Автореферат и диссертация по медицине (14.01.23) на тему:Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов и его растворимой формы рецептора второго типа при раке почки

На правах рукописи

ГЛЫБИН Павел Вадимович

Клиническое значение фактора роста эндотелия сосудов и его растворимой формы рецептора второго типа при раке почки

14.01.23 - урология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- з июн 2010

Москва-2010

004604664

Диссертационная работа выполнена в ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им.

М.Ф.Владимирского

Научный руководитель: академик РАМН, д.м.н., профессор Трапезникова Маргарита Федоровна

Научный консультант: член-корр. РАМН, д.м.н., профессор Кушлинский Николай Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Авдошин Владимир Павлович Доктор медицинских наук, профессор Серегин Александр Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава им. Н.И.Пирогова.

Защита состоится «3/» А/ А $ 2010г. в 14.00 на заседании Диссертационного Совета Д.208.049.01 при ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского по адресу: г. Москва, ул. Щепкина, 61/2, корп. 15, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского.

Автореферат разослан «л

2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета д.м.н., профессор

Астахов П.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Рак почки в структуре онкологических заболеваний составляет 2-3% и 85% среди всех первичных злокачественных опухолей почки [М.Ф.Трапезникова, 1978; Jacobsen J. et al., 2006]. По темпам прироста онкологической заболеваемости в России рак почки устойчиво занимает третье место после рака предстательной и щитовидной железы [В.И.Чиссов и соавт., 2009]. Ежегодно в России от рака почки умирает около 8000 человек, что составляет 2,7% в структуре смертности от злокачественных новообразований [Е.М.Аксель, 2003]. 5-летняя выживаемость при раке почки тесно связана с первоначальной стадией заболевания, составляет 50-90% при локализованном опухолевом процессе и снижается до 0-13% у больных с генерализованным процессом [Godley P.A. et al., 2001; Ficarra V. et al., 2006].

В последнее десятилетие пристальное внимание онкологии уделяют изучению процессов неоангиогенеза, так как доказано, что опухоль не может расти без адекватного снабжения кислородом [Folkman J., 1972]. Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза привело к обнаружению про- и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых обеспечивает формирование и развитие новых сосудов внутри опухоли. Основным активатором ангиогенеза считают фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) мультифункциональный цитокин, вызывающий пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток [Е.С.Герштейн. и соавт., 2006]. Кроме того, VEGF активирует урокиназу и коллагеназу, в результате чего происходит лизис эндотелиального матрикса, что повышает способность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию [Ferrara N., 1997; Dvorak H.F., 2002; Ferrara N. et al., 2003].

Известно, что VEGF проявляет свои биологические эффекты посредством взаимодействия с рецептором (VEGFR). На поверхности эндотелиальных клеток имеются три вида рецепторов VEGF (типичные рецепторные тирозинкиназы): рецептор VEGFR1 (flt-1), рецептор VEGFR2 (KDR/Flk-1) и рецептор VEGFR3 -продукт гена flt-4. После прикрепления VEGF к экстрацеллюлярной области рецептора, димеризации и аутофосфорилирования последнего, внутриклеточный

участок рецептора способствует запуску каскадной активации протеинов, которые в свою очередь воздействуют на разные этапы ангиогенеза [Rini B.I. et al., 2005].

Клинические исследования показали, что уровень экспрессии VEGF в опухоли может выступать независимым фактором прогноза наряду со стадией и степенью дифференцировки рака почки [Paradis V. et al., 2ООО]. По данным G.Djordjevic et al. (2007) гиперэкспрессия VEGF в опухоли почки также является неблагоприятным прогностическим признаком, который связан со степенью дифференцировки, пролиферативной активностью и размером опухоли, а безсобытийная выживаемость пациентов достоверно выше при низких значениях VEGF в цитозоле опухоли [Rivet J. et al., 2008].

Вместе с тем, в исследовании J.Jacobsen et al. (2004) показано, что экспрессия VEGF в опухоли почки не может служить маркером прогноза. В работе D.Minardi et al. (2005) также не доказана прогностическая значимость экспрессии VEGF при раке почки. И, хотя по данным J.Jacobsen et al. (2000) VEGF не является прогностическим маркером при раке почки, анализ уровня VEGF в сыворотке крови может бьггь полезным для выделения группы пациентов с потенциально быстрым прогрессированием процесса, особенно при опухолевой инвазии нижней полой вены. F.I.AIamdari et al. (2007), L.Schips (2007) также отвергают прогностическую значимость VEGF сыворотки крови при раке почки и утверждают, что стадия и степень злокачественности опухоли, а также число регионарных метастазов следует считать независимыми факторами прогноза выживаемости [Alamdari F.I. et al., 2007; Schips L., 2007]. В целом, данные литературы о клиническом значении уровня VEGF и его рецепторов в физиологических жидкостях и тканях больных раком почки остаются противоречивыми. Учитывая тот факт, что ингибирование процессов ангиогенеза является в настоящее время перспективным направлением в терапии рака почки (Heng D.Y. et al., 2007; Pouessel D. et al., 2008), a результаты проведенных работ неоднозначны, необходимо дальнейшее изучение ангиогенных факторов и их рецепторов при раке почки, что следует считать своевременным и актуальным.

