Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническое значение матриксных металлопротеиназ у больных раком яичников

На правах рукописи

ЛЁВКИНА НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МАТРИКСНЫХ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЯИЧНИКОВ

(специальность 14.01.12-онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 1 ДЕК 2011

Москва - 2011 г.

005004555

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

Директор - академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов.

Научные руководители: Д. м.н., профессор Д. б. н., профессор

Константин Павлович Лактионов

Елена Сергеевна Герштейн

Официальные оппоненты: Д.м.н., профессор

Виктор Васильевич Кузнецов Лора Борисовна Горбачева

Д. б. н., профессор

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития России

Защита диссертации состоится « /«¿, 2011 г. в_часов на заседании Диссертационного совета (Д.001.017.01) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохи-наРАМН.

Автореферат разослан « /4» // 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета профессор, д.м.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак яичников - одна из наиболее инвазив-ных злокачественных опухолей, причем у большинства больных заболевание диагностируется на достаточно поздних стадиях, когда опухоль уже распространена по брюшине. Трудности ранней диагностики и высокий метастатический и инвазивный потенциал рака яичников определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения этой опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно воздействующих на процессы метастазирования и инвазии.

Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеазами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоангиогенеза. В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеаз, к важнейшим из которых следует отнести группу матриксных металлопротеиназ (ММП) или матриксинов, названных так именно за свою способность специфически гидролизовать все основные белки внеклеточного матрикса, в первую очередь, коллаген (А.Иекоп и соавт., 2000; Е.йегуи^та и соавт., 2010). ММП - это мультигенное семейство, состоящее из более 20 секре-тируемых и связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопепти-даз. Помимо большинства компонентов ВКМ, их субстратами могут быть также другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста. Важнейшими представителями семейства ММП являются желатиназы А и В,специфические коллагеназы коллагена IV типа (ММП-2 и 9), а также матрилизин - ММП-7, имеющий широкую субстратную специфичность и помимо коллагена IV гидролизующий также эластин, протеогликаны, фибронектин и др. Матрилизин участвует также в активации предшественников ММП-2 и 9. Публикации последнего десятилетия свидетельствуют о том, что именно эти ММП являются перспективными маркерами для дифференциальной диагностики различных новооб-

разований яичников и прогноза рака яичников (Б.БШапраа и соавт., 2006, 2007; А.КатШ и соавт., 2006; А.Оете(ег и соавт., 2005). Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется четырьмя тканевыми ингибиторами, играющими также важную самостоятельную роль в регуляции роста и дифференцировки опухолевых и нормальных клеток и обладают антиангиогенными свойствами (А.Вакег и соавт., 2002). Среди тканевых ингибиторов наиболее значимым маркером рака яичников, по данным литературы, является ТИМП-1 (М.МааПа и соавт., 2004). Использование природных и синтетических ингибиторов ММП считается перспективным подходом к противоопухолевой терапии.

Цель работы:

Оценить клинические перспективы исследования содержания ключевых матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях, сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком яичников.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить содержание ММР 2, 7, 9 и их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа в опухолях, асцитической жидкости и сыворотке крови больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников.

2. Проанализировать соотношение концентрации изучаемых белков в сыворотке крови больных раком яичников с уровнем их экспрессии в опухолевой ткани и концентрацией в асцитической жидкости.

3. Изучить взаимосвязь уровня изучаемых белков в опухолях, сыворотке крови и асцитической жидкости с основными клинико-морфологическими особенностями рака яичников (стадией процесса, гистологической формой и степенью дифференцировки опухоли, возрастом и менопаузным статусом больных).

4. Изучить возможность комплексного использования клинических, морфологических и изученных биохимических факторов в прогнозировании эффективности лечения больных раком яичников.

Научная новизна и практическая значимость исследования: Впервые количественными иммуноферментными методами исследован спектр экспрессии матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингиби-

торов в опухолях больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников, прослежена взаимосвязь внутриопухолевых и сывороточных концентраций этих белков. Показано, что в ткани рака яичников достоверно повышено содержание ММП-7 и снижено содержание ММП-2 и ТИМП-2 по сравнению с доброкачественными опухолями, а уровни ММП-9 и ТИМП-1 в различных новообразованиях яичников достоверно не отличаются. Продемонстрировано также достоверное повышение содержания ММП-7, ММП-9 и ТИМП-1 и снижение содержания ММП-2 в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с показателями группы контроля и пациенток с доброкачественными новообразованиями. У больных раком яичников выявлена положительная корреляция между концентрациями изученных маркеров в опухоли и сыворотке крови.

Предполагается, что несмотря на отсутствие четкой ассоциации уровня экспрессии ММП и ТИМП в опухоли с основными клинико- морфологическими факторами неблагоприятного прогноза рака яичников, при длительном наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры смогут приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Наиболее перспективным сывороточным маркером для диагностики и мониторинга рака яичников является ММП-7: ее уровень повышен относительно контроля у 78% больных, он также коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников - СА-125.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Изменение внутриопухолевого содержания и сывороточной концентрации мариксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов при переходе от доброкачественных новообразований яичников к пограничным и злокачественным.

2. Матрилизин (ММП-7) как перспективный серологический маркер рака яичников, коррелирующий с распространенностью процесса. Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников отделения опухолей женской репродуктивной системы, лаборатории клинической биохимии, отделения гинекологии, отделения амбулаторных методов диагностики и лечения, отделения радиохирургии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 21 июня 2011 г. Материалы диссертации представлены на VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2009), 37, 38 и 39-м съездах ISOBM (International Society of Oncology and Biomarkers) (Амстердам, 2009; Мюнхен, 2010; Флоренция, 2011), Научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009), Днях лабораторной медицины - 2010, 2011 (Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в т.ч. 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах, состоит из введения, обзора литературы, характеристики клинического материала и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 8 отечественных и 109 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 44 таблицами и 8 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Характеристика больных. В исследование включено 102 больных новообразованиями яичников, проходивших обследование и лечение в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период с марта 2007 г. по июнь 2010 г. У 24 (23,5%) из них выявлены доброкачественные образования яичников, у 11 (9,5%) - пограничные опухоли и у 67 (67%) - злокачественные опухоли яичников. Из 67 больных раком яичников 49 обследованы до начала специфического лечения, а 18 - после ранее проведенной терапии. В контрольную группу вошли 30 практически здоровых женщин.

Среди доброкачественных новообразований преобладали опухоли серозного и эндометриоидного типа, а также неэпителиальные опухоли -стромы полового тяжа и герминогенные. Возраст больных доброкачественными опухолями составил 17 -76 лет, медиана - 44 года. Пограничные опухоли были отнесены преимущественно к муцинозному типу. Возраст больных этими новообразованиями находился в пределах от 23 до 63 лет, медиана - 45 лет.

Возраст больных раком яичников - от 17 до 82 лет, медиана - 55 лет. 62% больных находились в постменопаузе, 36% - в репродуктивном периоде. I-II стадия заболевания была только у 31% больных, а более чем у половины пациенток был распространенный процесс IIIc-IV стадии. По гистологическому строению 75% опухолей представляли собой серозные цистаденокарциномы, на втором месте по частоте были эндометриоидные аденокарциномы - 12%. Распределение опухолей по степени дифференци-ровки было достаточно равномерным. Большинство обследованных больных - 52% - были прооперированы с последующей химиотерапией, 28% -прооперированы после предшествующей химиотерапии, 19% оперированы повторно.

