса (К,,,) ферментов ротовой жидкости больных с кариесом в стадии субкомпсисации(* 10° М)_

ЛДГ, ЩФ, Амилаза,

М±т М±т М±т

Интактный пародонт 1.31 ±0.02 3.18±0.31 5..24±0.14

2 мкг/мл паночастиц меди 1.39±0.03 3.68±0.11* 5.34±0.17

20 мкг/мл наиочастнц меди 1.48±0.06 * 3.87±0.24* 5.76±0.19*

150 мкг/мл паночастиц меди 1.68 ±0.07* 4.02±0.18* 5.89±0.15*

200 мкг/мл паночастиц меди 1.95±0.09** 4.23±0.27** 6.12±0.13**

Примечание: * - достоверность при сравнении Кш ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии субкомпенсациир> 0,05; * - р < 0,05; ** -р< 0,01.

Изменение константы Михаэлиса (Кш) ферментов ротовой жидкости с кариесом в стадии декомпенсации (* 10"3 М)_

лдг ЩФ Амилаза

Mlm М±т Mim

Иптактный пародонт 1.39±0.02 3.25±0.31 5..29J0.14

2 мкг/мл наночастиц меди 1.6910.05* 3.6310.15* 5.3310.11*

20 мкг/мл паночастиц меди 1.78±0.08* 3.9710.13* 5.76Ю.20*

150 мкг/мл паночастиц меди 2.13Ю.12** 4.22Ю.16** 5.9610.13**

200 мкг/мл паночастиц меди 2.35Ю.09** 4.3510.21** 6.22Ю.24**

Примечание: * - достоверность при сравнении Кш ферментов ротовой жидкости у больных с кариесом в стадии декомпенсации:р> 0,05; * - р < 0,05; ** -р<0,01.

Антибактериальное действие паночастнц меди на микрофлору ротовой полости при карнозном процессе

После подсчета клеточных колоний па чашках производилась статистическая обработка полученных результатов. Формула для расчета:

(О.-О;)2

, где х - критерии соответствия,О] и СЬ - полученные из эксперимента величины общего числа бактериальных клеток, выросших на чашках в контроле и опыте соответственно.

С помощью критерия соответствия определяли величину Р - вероятность значения х2 (величина табличная). Сравнение между собой числа клеточных колоний в контроле и опыте с использованием критерия соответствия х2 указывает на достоверное различие между фактическими и теоретически ожидаемыми результатами (Р< 0,001). Это свидетельствует о достоверности полученных результатов.

Проведенные исследования показали, что при увеличении концентрации паночастиц в суспензии число колоний микроорганизмов уменьшается вплоть до полного их отсутствия.

Таблица 12

Влияние напочастиц меди па колоииеобразующую способность культуры£. Coli штамма 113-13

Концентрация напочастиц, мг/мл Среднее количество КОЕ

п Штамм 11313 Р

Контроль 10 578±25

1 10 18±5 <0.001

0,1 10 24±6 <0,001

0,01 10 67 ±3 <0,001

При воздействии напочастиц меди па культуры Е. coli наблюдается значительное уменьшение количества КОЕ, при этом максимальный эффект достигается при концентрации 1.0 мг/мл (табл. 12). Так для культур Е. coli штамма 113-13 отмечено уменьшение количества бактериальных клеток почти в 30 раз по сравнению с контролем.

Таблица 13

Влияние напочастиц меди на колоииеобразующую способность S.Epidermidis

Концепт рация напочастиц, мг/мл Среднее количество КОЕ

п Интакт- ный пародии т Р Шгамм декомп епсация Р Штамм субкомп епсация Р Штамм компен сация Р

Контроль 10 345 ± 17 — 398±17 — 678 ± 16 — 569± 25 —

1 10 14 ± 5 <0,00 1 41 ±9 < 0,001 78 ±3 < 0,001 29 ±8 < 0,001

0,1 10 19 ± 8 <0,00 1 139*10 < 0,001 99 ±4 < 0,001 59 ±7 < 0,001

0,01 10 53 ±10 <0,00 1 174±13 < 0,001 141 ±4 < 0,001 124 ±4 < 0,001

Показана концентрационная зависимость количества КОЕ при исследовании действия суспензий напочастиц меди в отношении Е. coli и в отношении S. Epidermidis и S. Salivariiis(ia6n. 13, табл. 14). Снижение концентрации напочастиц по сравнению с максимальной приводит к пропорциональному увеличению числа КОЕ.