Цель исследования

Сравнительное изучение содержания фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и растворимой формы его рецептора 2-го типа (VEGFR-2) в сыворотке

крови, опухоли и непораженной паренхиме почки у больных почечно-клеточным раком с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

Задачи исследования.

1. Изучить концентрации УЕСБ и УЕОРЛ-2 в сыворотке крови больных раком почки и сравнить их с таковыми показателями у практически здоровых людей (группа контроля).

2. Провести сравнительное изучение уровней УЕСР и УЕСРИ.-2 в сыворотке крови больных раком почки с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания (топографической локализации опухоли в органе и стадии процесса, возраста и пола пациентов, клинических симптомов заболевания, гистологического строения и степени дифференцировки опухоли).

3. Сопоставить показатели \ТЮР и УЕОРЯ-2 в цитозоле опухоли и непораженной паренхимы почки с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

4. Оценить клиническое значение показателей УЕОР и УЕСБЯ-2 в сыворотке крови и опухоли больных раком почки.

Научная новизна исследования

Впервые в отечественной практике на клиническом материале проведено сравнительное исследование содержания ключевых активаторов ангиогенеза фактора роста эндотелия сосудов (УЕОР) и растворимой формы его рецептора 2-го типа (УЕ0РЯ-2) в сыворотке крови, непораженной паренхиме и опухоли почки у больных почечно-клеточным раком. На основании анализа полученных данных, обнаружены достоверно высокие показатели экспрессии УЕСР и УЕСРЛ-2 в цитозоле первичной опухоли, по сравнению с непораженной паренхимой почки, при этом уровни УЕвР в опухоли не были связаны с возрастом пациентов, гистологическим строением и наличием гематурии. Однако выявлено достоверное повышение исходных уровней УЕвР и УЕСРЯ-2 в сыворотке крови, а также снижение уровней УЕСР11-2 и повышение УЕСР в цитозоле опухоли с увеличением степени злокачественности почечно-клеточного рака - одного из неблагоприятных факторов прогноза выживаемости данной категории больных. Впервые показано, что при наличии инвазии псевдокапсулы опухоли почки

обнаружены достоверно низкие показатели УЕОРЯ-2 в цитозоле опухоли больных почечно-клеточным раком. При наличии инвазии псевдокапсулы почки также отмечено повышение уровня УЕвР в сыворотке крови. Представленные данные позволяют заключить, что тканевой уровень УЕвР следует считать перспективным биологическим маркером почечно-клеточного рака, связанным с показателем распространенности первичной опухоли (Т). Однако, исходные показатели УБвР и УЕОП1-2 в периферической крови больных раком почки не претерпевают значимых изменений по сравнению со здоровыми людьми, поэтому не могут рассматриваться в качестве диагностических маркеров заболевания. Повышенная продукция УБвР и УЕОРЯ-2 в ткани почечно-клеточного рака позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры в качестве мишени таргетной антиангиогенной терапии.

Практическая значимость исследования

Анализ результатов исследования активаторов неоангиогенеза в сыворотке крови и опухоли больных почечно-клеточным раком показал, что определение в цитозоле опухоли содержания УЕОР следует считать важным биологическим маркером при оценке распространенности первичной опухоли. При этом, высокие уровни УЕвР, УЕОРЯ-2 в сыворотке крови, низкие значения УЕОРЯ-2 и высокие показатели УЕвР в опухоли характеризуют высокую степень злокачественности почечно-клеточного рака и его инвазивный потенциал. Это позволяет использовать их наряду с основными клинико-морфологическими факторами прогноза в качестве дополнительных тканевых маркеров, характеризующих фундаментальные биологические свойства опухоли. Вместе с тем, исходные (до лечения) показатели УЕОР и УЕОРЯ-2 в периферической крови больных раком почки не могут быть полезны в качестве диагностических маркеров заболевания. Анализ данных литературы и результаты собственных исследований свидетельствуют о повышенной продукция УЕОР и УЕОРЛ-2 в цитозоле опухоли почки, что позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры ангиогенеза в качестве мишени таргетной антиангиогенной терапии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины (Москва, 7-9 октября 2008г.); на XII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 18-20 ноября 2008г.); на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 1-3 октября 2008г.); на VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10-11 ноября 2009г.); на XIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 17-19 ноября 2009г.); на XVII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 12-16 апреля 2010г.)

Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции сотрудников урологической клиники, кафедры урологии ФУВ ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского и сотрудников лаборатории клинической биохимии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 13 апреля 2010г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Внедрение

Полученные результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику урологической клиники ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, построена по традиционному плану, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, который включает ссылки 22 отечественных и 152 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 47 таблицами и 50 рисунками.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Достоверно высокие показатели ключевого активатора анпиогенеза 'УЕвР и его рецептора \гЕОР11-2 обнаружены в цитозоле опухоли, по сравнению с

непораженной паренхимой у больных раком почки, при этом уровни УЕОР в цитозоле опухоли не были связаны с возрастом пациентов, гистологическим строением и наличием гематурии.

2. Выявлено достоверное повышение уровней УЕСР, УЕСРЯ-2 в сыворотке крови и снижение УЕСРЯ-2 в опухоли с увеличением степени злокачественности почечно-клеточного рака - неблагоприятного фактора прогноза 5-летней выживаемости данной категории больных.

3. При наличии инвазии псевдокапсулы опухоли почки у большинства обнаружены высокие показатели УЕОРЯ-2 в сыворотке крови. При этом уровни УЕОР11-2 в цитозоле опухоли были достоверно низкими.

4. Тканевой уровень УЕвР следует считать перспективным биологическим маркером почечно-клеточного рака, связанным с распространенностью опухолевого процесса.

5. Показатели УЕСР и УЕОР11-2 в периферической крови больных раком почки не претерпевают значимых изменений по сравнению со здоровыми людьми, поэтому не могут рассматриваться в качестве диагностических маркеров заболевания.

6. Повышенная продукция УЕСР и УЕСРЯ-2 в ткани почечно-клеточного рака позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры в качестве мишени таргетной антиангиогенной терапии.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Общая характеристика обследованных больных.

В исследование включено 37 больных раком почки (18 мужчин и 19 женщин) в возрасте от 33 до 78 лет, проходивших обследование и лечение в клинике урологии ГУ МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского в период с сентября 2006 по октябрь 2007 гг. Рак почки у всех выявлен впервые и подтвержден данными гистологического исследования опухоли.

Группу контроля составили 57 практически здоровых людей соответствующего возраста (12 мужчин и 45 женщин). Распределение больных раком почки с учетом стадии заболевания и пола пациентов представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение больных раком почки с учетом стадии заболевания ____и пола пациентов_

Стадия СШМ) Число наблюдений Возраст, годы Мужчины Женщины

Т)а^оМо 10 (27,0%) 56,0+2,9 4 (22,2%) 6(31,6%)

Т1ЬЫ0М0 9 (24,3%) 55,8±4,3 4 (22,2%) 5 (26,3%)

Т,ЛМ, 1 (2,7%) 50 - 1 (5,3%)

Т2ЫоМо 6 (16,2%) 51,8+3,9 3 (16,7%) 3 (15,8%)

ТзаТШо 6 (16,2%) 59,8±4,3 4 (22,2%) 2(10,5%)

ТзьЫ0Мо 4 (10,8%) 57,3+7,1 3 (16,7%) 1 (5,3%)

ТзьЫ,Мо 1 (2,7%) 57 - 1 (5,3%)

Всего 37 (100%) 55,9±1,7 18 (100%) 19 (100%)

У большинства (29 - 78,4%) выявлен светлоклеточный рак почки, папиллярный и хромофобный варианты - по 4 наблюдения. У 8 из 37 (21,6%) больных раком почки установлен критерий РиЬгтап 01, у 16 (43,2%) - 02, у 8 (21,6%) -С3,у 5 (13,5%) - (табл. 2).

Таблица 2.

Распределение больных раком почки с учетом стадии

процесса и степени злокачественности опухоли_

Стадия СШМ) Число наблюдений а в2 вз в4

Т|аКоМо 10 (27,0%) 1 (10,0%) 8 (80,0%) 1 (10,0%) -

Т1ЬЫоМо 9 (24,3%) 2 (22,2%) 4 (44,4%) 2 (22,2%) 1 (11,1%)

Т1ЬЫ0М, 1 (2,7%) 1 - - -

Т2М0Мо 6 (16,2%) 4 (66,7%) 1 (16,7%) 1 (16,7%) -

ТзаИоМо 6(16,2%) - 3 (50,0%) 1 (16,7%) 2 (33,4%)

ТзьН)Мо 4(10,8%) - - 3 (75,0%) 1 (25,0%)

ТзьТ^Мо 1 (2,7%) - - - 1

Всего 37 (100%) 8 (21,6%) 16 (43,2%) 8 (21,6%) 5 (13,5%)

Большинство обследованных больных раком почки (26/70,3%) не имели сопутствующих урологических заболеваний. Однако, кисты/микрокисты (в том числе с некрозом) выявлены у 4 пациентов, у 2 - доброкачественная гиперплазия простаты, у 1 - в анамнезе перенесенная операция иссечения карбункула правой почки.