Биохимические исследования. Содержание исследуемых белков определяли в сыворотке крови, полученной по стандартной методике до операции, лизатах опухолей и асцитической жидкости, освобожденной от клеточного материала с помощью центрифугирования при 2000 об/мин в течение 15 мин, 4°С. Опухолевый материал брали во время операции и хранили при -70°С до начала исследования. Маркеры определяли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа: «Ни-man/Mouse/Rat ММР-2 (total)», «Human ММР-7 (total)», «Human ММР-9 (total)», «Human TIMP-1» и «Human TIMP-2» (Quantikine®, R&D Systems, США) - в соответствии с инструкциями производителей. Содержание ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1 было определено в опухолях и сыворотке крови всех больных, содержание ТИМП-2 - у 45 пациенток. У 25 больных определено также содержание всех маркеров в асцитической жидкости. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 (Bio-Tek Instruments Inc., США). Концентрацию исследо-

ванных показателей в сыворотке крови и асцитической жидкости выражали в нг/мл, в тканях - в нанограммах (нг) на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури.

В статистическом анализе использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни - при сравнении двух независимых подгрупп, медианный тест или тест Краскелла-Уоллиса - при сравнении нескольких подгрупп (оценка роли признака в целом), тест корреляции рангов Спирмена (R) при анализе взаимосвязей между различными показателями. Различия и корреляции считали достоверными при р<0,05. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программного пакета «Statistica 7.0» (StatSoft Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях больных различными новообразованиями

яичников

На первом этапе статистического анализа полученных данных мы сопоставили содержание исследованных ММП и ТИМП в доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолях яичников (рис. 1).

Выявлено достоверное увеличение уровня ММП-7 в ткани рака яичников по сравнению с доброкачественными опухолями, что косвенно подтверждает участие матрилизина в формировании инвазивного потенциала рака яичников. Аналогичная тенденция продемонстрирована и для ММП-9, однако для этой протеазы различия не достигли порога статистической значимости.

В то же время, для ММП-2 обнаружена противоположная закономерность - ее уровень в доброкачественных опухолях оказался достоверно более высоким, чем в пограничных и злокачественных. Такая особенность ММП-2 согласуется с экспериментальными данными о снижении ее экспрессии в клетках рака по сравнению с нетуморогенными клетками поверхностного эпителия яичников, а выявленные закономерности в целом свидетельствуют о различной роли ММП, в том числе и близких по свой-

ствам специфических коллагеназ ММП-2 и ММП-9, в малигнизации опухолей яичников.

Рис. 1. Содержание ММП и ТИМП в опухолях больных новообразованиями яичников: А - доброкачественные опухоли; В - пограничные; С - рак яичников. По оси ординат: содержание маркера в нг/мг белка. Прямоугольники отражают величины 25-75% квартилей, пересекающая их линия — медиану. Различия: ММП-2: p^vsB = 0,021; Ра^с = 0,002. ММП-7:pAvsC = 0,012; ТИМП-1: pBvsC= 0,018. ТИМП-2:

Pavsc = 0,012.

По-разному менялась при переходе от доброкачественных опухолей яичников к злокачественным и экспрессия двух типов ТИМП (рис. 1): уро-

вень ТИМП-2 в ткани рака был достоверно снижен, а уровень ТИМП-1 был сходным в доброкачественных и злокачественных опухолях, но существенно повышен в пограничных новообразованиях.

Мы проанализировали также корреляционные взаимосвязи между уровнями изучаемых маркеров в опухолях. Выявлена достоверная положительная корреляция содержания ТИМП-1 с содержанием ММП-7 (11=0,33; р = 0,038) и ММП-9 (11=0,41; р = 0,012) в ткани рака яичников. При этом показатели содержания ММП-7 и 9 не коррелировали между собой. В то же время достаточно четкая взаимосвязь между уровнями ММП-7 и 9 выявлена в доброкачественных новообразованиях яичников (11=0,47; р = 0,034). В этих опухолях отмечается также положительная взаимосвязь уровней ММП-2 и ТИМП-2 (11=0,65; р = 0,02), причем, как отмечено выше, оба эти маркера повышены в доброкачественных опухолях по сравнению со злокачественными. Таким образом, соотношение между уровнями экспрессии различных представителей семейства ММП изменено в злокачественных опухолях яичников по сравнению с доброкачественными.

В целом, сравнительный анализ содержания ММП и ТИМП в доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолях яичников продемонстрировал увеличение экспрессии ММП-7 и тенденцию к увеличению тканевого уровня ММП-9 в злокачественных новообразованиях яичников по сравнению с доброкачественными и пограничными. Для ММП-2 и ТИМП-2 отмечается противоположная закономерность - их уровень наиболее высок в доброкачественных опухолях. Такая особенность ММП-2 согласуется с экспериментальными данными о снижении ее экспрессии в клетках рака по сравнению с нетуморогенными клетками поверхностного эпителия яичников.

У 18 из 67 обследованных больных раком яичников материал для им-муноферментных исследований был получен после проведения различной предоперационной терапии. В опухолях больных раком яичников, получавших специфическое лечение, уровень ММП-2 достоверно выше, чем в опухолях нелеченных больных и даже превышает показатели доброкачественных опухолей. Отмечена тенденция к снижению содержания ТИМП-1 в

и

опухолях предварительно леченных больных, уровни ММП-7 и ММП-9 в обеих группах практически не отличаются.

Таким образом, можно предположить, что после проведения предоперационной терапии происходит относительная «нормализация» содержания всех ММП и ТИМП в ткани рака яичников и их смещение к показателям, характерным для доброкачественных новообразований.

Взаимосвязь экспрессии матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях с клиннко-морфологическнми особенностями рака яичников.

На следующем этапе работы мы проанализировали содержание ММП и ТИМП в опухолях больных раком яичников в зависимости от клинических особенностей и морфологических характеристик опухолей. Из этого анализа были исключены тех больные, получившие специфическое лечение до операции и взятия материала для иммуноферментных исследований.

Таблица 1.

Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 (нг/мг белка)

в опухолях больных раком яичников в зависимости от возраста.

Показатель Возраст

До 50 лет (1) 50-59 (2) 60 и более (3)

п Медиана, пределы п Медиана, пределы п Медиана, пределы

ММП-2 14 13,4 1,1-55,4 17 13,1 2,6-86,7 12 8,9 1,1-84,7

ММП-7 14 6,1 0-13,8 18 5,0 0,2-51,8 12 1,6 0,6-13,8

ММП-9 14 27,8 0-450 15 28,6 0-262 12 8,8 0,5-133

ТИМП-1 13 36,2 3,6-106 14 34,1 5,2-165 12 30,3 6,5-58,8

ТИМП-2 7 9,8 2,7-15,3 5 8,3 4,4-10,7 10 9,3 3,2-44,7

Примечание: ММП-9:р2г1з= 0,0047;р¡т3=0,016.

В таблице 1 представлены результаты анализа внутриопухолевого содержания исследуемых ММП и ТИМП у больных различных возрастных групп. Можно отметить тенденцию к снижению всех показателей у больных старшей возрастной группы (60 лет и более), однако достоверным это снижение является только для ММП-9, а наименее выражено оно для ММП-2. При сравнении изучаемых показателей в опухолях больных с сохраненной менструальной функцией и находящихся в менопаузе достоверных различий обнаружено не было, однако отмечена выраженная тенденция к снижению уровня ММП-9 и ММП-7 в опухолях больных второй группы по сравнению с первой.

Выявленные закономерности и тенденции косвенно отражают тот факт, что у пожилых больных злокачественный процесс протекает медленнее и менее агрессивно, чем у более молодых.

Мы проанализировали также взаимосвязь исследуемых показателей с такими факторами гинекологического анамнеза пациенток, как возраст менархе, наличие родов и абортов, а также других гинекологических заболеваний и операций. Значимых различий при этом выявлено не было

Анализ взаимосвязи концентраций исследованных маркеров в ткани рака яичников с основными клинико-морфологическими факторами прогноза показал, что достоверных различий уровней различных ММП в зависимости от стадии рака яичников по классификации FIGO не наблюдается, однако уровни ММП-9 в опухолях больных I-II стадии оказались значительно выше, чем в опухолях больных III-IV стадии. В то же время уровень ТИМП-1 в опухолях при III-IV стадии был достоверно снижен по сравнению с I-II (табл. 2). При учете отдельных показателей распространенности рака яичников выяснилось, что внутриопухолевое содержание ММП-2 и ММП-7 достоверно выше при двустороннем поражении яичников, чем при одностороннем. Противоположная тенденция отмечена и для ММП-9, но эти различия не достигли уровня статистической значимости.