Напочастицы меди показали большую антибактериальную активность по отношению к клеткам 5. Salivarius.

Влияние цацочастиц меди па колоииеобразующую способность 5. salivarius.

Концент рация ианочастиц, мг/мл Среднее количество КОЕ

п Интактн ый пароаонт Р Штам м декомп енсаци я Р Штам м субком пенсац ия Р Штамм компеп сання Р

Контроль 10 345 ±17 — 598 ± 17 — 634 ± 18 — 567± 23 —

1 10 14 ± 5 < 0,001 65 ±7 < 0,001 61 ±3 < 0,001 29 ±5 < 0,001

0,1 10 19 ± 8 < 0,001 119 ± 11 < 0,001 98 ±7 < 0,001 37 ±4 < 0,001

0,01 10 53 ± 10 < 0,001 134 ± 13 < 0,001 111 ±4 < 0,001 109 ±4 < 0,001

В отношении всех исследованных культур Е. coli наблюдали уменьшение числа КОЕ в среднем примерно в 30 раз при концентрации наночлетнц меди 1мкг/мл по сравнению с контролем; уменьшение числа КОЕ в 20 раз при той же концентрации ианочастиц для культуры S. Epidermidis, выделенной от больных кариесом в стадии компенсации и примерно в 10 раз для той же культуры, выделенной от больных в стадии субкомпепсации и компенсации. Для культуры S. Salivarius при концентрации наночастиц 1 мкг/мл наблюдается картина подавления роста клеток, схожая с картиной для S. Epidermidis. Однако при уменьшении концентрации ианочастиц меди в растворе большую чувствительность проявляют клетки штамма S. salivarius.

Изменение биохимических показателей сыворотки крови белых беспородных мышей В процессе работы было выявлено, что медные частицы обладают биодоступностью и способны проникать из желудочно-кишечного тракта п кровь, переноситься с током крови к различным органам и оказывать биологический эффект, который проявляется также в изменении биохимических показателей сыворотки крови. Результаты экспериментов по изучению биохимических показателей при введении ианочастиц меди представлены в таблице 15.

Исследовали состояние углеводного, белкового, липидного обменов организма животных, а также активность клеточных ферментов под влиянием наночастиц меди.

Исследование показателей углеводного обмена под воздействием частиц проводили по трем основным показателям-концептрацииглюкозы, лактата, пнрувата в крови.

Уровень глюкозы в крови интактпых мышей составил 7,22±0,66 ммоль/л. Введение медных наночастиц в концентрациях 2 - 200 мкг/20г достоверных изменений не вызвало; во всех исследуемых группах содержание глюкозы колебалось в пределах нормы.

Концентрация лактата в крови экспериментальных животных по сравнению с контролем (24,77±1,62 ммоль/л) во всех случаях оставалась в пределах нормы.

Концентрация ПВК в контрольной группе животных составила 0,21±0,01 ммоль/л. Все исследуемые концентрации медных частиц вызывают увеличение содержания ПВК в крови лабораторных животных (р<0,001); при этом концентрация ПВК возрастает прямо пропорционально концентрации вводимых частиц: па 36% при введении 2 мкг/20г частиц остальные концентрации (20200 мкг/20г) способствуют увеличению содержания ПВК в 4-5 раз. Такие сдвиги могут быть обусловлены усилением катаболизма глюкозы с образованием ПВК и ослаблением ее утилизации в магриксс митохондрий, что приводит к повышению концентрации ПВК в сыворотке крови.