Наиболее часто пациенты предъявляли жалобы на боль (37,8%) и макрогематурию (24,3%), при этом указанные симптомы развивались чаще при поздних стадиях заболевания (66,7%). Одновременно боль и макрогематурию отметили 5 (13,5%) больных. У 16 пациентов (43,2%) выявленная опухоль почки

описана в анамнезе как «случайная находка». У этих пациентов отсутствовали такие симптомы как боль, макрогематурия, гипертензия, потеря массы тела. У 19 (51,4%) больных выявлена опухоль левой почки, у 18 (48,6%) - правой.

В исследовании преобладали пациенты (64,9%) со смешанным типом роста опухоли, экстраренальный и интраренальный типы роста опухоли отмечены в 18,9 и 16,2% наблюдений соответственно.

Таблица 3.

Размеры опухоли у больных раком почки с учетом клинико-_ морфологических признаков __

Признак Градации N М±ш Пределы колебания Меди -ана

Пол Мужской 18 5,8+0,6 2,5-11 6,0

Женский 19 5,9+0,7 2,5-13 5,0

Возраст <50 лет 10 б,5±1,2 2,5-13 6,3

50-59 лет 15 5,8+0,6 2,5-11 5,5

>60 лет 12 5,4±0,8 2,5-12,5 5,3

Локализация опухоли в почке Нижний полюс 13 6,5±0,8 2,5-12 6,0

Верхний полюс 16 6,0±0,6 2,5-13 6,0

Средний отдел 8 4,6+1,2 2,5-12,5 3,5

Тип роста опухоли Интраренальный 6 6,8+1,7 2,5-13 5,5

Смешанный 24 6,3±0,5 2,5-12,5 6,0

Экстраренальный* 7 3,6+0,5 2,5-6 3,0

Боль Нет 23 5,6±0,6 2,5-13 5,5

Есть 14 6,4+0,8 2,5-12,5 6,5

Гематурия Нет 28 5,2+0,5 2,5-12,5 5,0

Есть** 9 8,0+0,9 2,8-13 7,0

■р*** Т,а 10 2,9+0,1 2,5-3,5 3,0

т,б 10 5,2±0,2 4-6 5,3

т2 6 8,2±1,0 7-13 7,0

Тза 6 8,8±1,6 2,5-12,5 10,2

т3б 5 6,6+0,4 5,5-8 6,5

0**** 8 6,7+1,0 3,5-13,0 6,0

а 16 4,3±0,6 2,5-11,0 3,5

йЗ 8 6,4±2,8 2,8-9,4 6,3

5 8,6+1,5 5,5-12,5 7,0

Гистологическое строение опухоли Светлоклеточный 29 5,8+0,5 2,5-12,5 5,5

Папиллярный 4 4,8+2,1 2,5-11 2,9

Хромофобный 4 7,4+1,9 5-13 5,8

Инвазия псевдокапсулы почки Нет 20 5,0±0,5 2,5-13 4,5

Есть 17 6,8±0,9 2,5-12,5 6,5

Примечание: *р=0,04; **р=0,007; ***р=0,00001; ****р=0,01.

Симптом макрогематурии отмечен у 14,3% больных экстаренальным типом роста рака почки, у 33,3% больных с интраренальным типом и у 25,0% со смешанным типом роста опухоли (табл. 3).

Все 37 больных раком почки подвергнуты хирургическому лечению различного объема, данные о которых представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Распределение больных раком почки с учетом объема _хирургического вмешательства _

Объем операции Число наблюдений (абс.) Число наблюдений (%)

Нефрэктомия односторонняя 16 43,2

Резекция почки - 10 27,0

Нефрэктомия + адреналэктомия 3 8,1

Нефрэктомия + лимфодиссекция 2 5,4

Нэфрэктомия + адреналэктомия + лимфодиссекция 3 8,1

Нефрэктомия + тромбэктомия + краевая резекция нижней полой вены + лимфодиссекция 2 5,4

Нефрэктомия + адреналэктомия + тромбэктомия + краевая резекция нижней полой вены + лимфодиссекция 1 2,7

Всего 37 100%

Специальные лабораторные методы исследования

Концентрации VEGF и VEGFR-2 определяли в сыворотке крови, цитозоле опухоли и непораженной паренхиме почки с помощью наборов реактивов для иммуноферментного анализа «Quantikine® Human VEGF Immunoassay» и «Quantikine® Human VEGFR-2 Immunoassay» (R&D systems, США) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы крови больных почечно-клеточным раком и практически здоровых людей забирали из кубитальной вены с 8.00 до 9.00 час натощак. Сыворотку крови отделяли от форменных элементов при центрифугировании в течение 10 мин при 2500xg и температуре 4-8°С, разливали по аликвотам и хранили в течение 2-3 недель при температуре -40°С до проведения исследования. Содержание VEGF и VEGFR-2 определяли в цитозолях опухолей и гистологически неизмененной паренхиме почки как описано ранее [А.М.Щербаков и соавт., 2005]. Концентрацию факторов в тканях выражали в пг/мг белка, определенного по методу Лоури.