Таблица 2.

Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в опухолях больных раком яичников в зависимости от показателей распространенности опухоли.*

Показатель распространимости

ММП-2

ММП-7

ММП-9

ТИМП-1

Стадия FIGO

Ia-Ic

13

11,1 1,2-40,7

4,0 0,0251,8

65,7 0-450

57,7 3,6-165

Па - ПЬ

30,1 2,2-46,0

1,3 0-2,6

131 0-262

15,0 14,9-49,6

1-Й

17

11,9 1,2-46,0

2,6 0-5 U

65,7 0-450

52,6' 3,6-165

lila - 111с

22

11,1 1,1-86,7

5,2 0,6-13,8

17,6 0-157

31,0 5,2-64,9

IV

22,9 1,1-46,4

1,0 0,7-13,8

10,1 3,6-164

27,5 6,5-43,7

III - IV

27

12,1 1,1-86,7

4,4 0,6-13,8

16,8 0-164

28,7' 5,2-64,9

Размер опухоли по данным УЗИ

До 10 см (1)

16,6 2,0-40,5

1,6 0,2-9,4

56,5 0,5-239

40,1 13,2-77,9

Более 10 см (2)

12

3,1' 1,1-44,8

1,9" 0,2-51,8

33,3 0-450

38,3 5,2-165

Односторонне е поражение (1+2)

17

5,03 1,1-44,8

1,65 0,2-51,8

33,3 0-450

38,5 5,2-165

"67х 0,0219,7

Двустороннее поражение (3)

25

15,4" 2,7-86,7

14,8 0-164

29,9 3,6-145

Диссеминация по брюшине

Нет (1)

14

11,9 2,6-46,0

4,3 0-51,8

11,6 0-450

52,6 3,6-165

просовидная (2)

13,1 7,6-86,7

8,0° 2,1-13,8

17,8 2,9-137

41,6 13,1-57,7

До 2 см (3) 21 11,0 1,1-84,7 1,6* 0,6-13,8 12,6 0-164 28,1 5,2-64,9 8,7 2,8-44,7

Метастазы в большой сальник

Нет 20 13,2 1,2-46,0 2,3 0-51,8 25,7 0-450 49,6 3,6-165 10,2 2,7-44,7

До 2 см 10 11,1 2,9-86,7 8,9 0,7-13,8 18,4 0-164 24,6 5,2-64,9 12,0 3,2-15,3

2-5 см 8 9,3 1,1-55,4 5,4 1,0-8,5 71,3 9,4-157 31,0 22,8-43,7 6,4 2,8-13,8

«Панцирный» сальник 6 25,0 1,1-84,7 2,1 0,7-13,8 10,6 3,6-37,9 21,8 6,1-58,8 6,2 4,3-10,3

Асцит

Нет (1) 28 П,17 1,1-55,4 2,3 0-51,8 28,6 0-450 39,3 3,6-165 6,2 2,7-44,7

До 5 л (2) 12 24,6' 1,2-86,7 4,4 0,7-13,8 11,2 6,8-164 27,5 6,1-58,8 12,9 4,3-15,3

Более 5 л(3) 5 9,0 1,1-55,4 2,5 1,1-9,7 37,9 18,4-137 27,3 20,5-33 4,4 3,2-5,2

Опухолевые клетки в асците или смыве брюшной полости

Есть 29 13,1 1,1-86,7 4,4 0,0219,7 18,6 0-450 31,0 3,6-145 8,3 2,7-16,8

Нет 10 15,0 2,9-46,0 1,4 0-9,4 105 0-262 47,3 5,2-165 7,0 4,3-9,8

* Представлены медианы и диапазоны значений (нг/мг белка). ' Pi-iivsiii-iv = 0,022; 2p2vs3 = 0,0004; 3p(l+2)m3 = 0,004;4р2т3 = 0,036;sp(l+2)vs3 = 0,03; 6p2vs3~0,01; 7pivs2=0,038.

Выраженной взаимосвязи содержания исследуемых маркеров в ткани первичной опухоли с характером диссеминации рака яичников по брюшине и наличием и размером метастазов в большом сальнике, а также локализацией отдаленных метастазов не обнаружено. Только уровень ММП-7 был достоверно выше в опухолях больных с просовидными очагами по брюшине, чем в опухолях больных с более крупными диссеминатами (табл. 2).

Образование асцита - одно из наиболее характерных свойств рака

яичников. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что различные представители семейства ММП в комплексе с факторами роста, ангиогенными факторами, белками клеточной поверхности могут активно участвовать в процессах, ведущих к образованию асцита и появлению опухолевых клеток в асцитической жидкости. Отмечено достоверное увеличение уровня ММП-2 в опухолях больных с объемом асцита до 5 л по сравнению с опухолями больных, у которых асцита не было (табл. 2). В то же время в опухолях у больных с большим количеством асцита уровень этой ММП не отличался от такового у пациенток без асцита.

Таким образом, однозначной взаимосвязи, свидетельствующей об увеличении уровня ММП в ткани рака яичников по мере распространения опухолевого процесса, выявить не удалось. В ряде случаев наблюдалось даже снижение уровня некоторых ММП при наиболее распространенном процессе: например, уровень ММП-7 снижался при массивной диссемина-ции по брюшине, а уровень ММП-9 - при двустороннем поражении яичников. В этой связи можно предположить, что продукция ММП в большей степени необходима опухолям на начальных или промежуточных стадиях развития, а при распространенном процессе потребность в протеолитиче-ской деградации внеклеточного матрикса снижается.

Важными факторами, определяющими течение рака яичников, являются гистологическое строение и степень дифференцировки опухоли. Более половины исследованных нами первичных эпителиальных раков яичников (27) принадлежали к серозному типу. В опухолях этого гистологического строения отмечено достоверное увеличение уровня ММП-2 (р=0,01) и снижение уровня ТИМП-1 (р=0,03) по сравнению с эндометрио-идными и муцинозными новообразованиями. Низкие уровни всех ММП и ТИМП-1 выявлены также в светлоклеточных раках. Несмотря на то, что распределение опухолей по степени дифференцировки было достаточно равномерным, что позволяло провести значимый статистический анализ, достоверной взаимосвязи показателей экспрессии ММП и ТИМП со степенью дифференцировки рака яичников обнаружено не было.

В целом, анализ уровня экспрессии трех ММП и их тканевых ингибиторов в ткани различных новообразований яичников показал:

1) В злокачественных и пограничных опухолях яичников существенно повышена экспрессия ММП-7 и снижена экспрессия ММП-2 и ТИМП-2 по сравнению с доброкачественными новообразованиями. Уровень ММП-9 повышается незначительно, а уровень ТИМП-1 наиболее высок в пограничных опухолях.

2) Выраженной взаимосвязи уровней исследуемых маркеров в опухолях больных первичным раком яичников с клинико-морфологическими особенностями заболевания не выявлено.

Содержание матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови больных доброкачественными, пограничными и злокачественными опухолями яичников и контрольной группы.

В практическом плане важен вопрос о том, в какой мере изменение продукции матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевой ткани отражается на их концентрации в периферической крови, так как при наличии корреляции между этими показателями появляется возможность оценки метастатического и инвазивного потенциала опухоли без хирургического вмешательства.

Проанализировав корреляционные взаимосвязи тканевого и сывороточного уровня исследуемых маркеров, мы выявили в общей группе обследованных больных не сильные, но достоверные положительные корреляции уровней всех трех ММП в сыворотке крови и в опухолевой ткани (для ММП-2 11=0,31, р=0,020; для ММП-7 11=0,29, р=0,006; для ММП-9 11=0,24, р=0,019), усиливавшиеся для ММП-7 и ММП-9 в группе больных раком (11=0,35; р=0,022 и 11=0,36; р=0,020, соответственно) и не проявлявшиеся у больных доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников.

