Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Клиническое значение мониторинга минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе

На правах рукописи

Челышева Екатерина Юрьевна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОНИТОРИНГА МИНИМАЛЬНОЙ ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ

14 00 29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва, 2007

003060378

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Научные руководители доктор медицинских наук А Г Туркина кандидат биологических наук А В Мисюрин

Официальные оппоненты Доктор медицинских наук, профессор А А Масчан Доктор биологических наук, профессор Н И Дризе

Ведущее научное учреждение Московский областной научно-исследовательский клинический институт им М.Ф Владимирского

Защита состоится "20" июня 2007 г в 14 час на заседании диссертационного Совета Д 001 042 01 в Государственном учреждении

Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук по адресу Москва, Новозыковский проезд, д 4а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук

Автореферат разослан "17" мая 2007 года

Ученый секретарь диссертационного Совета

кандидат медицинских наук Е Е Зыбуновэ

Актуальность темы исследования

Хронический миелолейкоз (XMJ1) - клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия — «филадельфийская хромосома», РЬ'хромосома (в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами образуется химерный онкоген BCR-ABL) На момент установления диагноза XMJI в костном мозге при кариологическом анализе выявляется 95-100% Ph'-положительных клеток

Современная терапия препаратами интерферона-альфа (ИФН-альфа) и ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниб мезилат) позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона и восстановления нормального кроветворения, что приводит к увеличению выживаемости больных (Н Kantarjian, 1995, Т Hudges, 2003) Полный цитогенетический ответ (ПЦО), при котором у пациентов определяется восстановление нормального кариотипа и не выявляется РЬ'хромосома, является стандартным критерием эффективности терапии у больных ХМЛ

При лечении иматинибом вероятность получить ПЦО через 3 года терапии составляет 40 % у больных в поздней хронической фазе ХМЛ (АГ Туркина, ГА Дружкова, 2005), через 5 лет терапии - у 87% больных в поздней хронической фазе ХМЛ и у 96% больных в ранней хронической фазе ХМЛ (А Ю Зарицкий, Е Г Ломаиа, 2007) При терапии ИФН-альфа получение ПЦО через 1 год терапии отмечено у 14% больных в хронической фазе ХМЛ (международное исследование IRIS, 2006), через 2 года терапи - у 20% (S Faderl, 1999)

Однако у больных с достигнутым ПЦО оказалось возможным обнаружить BCR-ABL положительные клетки при применении более чувствительного молекулярно-биологического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) Стало очевидно, что данных стандартного цитогенетического исследования (чувствительность 1 10"2 клеток) может быть недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию, особенно у пациентов, достигших не только полной клинико-гематологической

ремиссии, но и ПЦО Поэтому для детекции химерного гена BCR-ABL и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) при XMJI целесообразным является использование метода ПЦР Изучение МОБ у больных ХМЛ дает основания определять новые критерии полноты достигнутой ремиссии, распознавать наиботее ранние признаки рецидива заболевания и разрабатывать терапевтические подходы при персистировании остаточной популяции опухолевых клеток

Поэтому вопрос количественной оценки остаточной опухолевой массы и мониторинга МОБ у больных XMJI является актуальным

Использование метода ПЦР в реальном времени (Real-time ПЦР) с чувствительностью КИ-Ю"5 дает возможность количественно охарактеризовать остаточную опухолевую массу у больных ХМЛ по уровню экспрессии гена BCR-ABL и проводить мониторинг МОБ Метод двухстадийной ПЦР обладает большей чувствительностью (1 10 "бклеток) по сравнению с Real-time ПЦР, по является только качественным и не позволяет оценить объем опухолевой массы

Изучение и обобщение информации о результатах молекулярно-биологических методов при мониторинге МОБ у больных ХМЛ послужило основанием для проведения собственных исследований

Цель исследования:

Оценить клиническую значимость молекулярно-биологических методов для детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом

Задачи исследования:

1 Оценить информативность количественного метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным

цитогенетическим ответом при разных видах терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия)

2 Сравнить уровень экспрессии гена BCR-ABL в костном мозге и периферической крови для решения вопроса о возможности использования периферической крови при мониторинге минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом

3 Определить взаимосвязь цитогенетических рецидивов и уровня экспрессии гена BCR-ABL по данным полимеразной цепной реакции в реальном времени у больных хроническим миелолейкозом при терапии иматииибом

4 Оценить взаимосвязь режима терапии и стабильности достигнутого цитогенетического и молекулярного ответа у больных хроническим миелолейкозом при терапии интерфероном-альфа, иматинибом и комбинированной терапии (иматиниб, интерферон-альфа и курсы малых доз цитозара)

5 Оценить частоту выявления остаточного опухолевого клона с помощью наиболее чувствительного метода двухстадийной ПЦР у больных с полным молекулярным ответом по данным количественного метода ПЦР в реальном времени

Научная новизна'

На основе данных молекулярно-биологических методов исследования и данных кариологического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа, терапию иматинибом и комбинированную терапию (иматиниб, интерферон-альфа, курсы малых доз цитозара) Установлено, что при динамическом исследовании экспрессии гена BCR-ABL с помощью метода количественной Real-time ПЦР у большинства (90,4%) больных с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом определяется персистирование остаточного опухолевого клона, что диктует необходимость продолжения терапии

Практическая ценность:

Установлено, что метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени является информативным для детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом На основании сопоставления данных цитогенетического исследования и количественного метода Real-time ПЦР установлен уровень экспрессии гена BCR-ABL, прогностически значимый для возникновения цитогенетического рецидива и уровень экспрессии, ассоциированный со стабильным полным цитогенетическим ответом Установлена возможность исследования периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни, что позволяет оценивать стабильность полученного молекулярного ответа в динамике без применения повторных стернальных пункций Определена схема обследования больных хроническим миелолейкозом при использовании молекулярно-биологических методов исследования

Внедрение результатов в практику

Основные положения диссертационной работы внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона Гематологического научного центра Российской Академии медицинских наук (ГНЦ РАМН) настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Разработка стратегии терапии хронического миелолейкоза» (2003-2007 гг) № 01200301557 Результаты исследований явились основанием для внедрения иматиниба в клиническую практику лечения больных XMJT Полученные в ходе исследования заключения включены в практическое пособие для врачей и методические рекомендации по обследованию и лечению больных XMJI

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ в отечественной и зарубежной литературе

Апробация работы

Работа апробирована 26 02 2007 г на заседании проблемной комиссии ГНЦ РАМН «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология, гемобластозы и депрессии кроветворения»

Основные положения диссертации доложены на Всероссийском декаднике по гематологии (ГНЦ РАМН, апрель 2003 г , апрель 2006 г , апрель 2007 г г Москва)

Объем и структура работы

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, методической главы, главы собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы Библиографический указатель содержит 102 источника литературы Работа иллюстрирована 10 таблицами и 35 рисунками

Диссертация выполнена в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона (руководитель-д м н , профессор Н Д Хорошко) ГНЦ РАМН (директор — академик РАН и РАМН А И Воробьев) совместно с лабораторией генной инженерии ГНЦ РАМН (руководитель- к б н А В Мисюрин), а также при участии сотрудников других подразделений ГНЦ РАМН

Цитогенетические исследования проводились в кариолопической лаборатории ГНЦ РАМН (руководитель- д м и , профессор Е В Домрачева) Лечение пациентов осуществлялось в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ РАМН, поликлиническом отделении ГНЦ РАМН (руководитель - профессор Л Г Ковалева), стационаре дневного пребывания (руководитель - к м н Н Н Цыба) Статистическая обработка данных производилась совместно с лабораторией медицинской статистики ГНЦ РАМН (руководитель - к т н СМ Куликов)

За коллегиальную помощь и содействие в проведении работы автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам отделений и лабораторий проф Н Д Хорошко, проф Е В Домрачевой, д м н А Г Туркиной, д м н, проф. Л Г Ковалевой, к б н А В Мисюрину, к т н СМ Куликову, к м н А В Захаровой, к м н ГА Дружковой, к м н С С Круглову, к м н ЕС Захаровой, к м н ЕМ Абакумову,

к м н ВС Журавлеву, к м н О Ю Виноградовой, к м н М А. Соколовой, к м н Т И Колошейновой, к м н Л Ю Колосовой, кмн С Р Горячевой, к м н ТВ Ивановой, к м н М В Вахрушевой, к м н Н Н Цыбе, Е В Аксеновой, Е Н Лисовской, С М Кругловой , И С Немченко, С В Кузнецову

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика больных

Материалом для данной работы являются результаты клинических и лабораторных исследований 83 пациентов с хронической фазой (ХФ) РЬ'-положительного ХМЛ, наблюдавшихся в отделении химиотерапии лейкозов и патологии эритрона, поликлиническом отделении и стационаре дневного пребывания ГНЦ РАМН в период с июня 2000 г по сентябрь 2006 г

