Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клиническое значение онкопротеинов E7 и p16ink4α в диагностике и лечении цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени

На правах рукописи

Ахметзяпова Алевтина Валериановна

г*

* с

Клиническое значение онкопротеинов Е7 и р16тк4а в диагностике и лечении цервикалыюй интраэпителиальной неоплазии различной степени

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

і ь т.т

005и<*°. —

Казань - 2012

005048112

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

- доктор медицинских наук, профессор Мальцева Лариса Ивановна

Официальные оппоненты:

- Фаткуллин Ильдар Фаридович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии №2 ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации;

- Габитов Наиль Адгамович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии №2 ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Уфа).

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в час. на заседании диссертационного совета Д 208.033.01 при ГБОУ ДПО « Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 420012, г. Казань, ул. Муштари, д.11. .

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (420012, г. Казань, ул.Муштари,

Д. 11).

Автореферат разослан «_»

2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, К.м.н., доцент

Тухватуллина Лилия Мухам етзяновна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Рак шейки матки является актуальной проблемой в современной онкологии, занимая второе место среди злокачественных новообразований женских репродуктивных органов. В возрастной группе 30-39 лет рак шейки матки является основной причиной смертности у женщин. Последнее десятилетие характеризуется изменением структуры заболеваемости РШМ, прослеживается тенденция к его росту у женщин репродуктивного возраста (Чиссов В.И., 2010; Прилепская В.Н., 2012). В снижении заболеваемости и смертности от рака шейки матки ведущее значение имеет ранняя диагностика и рациональное лечение предраковых заболеваний шейки матки (Казаченко В.П., 2005).

Подтверждение этиологической роли вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки привело к тому, что диагностика па-пилломавирусной инфекции стала рассматриваться как важнейший элемент скрининга и профилактики этого заболевания (Khan М., 2005; WHO, 2006). Однако, у большинства зараженных женщин инфекция спонтанно разрешатся, и только у 1 из 100 инфицированных развиваются клинические поражения (Lehtinen М., 2007).

Наряду с методами, направленными на детекцию ВПЧ, большой интерес представляет определение онкобелков Е7 и pl6ink4a, как ранних маркеров развития неопластических процессов. В то же время значимость этих тестов в диагностике и оценке эффективности лечения не определена.

В связи с этим целью исследования явилась оптимизация диагностики и лечения цервикальных интраэпителиальных неоплазий различной степени при помощи оценки экспрессии онкопротеинов Е7 и pl6ink4a.

В соответствии с поставленной целью сформированы следующие задачи исследования:

1. Изучить клиническую характеристику больных с различной степенью цервикальной интраэпителиальной неоплазии в зависимости от экспрессии онкопротеинов Е7 и pl6ink4a.

2. Оценить иммуноцитохимическую и иммуногистохимиче-скую экспрессию белка pl6ink4a у женщин с различной степенью цервикальной интраэпителиальной неоплазии в сопоставлении с цитологическими и гистологическими результатами.

3. Изучить степень нарушения обмена метаболитов эстроге-

нов у женщин с цервикальной интраэпителиальной неоплазией шейки матки.

4. Оценить возможности белков Е7 и pl6ink4a для проведения дифференцированной терапии больных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и контроля эффективности лечения.

Научная новизна. Результаты проведенного исследования впервые показали связь онкобелков Е7 и pl6ink4a с клиническими особенностями цервикальной интраэпителиальной неоплазии, коль-поскопическими характеристиками поражений шейки матки, значимость этих белков в прогрессии неопластических изменений и выбора дифференцированной терапии в зависимости от их экспрессии.

Научно новым явился факт появления белка pl6ink4a с выраженной иммуноцитохимической и иммуногистохимической реакцией в эпителии шейки матки только при наличии цервикальной интраэпителиальной неоплазии, а белка Е7 как при различных формах CIN, так и других изменениях шейки матки - воспалительном процессе, дискератозе. Проведенные исследования показали, что белок pl6ink4a появляется в более позднем возрасте и отражает прогрессирующее течение неоплазии, тогда как Е7 - персистирующую ВПЧ инфекцию с перспективой развития неоплазии.

Установлен факт отрицательного иммуноцитохимического теста на белок pl6ink4a у женщин с CIN при положительной иммуногистохимической экспрессии у 10% женщин с лейкоплакией, что важно учитывать в диагностическом плане. Научную новизну представляет собой выявление стойкого нарушения обмена эстрогенов с минимальными показателями соотношения метаболитов эстрадиола 0,86±0,1 у женщин с экспрессией белка pl6ink4a.

Впервые обоснованы дифференцированные подходы к терапии с учетом появления белков Е7 и pl6ink4a. Позитивная реакция на pl6ink4a при любой степени CIN требует деструктивных методов лечения, независимо от наличия Е7. При отрицательном значении pl6ink4a, но позитивном Е7 возможна консервативная противовоспалительная и противовирусная терапия в случаях CIN I и CIN II, при CIN III - деструктивные методы лечения.

Практическая значимость. Определено место онкопротеинов Е7 и pl6ink4a в диагностическом и лечебном процессе у больных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией различной степени тяжести. Показана наибольшая прогностическая значимость определения белка p!6ink4a в оценке прогрессирования CIN при иммуноги-

стохимическом исследовании и высокая чувствительность иммуно-цитохимической реакции на белок pl6ink4a для выбора метода лечения.