Таким образом, можно предположить, что у больных раком яичников концентрация ММП-7 и ММП-9 в периферической крови, в определенной степени отражает уровень экспрессии этих белков в опухолевой ткани, а

при доброкачественных и пограничных новообразованиях яичников сывороточные ММП, скорее всего, имеют неопухолевое происхождение.

Рис. 2. Содержание ММП н ТИМП в сыворотке крови: N - контрольная группа; А - больные доброкачественными опухолями; В - больные пограничными опухолями; С - больные раком яичников (представлены данные только по первичным больным). По оси ординат: содержание маркера в нг/мл. Прямоугольники - величины 25-75% квартилей, пересекающая их линия - медиана. Различия: ММП-2: 0,003; р^г=0,003; рКкВ=0,04; ММП-7: РпвС=0,0029; рАпС=0,0003; рВтС=0,01; ММП-9: рЫтС=0,026; рЛтС=0,0574; ТИМП-1: р^в=0,017; ршс=0,039; РачзС~ 0,004; рвкС-0,015.

Другим важным аспектом изучения уровня биологических маркеров в сыворотке крови является возможность их использования для дифференциальной диагностики и/или мониторинга эффекта лечения. Продемонстрировано достоверное увеличение содержания ММП-7 и ММП-9 в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с контролем и пациентками с доброкачественными и пограничными новообразованиями (рис. 2). В то же время, содержание ММП-2 в сыворотке крови больных раком и пограничными опухолями яичников было достоверно ниже, чем в контроле, а у больных доброкачественными новообразованиями яичников достоверно не отличалось от показателей контрольной группы. Это соотношение соответствует закономерностям, выявленным для опухолевых тканей. Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови больных раком яичников достоверно выше, чем у пациентов всех других групп, а самый низкий уровень ТИМП-1 выявлен в сыворотке крови больных пограничными опухолями яичников (рис. 2).

В целом, анализ содержания ММП и ТИМП в сыворотке крови показал, что наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики пограничных, доброкачественных и злокачественных новообразований яичников является ММП-7. Уровень этой ММП повышен относительно контроля только у больных раком яичников. Превышение верхней границы нормы (95% показателей контрольной группы - менее 4,67 нг/мл) отмечено у 38 из 49 первичных больных раком, т.е. чувствительность относительно контроля при 95%-ной специфичности составляет 78%. Чувствительность этого теста относительно доброкачественных и пограничных новообразований составляет соответственно 37,5 и 64%. Чувствительность ММП-9 и ТИМП-1, также повышенных в сыворотке крови больных раком, составляет всего 24 и 23% при пороговых значениях 565 нг/мл и 504 нг/мл, соответственно.

Взаимосвязь экспрессии матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях с клпнико-морфологическими особенностями рака яичников.

При анализе взаимосвязи показателей сыворотки крови с клинико-морфологическими особенностями рака яичников (табл. 3) оказалось, что в

наибольшее число закономерностей выявляется для ММП-7.

Ее уровень достоверно положительно коррелировал с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита. Уровень ММП-7 в сыворотке крови коррелировал также и с ее концентрацией в асцитической жидкости (11=0,53; р=0,008).

Таблица 3.

Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови больных раком яичников в зависимости от показателей распространенности опухоли*.

Показатель распространенности п ММП-2 ММП-7 ММП-9 ТИМП-1 ТИМП-2

Стадия FIGO

Ia-Ic 13 11,1 1,2-40,7 4,0 0,0251,8 65,7 0-450 57,7 3,6-165 9,8 2,7-14,2

IIa - IIb 4 30,1 2,2-46,0 1,3 0-2,6 131 0-262 15,0 14,9-49,6 44,7

1-И 17 11,9 1,2-46,0 2,6 0-51,8 65,7 0-450 52,6' 3,6-165 10,2' 2,7-44,7

Illa-IIIc 22 11,1 1,1-86,7 5,2 0,6-13,8 17,6 0-157 31,0 5,2-64,9 8,3 3,2-16,8

IV 5 22,9 1,1-46,4 1,0 0,7-13,8 10,1 3,6-164 27,5 6,5-43,7 6,2 2,8-12,0

III - IV 27 12,1 1,1-86,7 4,4 0,6-13,8 16,8 0-164 28,7' 5,2-64,9 7,3' 2,8-16,8

Размер опухоли по данным УЗИ

До 10 см (1) 5 16,6 2,0-40,5 1,6 0,2-9,4 56,5 0,5-239 40,1 13,2-77,9 9,8 3,2-16,8

Более 10 см (2) 12 3,1* 1,1-44,8 1,94 0,2-51,8 33,3 0-450 38,3 5,2-165 6,7 2,8-44,7

Одностороннее поражение (1+2) 17 5,0J 1,1-44,8 1,6S 0,2-51,8 33,3 0-450 38,5 5,2-165 8,3 2,7-44,7

Двустороннее поражение(3) 25 15,4" 2,7-86,7 6,74'5 0,0219,7 14,8 0-164 29,9 3,6-145 8,7 2,7-15,3

Диссеминация по брюшине

Нет (1) 14 11,9 2,6-46,0 4,3 0-51,8 11,6 0-450 52,6 3,6-165 7,4 2,7-10,7

просовидная (2) 9 13,1 7,6-86,7 8,0" 2,1-13,8 17,8 2,9-137 41,6 13,1-57,7 4,3 3,2-15,3

До 2 см (3) 21 11,0 1,1-84,7 1,6' 0,6-13,8 12,6 0-164 28,1 5,2-64,9 8,7 2,8-44,7

Метастазы в большой сальник

Нет 20 13,2 1,2-46,0 2,3 0-51,8 25,7 0-450 49,6 3,6-165 10,2 2,7-44,7

До 2 см 10 11,1 2,9-86,7 8,9 0,7-13,8 18,4 0-164 24,6 5,2-64,9 12,0 3,2-15,3

2-5 см 8 9,3 1,1-55,4 5,4 1,0-8,5 71,3 9,4-157 31,0 22,8-43,7 6,4 2,8-13,8

«Панцирный» сальник 6 25,0 1,1-84,7 2,1 0,7-13,8 10,6 3,6-37,9 21,8 6,1-58,8 6,2 4,3-10,3

Асцит

Нет (1) 28 И,Г 1,1-55,4 2,3 0-51,8 28,6 0-450 39,3 3,6-165 6,2 2,7-44,7

До 5 л (2) 12 24,б7 1,2-86,7 4,4 0,7-13,8 11,2 6,8-164 27,5 6,1-58,8 12,9 4,3-15,3

Более 5 л(3) 5 9,0 1,1-55,4 2,5 1,1-9,7 37,9 18,4-137 27,3 20,5-33 4,4 3,2-5,2

Опухолевые клетки в асците или смыве брюшной полости

Есть 29 13,1 1,1-86,7 4,4 0,0219,7 18,6 0-450 31,0 3,6-145 8,3 2,7-16,8

Нет 10 15,0 2,9-46,0 1,4 0-9,4 105 0-262 47,3 5,2-165 7,0 4,3-9,8

* Представлены медианы и диапазоны значений (нг/мл).

1 Р(Н2МзигО, 00025; 2рм=0,003; 3рЫ4=0,004; 4рм=0,048;5рц^з = 0,000002; 6р2т} = 0,039; 7рм = 0,055; *рш = = 0,029; юр,^0,001; "рш=0,01;

пр,„2=0,027; "р,„з=0,01; " рм=0,0005;15р,„2=0,02; ,6рш=0,01; "ры2"0,01;19 р=0,015.

Таким образом, анализ содержания трех ММП и их тканевых ингибиторов в сыворотке крови больных различными новообразованиями яичников показал, что наиболее перспективным маркером как для дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных новообразований, так и для оценки распространенности рака яичников является ММП-7 (матрилизин): уровень этой ММП превышает показатели контроля у более 90% больных раком, а также возрастает по мере увеличения местного и отдаленного распространения заболевания. Кроме того, это единственный из исследованных маркеров, сывороточный уровень которого коррелирует с уровнем классического маркера рака яичников СА-125.