Особенностью всех включенных в исследование пациентов быто получение на фоне проводимой терапии 1) полной клинико-гематологической ремиссии, 2) большого и полного цитогенетического ответа Следует отметить, что 63,9% пациентов было из благоприятной, 1-ой группы риска (критерии ГНЦ РАМН 1998 г)

Соотношение мужчины женщины составило 39 44 Медиана возраста 41 год (от 10 до 70 лет) Медиана длительности заболевания составляла 42 мес (от 6 до 108 мес ) 47 (57%) больных было в ранней ХФ ХМЛ (длительность заболевания менее 12 мес на момент начала специфической терапии), 36 (43%) больных - в поздней ХФ ХМЛ (длительность заболевания более 12 мес ) В исследование были включены

1 19 больных в ранней ХФ ХМЛ, получавших терапию ИФН-альфа в расчетной дозе 5 МЕ/м2 У 8 из них за время наблюдения периодически дополнительно проводились курсы малых доз цитозара (20 мг х 2 раза в день подкожно в течение 10 дней ежемесячно), медиана наблюдения 66 мес

2 53 больных, получавших лечение иматинибом в дозе 400 мг ежедневно в качестве II линии терапии после неудачи терапии ИФН-альфа, медиана наблюдения

48 мес Большинство больных в этой группе (67,9%) были в поздней ХФ, 32,1 % - в ранней ХФ XMJ1

3 11 больных в ранней ХФ XMJI, которым проводилась комбинированная с иматинибом терапия (далее - комбинированная терапия) В качестве индукционной терапии эти больные получали иматиниб в дозе 400 мг ежедневно в сочетании с ежемесячными курсами малых доз цитозара, а после достижения ПЦО - иматиниб в дозе 400 мг ежедневно в сочетании с поддерживающими дозами ИФН-альфа (3 ME через день либо 50 мкг 1 раз в неделю при использовании пролонгированных форм препарата), медиана наблюдения 36 мес

Модификация доз препаратов

Изменение доз препаратов производилось в зависимости от ответа на терапию (под которым подразумевалась клинико-гематологическая ремиссия, цитогенетический ответ), а также от степени токсичности терапии (критерии токсичности NCI/NIH -National Cancer Institute, Bethesda. Cancer Therapy Evaluation program Common toxicity criteria, version 2 0, March 1998)

Перерывы в терапии ИФН-альфа осуществляли при развитии негематологической и/или гематологической токсичности 3-4 степени После уменьшения токсичности до степени < 2 введение ИФН-альфа возобновляли в той же дозе Редукцию дозы на 30% и 50% проводите при длительной (более 2 недель) гематологической токсичности, повторных эпизодах развития негематологической токсичности >2 степени

Перерывы в терапии иматинибом производили при развитии негематологической токсичности 3-4 степени, а также при развитии нейтропении или тромбоцитопении 3-4 степени После уменьшения токсичности до степени < 2 прием препарата возобновляли в прежней дозе (400 мг/сут) Если перерыв в лечении составлял более 2 недель, отмечались повторные эпизоды гематологической токсичности >2 степени, дозу иматиниба снижали до 300 мг/сут

При проведении комбинированной терапии снижение дозы ИФН-альфа было нецелесообразным, так как в схеме использовалась минимальная поддерживающая доза. При гематологической и негематологической токсичности 3-4 степени

производилось временное прерывание терапии ИФН-альфа, после купирования явлений токсичности введение ИФН-альфа возобновляли

Повышение дозы иматиниба до 600 и 800 мг/сут предусматривалось при развитии гематологической или цитогенетической резистентности При развитии гематологической или цитогенетической резистентности на фоне терапии ИФН-альфа больных переводили на терапию иматинибом

Методы исследования

Цитогенетическое исследование клеток костного мозга было выполнено в кариологической лаборатории ГНЦ РАМН (руководитель д м н, профессор Е В Домрачева) В 87% случаев проводилось стандартное цитогенетическое исследование -прямым методом и методом культивирования клеток с равномерной и G-дифференциальной окраской хромосом (G-banding) В 13% случаев, при недостаточном количестве метафаз (<15), был использован метод флуоресцентной гибридизации m situ (FISH)

Молекулярно-генетическое исследование костного мозга и периферической крови методами двухстадийной ГЩР и Real-time ПЦР проводилось автором работы совместно с научными сотрудниками лаборатории генной инженерии ГНЦ РАМН (руководитель к б н А В Мисюрин) Двухстадийная (nested) ПЦР

Амплификацию проводили в два этапа, с двумя парами праймеров (ПЦР I и ПЦР II) с использованием прибора "PCR sprint thermal cycler" (Hybaid) Нуклеотидные последовательности праймеров указаны в таблице 1

Таблица 1 Нуклеотидные последоватетьности праймеров для двухстадийной ПЦР

Этап ПЦР Последовательность (от 5' к 3' концу) Описание

ПЦР I 12Ы TCT-GAC-TAT-GAG-CGT-GCA-GA BCR прямой

ПЦР I 3Ball AGT-GTT-GAT-CCT-GTA-ATG-GT ABL обратный

ПЦР II Dl GGA-GCT-GCA-GAT-GCT-GAC-CAA-C В CR прямой

ПЦР II ЗВа12 GAC-CAG-ATA-CTC-AGC-GGC-ATT-G ABL обратный

Анализ продуктов ПЦР выполняли с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле Фрагменты, соответствовавшие Ь3а2 типу мРНК BCR-ABL, имели длину 494 п н , типу Ь2а2 - 419 п н.

Количественная Real-time ПЦР

Количественное определение экспрессии гена BCR-ABL проводилось методом Real-time ПЦР по технологии TaqMan с использованием прибора ICycIer IQ (BioRad), в соответствии в основными рекомендациями протокола EAC (European Anti Cancer Program, 2003)

В качестве контрольного (housekeeping) гена использовали ген Р2 микроглобулина ф2М) Для каждого образца проводились 2 независимые ПЦР-реакции для количественного определения BCR-ABL и Р2 микроглобулина Экспрессия генов BCR-ABL и р2 микроглобулина определялась в виде числа копий транскрипта. Окончательный результат относительной экспрессии выражали в виде соотношения

число копий BCR-ABL

х 107

число копий Р2 микроглобулина

Эмпирический коэффициент 107 был введен для удобства представления результатов Количество копий в исследуемых образцах определяли по отношению к стандартной калибровочной кривой, построение которой производилось с помощью прибора Real-time ПЦР на основании серии 10-кратных разведений плазмиды с известным количеством копий в 1 мкл В качестве положительного контроля использовались плазмиды pGEM-T, содержащие клонированные фрагменты генов BCR-ABL и Р2 микроглобулина

Нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов, использованных при проведении Real-time ПЦР, представлены в таблице 2

Таблица 2 Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для Real-time ПЦР

Название Последовательность (от 5' к 3' концу) Описание

ENF501 TCC-GCT-GAC-CAT-CAA-TAA-GGA BCR3K30H 13, прямой

ENR561 CAC-TCA-GAC-CCT-GAG-GCT-CAA ABL экзон 2, обратный

ENP541 FAM-CCC-TTC-AGC-GGC-CAG-TAG-C AT-CTG-A-BHQ1 ABL флуоресцентный зонд

ENF-1302 GAG-TAT-GCC-TGA-CGT-GTG ß2 М, прямой

ENR-1362 AAT-CCA-AAT-GCG-GCA-TCT ß2 М, обратный

ENPr FAM-CTC-CAT-GAT-GCT-GCT-TAC-ATG-TCT-C-BHQ1 Р2М флуоресцентный зонд

Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета SPSS v 13 0 и включала в себя определение медианы, минимальных и максимальных значений, коэффициента корреляции Для оценки достоверности различий применялись критерии X2 Проведение статистического анализа проводилось совместно с лабораторией медицинской статистики ГНЦ РАМН (руководитель — к т н Куликов С.М )

Критерии оценки эффективности терапии и основные определения

Полная клинико-гематологическая ремиссия (ГГКГР) — состояние кроветворной ткани, при котором в пунктате костного мозга обнаруживается <5% бластных клеток при нормальном соотношении всех ростков кроветворения, при количестве нейтрофилов в периферической крови 1,5х109/л, тромбоцитов>100х109/л и отсутствии экстрамедуллярных очагов лейкемического роста

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) — это остаточная популяция опухолевых клеток, выявить которую у больных XMJI с полной клинико-гематологической ремиссией возможно только с помощью цитогенетических и высокочувствительных молекулярно-генетических методов

Цитогенетический ответ (ЦО) определяли по содержанию Ph'-положительных клеток в пунктате костного мозга. При этом выделяли 1) полный цитогенетический ответ (ПЦО) - 0% Ph'-положительных клеток, 2) частичный цитогенетический ответ (ЧЦО) - 1-35% Ph'-положительных клеток, 3) малый цитогенетический ответ (МЦО) - 36-95% Ph'-почожительных клеток, 4) отсутствие цитогенетического ответа - 95-100% Ph'-положительных клеток ПЦО и ЧЦО были объединены под названием большой цитогенетический ответ (БЦО)