Практически важным являются данные о появлении белка Е7 как раннего маркера активной ВПЧ инфекции с перспективой развития неоплазии и возможности консервативного лечения до реализации этой перспективы. Сохранение белка Е7 после проведенного деструктивного лечения свидетельствует об отсутствии полной элиминации ВПЧ инфекции. Определена чувствительность и специфичность для белка Е7 (84% и 48% соответственно) и pl6ink4a (94% и 85,7%) в прогнозе риска развития и прогрессии CIN.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практическую деятельность гинекологического отделения ГУЗ «Республиканская клиническая больница №2» МЗ РТ, гинекологического отделения ГАУЗ «Республиканский клинический онкологический диспансер» МЗ РТ, медицинского центра «Здоровье семьи» г. Казани. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии №1 ГБОУ ДПО КГМА Минздрава России.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены и обсуждены на: конференции молодых ученых КГМА (Казань, 2009), заседании общества онкологов (Казань, 2009), IX Всероссийском конкурсе молодых ученых по онкологии на лучшую научную работу 2010 г. в рамках XIV Российского онкологического конгресса (Москва, 2010), научно-практическом семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии» (Сочи, 2010), XII Всероссийском научном форуме «Мать и детя» (Москва, 2011), II Общероссийском научно-практическом семинаре «Репродуктивный потенциал России: здоровье женщины - здоровье нации. Казанские чтения» (Казань, 2011); XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2012); республиканской конференции «Совершенствование медицинской помощи населению при раке шейки матки» (Казань, 2012), Международном междисциплинарном форуме «Шейка матки и вульвовагинальные болезни» (Москва, 2012); совместной конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1, кафедры акушерства и гинекологии №2 ГБОУ ДПО КГМА Минздрава России, кафедры акушерства и гинекологи №1, кафедры акушерства и гинекологии №2 ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 работы - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 257 наименований, в том числе 80 отечественных и 177 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 12 рисунками.

Положения, выносимые на защиту:

1. Появление онкобелков Е7 и pl6ink4a при ВПЧ поражении шейки матки в различной степени отражает активность инфекции и риск прогрессии неопластических изменений шейки. Экспрессия белка Е7 наблюдается у молодых женщин с невыраженными кольпоско-пическими изменениями и ассоциируется с нетяжелыми формами поражений шейки. Белок pl6ink4a появляется при выраженных аномальных кольпоскопических картинах с развитием CIN различной степени тяжести.

2. Определение белков Е7 и pl6ink4a позволяет провести дифференцированную терапию больных, имеющих CIN. При pl6ink4a позитивном результате независимо от степени цервикальной интра-эпителиальной неоплазии необходимы деструктивные методы лечения шейки матки. При отрицательном тесте pl6ink4a, но положительном на Е7 возможна консервативная терапия CIN I и CIN II.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование было проведено в период с 2008 по 2012 гг. в 1-м гинекологическом отделении ГАУЗ «Республиканский онкологический диспансер» МЗ РТ, на базе поликлиники ГАУЗ «Республиканский онкологический диспансер» МЗ РТ и медицинского центра «Здоровье семьи» г. Казани. Согласно поставленным задачам, проведено комплексное клинико-лабораторное и инструментальное исследование 110 женщин в возрасте от 20 до 45 лет с различными степенями цервикальной интраэпителиальной неоплазии. По результатам экспрессии белков pl6ink4a и Е7 пациентки были разделены на 2

группы: 1-ю составили 70 женщин с позитивной реакцией на белок pl6ink4a и позитивной или негативной реакцией на белок Е7, 2-ю -40 женщин с негативной экспрессией на белок pl6ink4a и позитивной реакцией на белок Е7. Контрольную группу составили 25 практически здоровых женщин без дисплазии цервикального эпителия.

Критерии включения в основную группы, гистологически подтвержденный диагноз CIN, возраст от 20 до 45 лет, предоставление письменного информированного согласия.

Критерии исключения-, беременность, лактация.

Критерии включения в группу контроля: возраст женщин от 20 до 45 лет, отсутствие патологических изменений на шейке матки подтвержденные клиническими, кольпоскопическими и цитологическими исследованиями, отрицательные результаты ВПЧ-тестирования.

Всем пациенткам было проведено комплексное общеклиническое и гинекологическое обследование. Простая и расширенная коль-поскопия проводилась с использованием видео-кольпоскопа «SLC-2000», применяли 25-кратное увеличение. Данные кольпоскопическо-го исследования интерпретировали согласно Международной классификации кольпоскопических терминов, одобренной на 14-ом Всемирном конгрессе Международной федерации по кольпоскопии и цервикальной патологии (IFCPC) (Рио-де-Жанейро, 2011).

Для идентификации ВПЧ 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58 и 59 типов хламидий, уреаплазм, микоплазм, вируса простого герпеса, использовали ПЦР диагностику с разделением продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза (НПФ «Литех», г. Москва). Генотипирование ДНК вирусов папилломы человека высокого канцерогенного риска, выделенных из клинических проб проводилось с помощью набора «РеалБест ДНК ВПЧ ВКР генотип» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуорес-центной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX-96 "REAL TIME" (Bio-Rad США).

Цитологическое исследование мазков с влагалищной части шейки матки и из цервикального канала проводили традиционно и методом жидкостной цитологии. Забор материала для жидкостной цитологии осуществлялся в ёмкость с транспортной средой с последующим центрифугированием цитоцентрифуге Cytospin®4. Цитопрепа-рат окрашивался по Романовскому-Гимзе и подвергался микроскопическому исследованию. Диагноз выставлялся согласно цитологической классификации опухолей и неопухолевых поражений Всемир-

ной организации здравоохранения (1973 г.)

Иммуноцитохимическое исследование белка pl6ink4a проводилось на основе жидкостной цитологии. Применялись первые антитела фирмы Santa Cruz (Германия), клон JC8 .

Изучение уровня иммуноцитохимической экспрессии белка р16 в цервикальных образцах было основано на оценке интенсивности реакции, полуколичественном определении индекса экспрессии. Оценивались ядерная реакция, ядерная реакция совместно с цито-плазматической.

На основании данных признаков мы выделили наиболее часто встречающиеся заключения. _

Заключение Комментарии

позитивная реакция на р16 2-3 яркопозитивные клетки (ядерно-цитоплазматическая реакция) в каждом поле зрения

позитивная реакция на р16 в единичных клетках 1 яркопозитивная клетка (ядерно-цитоплазматическая реакция) на 5 полей зрения

слабопозитивная реакция на р16 Слабая ядерно-цитоплазматическая реакция во всех визуализируемых клетках

Гистологическое исследование биоптатов шейки матки было проведено на микроскопе «Leica». Выполняли прицельную биопсию зон измененного эпителия шейки матки под контролем кольпоскопа. Для окрашивания микропрепаратов применяли гематоксилин и эозин.