. Содержание матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в асцнтической жидкости.

Как уже отмечалось, одной из важнейших особенностей рака яичников, отличающих его от многих других злокачественных новообразований, является высокая частота образования асцита. Экспериментально доказано, что различные представители семейства ММП в комплексе с факторами роста, ангиогенными факторами, белками клеточной поверхности могут активно участвовать в процессах, ведущих к образованию асцита.

Таблица 4.

Содержание ММП-2, ММП-7, ММП-9, ТИМП-1 и ТИМП-2 (нг/мл) в

асцнтической жидкости больных новообразованиями яичников.

Опухоли п ММП-2 ММП-7 ММП-9 ТИМП-1 ТИМП-2

Пограничные 2 301 298-305 22,7 20,6-24,9 5,4 2-8,8 1474 1465-1483 183 179-187

Злокачественные 23 451 158-565 43,6 3,6-117 19,5 0-2114 1557 1067-1815 206 134-314

Первичные 20 447 158-565 51,2 3,6-117 26,4 0-2114 1537 1067-1733 203 134-314

После лечения 3 492 472-511 8,3 4,1-30,2 14,2 5,0-19,5 1573 1542-1815 209 203-314

Примечание: ММП-7: р=0,045 при сравнении группы первичных и леченных больных раком; ММП-9: р=0,07 при сравнении группы первичных и леченных больных.

Выше мы проанализировали взаимосвязь между наличием и объемом асцита, присутствием в нем или в смывах брюшной полости опухолевых клеток и содержанием ММП и ТИМП в первичных опухолях и сыворотке крови первичных больных раком яичников. Кроме того, нам удалось определить содержание исследуемых маркеров в асцитической жидкости 25 больных (табл. 4). У двух из них опухоли были отнесены к пограничному типу, у 23 - был рак яичников, причем 2 пациентки обследованы после предварительного лечения. Небольшой размер большинства сравниваемых групп не позволил выявить достоверные различия, однако обращает на себя внимание существенно более низкие уровни всех маркеров, в особенности, ММП-7 и ММП-9, в асцитической жидкости пограничных опухолей по сравнению со злокачественными. Кроме того, уровни ММП-7 и ММП-9 снижены в асцитической жидкости, исследованной после лечения, по сравнению с асцитической жидкостью нелеченных больных (для ММП-7 различие достоверно).

Исследовав корреляционные взаимосвязи содержания исследованных маркеров в асцитической жидкости с соответствующими показателями опухолей и сыворотки крови, мы обнаружили, что концентрация ММП-7 в асцитической жидкости достоверно положительно коррелирует с ее содержанием как в ткани опухоли (11=0,42; р=0,047), так и в сыворотке (11=0,53; р=0,008). Кроме того, выявлена сильная положительная взаимосвязь между содержанием ММП-2 в асцитической жидкости и в опухоли (11=0,55; р=0,013). Других значимых корреляций не обнаружено.

Таким образом, в асцитической жидкости больных раком яичников обнаружены все исследованные матриксные металлопротеиназы и их тканевые ингибиторы. Содержание ММП-2 и ММП-7 в асците положительно взаимосвязано с содержанием соответствующих протеаз в опухолевой ткани, а ММП-7 - также и с показателями сыворотки крови. Значимой взаимосвязи с клинико-морфологическими факторами не обнаружено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммуноферментное исследование содержания нескольких матрикс-ных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолевой ткани,

сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников показало координированное увеличение тканевой экспрессии и сывороточной концентрации ММП-7 при раке яичников, нарастающее по мере распространения заболевания. Противоположная направленность изменений обнаружена для другой металлопротеиназы - ММП-2. В меньшей степени выражены изменения в показателях содержания ММП-9 и ТИМП 1 и 2 типа. Наиболее значимым маркером рака яичников следует признать ММП-7, которая помимо разрушения компонентов внеклеточного матрикса, участвует также в про-цессинге некоторых биологически важных молекул клеточной поверхности.

ВЫВОДЫ

1. Статистический анализ показал, что в группе больных раком яичников достоверно повышено внутриопухолевое содержание ММП-7 и снижено содержание ММП-2 и ТИМП-2 по сравнению с показателями больных доброкачественными опухолями, а уровни ММП-9 и ТИМП-1 в различных новообразованиях яичников достоверно не различаются.

2. При учете показателей распространенности рака яичников выявлены следующие достоверные различия: 1) более высокое содержание ММП-2 и ММП-7 в первичных опухолях при двустороннем поражении яичников, чем при одностороннем; 2) более высокий уровень ММП-7 в опухолях при наличии просовидных очагов по брюшине, чем при наличии более крупных очагов; 3) увеличение уровня ММП-2 в опухолях больных с асцитом по сравнению с опухолями больных, у которых асцита не было.

3. Содержание ММП-2 достоверно увеличено, а содержание ТИМП-1 снижено в серозных раках яичников по сравнению с эндометриоидны-ми и муцинозными. Значимых взаимосвязей уровней ММП-7, 9 и ТИМП-2 с гистологическим строением и степенью дифференцировки рака яичников не обнаружено.

4. В сыворотке крови больных раком яичников, обследованных до проведения специфического лечения, достоверно повышено содержание ММП-7, ММП-9 и ТИМП-1 и снижено содержание ММП-2 по сравне-

нию с показателями группы контроля и пациенток с доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников. При этом наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики пограничных, доброкачественных и злокачественных новообразованиями яичников является ММП-7: ее уровень повышен относительно контроля (пороговое значение - 4,67 нг/мл) у 78% больных раком яичников.

5. В общей группе обследованных больных выявлены не сильные, но достоверные положительные корреляции уровней всех трех ММП в сыворотке крови и в опухолевой ткани, усиливающиеся в группе больных раком и не проявляющиеся у больных доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников. Уровень ММП-7 в сыворотке крови коррелирует также с ее содержанием в асцитической жидкости.

6. Уровень ММП-7 в сыворотке крови достоверно положительно коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников - СА-125. Для других ММП и ТИМП значимых взаимосвязей с клинико-морфологическими особенностями рака яичников не обнаружено.

7. Проведенное иммуноферментное исследование содержания нескольких ММП и ТИМП в опухолевой ткани, сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников показало координированное увеличение тканевой экспрессии и сывороточной концентрации ММП-7 при раке яичников, нарастающее по мере распространения заболевания, что позволяет рассматривать ММП-7 (матрилизин) в качестве потенциально значимого серологического маркера рака яичников.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Герштейн Е.С., Матриксные металлопротеиназы 2, 7, 9 и тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 1 типа в опухолях и сыворотке крови больных новообразованиями яичников / Е.С.

Герштейн, H.B. Лёвкипа, М.А. Дигаева, К.П. Лактионов, И.В. Те-решкина, Д.Н.Кушлннский // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - т. 149. - № 5. - С. 562 - 565.

2. Герштейн Е.С., Матриксные металлопротеиназы и клинико -морфологическая характеристика новообразований яичников / Е.С. Герштейн, Н.В. Лёвкина, Н.Е. Кушлинский, Д.Н. Кушлин-ский, И.В. Терешкина, К.П. Лактионов, Л.В.Адамян // Технологии живых систем. - 2010. - т. 7. - №8. - С. 52-57.

3. Лёвкина Н.В., Клиническое значение исследования уровня матриксных металлопротеиназ 2, 7, 9 и тканевого ингибитора матриксиых металлопротеиназ 1 типа в опухолях и сыворотке крови больных новообразованиями яичников / Н.В. Лёвкина, Е.С.Герштейн, К.П.Лактионов, Н.Е.Кушлинский // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №9. - С.22-23.