Стабильный ПЦО - отсутствие Ph'-положительных клеток по данным цитогенетического исследования на протяжении всего периода наблюдения

Нестабильный ПЦО - персистирование Ph'-положительных клеток в пределах I-35% по данным однократного цитогенетического исследования и восстановление ПЦО по данным повторного исследования

Цитогенетический рецидив - увеличение процента Ph'-положительных клеток более, чем на 30%, подтвержденное в двух последовательных анализах

Молекулярный ответ (МО) - уровень экспрессии гена BCR-ABL по данным Realtime ПЦР

Большой молекулярный ответ (БМО) отмечали при снижении экспрессии гена BCR-ABL на 3 и более lg (те более, чем в 1000 раз) по сравнению с начальным базальным уровнем экспрессии

Полный мочекулярный ответ (ПМО) - отсутствие исходно определявшейся экспрессии гена BCR-ABL по данным количественного метода Real-time ПЦР

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Характеристика цитогенетического ответа на разных видах терапии Важнейшей задачей при терапии ХМЛ является восстановление Ph'-негативного кроветворения как фактора длительной выживаемости больных В исследуемой группе больных за время наблюдения у всех пациентов было отмечено получение БЦО и/или ПЦО

Достоверно более поздние сроки достижения ГТЦО были отмечены отмечены в группе больных, получавших терапию ИФН-альфа (рисунок 1) по сравнению с больными, получавшими лечение иматинибом и комбинировать'го терапию (р<0.05).

Рис.1 Получение полного цитогенетического ответа у больных в хронической фазе ХМЛ на разных видах терапии (п=83).

Достоверно более высокая частота получения ПЦО была отмечена к 6 мес. терапии при проведении комбинированной терапии (р=0,002), однако к году наблюдения пропент ПЦО был практически одинаковым н группе больных, получавших монотерапию иматинибом и у больных, получавших комбинированную терапию (таблица 3). Поэтому есть основания считать, что по срокам получения ПЦО комбинированная терапия не имеет значительных преимуществ по сравнению с монотерапией иматинибом на первом году терапии.

Таблица 3, Получение полного цито генетического ответа на первом году терапии у больных в хронической фазе ХМЛ в зависимости от вида терапии (п=83).

Вид терапии Число больных, достигших ПЦО к 6 мес.(%) Число больных, достигших ПЦО к 12 мес. {%}

И нтерф срои -альф а (п=19) г!»0/»1) 1 (47,3%)

Иматиииб (п=53) 25 (46%) 38 (71%)

Комбинированная терапия (п=1 ¡) 8 (72,7%) 8 (72,7%)

Как видно из представленных данных (таблица 4), достоверно более высокая частота стабильных ПЦО была отмечена при проведении комбинированной терапии у больных в ранней ХФ ХМЛ по сравнению с больными получавшими терапию ИФН-альфа и иматиниб в качестве II линии терапии (р=0,002) Достоверных различий по частоте нестабильных ЦО и цитогенетических рецидивов в трех группах больных не было выявлено (р>0,05)

Таблица 4. Стабильность цитогенетического ответа у больных в хронической фазе ХМЛ в зависимости от вида терапии (п=83)

число больных (%) Медиана наблюдения

Вид терапии стабильный ЦО нестабильный ЦО цитогенетический рецидив

Интерферон-альфа (п= 19) 1 (5,3%) 9 (47,3%) 9 (47,3%) 66 мес

Иматиниб (п=53) 22 (41,5%) 16 (30,2%) 15 (28,3%) 48 мес

Комбинирован ная терапия (п=11) 7 (63,6%) 1 (9,1%) 3 (27,3%) 36 мес

При анализе возможных причин цитогенетических рецидивов было установлено, что во всех трех группах больных цитогенетические рецидивы возникали как при развитии резистентности на фоне стандартных расчетных доз, так и при снижении доз и/или перерывах в терапии Достоверных различий выявлено не было (р=0,4)

Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью двухстадийной ПЦР

До применения количественного метода Real-time ПЦР многие исследователи (R Kurzrock, HKantarjian, М Talpaz, 1991-1995) использовали качественный метод двухстадийной ПЦР для мониторинга МОБ у больных ХМЛ В нашей работе изначально мониторинг МОБ также проводился с помощью этого метода Было

произведено 55 исследований у 19 больных, получавших терапию ИФН-альфа, на сроках терапии от 6 до 72 мес. (медиана 54 мес.). У всех больных на фоне проводимой терапии была получена полная кл и 5 ш ко - гемато л о ги ч еская ремиссия, а также БЦО и ПЦО.

Отрицательные результаты двухстадийной ПЦР, при которых экспрессия гена ВСН-АВЬ не была выявлена, были отмечены хотя бы однократно у 12 (63%) из 19 больных. Как видно из представленных данных (рисунок 2), было отмечено увеличение частоты отрицательных результатов 11ЦР на поздних сроках наблюдения.

Однако эти результаты не были стабильными; при дальнейшем динамическом наблюдении у всех больных была выявлена МОБ. При этом у 8 из 12 больных потеря отрицательных результатов была отмечена на фоне снижении расчетных доз ИФН-альфа или перерывах в терапии.

до 12 мес. 12-24 мес. 24-36 мес 36- 48 мес. 48-60 мес. более GO срок терапии мес

Рис, 2 Отрицательные результаты двухстадийной ПЦР при терапии интерфероном-альфа у больных с хронической фазой XMJI (п=19).

Таким образом, учитывая нестабильность полученных отрицательных результатов качественной ПЦР, а также возможность их потери при прерывании лечения, есть основания считать, что отсутствие экспрессии гена BCR-ABL не может являться показанием к прекращению -терапии.

В связи с недостаточной информативностью двух стади иной ПЦР и невозможностью оценки объема остаточной опухолевой массы у больных с положительным результатом ПЦР (выявлением экспрессии гена BCR-ABL), в дальнейшем мониторинг МОЕ проводился с помощью количественного метода Realtime ПЦР у 10 из 19 больных, которым была продолжена терапия ИФН-альфа.

Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью количественного метода Real-time ПЦР

Определение начального базального уровня экспрессии гена BCR-ABL Поскольку измерить изначальную экспрессию BCR-ABL у каждого больного не представлялось возможным, мы использовали методический подход с определением диагностического (или начального базального) уровня экспрессии, впервые примененный в многоцентровом исследовании IRIS (2003-2006 г )

Экспрессия BCR-ABL была определена у 35 больных с впервые диагностированным XMJI, ХФ, до начала терапии Диапазон значений экспрессии у этих больных составил от 1930 до 42744 (копий BCR-ABL х 107/ копий Р2 микроглобулина) Медиана экспрессии BCR-ABL у больных с впервые выявленным ХМЛ была принята за величину начального базального уровня (НБУ) Значение НБУ составило ¡1245 (5СТМЯ£х107/копий Р2 микроглобулина)

Для удобства представления данных по изменению уровня экспрессии BCR-ABL в динамике была использована логарифмическая шкала измерений Результаты выражали в виде десятичного логарифма (lg) снижения экспрессии по отношению к НБУ lg НБУ - lg результат Таким образом, снижение экспрессии на 1 lg по отношению к НБУ означало снижение уровня BCR-ABL транскрипта по сравнению с НБУ в 10 раз, на 2 lg - в 100 раз, на 3 lg-в 1000 раз, на 4 lg-в 10000 раз

Сравнительный анализ экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови и костного мозга

Сравнительный анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL в клетках крови и костного мозга был проведен у 20 больных с целью выявления возможности использования периферической крови для исследования с помощью Real-time ПЦР. Была выявлена высокая корреляция (коэффициент корреляции 0,9), что позволяет рекомендовать периферическую кровь в качестве материала при мониторинге МОБ При анализе в динамике следует использовать один и тот же материал, чтобы избежать случайных колебаний значений, обусловленных разницей в экспрессии гена BCR-ABL в клетках периферической крови и костного мозга

Сопоставление данных цитогенетического исследования и данных молекулярно-биологического исследования методом Real-time ПЦР

В настоящее время цитогенетическое исследование является стандартным методом оценки объема остаточной опухолевой массы у больных XMJT, а цитогенетический ответ - важнейшим критерием эффективности терапии Более чувствительный метод Real-time ПЦР также предназначен для оценки объема остаточной опухоли при ХМЛ Поэтому важной задачей является сопоставление результатов этих исследований