Иммуногистохимическое исследование белка pl6ink4a проводили на биопсийном материале. Применяли первые антитела фирмы МТМ Laboratories, клон Е6Н4 (CINtec Histology Kit МТМ laboratories, Германия). Оценивали интенсивность реакции (1 балл - слабая, 2 балла - умеренная, 2 - балла - высокая), индекс экспрессии (0 баллов - экспрессия отсутствует, 1 балл - менее 50% экспрессии клеток, 2 балла - более 50% экспрессирующих клеток), наличие ядерной метки (в %) при подсчете не менее чем в 10 полях зрения на 1000 клеток (негативная - 0 баллов; 5 и менее клеток в поле зрения - единичная, 1 балл; более 5 клеток в поле зрения- множественная, 2 балла).

Онкобелок Е7 выявляли в цервикальных пробах методом имму-ноферментного анализа, используя набор реагентов «Е7-ВПЧ-16/18-Диагност»

Гормональное исследование включало количественное определение метаболитов эстрадиола (2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1), их соотношения в утренней порции мочи методом ИФА с помощью тест-системы Es-tramet (Мираксфарма, г. Москва)

Статистическая обработка проводилась с использованием программы «Biostat». Для оценки показателей применялись критерий X2 и критерий Стьюдента для долей. При статистическом анализе материала выполняли расчет интенсивных и экстенсивных показателей, средних величин по критерию Стьюдента. Достоверным считали различия между сравниваемыми средними и относительными величинами со степенью доверительной вероятности 95% и выше (р<0,05). В работе использован корреляционный анализ.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В соответствии с поставленными задачами, определение белка Е7 иммуноферментным методом и pl6ink4cc иммуноцитохимическим методом проведено у 135 женщин, из них 110 с различной степенью цервикальной интраэпителиальной неоплазии и 25 практически здоровых.

Позитивная реакция на белок pl6ink4a иммуноцитохимическим методом отмечена у 70 женщин (1-я группа), негативная у 40 (2-я группа). При исследовании белка Е7 положительный результат оказался у 103 больных, отрицательный - у 7. У женщин 1-й группы по результатам гистологического исследования биоптата шейки матки CIN I выявлена в 9 (12,85%), CIN II в 12 (17,1%), CIN III в 49 (70%) случаев, 7 больных с отрицательным белком Е7 также вошли в 1-ю группу, так как имели ярко выраженный позитивный тест на р16 и CIN III при морфологическом исследовании. Среди женщин 2-й группы с отрицательным результатом на белок р16 гистологически диагностирована CIN I у 24 (60%), CIN II у 14 (35%), CIN III - у 2 (5%). У 25 здоровых женщин (3-я группа), вошедших в группу контроля, имелся отрицательный тест на белок Е7 и белок pl6ink4a (таблица 1).

Средний возраст женщин в первой группе составил 33,07±1,4 года, во второй - 29,8±1,1 лет, в контрольной группе 30,2±1,6. Наибольшее число 33 (47,1%) женщин, с позитивной реакцией на белок pl6ink4a, находилось в возрасте от 31 до 40 лет. Во второй группе достоверно преобладали женщины раннего репродуктивного возраста

от 20 до 30 лет-21 (52,5%).

Таблица 1

Экспрессия белка pl6ink4a иммуноцитохимическим методом в зависимости от степени CIN

Результат иммуноцито-химического исследования на р16іпк4а Количество больных (абс./%)

CIN I CIN II CIN III Контрольная группа

позитивная реакция (1-я группа) (п=70) 9 (12,85%) 12 (17,1%) 49 (70%)

негативная реакция (2-я группа)(п=40) 24 (60,0%) 14 (35,0%) 2 (5,0%) 25 (100%)

Различия в возрасте у больных 1-й и 2-й групп были статистически достоверны и указывали на более старший возраст пациенток с CIN, имевших позитивный тест на белок р16. Как показал анализ развитие цервикальной интраэпителиальной неоплазии у более молодых женщин сопровождается появлением только белка Е7 и более легкими формами CIN в 60% случаев, тогда как позитивная реакция р16 ассоциирована с более тяжелыми формами CIN в 70% случаев. Корреляционный анализ показал связь CIN III с белком р16 (г=0,70; р<0,01) и связь CIN I с белком Е7 (г=0,36; р<0,01)

Такие признаки как раннее начало половой жизни (до 18 лет) и большое количество половых партнеров (3 и более) в равной степени преобладали в обеих группах. Раннее начало половой жизни (до 18 лет) было отмечено у 18 (25,7%) женщин 1-й группы, у 12 (30%) пациенток из 2-й. На 3 и более половых партнеров указывали большинство 1-й группы - 30 (42,85%) и 17 (42,5%) из 2-й.

Установлена положительная связь (г=0,18; р<0,05) белка р16 с приёмом оральных контрацептивов, которую использовали 26 (37,1%) женщин 1-й группы, из них 80% продолжительно, тогда как 14 (35%) из 2-й гормональную контрацепцию применяли короткое время.

Анализ гинекологического анамнеза показал, что в структуре заболеваемости у больных обеих групп преобладают воспалительные процессы как нижних, так и верхних отделов половых путей. Достоверно в первой группе преобладали пациентки с бактериальным ва-гинозом 24 (34,3%) (р<0,05), что в 2 раза больше, чем во второй - 7 (17,5%). Обращает внимание высокий процент хронических экзо- и эндоцервицитов в обеих основных группах - 38 (54,3%) и 21 (52,5%)

соответственно. Частота бесплодия в 1-й группе в 3 раза превышала аналогичный показатель во 2-й, число самопроизвольных абортов - в 2 раза.