Методы статистического анализа полученных результатов

При анализе полученных результатов применяли однофакторный и многофакторный дисперсионный анализ. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы «Statistica 6.0» (StatSoft Inc). Достоверность различия средних оценивали с помощью непараметрических критериев -медианного, Колмогорова-Смирнова, Mann-Whitney. Достоверность различий частот в изучаемых признаках оценивали с помощью критерия х2> Для малых выборок рассчитывали непараметрический точный критерий Фишера. При сравнении показателей использовали t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, медианный тест Краскела Уоллиса, парный критерий Вилкоксона, корреляционный тест Пирсона (г) и тест корреляции рангов Спирмена (R).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Показатель VEGFR-2 определен в сыворотке крови 37 больных раком почки, а также у 57 практически здоровых людей. Распределение показателя VEGFR-2 не отличалось от распределения Гаусса, и для сравнения показателей VEGFR-2 у больных и в контроле применяли параметрические статистические методы.

Не выявили различий в показателях VEGFR-2 у больных и в контроле. Однако уровни VEGFR-2 в сыворотке крови больных раком почки мужчин были достоверно ниже, чем в контроле, а у больных женщин, напротив, были достоверно выше, чем у здоровых (табл. 5).

Таблица 5.

Содержание УЕСЕК-2 в сыворотке крови больных раком почки _и в контроле с учетом пола _

Статистические показатели содержания УЕСЕК-2 (пг/мл) Контроль Больные раком почки

1 Муж. 2 Жен. 3 Муж. 4 Жен.

Количество наблюдений 12 45 18 19

М+ш 16,7+1,3 10,7+0,3 11,5+0,7 12,7+0,8

95% ДИ среднего содержания 13,7-19,6 10,0-11,3 9,9-12,9 11,1-14,4

Медиана 16 10,2 10,8 12,4

Пределы колебания 9,1-23,1 6,8-16,4 6,5-17,1 7,4-22,8

95% ДИ общего содержания 11,9-23,0 7,3-15,7 7,8-16,4 8,8-15,5

Примечание: pi.2=0,00001; pi_3=0,0002; р3_4=0,1; р2^=0,01 (р рассчитано с учетом множественности сравнения по критерию Шеффе).

При этом у здоровых мужчин чаще выявляли уровни УЕОРЯ-2 в сыворотке крови >14 пг/мл, а у женщин <10 пг/мл. Тогда, как у больных раком почки мужчин отмечено высокодостоверное смещение содержания УЕвРК-2 в сторону более низких (<11,9 пг/мл) его значений (66,7%, 12 из 18 пациентов). В группе больных женщин обнаружено достоверное смещение значений рецептора в сторону больших значений, хотя они оставались в пределах уровней цитокина контроле (рис. 1).

□ >=14

И 10-13,9

□ <10

100% 80% 60% 40% 20% 0%

ЕСРЯ2 (пг/мл)

конгрогъ, рак почки, контроль, рак почки,

мужчины мужчины группы женщины жениуны

Рис. 1. Распределение уровней УЕСРК-2 в сыворотке крови больных раком почки и в контроле у мужчин и женщин.

Обнаружена обратная корреляционная зависимость между уровнями УБвРЯ^ и возрастом больных раком почки мужчин (г=-0,57; р=0,013). В группе женщин такой зависимости не отмечено.

Содержание УЕСРЯ-2 в сыворотке крови общей группы больных раком почки повышалось с увеличением показателя распространенности первичной опухоли (Т), однако все наблюдаемые различия были статистически недостоверными (р=0,6).

Медиана и среднее содержание УЕОРЫ-2 в сыворотке крови 19 больных раком почки в I стадии составили соответственно 11,0 и 11,4+0,6 пг/мл, 6 больных во II стадии - 12,1 и 12,6+1,3 пг/мл, 11 больных в III стадии - 12,9 и 13,2±1,3 пг/мл, у 1 больного в IV стадии - 11,5 пг/мл (р1.ш=0,17).

В группе больных раком почки мужчин не обнаружили изменения содержания УЕОРЯ-2 в сыворотке крови при повышении показателя распространенности первичной опухоли. Напротив, у больных женщин отмечен максимальный его уровень при показателях 12, ТЗа и ТЗЬ по сравнению с больными при распространенности, соответствующей Т1а-1б (р=0,01).

Медиана и среднее содержание УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки мужчин не зависело от стадии заболевания. Только в группе больных раком почки женщин установлено достоверное повышение содержания УЕОРЯ-2 в сыворотке крови при увеличении стадии заболевания. Так, у 11 больных раком почки женщин в I стадии медиана и среднее содержание УЕОРЯ-2 равнялось соответственно 11,2 и 11,3+0,7 пг/мл; 12,4 и 14,2+2,2 пг/мл - во II стадии, 13,7 и 15,8±2,4 пг/мл - в III стадии, у 1 больной раком почки в IV стадии содержание УЕвРК-2 составило 11,5 пг/мл. При этом выявлено достоверное повышение уровня УЕСР11-2 у пациенток в III стадии по сравнению с I стадией заболевания (р=0,049).