4. Герштейн Е.С., Взаимосвязь экспрессии компонентов VEGF-сигнального пути и матриксных металлопротеиназ в опухолях больных с новообразованиями яичников / Е.С. Герштейн, Н.В. Лёвкина, Д. Н. Кушлинский, И.В.Терешкина, В.Б. Носов, К.П. Лактионов, Л.В Адамян // Бюлетень экспериментальной биологии и медицины. - 2011. - т. 151. - №4. - С. 431-435.

5. Герштейн Е.С., Клинические перспективы исследования матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у больных раком яичников / Е.С.Герштейн, Н.В. Лёвкина, Д.Н. Кушлинский, И.В.Терешкина, Ю.В.Крюк, Л.В.Адамян, К.П. Лактионов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.- 2011.-№10.- С. 27-34.

6. Герштейн Е.С., Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы 1 и 2 типа в опухолях и сыворотке крови больных новообразованиями яичников / Е.С. Герштейн, Н.В. Лёвкина, М.А. Дигаева, Ю.В. Крюк, Д.Н. Кушлинский // Труды научно практической конференции « Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года». М. - «Лабора». - 2009. - С. 31-32.

7. Герштейн Е.С., Сравнительное исследование уровня матриксных металлопротеиназ и компонентов VEGF- сигнального пути в опухолях и сыворотке крови больных опухолями яичников / Е.С. Герштейн, Н.В. Лёвкина, М.А. Дигаева, Д.Н.Кушлинский, К.П.Лактионов // VI

Международная конференция « Молекулярная медицина и биобезопасность». Сборник материалов. -10-11 ноября 2009 г. - Москва,- С. 62-63.

8. Лёвкина Н.В., Матриксные металлопротеиназы и компоненты VEGF-сигнального пути в опухолях и сыворотке крови больных опухолями яичников / Н.В.Лёвкина, Е.С. Герштейн, М.А. Дигаева, Д.Н. Куш-линский , К.П. Лактионов // XIII Российский онкологический конгресс. Российская академия медицинских наук Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН. - 17-19 ноября 2009 г. - Москва. - С.366 - 367.

9. Герштейн Е.С., Матриксные металлопротеиназы 2, 7, 9 и их тканевой ингибитор 1 типа в опухолях и сыворотке крови больных новообразованиями яичников / Е.С. Герштейн, Н.В. Лёвкина, И.В. Те-решкина, Д.Н. Кушлинский, К.П. Лактионов // VII Международная конференция « Молекулярная медицина и биобезопасность». Сборник материалов. - 28-29 октября 2010г. - Москва. - С. 53 - 54.

10. Gershtein E.S., Comparative ELISA study of matrix metalloproteinase (MMPs) and VEGF/VEGF receptors levels in tumours and peripheral blood of patients with ovarian neoplasm / E.S. Gershtein, N.V. Levkina, M.A. Digaeva, D.N. Kushlinsky, K. P. Lactionov // International Society of Oncology and Biomarkers 37th Meeting. Biomarkers and New Treatment Strategies in Oncology. ISOBM 2009. Amsterdam, The Netherlands. - September 27 - 30. - 2009. - P. 61.

11. Gershtein E.S., Vascular endothelial growth factor and its receptor in tumor tissue and patients with ovarian neoplasms: clinico- pathologic analysis / E.S. Gershtein, N.V. Levkina , D.N. Kushlinsky, K.P. Lactionov, L.V. Adamyan // Tumor Biology. - 2010. - V.31. - Suppl.l. - P. 109.

12. Герштейн E.C., Клиническое значение исследования матриксных ме-таллопротеиназ и их тканевых ингибиторов у больных раком яичников / Е.С.Герштейн, Н.В.Лёвкина, Д.Н.Кушлинский, И.В. Терешкина, Ю.В.Крюк, К.П.Лактионов // Клиническая лабораторная диагностика. -2011. -№9.-С. 21. (^te^

Подписано в печать 06.10. ц Формат 60x84/16.

Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 967 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы. Рак яичников - одна из наиболее инвазив-ных злокачественных опухолей, при этом у большинства больных заболевание диагностируется на достаточно поздних стадиях, когда опухоль уже распространена по брюшине. Трудности ранней диагностики и высокий метастатический и инвазивный потенциал рака яичников определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно воздействующих на процессы метастазирования и инвазии.

Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеазами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоангиогенеза [2, 33, 35]. В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеаз, к важнейшим из которых следует отнести группу матриксных металлопро-теиназ (ММП) или матриксинов, названных так именно за свою способность специфически гидролизовать все основные белки внеклеточного матрикса, в первую очередь, коллаген [31, 32, 36, 110]. ММП - это мульти-генное семейство, состоящее из более 20 секретируемых и связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопептидаз. Помимо большинства компонентов ВКМ, их субстратами могут быть также другие протеазы, хе-мотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста [39, 100, 114]. Важнейшими представителями семейства ММП являются различные неспецифические (ММП-1, ММП-8, ММП-13) и специфические (ММП-2/желатиназа А и ММП-9/желатиназа В) коллагеназы, матрилизин (ММР-7), стромелизины (ММР-3 и ММР-10). Активность ММР в межклеточном пространстве специфически подавляется тканевыми ингибиторами

ТИМП) - четырьмя структурно родственными белками, три из которых (ТИМГТ-1, -2 и -4) секретируются в растворимой форме, а один (ТИМП-3) -связан с ВКМ [82].

Для многих ММП продемонстрировано увеличение экспрессии в опухолях различного генеза, причем активация происходит по паракринному механизму с участием факторов роста и цитокинов, секретируемых инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, а также клетками опухолевой стромы [13]. В последнее время появляются данные, свидетельствующие о том, что ТИМП, в первую очередь, ТИМП-1 и ТИМП-2, играют важную самостоятельную роль в регуляции роста и дифференци-ровки опухолевых и нормальных клеток, а также обладают антиангиоген-ными свойствами [15, 82]. В связи с этим различные ММП и ТИМП рассматриваются в настоящее время в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности злокачественных опухолей, в частности, рака яичников [64, 79, 81, 94-96], а использование природных и синтетических ингибиторов ММП считается перспективным подходом к противоопухолевой терапии [10, 12, 14, 30, 44].

Цель работы:

Оценить клинические перспективы исследования содержания ключевых матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях, асцитической жидкости и сыворотке крови больных раком яичников.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить содержание ММР 2, 7, 9 и их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа в опухолях, асцитической жидкости и сыворотке крови больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников.

2. Проанализировать соотношение концентрации изучаемых белков в сыворотке крови больных раком яичников с уровнем их экспрессии в опухолевой ткани и концентрацией в асцитической жидкости.

3. Изучить взаимосвязь уровня изучаемых белков в опухолях, асцитической жидкости и сыворотке крови с основными клинико-морфологическими особенностями рака яичников (стадией процесса, гистологической формой и степенью дифференцировки опухоли, возрастом и менструальным статусом больных).

4. Изучить возможность комплексного использования клинических, морфологических и изученных биохимических факторов в прогнозировании эффективности лечения больных раком яичников.

Научная новизна и практическая значимость исследования:

Впервые количественными иммуноферментными методами исследован спектр экспрессии матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников, прослежена взаимосвязь внутриопухолевых и сывороточных концентраций этих белков. Показано, что в ткани рака яичников достоверно повышено содержание ММП-7 и снижено содержание ММП-2 и ТИМП-2 по сравнению с доброкачественными опухолями, а уровни ММП-9 и ТИМП-1 в различных новообразованиях яичников достоверно не отличаются. Продемонстрировано также достоверное повышение содержания ММП-7, ММП-9 и ТИМП-1 и снижение содержания ММП-2 в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с показателями группы контроля и пациенток с доброкачественными новообразованиями. У больных раком яичников выявлена положительная корреляция между концентрациями изученных маркеров в опухоли и сыворотке крови.