При сопоставлении процента Ph'-положительных клеток в костном мозге и экспрессии гена BCR-ABL по данным Real-time ПЦР в периферической крови и костном мозге выяснилось, что несмотря на широкий диапазон экспрессии гена BCR-ABL, медианы уровня экспрессии различались у больных с разным цитогенетическим ответом (таблица 5) Медиана снижения уровня экспрессии BCR-ABL относительно начального базального уровня экспрессии (НБУ) в случае ПЦО составляла 2,42 lg, в случае выявления Ph'-хромосомы в 1-35% клеток костного мозга - 1,18 Ig, при выявлении Ph'-хромосомы более, чем в 35% клеток - 0,62 lg

Таблица 5. Сопоставление процента Ph'-положительных клеток в костном мозге и уровня экспрессии гена BCR-ABL

Молекулярный ответ Цитогенетический ответ

Снижение экспрессии BCR-ABL относительно НБУ Ph'-хромосома 0% (п=115) Ph'-хромосома в 1-35% клеток (п=32) Ph'-хромосома в > 35% клеток (п=12)

Медиана 2,42 1,18 0,62

Максимальное снижение 4,03 2,43 1,18

Минимальное снижение -0,4 0,13 -0,42

При анализе структуры молекулярного ответа (рисунок 3) было установлено, что при ПЦО в 24,4% случаев отмечалось снижение экспрессии BCR-ABL более, чем на 3 ^ по сравнению с НБУ, в 43,5% случаев - на 2-2,99 1г, в 22,6% случаев - на 1-1,99 в 9,6% случаев - менее, чем на 1 таким образом, у большинства больных с ПЦО

(67,9%) было отмечено снижение экспрессии BCR-ABL более, чем на 2 lg по сравнению с НБУ. При выявлении i-35% Ph'-положительных клеток н 18,7% случаев отмечалось снижение экспрессии ВСЯ-ABL на 2-2,99 lg но сравнению с ИБУ, в 37,5% случаев - на 1-1,99 lg, в 43,8% случаев — менее, чем на 1 lg. При выявлении Piv-хромошмы более, чем в 35% клеток костного мозга, в большинстве случаев (83,3%) преобладало снижение экспрессии 8CR-ABL менее, чем на 1 lg по сравнению с НБУ; в 16,7% случаев отмечалось снижение экспрессии BCR-ABL на 1-1,99 lg. Все различия были достоверны (р<0,001).

100% 80% -

U

i 60% §

о а.

20% 0%

km*

: .

■

1д сиикения экспрессии BCR-ABL rû огноилнич к НБУ

■ 1 19 fi 1-1.3& lg □ 2-2.99 19 Qs-3 lg

Phi-0% Pii+ 1-36% (л =32) (п»12)

цкгтчгчнетическкй стает

Рис. 3 Структура молекулярного отпета при ПЦО, выявлении 1-35% и более 35% РИ'-положительных клеток.

Таким образом, несмотря на значительный диапазон значений экспрессии гена ВСЯ-АВ1,, были отмечены достоверные различия в значениях экспрессии ВС Я-А В1 в соответствии с иигогснетическим ответом.

Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных ХМЛ при разных видах терапии

С помощью количественного метода Real-time ГИДР мониторинг МОЕ проводился у 74 больных (среди них - 10 из 19 больных, которым была продолжена терапия ИФН-атьфа, 53 больных на терапий имагинибом, 11 больных на комбинированной терапии); было произведено 250 исследований.

У 18 больных образцы крови и костного мозга были дополнительно проанализированы в референс-лаборатории (лаборатория молекулярной онкологии,

госпиталь С Луиджи, Турин, Италия), где на тот момент метод Real-time ПЦР для больных ХМЛ был уже стандартизирован в соответствии с EAC (European Against Cancer program, 2003) Была выявлена высокая корреляция данных (коэффициент корреляции 0,95), что подтвердило на практике достоверность полученных нами результатов

Возможность минимум однократного ПМО была отмечена у 39 (72,8%) из 53 пациентов при терапии иматинибом, 8 (72,7%) из 11 пациентов при проведении комбинированной терапии и у 8 (80%) из 10 больных, длительно получающих терапию ИФН-альфа. Ранее при проведении мониторинга с помощью качественной двухстадийной ПЦР возможность достижения ПМО была отмечена у 12 (63%) из 19 больных Однако при динамическом наблюдении у всех больных, получающих терапию ИФН-альфа, ПМО был утерян При терапии иматинибом стабильно сохраняющийся ПМО отмечен у 5 (9,4%) из 53 больных, при проведении комбинированной терапии -у 3 (27,3%) из 11 больных Таким образом, у 75 (90,4%) из 83 пациентов при динамическом наблюдении было отмечено персистирование МОБ, что свидетельствует о необходимости продолжать проводимую терапию

При сравнении уровня экспрессии гена BCR-ABL у больных ХМЛ на разных видах лечения независимо от срока терапии было установлено, что на момент получения ПЦО медиана снижения экспрессии BCR-ABL по отношению к НБУ составляла 2,41 lg при терапии ИФН-альфа, 2,5 lg при терапии иматинибом и 2,36 lg при комбинированной терапии, то есть различий не было выявлено

В наиболее многочисленной группе пациентов, получающих терапию имашнибом (п=53), были отдельно проанализированы больные со стабильным ПЦО, нестабильным ПЦО и цитогенетическим рецидивом У пациентов со стабильным и нестабильным ПЦО медианы снижения уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО не различались и составили 2,56 и 2,57 lg по сравнению с НБУ При проведенном в 6 случаях молекулярном анализе за 6-12 мес до возникновения цитогенетического рецидива были выявлены высокие уровни экспрессии гена BCR-ABL медиана 0,86 Ig снижения по сравнению с НБУ При этом у этих 6 больных сохранялся БЦО на момент выявления этих высоких уровней экспрессии гена BCR-ABL, сопоставимой с

экспрессией, которая была выявлена на момент развития што генетического рецидива (медиана 0,62 ^ снижения по сравнению с НБУ).

а,5-"

11 Р

О СП

менее 1Н?

2-2 991д

более 3 к)

о Ф

г г

^ отрицательнее

I

40»

процент случаен

1 ч ■ - 1 ■

1 ГШГ МММ 3

г 1 ! _ 1

»».«шив

-

ГЦ 88.6% и«

... :,.•! • ■

100%

I ! ■ --

100%

1 1 1 1

□ ри+О%

□ РИ+ 1-35%

на момент БЦО, зз 6-12 мес, до ^1 развития , цитогенетического рецидива

|цитогенетический рецидив

Рис.4 Выявление РЬ'-положительных клеток в зависимости от уровня экспрессии гена ВСТАВЬ у 53 больных ХМЛ при терапии нматиннбом.

Как показано на рисунке 4, ЬМО, яри котором наблюдалось снижение экспрессии гена ВСЯ-ЛВЬ на 3 и более но отношению с ПБУ, а также ЛМО. во всех случаях были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. Развития цитогенетического рецидива в течение последующих 6-12 мес. наблюдения у этих больных не было отмечено. При снижении уровня экспрессии ВСЯ-АВ1на 2-2,99 но отношению к НБУ в 88,6% случаев сохранялся ПЦО. а в 11,4% случаев сохранялся ЧЦО. также без последующего развитая онтогенетического рецидива в течение 12 мес. наблюдения.

При выявлении более высокого уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ отмечалась более высокая частота потери ПЦО. Снижение уровня экспрессии гена ВСЯ-АВ£ на 11,99 по отношению к НБУ в 4% случаев было отмечено при развитии патогенетического рецидива, и 16% случаев эти уровни экспрессии были выявлены на фоне сохраняющегося БЦО за 6-12 мес. до возникновения онтогенетического рецидива. В 24% случаев снижение уровня экспрессии гена ВС В.-А ВI. на 1-1,99 ^ по отношению к НЬУ было отмечено при сохраняющемся ЧЦО и в 56% случаев при ПЦО,

без последующего развития цитогенетического рецидива Снижение уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ менее, чем на 1 ^ по отношению к НБУ в 32% случаев было отмечено при развитии цитогенетического рецидива, в 32% случаев эти уровни экспрессии были выявлены на фоне сохраняющегося БЦО за 6-12 мес до развития цитогенетического рецидива, в 18,2% случаев отмечались при ЧЦО, в 18,2% случаев -при ПЦО, без последующего развития цитогенетического рецидива

Влияние перерывов в терапии на динамику минимальной остаточной болезни У 5 больных мониторинг МОБ осуществлялся не только на фоне терапии но и во время длительных перерывов в терапии, обусловленных негематологической токсичностью

У 3 больных, получавших терапию ИФН-альфа, перерывы в лечении производились на поздних сроках терапии (42,60 и 66 мес ) При этом у 2 из 3 больных сохранялась ПКГР, однако отмечалось развитие цитогенетического рецидива через 24 и 30 мес наблюдения без терапии и нарастание уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в динамике (снижение экспрессии по отношению к НБУ составляло менее 1 что послужило основанием для перевода на постоянную терапию иматинибом, при которой повторных явлений токсичности не было отмечено