Установлено достоверное повышение уровня УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки при увеличении критерия БиИгтап (О (р=0,04) (табл. б). Закономерность характерна как для больных мужчин, так и женщин.

Таблица 6.

Содержание УЕС№-2 в сыворотке крови больных раком почки _с учетом критерия ЕиЬгтап (С)_

Статистические показатели содержания УЕСЕИ-2 (пг/мл) Индекс G

G1 G2 G3 G4

Количество наблюдений 8 16 8 5

М±ш 11,0±0,4 11,4+0,6 12,5+1,6 15,7+1,8

95% ДИ среднего содержания 10,0-13,0 9,0-13,5 9,4-15,9 9,6-15,4

Медиана 11,3 10,9 12,9 14,0

Пределы колебания 9,3-12,4 7,4-17,1 6,5-18,5 12,9-22,8

VEGFR-2 >14 0% 18,8% 50,0% 60,0%

Уровень VEGFR-2 в сыворотке крови больных раком почки не зависел от гистологического варианта строения опухоли: при светлоклеточном раке составил 11,7±0,5 пг/мл, при папиллярном - 12,9±2,0 пг/мл, при хромофобном - 14,1±2,9 пг/мл.

У больных раком почки с наличием инвазии псевдокапсулы опухоли обнаружена тенденция к более высокому (>14 пг/мл) содержанию VEGFR-2 в

сыворотке крови (р=0,06) (рис. 2). Закономерность была характерна для пациентов обоих полов, но в группе больных женщин различия были достоверными (р=0,01).

нет инвазии есть инвазия _

группы

Рис. 2. Частота выявления низких и высоких уровней УЕСКЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки с учетом наличия инвазии псевдокапсулы опухоли.

Не обнаружено связи между исходным содержанием УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки и максимальным размером, а также характером роста опухоли и таких клинических признаков как боль и макрогематурия.

Многофакгорный анализ не выделил признак, достоверно связанный с повышенным содержания УЕОР11-2 в сыворотке крови больных раком почки.

Содержание \гЕвРК-2 определили в 31 образце непораженной паренхимы почки и в 35 образцах опухоли больных раком почки. У 12 из 30 (32,4%) больных раком почки, выявлено превышение содержания показателя УЕОРЯ-2 в цитозоле опухоли по сравнению с непораженной паренхимой почки. В то же время в опухоли наиболее часто выявляли значения рецептора <400 пг/мг белка (40%, в 14 из 35), значения 400-799 пг/мг белка - в 31,4%, 800-1199 пг/мг белка - в 8,6%, >1200 пг/мг белка - в 20% наблюдений. Таким образом, в цитозоле опухоли происходит с одной стороны смещение значений рецептора в сторону более низких его значений (<400 пг/мг белка) по сравнению с непораженной паренхимой почки, а с другой стороны - чаще выявляли высокие значения рецептора (>1200 пг/мг белка). Обнаружена достоверная корреляционная зависимость (г=0,45; р=0,039) между содержанием УЕОР11-2 в цитозолях непораженной паренхимы и опухоли почки.

Сравнили значения содержания рецептора в непораженной паренхиме и опухоли почки с учетом пола пациентов (табл. 7). Только в группе мужчин различие содержания рецептора было достоверным (р=0,035).

Таблица 7.

Статистические характеристики содержания УЕСРЯ-2 в непораженной паренхиме и опухоли больных раком почки с учетом пола_

Группы Пол N УЕСРИ-г (пг/мг белка)

М±т Медиана Пределы колебания

Непораженная паренхима почки мужской 14 730±70,2 651 335-1405

2 женский 17 688±78,8 586 14,4-1295

Опухоль почки 3 мужской 16 542+125 565 61,4-2148

4 женский 19 953+202 655 52,6-2731

Примечание: р|_3=0,035; р2.4=0,49; р3^=0,1.

Выявленная прямая корреляционная зависимость между содержанием УЕОРИ2 в опухоли и непораженной паренхиме почки характерна как для мужчин, так и женщин. Выявленная ранее корреляционная зависимость между содержанием рецептора в опухоли и непораженной паренхиме почки у больных в возрасте старше 50 лет усиливалась до значения (г=0,65; р=0,001).

Не обнаружено различий в содержании рецептора в непораженной паренхиме и опухоли почки с возрастом, показателем распространенности первичной опухоли (Т), стадией заболевания. Однако медиана УЕСРЛ-2 в опухоли достоверно снижалась при увеличении критерия РиЬгшап (С) (р=0,048). При этом корреляционная зависимость между содержанием \ТЮР11-2 в непораженной паренхиме и опухоли почки ослабевала по мере увеличения индекса в (г5=0,54; р=0,01) со значимого уровня \TiGFR-2 у больных с индексами 01-02 до нуля - у больных с индексами 03-С4. Эти данные свидетельствуют о том, что при индексах 03-04 степень снижения содержания рецептора в опухоли существенно больше, чем в непораженной опухолевым процессом паренхиме почки.