Каждая четвертая женщина с CIN имела анамнез длительно курящей (от 3 до 10 лет).

Анализ генотипирования вируса папилломы показал, что ВПЧ 16 типа преобладал в обеих группах, в 1-й - в варианте моноинфекции у 46 (65,7%) женщин, во 2-й - у 19 (47,5%) женщин. ВПЧ 18 типа обнаруживался значительно реже: у 5(7,1%) из 1-й группы, у 2 (5,9%) -из 2-й. Вирусы 31, 33, 52, 45, 58 типов обнаружены у 3 (4,2%), 2 (2,8%), 3 (4,2%), 1 (1,4%) и 1 (1,4%) женщин соответственно из 1-й группы, у 5 (12,2%), 4 (10%), 2 (5,9%), 1 (2,5%) и 1 (2,5%) - из 2-й. Установлены сочетания папилломавирусной инфекции различных типов (таблица 2). Наличие ВПЧ инфекции 16 типа коррелировало как с белком р16 (г=0,612; р<0,05), так и с белком Е7 (г=0,404; р<0,05).

Таблица 2

Частота выявления типов вируса папилломы человека (ВПЧ)

и их сочетаний у обследуемых женщин

Тип вируса папилломы человека Группа

первая (п=70) вторая (п=40)

Папилломавирусная инфекция 16 тип 46(65,7%)* 19(47,5%)*

Папилломавирусная инфекция 18 тип 5(7,1%) 2(5,9%)

Папилломавирусная инфекция 31 тип 3(4,2%) 5(12,5%)

Папилломавирусная инфекция 33 тип 2(2,8%) 4(10%)

Папилломавирусная инфекция 52 тип 3(4,2%) 2(5,9%)

Папилломавирусная инфекция 45 тип 1(1,4%) 1(2,5%)

Папилломавирусная инфекция 58 тип 1(1,4%) 1(2,5%)

Сочетание ВПЧ 16 и 18 типов 2(2,8%) 1(2,5%)

Сочетание ВПЧ 16 и 31 типов 1(1,4%) 1(2,5%)

Сочетание ВПЧ 16 и 33 типов 2(2,8%) 2(5,0%)

Сочетание ВПЧ 16 и 52 типов 3(4,2%) 1(2,5%)

Сочетание ВПЧ 16 и 39 типов 1(1,4%) 1(2,5%)

Как правило папилломавирусная инфекция сочеталась с различными другими видами инфекций, передающихся половым путем. В 1 -й группе Ureaplasma urealyticum была выявлена у 26 (37,1%), Mycoplasma hominis у 4 (5,7%), Chlamydia trachomatis у 3 (4,3%), Herpes simplex I+II у 3 (4,3%), Candida albicans у 2 (2,9%) женщин.

Среди больных 2-й группы ассоциации были аналогичными, также преобладала Ureaplasma urealyticum у 9 (22,5%) женщин, реже Mycoplasma hominis - 2(5,0%), Chlamydia trachomatis у 2(5,0%), Herpes simplex I+II у 1 (2,5%), Candida albicans у 3 (7,5%). При проведении корреляционного анализа сочетание ВПЧ с Ureaplasma urealyticum коррелировало с белком р16 (г=0,287; р<0,05) и с белком Е7 (г=0,469; р<0,05).

Таким образом, Ureaplasma urealyticum наиболее частая сопутствующая инфекция и возможно она играет определенную кофактор-ную роль в прогрессии ВПЧ-ассоциированных CIN.

Анализ данных кольпоскопии среди пациенток 1-й группы выявил преобладание выраженных аномальных кольпоскопических картин с плотным ацетобелым эпителием у 29 (37,1%) (р<0,05), грубой мозаикой у 18 (25,7%) (р<0,05), грубой пунктуацией у 11 (15,7%) (р<0,05). Встречались кольпоскопические картины, подозрительные на инвазию - атипические сосуды выявлены у 8 (11,4%) женщин. В 30% случаев наблюдалось сочетание аномальных кольпоскопических образований: ацетобелый эпителий и мозаика, ацетобелый эпителий и пунктуация, ацетобелый эпителий, пунктуация и мозаика.

Во 2-й группе в кольпоскопической картине преобладали невыраженные изменения- тонкий ацетобелый эпителий у 16(40,0%) пациенток (р<0,05), нежная мозаика у 5 (12,5%), нежная пунктуация у 3 (7,5%).

Во всех группах мы отметили наличие неудовлетворительных кольпоскопических картин. В 1-й группе у 30%, во 2-й у 10% пациенток имели, либо частичную визуализацию зоны трансформации, либо ЗТ не визуализировалась полностью.

При проведении корреляционного анализа выявлена связь между наличием белка pl6ink4a и плотным ацетобелым эпителием (г=0,248; р<0,05), грубой мозаикой (i=0,367; р<0,05), грубой пунктуацией (г=0,313; р<0,05), йод-негативной зоной (г=0,244; р<0,05). Наличие белка Е7 коррелировало с тонким ацетобелым эпителием (г=0,370; р<0,05), йод-негативной зоной (г=0,296; р<0,05), что позволяет предположить связь белка Е7 нетяжелыми изменениями эпителия шейки матки, несмотря на атипический их характер.

Анализ результатов жидкостной цитологии показал (таблица 3), что среди женщин с позитивной реакцией на белок р16 достоверно преобладала умеренная (35,7%) и тяжелая (41,4%) дисплазия (р<0,05), тогда как при отрицательном р16, но положительном Е7 -

легкая дисплазия (62,5%) (р<0,05).

Таблица 3

Результаты жидкостной цитологии пациенток основных групп

Цитологические результаты

Норма

Легкая дисплазия

Умеренная дисплазия

Тяжелая дисплазия

Ca in situ

первая (n=70)

Группа (абс.%)

15 (21,4%)

25 (35

29 (41,4%)*

1 (1,4%)

вторая (п=40)

9 (22,5%)

25 (62,5%)*

6(15,0%)

*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001 достоверность различий между 1-й и 2-й группами

При анализе результатов жидкостной цитологии определились некоторые особенности фоновых изменений при различных степенях интраэпителиального поражения (таблица 4).