У 1 из 3 больных в течение 36 мес наблюдения после отмены ИФН-альфа сохраняются ПКГР, стабильный ПЦО и определяется снижение экспрессии гена ВСЯ-АВЬ на 2,39-2,26 ^ по отношению к НБУ

У 2 больных комбинированная терапия (иматиниб + ИФН-альфа) была прервана на более ранних сроках лечения (9 и 20 мес) При этом в течение 3 и 4 мес в обоих случаях было отмечено развитие цитогенетического рецидива, что сопровождалось повышением уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ (определялось снижение экспрессии на 1 ^ по отношению к НБУ) Обоим пациентам в дальнейшем проводилась монотерапия иматинибом, явлений токсичности не было отмечено

Таким образом, развитие цитогенетических рецидивов и нарастание уровня экспрессии гена ВСЯ-АВЬ в динамике на фоне отмены лечения свидетельствуют о возможности активации остаточной популяции опухолевых клеток Длительность

периода без развития цитогенетического рецидива на фоне отмены терапии может быть обусловлена как особенностями механизма действия ИФН-альфа (в том числе, иммуно-опосредованного) и иматиниба, так и сроками терапии, на которых производились вынужденные перерывы в лечении Персистирование МОБ и возможность развития рецидивов на фоне длительных перерывов в лечении у больных XMJI диктуют необходимость проведения постоянной терапии, оптимально подобранной с учетом максимальной эффективности и минимизации возможных явлений токсичности

Динамика минимальной остаточной болезни при хроническим миелолейкозе

Поскольку отмечается широкий диапазон экспрессии гена BCR-ABL, однократный анализ с помощью метода Real-time ПЦР может не дать достаточно информации о нарастании или снижении остаточной опухолевой массы Оценка МОБ особенно важна при динамическом наблюдении Снижение уровня экспрессии гена BCR-ABL в динамике, стабильно низкие уровни экспрессии и ПМО, ассоциированные с сохранением ПЦО, свидетельствуют о достаточном контроле болезни (рисунок 5а) Нарастание экспрессии BCR-ABL в динамике может предшествовать развитию цитогенетического рецидива или определяться во время его возникновения, что наблюдается при развивающейся резистентности к проводимой терапии (рисунок 56) Кроме того, по литературным данным (S Branford, 2004 г) даже двухкратное повышение уровня транскрипта BCR-ABL может быть сопряжено с появлением мутаций киназного домена BCR-ABL, которые препятствуют связыванию иматиниба и приводят к развитию приобретенной резистентности Поэтому выявление у больных XMJT прогностически неблагоприятного нарастания уровня экспрессии BCR-ABL обусчавдиваст необходимость проведения цитогенетического исследования, обследования на наличие мутаций и решения вопроса о возможном изменении тактики терапии, учитывая имеющуюся в настоящее время возможность применения новых ингибиторов тирозинкиназ (НТК)

ИМЭ7ИНИ6 400 нг/суг ► ИФН-альфа 3 ME ч/день

3

—Т О

0%

отр. отр. fe. _

0%Oft

г *

К* X Л

- 2 1 1 1 £ s + 3| | « Hi £т

\ 4 II I

а>

1 а ■ч

-L e "

3 мае 6 мес

9 нес 12 мес 15 мае 1S май 21 мае 24 мес 30 мае сректграгтии

L

ицатуииб 4Ш мг/суг

S 100

1 аа

i 60 О.

S 40

3-

а. с

О

№

. П 43__л 85%

35%

^ 0% 0% ^ 0% 0% 0% 0% [ | 0%

i S §

И г>

X I О 10

I s 11 = 8 6 — cl _j

с О

5 <

бмес 12 IB J4 3D

нес net нес мес.

36 42 45 48 64 60 ее 72 иве. нес vec. нес. мес мес. мес. нес. срок терапии

6.

Рис.5 Динамика минимальной остаточной болезни у больных ХМЛ а) ггри стабильном полном цито генетическом ответе б) при развитии шло генетического рецидива.

Использование двухстадийной ПЦР для оценки минимальной остаточной болезни у больных с полным молекулярным ответом по данным количественного метода Real-time ПЦР

Метод двухстадийной (nested) ПЦР имеет более высокую чувствительность (до 10"6) по сравнению с количественным методом Real-time ПЦР (чувствительность до lO^-lO"5). Учитывая эту разницу в чувствительное™ методов, мы провели 37 исследований у 28 больных ХМЛ, получавших терапию иматинибом, у которых по данным количественной Real-time ПЦР отмечался ПМО. В 55% случаев с помощью двух стали иной ПЦР была выявлена экспрессия гена BCR-ABL, ЧТО свидетельствует о сохранении МОК.

Таким образом, мы считаем, что при получении ПМО по данным Real-time ПЦР нельзя обсуждать вопрос о прерывании терапии, так как есть свидетельства того, что остаточные опухолевые клетки могут при этом персистировать, оставаясь за пределами чувствительности метода

Практические рекомендации по мониторингу МОЕ у больных ХМЛ Молекулярный мониторинг с помощью Real-time ПЦР является информативным у больных ХМЛ с достигнутым ранее ПЦО, так как позволяет выявлять прогностически значимые уровни экспрессии BCR-ABL при отсутствии информации по кинетике остаточной опухолевой массы по данным других исследований, обладающих меньшей чувствительностью

У больных ХМЛ с ПКГР, которые не достигли ПЦО, основным методом мониторинга остаточной опухолевой массы и контроля эффективности терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия), позволяющим принимать клинические решения, является стандартное цитогенетическое исследование 1 раз в 6 мес

Учитывая длительное течение заболевания в ХФ ХМЛ, для мониторинга МОБ в динамике оптимально производить исследование с помощью Real-time ПЦР 1 раз в 3 мес у больных ХМЛ, которые достигли ПЦО Выявленная высокая корреляция экспрессии BCR-ABL в крови и костном мозге позволяет рекомендовать периферическую кровь в качестве материала при мониторинге МОБ с помощью Realtime ПЦР и избежать повторных стернальных пункций Цитогенетическое исследование у больных с ПЦО возможно проводить 1 раз в 12 мес

При выявлении низких уровней экспрессии BCR-ABL (снижение на 3 lg и более по отношению к НБУ), тенденции к снижению экспрессии гена BCR-ABL в динамике, пациентам следует продолжить проводимую терапию и мониторинг МОБ При снижении экспрессии BCR-ABL на 2-2,99 lg по отношению к НБУ также следует продолжить проводимую терапию и мониторинг МОБ, оценить тенденцию к нарастанию или снижению уровня экспрессии BCR-ABL в динамике.

Выявление высоких уровней (снижение экспрессии BCR-ABL менее, чем на 1,9 lg) и/или нарастание экспрессии BCR-ABL в динамике является показанием к проведению цитогенетического исследования для исключения развития цитогенетического рецидива, при этом также необходимо проводить обследование на предмет выявления мутаций киназного домена BCR-ABL для решения вопроса о возможном изменении тактики терапии

Достижение ПМО у больных XMJI не может являться показанием к прерыванию терапии, так как существует возможность персистирования МОБ, доказанная с помощью более чувствительных методов, кроме того, было отмечено развитие рецидивов заболевания у большинства больных при отмене лечения Учитывая высокую чувствительность двухстадийной ПЦР, это исследование может быть рекомендовано в качестве дополнительного метода характеристики степени искоренения остаточной опухолевой массы при получении двух и более повторных отрицательных результатов по данным Real-time ПЦР

Выводы:

1 Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени является информативным методом для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом на фоне проведения направленной терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа) Установлено, что при динамическом наблюдении у 90,4% больных с полным цитогенетическим ответом отмечается персистирование минимальной остаточной болезни

2 Выявлена корреляция уровня экспрессии гена BCR-ABL в периферической крови и костном мозге (коэффициент корреляции 0,9), что позволяет рекомендовать к использованию периферическую кровь для мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом в процессе терапии

3 Установлено, что у больных XMJI, получающих терапию иматинибом, высокие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению менее, чем на

1,9 \% по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы с возникновением цитогенетического рецидива Полный молекулярный ответ и низкие уровни экспрессии гена ВСЯ-АВЬ, соответствующие снижению более, чем на 3 ^ по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы со стабильным полным цитогенетическим ответом

4 Больным хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом показана непрерывная постоянная терапия (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия), поскольку при отмене лечения отмечается потеря достигнутого ответа и увеличение процента РЬ'-положительньк клеток в костном мозге

5 Исследование с помощью метода двухстадийной полимеразной цепной реакции с чувствительностью до 10"6 позволяет выявить минимальную остаточную болезнь в 55% случаев полного молекулярного ответа, что свидетельствует о возможности персистирования остаточного опухолевого клона и необходимости проведения постоянной терапии