Наличие инвазии псевдокапсулы опухоли не было связано с уровнем УЕ0РЯ-2 в непораженной паренхиме почки (р=0,9), но сопровождалось достоверным снижением значения рецептора в опухоли (р=0,011) (табл. 8).

Таблица 8.

Содержание УЕСРК-2 в непораженной паренхиме и опухоли почки _с учетом наличия инвазии псевдокапсулы опухоли_

Группы Инвазия N УЕСП*-2 (пг/мг белка)

М±га Медиана Пределы колебания

Непораженная паренхима почки нет 16 715+78,9 673 14,4-1295

2есть 15 698+72,4 596 334-1405

Опухоль почки Знет 19 1052+191 759 52,6-2730

4 есть 16 423±116 300 59,7-1919

Примечание: рз_4=0,011.

Коэффициент соотношения показателей _УЕОР11-2 в опухоли к непораженной паренхиме был в 2,8 раза выше у 16 больных без инвазии псевдокапсулы опухоли (р=0,002) и составил 1,72±0,3 (медиана 1,1), а в группе 15 пациентов с инвазией псевдокапсулы опухоли - 0,6±0,1 (медиана 0,4).

Средний уровень и медианы показателей УЕОРЯ-2 в почечно-клеточном раке не зависели от гистологического строения, локализации и типа роста опухоли.

Дисперсионный анализ также не выявил достоверных различий между показателями УЕОРЯ-2 в опухоли и непораженной паренхиме почки с размером новообразования (р>0,05). Боль и макрогематурия не были связаны с содержанием УЕОЕ11-2 как в непораженной паренхиме, так и в опухоли больных раком почки.

В общей группе больных раком почки не обнаружено корреляционной зависимости между содержанием УЕОРЯ-2 в сыворотке крови и непораженной паренхиме, а также между содержанием рецептора в сыворотке крови и опухоли больных раком почки.

Однако полученные данные выявили, что при увеличении степени злокачественности рака почки изменяется характер взаимосвязи УЕСРЯ-2 в цитозоле первичной опухоли и сыворотке крови. Так, в группе больных раком почки с индексом 01-02 низким значениям УЕ0РИ.-2 в опухоли (<335 пг/мг белка) чаще соответствовали низкие (<10 пг/мл) значения рецептора в сыворотке крови (57,1%) и не выявлены УЕОРЯ-2 в опухоли при его уровне в сыворотке крови ->14 пг/мл. В то же время, у больных раком почки при индексе 03-04 закономерность была обратной - низким значениям УЕОБ11-2 в опухоли (<335 пг/мг белка) чаще (в 80% наблюдений) соответствовали высокие значения

рецептора в сыворотке крови (>14 пг/мл), а при значениях \TiGFR-2 в сыворотке крови <10 пг/мл отсутствовали опухоли с критерием РиЬгтап 03-04 (р=0,034) (рис. 3).

«■з * 1 | 8 г I &

т # о

г о ц у ш 5 > «о

степень злокачественности рака почки

80,0%

<10 10-14 >14

УЕйРК2 в сыворотке крови, пг/мл

Рис. 3. Частота выявления высоких и низких значений УЕСРК-З в сыворотке крови больных раком почки со значениями рецептора в опухоли меньшими нижней границы в непораженной паренхиме почки (<335 пг/мг белка).

Проведенный многофакторный анализ в общей группе больных раком почки с включением в модель как биохимических показателей, так и клинических факторов (пол, возраст, критерий РиЬгтап, стадия заболевания, наличие инвазии псевдокапсулы опухоли) показал, что наиболее связанными оказались признаки: 1) УЕОРЯ-2 в сыворотке крови, критерий РиЬгтап и наличие инвазии псевдокапсулы опухоли и 2) содержание УЕОРЯ-2 в опухоли и непораженной паренхиме больных раком почки.

Подводя итоги исследования содержания УЕОРЯ-2 в сыворотке крови, опухоли, непораженной паренхиме почки, отметим различный характер связи между содержанием УЕОРЯ-2 в сыворотке и опухоли у пациентов при изменении критерия РиЬгтап и при инвазии псевдокапсулы опухоли. Минимальные значения соотношения установлены при неблагоприятных клинических факторах рака почки.

Отметим, что содержание УЕОР в сыворотке крови, как в группе контроля, так и у больных раком почки не отличалось достоверно и не зависело от возраста и

заболевания. Однако уровень УЕйР в сыворотке крови больных раком почки достоверно повышался у увеличением критерия РиЬгтап (р=0,02).