Таблица 4

Фоновые изменения при интраэпителиальных поражениях

Фоновые изменения Группа (абс.%)

первая(п=70) вторая(п=40)

Воспаление 41 (58,6%)* 19 (47,5%)*

Пролиферация цилиндрического эпителия 10 (14,3%) 10(25%)

Дискератоз, гиперкератоз 3 (4,3%) 4 (10,0%)

Без фоновых изменений 16(22,8%) 7(17,5%)

*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001 достоверность различий между 1-й и 2-й группами

Фоновые изменения в мазке имели 77,2% женщин из 1-й группы, 82,5% из 2-й группы. Достоверно чаще в обеих группах встречалась цитограмма воспаления. При проведении корреляционного анализа воспаление в цервикальном мазке коррелировало как с белком р16 (г=0,467; р<0,05) так и белком Е7 (г=0,517; р<0,05), что абсолютно подтверждает роль воспаления как основного фактора, предрасполагающего и сопровождающего CIN.

При сопоставлении данных различных вариантов имуноцитохи-мической экспрессии р16 с гистологическими заключениями пациенток 1-й группы выявлены некоторые особенности (таблица 5). Как

следует из таблицы 5 достоверно чаще позитивная реакция на белок р16 во множественных и единичных клетках встречалась при CIN III (р<0,05). Не установлено ни одного случая CIN III при слабопозитивной реакции на белок р16.

Таблица 5

Сопоставление различных вариантов иммуноцитохимической

экспрессии р!6 с гистологическим заключением

Вариант иммуноцитохимической экспрессии р16 Степень дисплазии

CIN 1 CIN II CIN III

Позитивная реакция на р16 (п=54) 14 9 31*

Позитивная реакция на р16 в единичных клетках (п=10) 1 3 6*

Слабопозитивная реакция на р16 (п=6) 5 1

Изучение уровня экспрессии р16 в биоптатах шейки матки было основано на оценке интенсивности цитоплазматической реакции, полуколичественном определении индекса экспрессии в пределах эпителиального пласта (свыше 50% окраски оценивалось как гиперэкспрессия) и наличия ядерной метки.

В 1-й группе больных с позитивной иммуноцитохимической экспрессией белка р16 более половины пациенток 16 (53,3%) имели выраженную интенсивность цитоплазматической реакции на белок р16 в иммуногистохимическом анализе тканей шейки матки. У 9 (30%) женщин интенсивность цитоплазматической реакции была умеренно выраженная, 5 (16,7%) имели слабоинтенсивную цитоплаз-матическую реакцию. Слабоинтенсивная цитоплазматическая реакция на белок р 16 в гистологических срезах наблюдалась в группе со слабопозитивной иммуноцитохимической реакцией. Во 2-й группе с негативной иммуноцитохимической реакцией на белок р16 цитоплазматической реакция при иммуногистохимическом исследовании белка р16 в ткани в большинстве случаев отсутствовала или была умеренно- и слабо интенсивной.

Высокий индекс экспрессии белка р16 (более 50% эпителиального слоя) достоверно преобладал в 1-й группе (р<0,05), где у 19 (63,3%) пациенток иммуногистохимическая окраска на белок р16 занимала весь эпителиальный пласт. У 11 (36,7%) пациенток наблюдалась окраска эпителиального пласта менее 50%, но имела диффузный характер. Как правило, окраска 1\3 эпителиального пласта соответствовала гистологическому диагнозу CIN I, окраска половины - гисто-

логическому диагнозу CIN II. Во 2-й группе с негативной иммуноци-тохимической реакцией на белок р16 экспрессии р16 в биоптате не наблюдалась в 11 (50%) случаев. У 5 (25%) индекс экспрессии р16 был низкий (менее 50% эпителиального слоя) и имел очаговый характер (таблица 6).

Таблица 6

Иммуногистохимические признаки pl6ink4a в эпителии шейки матки больных с CIN

Признак Группа

первая (п=30) вторая (п=20)

Интенсивность реакции: - слабая (0-1 балл) - умеренная (2 балла) - выраженная (3 балла) 5(16,7%) 9(30%) 16(53,3%)* 14(70%)* 2(10%) 4(20%)

Индекс экспрессии: нет экспрессии (0 баллов) менее 50% (1 балл) более 50% (2 балла) 0 11(36,7%) 19(63,3%)* 11(55%)* 5(25%) 4(20%)

Наличие ядерной метки: негативная (0 баллов) единичная(1 балл) множественная (2 балла) 1(3,3%) 8(26,7%) 21(70%)* 12(60%)* 4(20%) 4(20%)

*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001 достоверность различий между 1-й и 2-й группами

Множественная ядерная метка достоверно превалировала в 1-й группе пациенток (р<0,05), она была выявлена у 20 (70%) женщин, негативная метка была у 1 (3,3%) пациентки, единичная ядерная метка выявлена у 8 (26,7%) женщин. Негативная и единичная ядерная метка встречалась при слабопозитивной иммуноцитохимической реакции на белок р16, что позволяет предположить обратимость данной стадии процесса неоплазии и возможности проведения консервативной терапии у данной группы пациенток. Среди женщин 2-й группы ядерная метка была негативна у 12 (60%) женщин, единичная ядерная метка у 4 (20%) пациенток. При проведении корреляционного анализа выявлена связь между яркопозитивной иммуноцитохимической экспрессией р16 с выраженной интенсивностью цитоплазматической реакции на белок р16 в иммуногистохимическом анализе тканей шейки (г=0,767; р<0,05), с высоким индексом экспрессии (50% и бо-

лее эпителиального пласта) (г=0,47; р<0,05), с множественной ядерной меткой (г=0,85; р<0,05), с диффузной иммуногистохимической окраской (г=0,75; р<0,05). Это доказывает высокую информативность как иммуноцитохимического так и иммуногистохимического метода определения белка pió.