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 A G Turkma, N D Khoroshko, G A Druzhkova, Е S Zakharova, E V Domracheva, A V Zakharova, E M Abakumov, E Y Chelysheva, M A Sokolova The effectiveness of Glivec (Imatimb mesylate, STI-571) in patients with CML late chronic phase, resistant to alpha-mterferon // The Hematology Journal vol 1, suppl 1 - June 2002 - p 291, abstr№ 0984

2 А Г Туркина, H Д Хорошко, Г А Дружкова, С С Лория, Е С Курова, Е М Абакумов, Е С Захарова, Е Ю Челышева, Т И Колошейнова, О Ю Виноградова. Возможности терапии ингибитором тирозинкиназы Гливеком у больных хроническим миелолейкозом // «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» Научно-практическая конференция, Санкт-Петербург - 2004 -С 61

3 А Г Туркина, Е Ю Челышева Цитогенетический и молекулярный ответ — ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+ хроническим миелолейкозом // Фарчатека. — 2004 - №18 (95)

4 Е Yu Chelysheva, A G Turkina, А V Misiurin, N D Khoroshko, E V Aksenova, A V Zakharova, E V Domracheva, G A Druzhkova, TI Kolosheinova. Monitoring of minimal residual disease for the patients with CML receiving interferon alpha and Glivec therapy // The Hemalogy Journal The abstracts for the 9th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2004 - abstr 945

5 A V Misyurin, E V Aksenova, E Ju Chelysheva, A G Turkina, N D Khoroshko PRAME and BCR-ABL gene expression analysis for quantative monitoring of MRD in CML by means of Real time PCR // The Hemalogy Journal The abstracts for the 9th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2004 -abstr 917

6 AG Turkina, N D Khoroshko, G A Druzhkova, S S Loria, E S Kurova, E Yu Chelysheva, E M Abakumov, S S Kruglov, E S Zakharova, TI Kolosheinova, L Yu Kolosova, О Yu Vinogradova, E V Domracheva, A V Zakharova, L V Dyachenko, В V Zingerman,LG Kovaleva, S E Semochkin,NZ Triputen The prognostic value of major cytogenetic response for the CML patients on imatinib therapy // The Hemalogy Journal The abstracts for the 9th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2004 - abstr 736

7 А Г Туркина, H Д Хорошко, Г А Дружкова, Е С Курова, Е С Захарова, Е М Абакумов, Е Ю Челышева, Т И Котошейнова, Е В Домрачева, А В Захарова, JIГ Ковалева, С С Лория Цитогенетический ответ - маркер эффективности терапии ингибитором тирозинкиназы (гливеком) у больных хроническим миелолейкозом // Терапевтический Архив - 2005- том 77- N7- с 42-48

8 А Г Туркина, Н Д Хорошко, Г А Дружкова, С С Круглов, Е Ю Челышева, Е В Домрачева, А В Захарова, JI В Дяченко, Е М Абакумов, О Ю Виноградова, М А Соколова, Е П Сысоева, В С Журавлев, С В Кузнецов, JIА Щербинина, Т И Колошейнова, Л Ю Колосова, С Р Горячева, Т В Иванова, Л Ю Тихонова, Б В Зингерман, Л Г Ковалева, С С Лория, Н 3 Трипутень Практические рекомендации по лечению больных хроническим миелолейкозом пособие для врачей М -Тверь ООО «Издательство «Триада», 2005 -78 с

9 E Y Chelysheva, A G Turkma, A V. Misyurin, E V Aksenova, G A Druzhkova, T1 Kolosheinova, L Y Kolosova, M A Sokolova, О Y Vinogradova, T V Ivanova. The results of monitoring of minimal residual disease for the patients with chronic myeloid leukemia receiving interferon alpha and Glivec therapy // The Hemalogy Journal The abstracts for the 10th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2005 -abstr 1205

10 AG Turkma, OY Vinogradova, AV Zakharova, EY Chelysheva, GA Druzhkova, S M Kruglova, S V Kuznetsov, E V Domracheva, N D Khoroshko The program therapy of Ph-positive chronic myeloid leukemia at early chronic phase // The Hemalogy Journal The abstracts for the 10th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2005 - abstr 1106

11 А Г Туркина, С С Круглов, Г А Дружкова, С С Лория, Е М Абакумов, Е Ю Челышева, О Ю Виноградова, Т И Колошейнова, Л Ю Колосова, А В Захарова, Л В Дяченко, С М Круглова, И С Немченко, Н Д Хорошко Успехи в лечении больных Ph+ хроническим миелолейкозом ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы Гливеком (результаты 4-летней выживаемости) // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы гематотогии и трансфузиологии Научно-практическая конференция, Ташкент - 2005 -С 141-142

12 EY Chelysheva, A G Turkma, А V Misyurin, EV Aksenova, Е V Domracheva, А V Zakharova, N D Khoroshko Clinical significance of quantitative real-time PCR for monitoring of minimal residual disease for patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase receiving Glivec therapy // The Hemalogy Journal The abstracts for the 11th annual Meeting of the European Hematology Association- June 2006 - abstr 1149

13 А Ю Зарицкий, ЕГЛомаиа, О Ю Виноградова, Г А Дружкова, С С Круглов, Е М Абакумов, М А Соколова, И С Немченко, Е С Захарова, Л Г Ковалева, Т И Колошейнова, С Р Горячева, Л Ю Колосова, М В Вахрушева, С С Лория, Л А Чернова, А В Захарова, Т И Поспелова, И В Крылова, А С Лямкина, Е Р Мачюлайтене, С В Кузнецов, Е Ю Челышева, В Л Иванова, В Ю Удальева, Т В Шнейдер, Ю С Огородникова, В С Журавлев, И С Мартынкевич, Е В Домрачева Результаты многоцентрового исследования терапии гливеком

больных хроническим миелолейкозом в хронической фазе // Гематология и трансфизиология - 2007 - №2 - С 13-17 МЕЮ Челышева, А Г Туркина, А В Мисюрин, А В Захарова. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня ВСЯ-АВЬ транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематология и трансфузиология -2007 -№2 - С 50-51 15 А В Мисюрин, ЕВ Аксенова, А А Кругов, А В Лукьяненко, Ю П Финашутина, М В Сучкова, В В Тихонова, Е Ю Челышева, И Н Соддатова, А Г Туркина, Н Д Хорошко Молекулярная диагностика хронического миелолейкоза // Гематология и трансфузиология - 2007 - №2 - С 35-40

Отпечатано в типографии ООО НВП «ИНЭК» Москва, Ленинградское шоссе, 18, тел 786-22-31

Подписано в печать 16 05 2007 Формат 60x90/16 Тираж 100 экз

Актуальность темы исследования.

Хронический миелолейкоз (XMJI) - клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия - «филадельфийская хромосома», РЬ'хромосома (в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами образуется химерный онкоген BCR-ABL). На момент установления диагноза XMJ1 в костном мозге при кариологическом анализе выявляется 95-100% РЬ'-положительных клеток.

Современная терапия препаратами интерферона-альфа (ИФН-альфа) и ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниб мезилат) позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона и восстановления нормального кроветворения, что приводит к увеличению выживаемости больных. Полный цитогенетический ответ (ПЦО), при котором у пациентов определяется восстановление нормального кариотипа и не выявляется РЬ'хромосома, является стандартным критерием эффективности терапии у больных XMJ1.

При лечении иматинибом получение ПЦО через 5 лет терапии отмечено у 87% больных в поздней хронической фазе XMJ1 и у 96% больных в ранней хронической фазе XMJI (А.Ю. Зарицкий, Е.Г. Ломаиа, 2007) [94]. При терапии ИФН-альфа получение ПЦО через 1 год терапии отмечено у 14% больных в хронической фазе ХМЛ (международное исследование IRIS)[76], через 2 года терапи - у 20% (Faderl S., 1999)[101].

Однако у больных с достигнутым ПЦО оказалось возможным обнаружить BCR-ABL положительные клетки при применении более чувствительного молекулярно-биологического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Стало очевидно, что данных стандартного цитогенетического исследования (чувствительность 1:10" клеток) может быть недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию, особенно у пациентов, достигших не только полной клинико-гематологической ремиссии, но и ПЦО. Поэтому для детекции химерного гена BCR-ABL и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) при XMJI целесообразным является использование метода ПЦР. Изучение МОБ у больных XMJI дает основания определять новые критерии полноты достигнутой ремиссии, распознавать наиболее ранние признаки рецидива заболевания и разрабатывать терапевтические подходы при персистировании остаточной популяции опухолевых клеток.

Поэтому вопрос количественной оценки остаточной опухолевой массы и мониторинга МОБ у больных XMJI является актуальным.

Использование метода ПЦР в реальном времени {Real-time ПЦР) с чувствительностью 10"4-10"5 дает возможность количественно охарактеризовать остаточную опухолевую массу у больных XMJI по уровню экспрессии гена BCR-ABL и проводить мониторинг МОБ. Метод двухстадийной ПЦР обладает большей чувствительностью (1:10 6клеток) по сравнению с Real-time ПЦР, но является только качественным и не позволяет оценить объем опухолевой массы.