Предполагается, что несмотря на отсутствие четкой ассоциации уровня экспрессии ММП и ТИМП в опухоли с основными клинико- морфологическими факторами неблагоприятного прогноза рака яичников, при длительном наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры смогут приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Наиболее перспективным сывороточным маркером для диагностики и мониторинга рака яичников является ММП-7: ее уровень повышен относительно контроля у 78% больных, он также коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием асцита, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников - СА-125.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменение внутриопухолевого содержания и сывороточной концентрации матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов при переходе от доброкачественных новообразований яичников к пограничным и злокачественным.

2. Матрилизин (ММП-7) как перспективный серологический маркер рака яичников, коррелирующий с распространенностью процесса.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников отделения опухолей женской репродуктивной системы, лаборатории клинической биохимии, отделения гинекологии, отделения амбулаторных методов диагностики и лечения, отделения радиохирургии НИИ КО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 21 июня 2011 г. Материалы диссертации представлены на VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), XIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2009), 37, 38 и 39-м съездах ISOBM (International Society of Oncology and Biomarkers) (Амстердам, 2009; Мюнхен, 2010; Флоренция, 2011), Научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009), Днях лабораторной дицины - 2010,2011 (Москва).

выводы

1. Статистический анализ показал, что в группе больных раком яичников достоверно повышено внутриопухолевое содержание ММП-7 и снижено содержание ММП-2 и ТИМП-2 по сравнению с показателями больных доброкачественными опухолями, а уровни ММП-9 и ТИМП-1 в различных новообразованиях яичников достоверно не различаются.

2. При учете показателей распространенности рака яичников выявлены следующие достоверные различия: 1) более высокое содержание ММП-2 и ММП-7 в первичных опухолях при двустороннем поражении яичников, чем при одностороннем; 2) более высокий уровень ММП-7 в опухолях при наличии просовидных очагов по брюшине, чем при наличии более крупных очагов; 3) увеличение уровня ММП-2 в опухолях больных с асцитом по сравнению с опухолями больных, у которых асцита не было.

3. Содержание ММП-2 достоверно увеличено, а содержание ТИМП-1 снижено в серозных раках яичников по сравнению с эндометриоид-ными и муцинозными. Значимых взаимосвязей уровней ММП-7, 9 и ТИМП-2 с гистологическим строением и степенью дифференцировки рака яичников не обнаружено.

4. В сыворотке крови больных раком яичников, обследованных до проведения специфического лечения, достоверно повышено содержание ММП-7, ММП-9 и ТИМП-1 и снижено содержание ММП-2 по сравнению с показателями группы контроля и пациенток с доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников. При этом наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики пограничных, доброкачественных и злокачественных новообразованиями яичников является ММП-7: ее уровень повышен относительно контроля (пороговое значение - 4,67 нг/мл) у 78% больных раком яичников.

5. В общей группе обследованных больных выявлены не сильные, но достоверные положительные корреляции уровней всех трех ММП в сыворотке крови и в опухолевой ткани, усиливающиеся в группе больных раком и не проявляющиеся у больных доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников. Уровень ММП-7 в сыворотке крови коррелирует также с ее содержанием в асцитической жидкости.

6. Уровень ММП-7 в сыворотке крови достоверно положительно коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников - СА-125. Для других ММП и ТИМП значимых взаимосвязей с кли-нико-морфологическими особенностями рака яичников не обнаружено.

7. Проведенное иммуноферментное исследование содержания нескольких ММП и ТИМП в опухолевой ткани, сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников показало координированное увеличение тканевой экспрессии и сывороточной концентрации ММП-7 при раке яичников, нарастающее по мере распространения заболевания, что позволяет рассматривать ММП-7 (матрилизин) в качестве потенциально значимого серологического маркера рака яичников.

Глава IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Трудности ранней диагностики и высокий метастатический и инва-зивный потенциал рака яичников определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения этой опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно подавляющих процессы метастазирования и инвазии.

Известно, что одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеаза-ми, играющими также важную роль в процессах метастазирования и не-оангиогенеза. В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеаз, к важнейшим из которых следует отнести семейство матриксных металлопротеиназ, названных так именно за свою способность специфически гидролизовать все основные белки внеклеточного матрикса, в первую очередь, коллаген. Важнейшими представителями ММП являются желатина-зы А и В/специфические коллагеназы коллагена IV типа (ММП-2 и 9), а также матрилизин - ММП-7. Публикации последнего десятилетия свидетельствуют о том, что именно эти ММП являются перспективными маркерами для дифференциальной диагностики различных новообразований яичников и прогноза рака яичников. Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется четырьмя тканевыми ингибиторами. Среди них наиболее значимым маркером рака яичников, по данным литературы, является ТИМП-1.

Следует отметить, что большая часть исследований опухолевых тканей, описанных в литературе, выполнена полуколичественными иммуно-гистохимическими методами. В них, как правило, оценивали отдельно экспрессию ММП и/или ТИМП в эпителиальных и стромальных клетках, однако общую количественную оценку состояния ММП-зависимого протеолиза в опухолевой ткани не проводили. Не обнаружили мы в литературе и исследований, посвященных сравнению уровня ММП и ТИМП в опухолях и сыворотке крови.

Все вышеизложенное определило цель и задачи нашего исследования: 1) используя количественные иммуноферментные тесты, провести сравнительную оценку содержания ММП-2, ММП-7 и ММП-9, их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа в опухолях и сыворотке крови больных раком, доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников; 2) проанализировать взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями рака яичников; 3) на основании полученных результатов оценить клинические перспективы определения данных маркеров.

Всего в исследование вошли 67 больных раком яичников, 24 пациентки с доброкачественными и 11 с пограничными новообразованиями яичников. В опухолях и сыворотке крови большинства из них было определено содержание трех металлопротеиназ и ТИМП-1 (в различных сочетаниях), а содержание ТИМП-2 было исследовано у 45 пациенток. У 25 больных было определено содержание всех маркеров также и в асцитической жидкости.

На первом этапе статистического анализа полученных данных мы сопоставили содержание исследованных ММП и ТИМП в доброкачественных, пограничных и злокачественных опухолях яичников. Было выявлено достоверное увеличение уровня ММП-7 в ткани рака яичников по сравнению с доброкачественными и пограничными опухолями, что косвенно подтверждает участие матрилизина в формировании инвазивного потенциала рака яичников. Аналогичная тенденция была продемонстрирована и для ММП-9, однако для этой протеазы различия не достигали порога статистической значимости. В то же время, для ММП-2 обнаружена противоположная закономерность - ее уровень в доброкачественных опухолях оказался достоверно более высоким, чем в пограничных и злокачественных. Такая особенность ММП-2 согласуется с экспериментальными данными о снижении ее экспрессии в клетках рака по сравнению с нетуморо-генными клетками поверхностного эпителия яичников [23, 54], а выявленные закономерности в целом свидетельствуют о различной роли ММП, в том числе и близких по свойствам специфических коллагеназ ММП-2 и ММП-9, в малигнизации опухолей яичников.

По-разному менялась при переходе от доброкачественных опухолей яичников к злокачественным и экспрессия двух типов ТИМП: уровень ТИМП-2 в ткани рака был достоверно снижен, а уровень ТИМП-1 был сходным в доброкачественных и злокачественных опухолях, но существенно повышен в пограничных новообразованиях. Закономерности, выявленные для ТИМП-1, согласуются с данными 8ака1а и соавт. [87], обнаруживших, что диффузное иммуногистохимическое окрашивание на ТИМП-1 было интенсивнее в доброкачественных и пограничных опухолях, чем в аденокарциномах яичников.

Анализ взаимосвязи концентраций исследованных маркеров в ткани рака яичников с основными клинико-морфологическими факторами прогноза проводили только в подгруппе из 43 больных, не получавших специфического лечения до операции и взятия материала для исследования, поскольку оказалось, что предоперационное лечение может существенно влиять по крайней мере на некоторые из изучаемых показателей.