При комплексной оценке иммуногистохимического индекса были получены следующие данные (таблица 7). В 1-й группе женщин с позитивной иммуноцитохимической экспрессией белка pió достоверно преобладала оценка иммуногистохимического индекса 4 и более баллов (р<0,05), 6 пациенток имели оценку 2-3 балла, оценка в 0-1 балл не была выявлена. Во 2-й группе с негативной иммуноцитохимической экспрессией белка р16 достоверно преобладала оценка иммуногистохимического индекса 0-1 балл. 12 (60%) женщин имели оценку 0-1 балл, 4 (20%) - 2-3 балла, 4 пациентки имели оценку в 4 и более балла. Корреляционный анализ позволил установить связь белка Е7 с уровнем иммуногистохимического индекса 0-1 балл (г=0,36; р<0,05), связь иммуноцитохимической экспрессии белка р16 с уровнем иммуногистохимического индекса 4 и более баллов (г=0,67; р<0,05), что подтверждает большую значимость онкопротеина р 16 в оценке прогрессирования цервикальной интраэпителиальной неопла-зии и белка Е7 как маркера начального этапа развития неоплазии.

Таблица 7

Уровень иммуногистохимического индекса р16

в эпителии шейки матки у больных с CIN_

Баллы Группа

первая (п=70) вторая (п=40)

0-1 балл - 12 (60%)*

2-3 балла 6 (20%) 4 (20%)

4 и более баллов 24 (80%)* 4 (20%)

*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001 достоверность различий между 1-й и 2-й группами

Особое внимание обращают на себя женщины из 2-й группы, имеющие отрицательную иммуноцитохимическую реакцию на белок р16 и резко положительную иммуногистохимическую реакцию на этот же белок в ткани. Были выявили характерные признаки данной категории пациенток: фоновые изменения в цервикальном образце в виде гиперкератоза и дискератоза, атипическую кольпоскопическую картину в виде лейкоплакии или плотного ацетобелого эпителия,

большая зона поражения шейки матки. Вероятно, что слой ороговевших клеток на поверхности эпителия шейки матки препятствует адекватной цитологической оценке цервикального мазка и иммуноцито-химической реакции на белок р!6.

Совершенно очевидно, что при морфологическом исследовании ткани шейки матки целесообразно проведение иммуногистохимиче-ского исследования белка р16, как наиболее достоверного маркера прогрессирования цервикальной интраэпителиальной неоплазии.

При анализе обмена метаболитов эстрогенов отмечено повышение уровня пролиферативно-активного метаболита 16а-ОНЕ1 в первой группе до 19,13±2,83 нг/мл, во 2-й до 11,62±1,25 нг/мл, в группе контроля до 11,66±0,76 нг/мл. Таким образом у женщин 1-й группы, с позитивной реакцией на белок р16 уровень метаболита 16а-ОНЕ1 достоверно превышал аналогичный показатель у больных, не экс-прессирущих р16 и здоровых женщин (р<0,05).

Уровень пролиферативно-нейтрального метаболита 2-ОНЕ1 в 1-й группе составил 13,1±044 нг/мл, во 2-й - 12,17±1,11 нг/мл, в группе здоровых - 25,06±0,53 нг/мл. Очевидно, что уровень 2-ОНЕ1 в основных группах был снижен в 1,9 и 2 раза соответственно по сравнению с группой здоровых.

Соотношение метаболитов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 в 1-й группе привело к резкому снижению показателей до 0,86±0,1, во 2-й - 1,09±0,13, у здоровых женщин - 2,18±0,13. Таким образом уменьшение соотношения 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 выявлено у всех пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, что соответствует имеющимся данным о важной роли нарушения обмена эстрадиола в ВПЧ-зависимом канцерогенезе.

Учитывая результаты гистологического, иммуноцитохимиче-ского и иммуногистохимического исследования, мы выделили пациенток из 1-й и 2-й группы, которым была показана комбинированная терапия, т.е. сочетание хирургического и лекарственного лечения и женщин, которым проводилось консервативное лечение противовирусными и иммуномодулирующими препаратами.

Всем больным с положительной иммуноцитохимической и им-муногистохимической (иммуногистохимический индекс более 3 баллов) реакцией на белок р16, независимо от степени тяжести CIN (CIN I у 4(5,7%), CIN II у 12 (17,1%), CIN III у 49 (70%) женщин) проведена комбинированная терапия - эксцизия шейки матки с лекарственным лечением.

Только лекарственное консервативное лечение применено у 36 женщин с положительным белком Е7, но отрицательной реакцией на р16, а также пяти больным с CIN I и одной - с CIN II, имеющим слабопозитивный иммуноцитохимический тест на р16 и иммуногисто-химический индекс менее 3 баллов.

В качестве хирургического лечения использовали конусовидную или петлевую электроэксцизию в зависимости от степени CIN, возраста женщины и зоны поражения.

Результаты морфологического анализа удаленной части шейки матки подтвердили диагноз CIN II и CIN III у всех женщин, у пациенток с CIN I в биоптате у 4 выявили CIN III, что доказывает необходимость выполнения эксцизии при яркопозитивной реакции белка р16 даже на фоне нетяжелых форм CIN.

В качестве лекарственной терапии использовали комбинацию препаратов: индол-3-карбинол по 2 капсулы 2 раза в течение 6 месяцев, 2 курса инозина пронабекса в дозе 0,5 мг\кг массы тела (3-4 г/день) в течение 10 дней с интервалом 20 дней, местное лечение Па-навир-гелем интравагинально 14 дней.

Через 6 месяцев в группе пациенток с комбинированной терапией при контрольном осмотре наблюдалась нормализация кольпоско-пических картин в 97% случаях, элиминация вирусной инфекции в 97% случаев, нормализация цитологической картины в 100% случаях, исчезновение белка Е7 в 93% случаев, белок р16 не определялся ни у одной больной.