Влияние нанопорошка меди на белковый обмен изучали по изменению копцепграции в крови лабораторных животных содержания общего белка и его альбуминовой фракции, а также по содержанию одного из конечных продуктов распада белков - мочевины.

Концентрация белка в крови мышей, которым вводили медные паночастнцы. несколько увеличивалась во всех экспериментальных группах.

Можно предположить, что увеличение содержания белка в крови животных происходило, вероятно, за счет фракции глобулинов (явления диспротеинсмии), поскольку концентрация альбуминов у животных под действием всех исследуемых концентраций наночастиц меди изменялась в пределах нормы (уровень альбуминов в контроле - 58,08±0,27 г/л).

Мочевина - один из конечных продуктов распада белков, основной компонент остаточного азота.

Под влиянием концентраций медных напопорошков - 2 мкг/20г, 20 мкг/20г, 150мкг/20г и 200 мкг/20г происходит некоторое снижение уровня мочевины в кропи - в 1.15, 1.17, 1.2 и 1.3 раза соответственно; при этом значимый сдвиг в концентрации мочевины отмечается при введении самой большой дозы исследуемого порошка (р<0,01).

Липидный обмен и состояние мембран оценивали по содержанию холестерина в сыворотке крови (рис.11). Все исследуемые концентрации медных паночастиц вызывают гиперхолестеринемию, при этом по степени увеличения концентрации холестерина в крови исследуемые дозы наночастиц располагаются в следующем порядке: 2 мкг/20г< 20 мкг/20г< 150 мкг/20г< 200 мкг/20г. Увеличение концентрации холестерина может быть связано с тем, что образующееся в процессе катаболизма глюкозы большое количество ПВК может участвовать в процессах образования ацетнл-КоА, который в дальнейшем идет на синтез холестерина.

Изменения показателей пигментного обмена анализировали по содержанию в сыворотке крови билирубина (прямого, непрямого, общего).

Во всех исследуемых группах отмечено высокое содержание билирубина в крови по сравнению с контролем. Содержание общего билирубина в сыворотке крови под влиянием медных паночастиц носит следующий характер: при введении 2 мкг/20г медных частиц уровень общего билирубина увеличивается в 2.18 раза, аналогичное увеличение отмечено и при действии паночастиц в дозировке 150200 мкг/20 г. Введение наночастиц в концентрациях 20 мкг/20г приводит к увеличению уровня билирубина в 2,5 раза.

Необходимо отметить, что увеличение уровня общего билирубина происходит преимущественно за счет прямого билирубина. Увеличение концентрации непрямого билирубина по сравнению с контрольной группой животных (1.3610,01 мг/дл) происходит параболически: дозировки медных порошков 2 и 20 мкг/20г увеличивают концентрацию непрямого билирубина в 1,5 раза, 150мкг/20г - п 1,3 раза, 200 мкг/20г - в 1,2 раза.

Концентрация прямого билирубина под влиянием медныхнанопорошков также увеличивается, причем пропорционально концентрации введенного панопорошка меди. Наиболее значимое увеличение концентрации прямого билирубина, почти в 2 раза, наблюдается при введении паночастиц в дозировке 200 мкг/20г.

Изменение биохимических показателей сыворотки крови экспериментальных животных пол влиянием наночастиц меди

Исследуемая группа Контроль Медь

концентрация наночастиц 2 мкг/20г 20 мкг/20г 150 мкг/20г 200 мкг/20г

биохимический показатель М±т М±ш Р М±т Р М±т Р М±т Р

глюкоза, ммоль/л 7,22±0,66 9,38±0,70 >0,05 7,98±0.31 >0,05 8,81 ±0,90 >0,05 7,95±0,83 >0,05

лактат, ммоль/л 24,7 7± 1,72 26,55±0,85 >0,05 23,86±0,53 >0,05 24,57±0,91 >0,05 24,5±0,89 >0,05

ПВК, ммоль/л 0,21 ±0,01 0,58±0.01 <0,001 0,95±0,01 <0,001 0,99±0,01 <0,001 1,20±0,03 <0,001