В настоящей работе представлены данные, полученные при использовании методов качественной и количественной ПЦР у больных XMJI, у которых было достигнуто значительное подавление Ph'-положительного опухолевого клона.

Цель исследования:

Оценить клиническую значимость молекулярно-биологических методов детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом.

Задачи исследования:

1. Оценить информативность количественного метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом при разных видах терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия).

2. Сравнить уровень экспрессии гена BCR-ABL в костном мозге и периферической крови для решения вопроса о возможности использования периферической крови при мониторинге минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом.

3. Определить взаимосвязь цитогенетических рецидивов и уровня экспрессии гена BCR-ABL по данным полимеразной цепной реакции в реальном времени у больных хроническим миелолейкозом при терапии иматинибом.

4. Оценить взаимосвязь режима терапии и стабильности достигнутого цитогенетического и молекулярного ответа у больных хроническим миелолейкозом при терапии интерфероном-альфа, иматинибом и комбинированной терапии (иматиниб, интерферон-альфа и курсы малых доз цитозара).

5. Оценить частоту выявления остаточного опухолевого клона с помощью наиболее чувствительного метода двухстадийной ПЦР у больных с полным молекулярным ответом по данным количественного метода ПЦР в реальном времени.

Научная новизна:

На основе данных молекулярно-биологических методов исследования и данных кариологического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа, терапию иматинибом и комбинированную терапию (иматиниб, интерферон-альфа, курсы малых доз цитозара). Установлено, что при динамическом исследовании экспрессии гена BCR-ABL с помощью метода количественной Real-time ГИДР у большинства (90,4%) больных с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом определяется персистирование остаточного опухолевого клона, что диктует необходимость продолжения терапии.

Практическая ценность:

Установлено, что метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени является информативным для детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом. На основании сопоставления данных цитогенетического исследования и количественного метода Real-time ПЦР установлен уровень экспрессии гена BCR-ABL, прогностически значимый для возникновения цитогенетического рецидива и уровень экспрессии, ассоциированный со стабильным полным цитогенетическим ответом. Установлена возможность исследования периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни, что позволяет оценивать стабильность полученного молекулярного ответа в динамике без применения повторных стернальных пункций. Определена схема обследования больных хроническим миелолейкозом при использовании молекулярно-биологических методов исследования.

Основные положения данной работы с 2004 г. внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук (далее - ГНЦ РАМН): настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Разработка стратегии терапии хронического миелолейкоза» (2003-2007 гг.) №01200301557. Результаты исследований явились основанием для внедрения иматиниба в клиническую практику лечения больных XMJI. Полученные в ходе исследования заключения включены в практическое пособие для врачей и методические рекомендации по обследованию и лечению больных XMJT.

- 12

ВЫВОДЫ:

1. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени является информативным методом для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом на фоне проведения направленной терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа). Установлено, что при динамическом наблюдении у 90,4% больных с полным цитогенетическим ответом отмечается персистирование минимальной остаточной болезни.

2. Выявлена корреляция уровня экспрессии гена BCR-ABL в периферической крови и костном мозге (коэффициент корреляции 0,9), что позволяет рекомендовать к использованию периферическую кровь для мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом в процессе терапии.

3. Установлено, что у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, высокие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению менее, чем на 1,9 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы с возникновением цитогенетического рецидива. Полный молекулярный ответ и низкие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению более, чем на 3 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы со стабильным полным цитогенетическим ответом.

4. Больным хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом показана непрерывная постоянная терапия (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия), поскольку при отмене лечения отмечается потеря достигнутого ответа и увеличение процента Ph'-положительных клеток в костном мозге.

5. Исследование с помощью метода двухстадийной полимеразной цепной реакции с чувствительностью до 10"6 позволяет выявить минимальную остаточную болезнь в 55% случаев полного молекулярного ответа, что свидетельствует о возможности персистирования остаточного опухолевого клона и необходимости проведения постоянной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные достижения в терапии ХМЛ позволяют не только получить полную клинико-гематологическую ремиссию у больных ХМЛ, но и добиться значительного подавления Ph'-положительного опухолевого клона. Важность достижения ПЦО как фактора увеличения продолжительности жизни у больных ХМЛ подтверждена во многих исследованиях [36-39].

Терапия ИФН-альфа и иматинибом (специфический ингибитор BCR-ABL-зависимой тирозинкиназы) уже доказали свою ценность и значимость использования в качестве «золотого стандарта» в лечении больных с хронической фазой ХМЛ. Однако точного ответа на вопрос о том, возможно ли полное искоренение опухолевого клона на фоне проводимой консервативной терапии, а также на вопрос о том, как долго должна продолжаться эта специфическая терапия у больных с полной цитогенетической ремиссией, на сегодняшний день еще нет. Единственным методом полного уничтожения опухолевого клона при ХМЛ в настоящее время признана аллогенная трансплантация костного мозга.

В связи с этим возрастает важность оценки МОБ у каждого больного ХМЛ, достигшего ПЦО на фоне консервативной терапии. Традиционно использующиеся в гематологии цитогенетические методы не всегда позволяют это сделать из-за их относительно низкой чувствительности. Молекулярные методы (качественная nested ПЦР и количественная Real-time ПЦР), чувствительность которых находится в пределах Ю^-Ю"6, позволяют более детально изучить остаточный опухолевый клон при ХМЛ.

В нашем исследовании представлена характеристика МОБ у 83 больных (39 мужчин и 44 женщин в возрасте от 16 до 70 лет) с ХФ Ph'-позитивного ХМЛ, получающих терапию ИФН-альфа, иматинибом и комбинированную терапию. Медиана наблюдения в группе больных, получавших терапию ИФН -альфа, составила 66 мес.(6-108 мес.); в группе больных, получавших терапию иматинибом - 48 мес. (6-60 мес.); в группе больных, получавших комбинированную терапию - 36 мес. (24-36 мес.). В группе больных, получавших терапию ИФН-альфа и в группе больных, получавших комбинированную терапию, все пациенты находились в ранней ХФ. В группе больных, получавших терапию иматинибом 67.9% пациентов были в поздней ХФ, 32,1% - в ранней ХФ.

В указанных трех клинических группах пациентов регулярно проводился цитогенетический мониторинг. Мониторинг МОБ производили у 19 больных с помощью метода качественной nested ПЦР и у 74 больных - с помощью количественного метода Real-time ПЦР.

Для проведения анализа выделяли РНК из клеток костного мозга или периферической крови, выполняли реакцию обратной транскрипции с целью получения комплементарной ДНК.

Для проведения качественной двухстадийной (nested) ПЦР проводили амплификацию на приборе "PCR sprint thermal cycler" фирмы Hybaid и визуализировали ПЦР-продукт с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле.

Количественную Real-time ПЦР проводили при помощи прибора ICycler IQ (фирмы BioRad) с использованием технологии TaqMan. Количество копий транскрипта гена BCR-ABL и гена [32-микроглобулина (выбранного в качестве контрольного гена) определяли относительно стандартной калибровочной кривой, представляющей собой серию разведений плазмиды, содержащей известное количество копий. Окончательный результат у выражали в виде соотношения: число копий BCR-ABL х 10 /число копий [32-микроглобулина.

Для оценки динамики МОБ определяли десятичный логарифм снижения уровня транскрипта BCR-ABL относительно НБУ по формуле: log 10 НБУ-loglO результат {BCR-ABL х 107/р2-микроглобулин). За величину начального базального уровня (НБУ) была принята медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL, полученная при диагностическом анализе 35 пациентов с впервые выявленным XMJI. Этот уровень (НБУ) составил 11245 {BCR-ABL х 107 /[32-микроглобулин) копий; lg НБУ = 4,05.

При анализе ЦО выяснилось, что наиболее раннее получение БЦО и ПЦО (к 3 мес. терапии) и наибольшее число стабильных ПЦО (63,6%) было отмечено среди пациентов, получающих комбинированную терапию, наиболее позднее (до 48 мес.) и наименьшая стабильность ПЦО (5,3%) - в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа. Частота возникновения ЦР была выше в группе больных, получающих лечение ИФН-альфа (36,8%). Снижение стандартных доз и перерывы в терапии могли быть ассоциированы с возникновением ЦР во всех трех клинических группах.

При анализе с помощью качественной ПЦР в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа, было установлено, что частота ПМО возрастает при увеличении срока терапии, однако полученный ПМО не был стабильным. Положительные результаты качественной ПЦР свидетельствовали о сохранении МОБ даже на поздних сроках терапии ИФН-альфа. Развитию цитогенетической нестабильности могли предшествовать как положительные, так и отрицательные результаты качественной ПЦР.