Достоверных различий уровней различных ММП в зависимости от стадии рака яичников выявить не удалось, однако уровни ММП-9 в опухолях больных 1-Н стадии оказались значительно выше, чем в опухолях больных Ш-1У стадии. В то же время уровень ТИМП-1 в опухолях при III-IV стадии был достоверно снижен по сравнению с 1-П. При учете отдельных показателей распространенности рака яичников выяснилось, что внут-риопухолевое содержание ММП-2 и ММП-7 достоверно выше при двустороннем поражении яичников, чем при одностороннем. Противоположная тенденция отмечена для ММП-9, но эти различия не достигли уровня статистической значимости. Выраженной взаимосвязи содержания исследуемых маркеров в ткани первичной опухоли с характером диссеминации рака яичников по брюшине и наличием и размером метастазов в большом сальнике, а также локализацией отдаленных метастазов не обнаружено. Только уровень ММП-7 был достоверно выше в опухолях больных с про-с овидными очагами в брюшной стенке, чем в опухолях больных с более крупными диссеминатами.

Образование асцита - одно из наиболее характерных свойств рака яичников. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что различные представители семейства ММП в комплексе с факторами роста, ангиогенными факторами, белками клеточной поверхности могут активно участвовать в процессах, ведущих к образованию асцита и появлению опухолевых клеток в асцитической жидкости. Отмечено достоверное увеличение уровня ММП-2 в опухолях больных с объемом асцита до 5 л по сравнению с опухолями больных, у которых асцита не было. В то же время в опухолях у больных с большим количеством асцита уровень этой ММП не отличался от такового у пациенток без асцита. Все исследованные мат-риксные металлопротеиназы и ТИМП обнаружены также в асцитической жидкости больных раком яичников. Выявлена обратная зависимость между количеством асцита и содержанием в нем ММП-2, при этом содержание ММП-2 и ММП-7 в асците положительно коррелировало с содержанием соответствующих протеаз в опухолевой ткани.

Таким образом, однозначной взаимосвязи, свидетельствующей об увеличении уровня ММП в ткани рака яичников по мере распространения опухолевого процесса, выявить не удалось. В ряде случаев наблюдалось даже снижение уровня некоторых ММП при наиболее распространенном процессе: например, уровень ММП-7 снижался при массивной диссеминации по брюшине, а уровень ММП-9 - при двустороннем поражении яичников. В этой связи можно предположить, что продукция ММП в большей степени необходима опухолям на начальных или промежуточных стадиях развития, а при распространенном процессе потребность в протеолитиче-ской деградации внеклеточного матрикса снижается.

Важными факторами, определяющими течение рака яичников, являются гистологическое строение и степень дифференцировки опухоли. Как и ожидалось, более половины исследованных нами первичных эпителиальных раков яичников принадлежали к серозному типу. В опухолях этого гистологического типа отмечено достоверное увеличение уровня ММП-2 и снижение уровня ТИМП-1 по сравнению с эндометриоидными и муциноз-ными новообразованиями. Низкие уровни всех ММП и ТИМП-1 выявлены также в светлоклеточных раках. Несмотря на то, что распределение опухолей по степени дифференцировки было достаточно равномерным, что позволяло провести значимый статистический анализ, достоверной взаимосвязи показателей экспрессии ММП и ТИМП со степенью дифференцировки рака яичников обнаружено не было.

При анализе взаимосвязи исследованных показателей с состоянием репродуктивной функции и некоторыми другими факторами гинекологического анамнеза пациенток была отмечена тенденция к снижению уровня всех маркеров в опухолях больных старшей возрастной группы, находящихся в менопаузе. Это наблюдение косвенно отражает тот факт, что у пожилых больных злокачественный процесс протекает, как правило, медленнее и менее агрессивно, чем у более молодых.

В целом, можно заключить, что четкой ассоциации уровня экспрессии ММП и ТИМП в опухоли с основными клинико-морфологическими факторами неблагоприятного прогноза рака яичников не выявлено, однако возможно, что при дальнейшем наблюдении за обследованными больными, данные биомаркеры смогут приобрести значение в качестве независимых прогностических факторов, определяющих как течение заболевания в целом, так и его чувствительность к отдельным видам лечения.

Одной из важных задач этого исследования было выяснение вопроса о том, в какой мере изменение продукции ММП и ТИМП в опухолевой ткани отражается на их концентрации в периферической крови. Проанализировав корреляционные взаимосвязи тканевого и сывороточного уровня исследуемых маркеров, мы выявили в общей группе обследованных больных не сильные, но достоверные положительные корреляции уровней всех трех ММП в сыворотке крови и в опухолевой ткани, усиливавшиеся в группе больных раком и не проявлявшиеся у больных доброкачественными и пограничными новообразованиями яичников. Таким образом, можно предположить, что у больных раком яичников концентрация ММП-7, ММП-9 и ММП-2 в периферической крови, в определенной степени отражает уровень экспрессии этих белков в опухолевой ткани, а при доброкачественных и пограничных новообразованиях яичников сывороточные ММП, скорее всего, имеют неопухолевое происхождение.

Другим важным аспектом изучения уровня биологических маркеров в сыворотке крови является возможность их использования для дифференциальной диагностики и/или мониторинга эффекта лечения. При исследовании сыворотки крови нами дополнительно была обследована контрольная группа практически здоровых женщин. Продемонстрировано достоверное увеличение содержания ММП-7 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных раком яичников по сравнению с контролем и пациентками с доброкачественными и пограничными новообразованиями. Содержание ММП-9 в сыворотке крови больных раком яичников, обследованных до проведения специфического лечения, также было достоверно выше, чем в группе контроля и у пациенток с доброкачественными опухолями. В то же время, содержание ММП-2 в сыворотке крови больных раком и пограничными опухолями яичников сывороточный уровень ММП-2 был достоверно ниже, чем в контроле, а у больных доброкачественными новообразованиями яичников достоверно не отличалось от показателей контрольной группы. Это соотношение соответствует закономерностям, выявленным для опухолевых тканей.

При сравнении показателей сыворотки крови больных раком яичников, обследованных до и после проведения специфического лечения, обнаружено, что после лечения происходит относительная нормализация показателей ММП-9 и ММП-2: в первом случае снижение, а во втором - повышение уровня маркера.

В целом, анализ содержания матриксных металлопротеиназ и ТИМП в сыворотке крови показал, что наиболее перспективным маркером для дифференциальной диагностики пограничных, доброкачественных и злокачественных новообразованиями яичников является ММП-7. Уровень этого маркера повышен относительно контроля только у больных раком яичников. Превышение верхней границы нормы (4,67 нг/мл), соответствующей специфичности 95%, отмечено у 38 из 49 первичных больных раком, т.е. чувствительность относительно контроля составляет 78%.

ММП-7 оказалась и самым значимым маркером при анализе взаимосвязи показателей сыворотки крови с клинико-морфологическими особенностями рака яичников. Ее уровень достоверно положительно коррелировал с ключевыми показателями распространенности рака яичников: стадией заболевания в целом, размером первичной опухоли по данным УЗИ, наличием и характером диссеминации по брюшине и метастазов в большом сальнике, наличием и количеством асцита. Уровень ММП-7 в сыворотке крови коррелировал также и с ее концентрацией в асцитической жидкости. Кроме того, только уровень этой ММП был положительно ассоциирован с показателями классического сывороточного маркера рака яичников - СА-125.

Таким образом, проведенное иммуноферментное исследование содержания нескольких матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолевой ткани, сыворотке крови и асцитической жидкости больных раком, пограничными и доброкачественными новообразованиями яичников показало координированное увеличение тканевой экспрессии и сывороточной концентрации ММП-7 при раке яичников, нарастающее по мере распространения заболевания. Противоположная направленность изменений обнаружена для другой металлопротеиназы - ММП-2. В меньшей степени выражены изменения в показателях содержания ММП-9 и ТИМП 1 и 2 типа. Наиболее значимым маркером рака яичников следует признать ММП-7 (матрилизин), которая помимо разрушения компонентов внеклеточного матрикса, участвует также в процессинге некоторых биологически важных молекул клеточной поверхности.