общий белок, г/л 70± 16,00 75±11.2 <0,05 89±9.0 <0,05 102±8.2 <0,05 106±17 <0,01

альбумин, г/л 58,08±0,27 66,00±4,80 >0.05 70.80±6,20 >0,05 65,40±2.90 <0,05 68,57±7,39 >0,05

мочевина.ммоль/л 3.2±0.2 2.8±0.3 >0,05 2.7±0,17 <0,05 2,6±0,29 <0,05 2,45±0,14 <0,01

холестерин ,мм ол ь/л 5.2±0,3 6.5±0,5 <0,001 7±0,6 <0,001 7,5±0,4 <0,001 8±0,2 <0,001

общий билирубин, мг/дл 1,6±0.1 3,5±0,2 <0,001 4±0,4 <0,001 3.6±0,1 <0,001 3,5±0,3 <0,001

прямой билнрубин, мг/дл 1.02±0,02 1.30±0,03 <0.001 1,47±0,25 <0.01 1,57±0,04 >0,05 1,72±0,39 <0,05

непрямой билирубин, мг/дл 1,36±0,0| 2,30±0,24 <0.001 2.2±0,15 <0,001 2,12±0,06 <0,001 1,75±0,16 <0,001

АсАТ, МЕ 130,00±9.2 142,70±13 >0,05 155,40±2,5 >0,05 173.50±2,0 >0,05 195±] 8,0 <0,001

АлАТ, МЕ 53,00±2.8 67,00±4,6 <0,01 79,40±3,7 <0,001 112,70±9,8 <0,001 134,29±6,9 <0,001

ЛДГ, МЕ 2045,00±55 2454±27 <0,001 2780±119 <0,001 3119±141 <0,001 3284±221 <0,001

ГГТ, МЕ 106±17.4 136±5.4 >0,05 165,5±6.0 <0,05 175±3.8 <0,001 187±4.9 >0,05

ЩФ, МЕ 396,00±12 418,40±18 <0,001 442.70±16 <0,001 485,10± 15 <0,001 493,29±10 <0,05

Амилаза, МЕ 456,00±7.5 525,60±7.0 <0.001 557.0±9.15 <0.001 587.10± 13.0 <0.001 614.0±24 <0.001

Прнмечанме:р- уровень вероятности различий в сравнении с контролем.

Увеличение уровня билирубина за счет прямого и непрямого билирубина позволяет прийти к заключению, что папочастииы меди оказывают повреждающее действие па клетки печени, вследствие чего печень теряет способность быстро обезвреживать пепрямой билирубин, и его концентрация возрастает в крови.Увеличение концентрации прямого билирубина в крови может являться следствием закупорки желчных протоков при попытке организма вывести гидрофобные папочастицы из печени с желчью.

Токсические эффекты, оказываемые напочастицами меди на печень, доказаны также в экспериментах по изучению активности индикаторных ферментов.

В контрольной группе животных активность АлАТ составила 53.00±2,8 ME. Все исследуемые концентрации папопорошка вызывают увеличение активности данного фермента; при этом имеется дозозависимый эффект.

При введении нанопорошка в количестве 2 мкг/20г активность АлАТ увеличилась в 1,25 раза; при дозировке 20 мкг/20г- в 1,42 раза; при концентрации 150 мкг/20г - в 2 раза; при 200 мкг/20г - в 2,6 раза.

Активность АсАТ под влиянием папочастиц меди также изменялась. При введении нанопорошка в количестве 2 мкг/20г активность АсАТ увеличилась в 1.17 раза, при дозировке 20 мкг/20г- в 1.2 раза, при концентрации 150 мкг/20г - в 1.3 раза, при 200 мкг/20г - в 1.5 раза.

Увеличение активности амипотрансфераз в сыворотке крови мышей будет указывать па их выход из гепатоцитов в сыворотку крови вследствие повреждения мембран гепатоцитовнаночастицами, что в какой-то мере объясняет феномен снижения образования мочевины в клетках печени из-за снижения процессов трансамиппрования аминокислот.