В группе пациенток с лекарственной терапией сохранились нерезко выраженные аномальные кольпоскопические картины без негативной прогрессии, в 61,5% случаев достигнута элиминация вируса, у 95% пациенток нормализовалась цитологическая картина, исчезновение белка Е7 отмечено в 57% случаев. Эти больные продолжают наблюдаются в диспансерной группе. У 2 пациенток со слабопозитивной иммуноцитохимической реакцией на белок р16 отмечено сохранение белка р16 в виде яркого позитива, им проведена эксцизия, где выявлена CIN И.

Была рассчитана прогностическая значимость исследуемых он-кобелков Е7 и pl6ink4a для оценки их чувствительности и специфичности в прогнозе прогрессирования CIN (таблица 8).

Наибольшей чувствительностью (98,9%) и специфичностью (97,6%) обладает белок р16 при иммуногистохимическом исследовании в тканях, позитивная иммуноцитохимическая реакция белка р16

также имеет высокую чувствительность (94%) и специфичность (85,7%). Определение белка Е7 является чувствительным методом (84%), однако обладает низкой специфичностью (48%). Совместное определение белка р16 и Е7 может повысить специфичность тестов до 91%.

Таблица 8

Прогностическая значимость онкобелков Е7 и pl6ink4ct у больных с цервикальной интраэпителиальной неоплазией

Метод Чув- Специ Прогностическая

стви- цифич ценность результата

тель- фич- положи- отрица-

ность ность тельного тельного

Иммуноцитохимия белка р16 94% 85,7% 91% 90%

Иммуногистохимия белка р16 98,9% 97,6% 98,3% 98%

Белок Е7 84% 48% 52% 86%

Совместное определение бел- 94% 91% 91% 91%

ка р16 и белка Е7

Был рассчитан коэффициент соотношения шансов для исследуемых нами клинических тестов, который позволил определить риск развития цервикальной интраэпителиальной неоплазии III степени (таблица 9).

Таблица 9

Факторы, ассоциированные с повышенным риском CIN III

Наличие фактора Повышенный риск развития CIN III

Инфицированность ВПЧ 16 типа OR=3,15; 95% CI: 1.56986 до 6.31319

Иммуногистохимия белка р16 OR=62,43; 95% CI: 8.91939 до 437.004.

Иммуноцитохимия белка р16 OR=l 1,19; 95% CI: 5.19556 до 24.1165.

Наличие белка Е7 OR=5,78; 95% CI: 0.841138 до 39.7305

Сочетание ИЦХ р16 и белка Е7 OR=6,2; 95% CI: 1.69456 до 10.4098

Как показал рассчитанный коэффициент соотношения шансов, повышенный риск развития CIN III в наименьшей степени ассоциирован с ВПЧ 16 типа и наличием белка Е7. Наиболее высокое значение показателей относительного риска развития CIN III имеют жен-

щины, у которых определяется белок р16 иммуногистохимическим способом (OR=62,43) и в меньшей степени иммуноцитохимическим методом (OR= 11,19).

Выводы

1. Для ВПЧ - ассоциированных цервикальных интраэпители-альных неоплазий характерно преобладание ВПЧ 16 типа. У женщин с позитивной реакцией на белки р16 и Е7 в эпителии шейки матки вирус обнаружен как моноинфекция у 65,7% женщин, при негативным тесте на р16, но позитивном на Е7 - в 47,5% случаев. Ассоциация с 18,31,33,52,39 типами наблюдалась в 12,8% случаев при наличии двух белков, в 17,5% случаев при наличии только Е7. Наряду с общими факторами риска развития CIN к особенностям характеристики персистирующей ВПЧ инфекции следует отнести более ранний возраст (29,8±1,1), когда отмечается экспрессия Е7, тогда как появление белка р16 характерно в 33±1,4 года, чаще у женщин, использующих КОК более 2 лет. Выделение белка Е7 ассоциировано с невыраженными кольпоскопическими изменениями шейки матки, белка р16 с выраженными аномальными кольпоскопическими картинами - плотным ацетобелым эпителием, грубой мозаикой, пунктуацией.

2. Яркопозитивная иммуноцитохимическая экспрессия белка р16 морфологически ассоциирована с CIN II или с CIN III, слабопозитивная с CIN I. В 90% случаев иммуногистохимическое выявление белка р16 в биоптате шейки матки совпадает с результатами иммуно-цитохимических исследований, у 10% женщин с гиперкератозом эпителия шейки матки возможна ложноотрицательная иммуноцитохимическая реакция. Чувствительность и специфичность онкобелков в оценке риска развития и прогрессии дисплазии составляет для белка Е7 84% и 48% соответственно, для белка р16 - 94% и 85,7% при им-муноцитохимическом исследовании и 98,9% и 97,6% при иммуноги-стохимическом выявлении.

4. У всех женщин с цервикальной интраэпителиальной неопла-зией выявлено нарушение обмена эстрогенов - стойкое снижение показателей соотношения метаболитов эстрадиола 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 за счет преобладания «агрессивного» метаболита 16а-ОНЕ1. У пациенток, позитивных на белок р16 и Е7 показатель соотношения метаболитов 2-ОНЕ1/16а-ОНЕ1 наименьший - 0,86±0,1, при отрицательном белке р16 - 1,09±0,13, что в 2 раза ниже, чем у здоровых женщин.

5. Выявление у больных с цервикальной интраэпителиальной

неоплазией позитивной реакции на белок pió в сочетании с Е7 или без него требует применения деструктивных методов лечения, объем которых зависит от степени тяжести CIN, возраста женщины. При определении белка Е7 с негативной реакцией на белок р16 возможно проведение консервативной противовоспалительной и противовирусной терапии при CIN I, CIN II. Верификация CIN III требует деструктивных методов лечения.

Практические рекомендации

1. У больных с диагностированной CIN I и CIN II необходимо иммуноцитохимическое исследование белка pl6ink4a и Е7 для определения тактики лечения.