На фоне снижения доз ИФН-альфа или перерывов в терапии была возможна потеря ПМО и ПЦО, а при коррекции терапии - их восстановление. Учитывая нестабильность полученных ПМО, и возможность их потери при прерывании лечения, отрицательный результат качественной ПЦР не может являться показанием к прекращению терапии ИФН-альфа.

Таким образом, качественный метод двухстадийной nested ПЦР позволил охарактеризовать МОБ у больных ХМЛ, получающих специфическую терапию, однако более полную информацию удалось получить с помощью количественного метода Real-time ПЦР.

Среди всех проанализированных с помощью количественного метода Real-time ПЦР 250 образцов 91 были отрицательными, 149 положительными.

Была выявлена высокая корреляция уровня экспрессии BCR-ABL в периферической крови и костном мозге при одновременном анализе 20 пар образцов крови и костного мозга. Коэффициент корреляции составил 0.9. Подобные данные были также получены в других исследованиях [76, 77], что послужило основанием рекомендовать использовать для анализа периферическую кровь.

Цитогенетически не имеющие различий пациенты имели разный уровень МОБ по данным молекулярного исследования.

Для большинства (83,3%) пациентов с ЦР было свойственно снижение уровня BCR-ABL транскрипта менее, чем на 1 lg. На момент ЧЦО снижение уровня транскрипта менее, чем на 1 lg по сравнению с НБУ определялось в 43,8% случаев, на 1-2 lg - в 37,5% случаев.

Похожие данные были получены в исследовании T.Bumm с соавторами [73], по данным которого БЦО не всегда был ассоциирован со снижением уровня транскрипта BCR-ABL более чем в 10 раз.

Среди пациентов с ПЦО отмечался наибольший диапазон экспрессии BCR-ABL. В большинстве случаев (43,5%) при ПЦО отмечалось снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 2-3 lg по сравнению с НБУ. Снижение уровня транскрипта на 3 lg и более по сравнению с НБУ (БМО) отмечалось в 24,4% проанализированных образцов у больных с ПЦО. Подобные данные были получены также в исследовании итальянских авторов [75], в котором все случаи стабильного ПЦО были ассоциированы со снижением уровня экспрессии BCR-ABL более, чем на 2 lg.,

По данным нашего исследования, медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО среди всех больных составила 2,42 lg (-0,4 - 4,03 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО составила 1,18 lg (0,13-2,43 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЦР составила 0,62 lg снижения по отношению к НБУ(-0,42 -1,18 lg).

По данным исследования T.Bumm с соавторами [73], все отрицательные результаты Real-time ПЦР были положительными при проверке стандартной двухстадийной ПЦР. В нашей работе при анализе 37 из 91 отрицательных по данным количественного метода Real-time ПЦР образцов крови и костного мозга с помощью более чувствительных методов (качественной nested ПЦР с чувствительностью до 10'6) BCR-ABL транскрипт удалось выявить в 20 (55%) из 37 образцов. Выявление МОБ в меньшем проценте случаев в нашем исследовании может быть обусловлено тем фактом, что медиана наблюдения была больше, чем в исследовании T.Bumm с соавторами, соответственно, степень подавления остаточного опухолевого клона также могла быть более выраженной при более длительном сроке терапии и мониторинге. Этот анализ продемонстрировал возможность сохранения МОБ на крайне низких уровнях, которые могут остаются за пределами чувствительности применяемого нами количественного метода. Клиническая значимость этих данных заключается в том, что отрицательный результат Real-time ПЦР у больных ХМЛ, получающих консервативную терапию, может не означать полного отсутствия болезни и окончательного искоренения BCR-ABL-позитивного клона.

В группе пациентов, получающих терапию ИФН-альфа, молекулярный анализ с помощью количественного метода Real-time ПЦР показал сохранение МОБ и нестабильность полученного ПМО у всех пациентов. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL у пациентов с сохраняющимся ПЦО на этой терапии составляла 2,41 lg снижения по сравнению с НБУ. В 3 случаях была отмечена возможность сохранения полной клинико-гематологической ремиссии и ПЦО (в 1 случае - стабильного, в 2 случаях - нестабильного) во время длительных (12-36 мес.) перерывов в терапии у пациентов на поздних сроках терапии ИФН-альфа.

В группе пациентов, получающих терапию иматинибом были отдельно проанализированы больные со стабильным ПЦО, нестабильным ПЦО и ЦР. У пациентов со стабильным и нестабильным ПЦО медианы уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО не различались и составили 2,56 и 2,57 lg снижения по сравнению с НБУ. Уровень экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО был выше, чем при ПЦО: медиана 1,41 lg снижения по сравнению с НБУ.

Наиболее высокие уровни экспрессии BCR-ABL среди пациентов на терапии иматинибом были выявлены в момент развития ЦР (медиана 0,62 lg снижения по сравнению с НБУ). При проведенном в 6 случаях молекулярном анализе за 6-12 мес. до возникновения ЦР также отмечалось появление высоких уровней экспрессии BCR-ABL: медиана 0,86 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ПЦО и 0,89 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ЧЦО.

Снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 1-1,99 lg по отношению к НБУ было характерно как для пациентов с ПЦО, так и для пациентов с ЧЦО и могло предшествовать развитию ЦР.

Низкие уровни экспрессии BCR-ABL (более 3 lg снижения по сравнению с НБУ) и отрицательные результаты Real-time ПЦР у больных ХМЛ на терапии иматинибом были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. Именно при таком уровне редукции уровня экспрессии BCR-ABL в течение 12 месяцев терапии иматинибом дальнейшая выживаемость без признаков прогрессии составила 100% по данным Hudges с соавторами [76] в рамках исследования IRIS. Подобные данные были получены также и в нашей работе.

В группе пациентов, получающих комбинированную терапию, на момент ПЦО медиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 2,4 lg ниже НБУ; медиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 0,9 lg ниже НБУ при сохраняющемся ЧЦО. Высокие уровни экспрессии BCR-ABL (менее 1,99 и менее 1 lg снижения по отношению к НБУ) и повышение уровня транскрипта в динамике могли предшествовать развитию ЦР, а также выявляться при цитогенетической резистентности. Выявление этих относительно высоких уровней также было отмечено на ранних (менее 3 мес.) сроках терапии при достижении ЧЦО. Снижении уровня экспрессии BCR-ABL на 1,5-1,9 lg также наблюдалось за 3-6 мес. до развития ЦР. Уровни экспрессии BCR-ABL, соответствующее более, чем 2 lg снижения по сравнению с НБУ, и отрицательные результаты у больных ХМЛ, получающих комбинированную терапию, были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. При длительных перерывах в лечении (3-4 мес.) на 1-2 году комбинированной терапии в 2 случаях отмечалось развитие ЦР.

Возможность получения отрицательных результатов Real-time ПЦР была отмечена у 72,8% пациентов на терапии иматинибом, 72,7% пациентов на комбинированной терапии и у 80% больных, длительно получающих терапию ИФН-альфа. По сведениям литературы (Lin с соавторами [78]) было установлено, что на терапии иматинибом что повторные отрицательные результаты Real-time ПЦР (стабильный ПМО) наблюдается редко. Данные нашего исследования подтверждают этот факт: стабильные ПМО при терапии иматинибом были отмечены только у 5 (9,4%) из 53 больных. При этом достоверно большая (р<0,05) частота достижения ПМО (72,8%) была выявлена у пациентов со стабильным ПЦО по сравнению с таковой у больных с нестабильным ПЦО (31,3%). Стабильные ПМО были отмечены также у 3 (27,3%) из 11 больных на комбинированной терапии.

С помощью клинических примеров на разных видах терапии (ИФН-альфа, иматиниб, комбинированная терапия) было продемонстрировано влияние изменения схемы и доз применяемой терапии, а также перерывов в терапии, на полноту и стабильность достигнутых цитогенетических и молекулярных ремиссий. Была показана динамика МОБ у отдельных пациентов и взаимосвязь роли цитогенетического и молекулярного мониторинга.

Учитывая длительное, хроническое течение заболевания у больных с хронической фазой XMJI, для мониторинга МОБ в динамике оптимально производить исследование с помощью Real-time ПЦР 1 раз в 3 мес., чтобы вовремя обнаружить тенденцию к изменению экспрессии BCR-ABL, выявить уровень экспрессии, ассоциированный с возникновением цитогенетического рецидива. Наиболее информативен для определения динамики изменения экспрессии гена BCR-ABL молекулярный мониторинг у больных с ПЦО. Возможность исследования периферической крови для мониторинга МОБ позволяет оценить стабильность полученного молекулярного ответа и избежать повторных стернальных пункций.

Таким образом, количественный метод Real-time ПЦР является важным в анализе МОБ при XMJT. Анализ с помощью этого метода позволяет определить относительно безопасные уровни МОБ, ассоциированные с сохраняющимся ПЦО, а также своевременно выявить ранние признаки развития рецидива.