Активность другого индикаторного фермента поражения гепатоцитов - ГГТ -также значительно менялась под влиянием медных частиц.

Достоверное увеличение активности данного фермента (р<0,01) по сравнению с контролем (106±17.4) отмечено при введении папочастиц во всех дозировках: при введении нанопорошка в количестве 2 мкг/20г активность 111 увеличилась в 1.3 раза, при дозировке 20 мкг/20г- в 1.5 раза, при концентрации 150 мкг/20г - в 1.7 раза, при 200 мкг/20г - в 1,8 раза. ГГТ является мембранным ферментом, значительное количество которого находится па поверхности гепатоцитов и который принимает активное участие в транспорте аминокислот из плазмы крови в ткани, в том числе в ткань печени. Появление этого фермента в крови указывает па повреждение мембран гепатоцитов и, как следствие, приводит к нарушению всасывания аминокислот в печени и к уменьшению концентрации мочепннм и

кропи из-за нарушения процессов трапсамннировапия аминокислот в гепатоцитах и в других тканях и органах.

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ), которая отражает состояние костной ткани и желчных протоков, во всех исследуемых группах увеличена по сравнению с контролем (396,00±2,18 МЕ) в 1,05-1.3 раза, что свидетельствует о возможных нарушениях метаболизма костной ткани, снижении функции остеобластов и остеокластов под действием наночастиц меди или их разрушении.

Активность амилазы под влиянием исследуемых концентраций наночастиц мели достоверно увеличивается по сравнению с контролем в 1,2-1,35 раза, что, возможно, обусловлено повреждающим действием медных наночастиц на мембраны клеток поджелудочной железы.

Все исследуемые концентрации наночастиц меди указывали па гнперферментемию в отношении ЛДГ. При введении наночастиц в концентрации 2 мкг/20г активность фермента увеличивалась в 1.2 раза, при введении 20мкг/20г -в 1.32 раза, при введении 150мкг/20г - 1.5 раза, при введении 200мкг/20г - в 1.6 раза. Увеличение активности ЛДГ может свидетельствовать об усилении анаэробного окисления глюкозы в тканях или усиленном распаде клеток, прежде всего гепатоцитов. с последующим выходом фермента в кровь, поскольку ЛДГ является диагностическим, индикаторным ферментом, указывающим па процессы цитолиза клеток. В пользу второго предположения указывает иезпач1ггельное изменение концентрации лактата в сыворотке крови.

Вы йоды

1. Активность лактатдегидрогепазы, щелочной фосфатазы и амилазы ротовой жидкости снижается под действием наночастиц меди шуНго, при этом величина снижения ферментативной активности зависит от стадии кариозного процесса.

2. Обнаруживаются менее выраженное уменьшение скорости ферментативной реакции и менее выраженное увеличение Кт амилазы по сравнению со скоростями ферментативной реакции и Кшлактатдепшрогсназы н щелочной фосфатазы в присутствии наночастиц меди шуНго при различных стадиях кариеса.

3. Диагностический индекс активности ЛДГ/амилаза позволяет дифференцировать стадии кариозного процесса: при компенсированном кариесе индекс равен 11.8 безразмерных единиц, при субкомпенсировапном кариесе - 15.2 единиц и при декомпенсироваппом кариесе - 18.1 безразмерных единиц (при ннтактном пародонте индекс равен 9.6 единиц).

4. Напочастнцы меди обладают бактериостатическнм действием на бактериальные клетки Е.СоН, 5.Ер1с]егттс11$ и З^аНуапий в рабочем диапазоне концентраций от 0,01 до 1.0 мг/мл. Наибольшую чувствительность к

наночастицампроявляли клетки кишечной палочки. В стадии субкомпспсацин и компенсации кариозного процесса папочастнцы меди обладали наиболее выраженной антибактериальной активностью в отношении клеток 8.Ер1(1еггш(№ п З.ЗаПуапиБ.