2. При выявлении онкобелка pl6ink4a и наличия CIN любой степени тяжести рекомендовать больной деструктивные методы, объем которых зависит от возраста и тяжести CIN. При отрицательном pl6ink4a, но положительном Е7 в случаях CIN I и CIN II показана консервативная терапия противовоспалительными и противовирусными препаратами, при CIN III только деструктивная терапия.

3. Отрицательный иммуноцитохимический результат на белок pl6ink4a при наличии аномальной кольпоскопической картины требует исследования белка в биоптате ткани шейки матки, выявление которого может изменить тактику лечения.

4. В комплексе лечения больных с цервикальной интраэпители-альной неоплазией даже при деструктивном лечении необходима коррекция нарушенного обмена эстрогенов препаратами индол-3-карбинол не менее 6 месяцев.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Ахметзянова A.B. Применение жидкостной цитологии и имуноцитохимии онкомаркера pió ink4a в диагностике дисплазий и рака шейки матки / A.B. Ахметзянова, Г.А. Раскин, C.B. Петров, Л.И. Мальцева, Л.Н. Фаррахова, A.B. Панов, Р.Ш. Хасанов II Материалы научного симпозиума по онкологии с международным участием «Современные тенденции в диагностике и лечении органов репродуктивной системы у женщин». - Кишинев, 2008. - С. 31-32.

2. Ахметзянова A.B. Белок р16 ink4a в диагностике дисплазий и неинвазивного рака шейки матки / A.B. Ахметзянова, Л.И. Мальцева, C.B. Петров, Г.А. Раскин, Р.Ш. Хасанов Н Материалы VII съезда онкологов России. - М., 2009. - С.40.

3. Ахметзянова A.B. Иммуноцитохимическое исследование pió ink4a на основе жидкостной цитологии в диагностике эпителиальных дисплазий шейки матки / A.B. Ахметзянова, Л.И. Мальцева, C.B. Петров, Г.А. Раскин, JI.H. Фаррахова, A.B. Панов, Р.Ш. Хасанов // Материалы III международного конгресса по репродуктивной медицине. - М., 2009. - С. 354-55.

4. Ахметзянова A.B. Иммуноцитохимическое исследование р16 ink4a на основе жидкостной цитологии в диагностике эпителиальных дисплазий шейки матки и неинвазивного рака шейки матки / A.B. Ахметзянова // Тез. докл. научно-практ. конференция молодых ученых. - Казань, 2009. - С. 152

5. Мальцева Л.И. Применение жидкостной цитологии и им-муноцитохимического определения онкомаркера pió ink4a для скрининга, диагностики и выбора тактики лечения заболеваний шейки матки: методические рекомендации / Л.И. Мальцева, К.Ш. Зыятди-нов, Г.А. Раскин, C.B. Петров, Л.Н. Фаррахова, A.B. Ахметзянова. -Казань, 2009. - С. 9-10

6. Раскин Г.А.Эффективность использования жидкостной цитологии в сочетании с иммуноцитохимнческим исследованием pl6ink4a в сравнении с традиционной цитологией и ПЦР-анализом ВПЧ высокого онкогенного риска в диагностике дисплазий и рака шейки матки / Г.А. Раскин, C.B. Петров, Р.В. Орлова, Л.И. Мальцева, A.B. Ахметзянова, JI.H. Фаррахова, Р.Ш. Хасанов // Вопросы онкологии. - 2009. - т. 55, №2. - С.192-195.

7. Ахметзянова А.В Белок р16 ¡пк4ав диагностике эпителиальных дисплазий и неинвазивного рака шейки матки / A.B. Ахметзянова, C.B. Петров, Л.И. Мальцева, Г.А. Раскин, Р.Ш. Хасанов // Научно-практ. конференция с международным участием «Совершенствование медицинской помощи при онкологических заболеваниях, включая актуальные проблемы детской гематологии и онкологии». Материалы VII съезда онкологов России. В 2-х томах. - М.: Издательский дом «Кодекс», 2009. - С. 276.

8. Ахметзянова A.B. Белок р16 ink4a в диагностике церви-кальных интраэпителиальных неоплазий и неинвазивного рака шейки матки / A.B. Ахметзянова, H.A. Нигматулина // Материалы научно-практ. конференции молодых ученых Приволжского федерального округа с международным участием «Молодые ученые в медицине». -Казань, 2011.-С. 84.

9. Нигматуллина H.A. Использование препаратов - произвол-

ных дезоксирибонуклеиновой кислоты в комплексном лечении пер-систирующей формы ВПЧ инфекции / H.A. Нигматуллина, Н.В. Яковлев, A.B. Ахметзянова // Материалы XVI Всероссийской научно-практ. конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2011. -С.84-85.

10. Ахметзянова A.B. Онкобелки Е7 и р16 ink4a в диагностике цервикальной интраэпителиальной неоплазии / A.B. Ахметзянова, H.A. Нигматулина // Материалы Всероссийского Конгресса с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика - в эпицентре женского здоровья». - М., 2012. - С. 154-155.

11. Мальцева Л.И. Оценка риска злокачественной трансформации эпителия шейки матки при ВПЧ-ассоциированном цервиците / Л.И. Мальцева, JI.H. Фаррахова, A.B. Ахметзянова, H.A. Нигматулина // Вопросы гинекологии, акушерства и пери-натологии (М.). - 2012. - т. 11. - №4. - С.53-57.

12. Мальцева Л.И. Цервикальная интраэннтелиальная не-оплазия: возможности диагностики и лечения (обзор литературы) / Л.И. Мальцева, A.B. Ахметзянова, Л.Н. Фаррахова, H.A. Нигматулина // Практическая медицина. - Казань, 2012. - №9 (65). -С.122-128.

Подписано в печать 23.11.2012г. Формат 60x84Vi6. Печатных листов 1. Бумага офсетная, тираж 100. Заказ Н-112. Отпечатано в

г. Казань, ул. Муштари, 11, тел. 259-56-48. E-mail: meddok2005@mail.ru