5. Наночастицы меди вызывают повреждения гепатоцитоп, о чем свидетельствует увеличение в крови активности индикаторных ферментоп: ЛсЛТ, АлАТ, ЛДГ, 11 I в 1.2 - 2.5 раза от исходного уровня. Под влиянием напопорошков меди происходит увеличение активности ЩФ и амилазы, что может указывать на повреждение клеток поджелудочной железы и желчевыводящих протоков.

Практические рекомендации

1. Использование паночаеттш меди в качестве добавки к композитным материалам повышает антибактериальную активность используемых в стоматологии материалов.

2. Индекс активности ферментов ЛДГ/амилаза в ротовой жидкости целесообразно использовать для определения степени развития кариозного процесса, что позволит ввести дополнительный лабораторный критерий наряду с клинической оценкой кариозного процесса.

3. Определение параметров ферментативной реакции: активности ферментоп ротовой жидкости, скорости ферментативной реакции, константы Мнхаэлнса способствует более точной оценке глубины и тяжести кариозного процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1 .Биологическое действие высокоднсперспых порошков металлов на ферменты сыворотки крови мышей/Ю.С.Дудакова, И.В. Бабушкина,В.Б. Бородулин.М.М.Сакалла // Известия ВУЗов. Северо-кавказский регион.- 2010. - № 2.-С. 84-88.

2.Действие напочастнц меди на клииическиещтаммы грамотрицательных бактерий/ И.В. Бабушкина, В.А.Мартьянова, А.Л.Боровский, М.М. Сакалла// Вестник РУДП,-2010.-№4.-С. 162-164.

3.Изучение влияния напочастиц металлов па чувствительность к антибиотикам клинических штаммов микроорганизмов/ И.ВБабушкипа, Е.Г.Чеботарепа. Е.В.Бородулипа, М.М. Сакалла // Вестник новых медицинских технологий. - 2011. - Т. XVIII. -№ 3. - С. 258-260.

4.Анализтоксического действия нанопорошка меди /Ю.С.Дудакова, Е.Г.Чеботарева, В.Б. Бородулин, М.М.Сакалла// обмен веществпри адаптации иповреждепии// Матер. X межвузовской конф. с междунар. участием - Росгоп-п/Д ,2011,-С. 62-63.

5. Изменение активности лактодегидрогеназы в опытах туЩопод влиянием наночастиц/Ю.С.Дудакова. Е.Г.Чеботарева, В.Б. Бородулин, М.М.Сакалла

// Обмен веществ при адаптации и повреждении: Матер. X межвузовской копф. с междупар. участием - Ростов-н/Д, - 2011. - С. 63-64.

6.Исследование гепатотоксического действия нанопорошка железа/Ю.С.Дудакова, Е.Г.Чеботарева, М.М.Сакалла, В.Б. Бородулш1 //Обмен веществ при адаптации и повреждении : Матер. X межвузовской конф. с междупар. участием - Ростов-н/Д, 2011.-С. 64-65.

7. Изменение морфологии почек мышей под влиянием наночастиц металлов/Ю.С.Дудакова, Е.Г.Чеботарева, М.М.Сакалла, В.Б. Бородулин// Обмен веществ при адаптации и поврсждении:Матер. X межвузовской конф. с междупар. участием - Ростов-п/Д, 2011. - С. 65-66.

Список нрниотых сокращении

АлАТ - алаиинаминэтрансфераза АсАТ - аснартатаминотрансфераза Г1Т - гамма-глутамилтрансфсраза КОЕ - колоииеобразующне единицы ЛДГ - лактатдегидрогеназа МПА - мясопептонный агар Г1ВК - пировиноградная кислота ЩФ - щелочная фосфатаза Кш - константаМихаэлиса-Мептен

Подписано в печать 12.04.2012г. Объем 1 печ. л. Тираж 100. Заказ № 2510. Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Принт-Клуб». 410026. г. Саратов, ул. Московская. 160. Тел.: (845-2) 338-300.

2012089729