У больных раком почки с наличием инвазии псевдокапсулы опухоли отмечена тенденция к повышению показателей УЕОР в сыворотке крови (р=0,17). При этом повышение УЕвР было заметно у больных раком почки женщин (р=0,05). Так, без инвазии у 7 больных мужчин и у 13 женщин уровень УЕйР составил соответственно 313±91,3 и 286±56,6 пг/мл. В группе больных с наличием инвазии показатели УЕОР у 11 мужчин и у 6 женщин составили соответственно 349+81 и 564+186 пг/мл (р=0,01).

Исходные уровни УЕОР в сыворотке крови не зависели от гистологического строения рака почки, типа роста, максимального размера опухоли, а также наличия симптомов боли и макрогематурии.

Содержание УЕОР определено в 31 образце непораженной паренхимы почки и в 35 образцах опухоли больных раком почки (табл. 9). Сравнение уровней показателя по критерию Стьюдента для связанных выборок показало высокозначимые различия (р=0,000001). За пороговое значение взято содержание УЕйР в цитозоле опухоли, равное верхней границе референсного интервала в цитозоле непораженной паренхимы (164 пг/мг белка) больных раком почки. В 74,3% наблюдений содержание УЕОР в опухоли больных раком почки превышало его содержание в непораженной паренхиме.

Таблица 9.

Содержание УЕСР в опухоли и непораженной паренхиме больных раком

почки

Статистические показатели содержания УЕСР (пг/мг белка) Непораженная паренхима почки Опухоль почки

Количество наблюдений 31 35

М+т 71,3±8,7 571±73,4

95% ДИ среднего содержания 53,6-89,0 421-719,7

Медиана 62,8 525,0

Пределы колебания 16,9-253 11,6-1796

95% ДИ общего содержания 20,4-164 13,8-1492

Р 0,000001

Корреляционная зависимость между показателями УЕОР в непораженной паренхиме и опухоли почки не выявлена (г=-0,19; р=0,3).

Не отличались достоверно показатели VEGF как в непораженной паренхиме (р=0,55), так и в опухоли (р=0,19) больных раком почки женщин по сравнению с мужчинами и при учете их возраста. Однако содержание VEGF в опухоли достоверно повышалось при увеличении показателя распространенности первичной опухоли (Т) (р=0,04). Достоверно высокие уровни VEGF выявлены в непораженной паренхиме почки у больных с показателем распространенности первичной опухоли Т]а (р=0,048) (табл. 10).

Таблица 10.

Статистические характеристики содержания VEGF в непораженной ткани и опухоли больных раком почкн с учетом показателя

Группы t(tnm) n vegf (фмоль/мг белка)

м±т Медиана Пределы колебания

Непораженная паренхима почки 'Tu 8 102+25,0* 87,2 22,6-253

2Т16 8 56,9+9,3* 57,3 20,4-92,9

3Та 6 50,9±13,4* 50,3 16,9-105

4Т3а 4 80,8+29,8 68,6 22,3-164

5Т3б 5 62,5+9,8 56,4 46,6-100

Опухоль почки 6Т1а 9 430+107 522 11,6-923

7т16 10 538±141 466 73,5-1492

8т2 6 533+185 513 13,5-1183

"тза 5 657±183 697 111-1130

ШТ36 5 847+274 588 283-1795

Примечание: *pivs2 и Pivs3=0>06.

X Зг

Т

§ 1000 и. о

S

о Mean □ ±SE Т±1ЛИЕ

Catea BwiWhetePWfEGF«n'=rtW

а

.................................._~Г

I .

...................fp-Hj- -

KL1A......._............;..........

Рис. 4. Сравнительный анализ показателей УЕСР в непораженной паренхиме и опухоли почки с учетом критерия ЕиЬгтап (в).

Показатели УЕОР в опухоли не зависели от стадии рака почки. Однако содержание УЕОР в опухоли достоверно повышалось при увеличении критерия РиЬппап (рис. 4). Уровни УЕОИ в непораженной паренхиме почки также имели тенденцию к повышению с увеличением критерия РиЬгтап.

Полученные результаты указывают на повышение содержания УЕОР при увеличении степени злокачественности опухоли, как в непораженной паренхиме, так и в опухоли больных раком почки, однако увеличение УЕОР в опухоли происходило интенсивнее.

Содержание УЕОР в опухоли почки достоверно не зависело от максимального размера новообразования и его гистологического строения, наличия инвазии псевдокапсулы опухоли почки и типа роста опухоли, наличия таких клинических симптомов как боль и макрогематурия.

Провели многофакторный анализ связи содержания УЕОР в сыворотке крови, опухоли и непораженной паренхиме почки с клиническими признаками.

1 фактор включал следующие признаки: согласованно изменяющиеся признаки УЕОР в опухоли, критерий РиЬппап, наличие инвазии псевдокапсулы опухоли, стадия заболевания.

2 фактор включал такие признаки как содержание УЕОР в непораженной паренхиме почки, тип роста и размер опухоли.

Выявлена достоверная прямая корреляционная зависимость между содержанием УЕОР в сыворотке крови и опухоли больных раком почки (г=0,36; р=0,049). Зависимость между содержанием УЕОР в сыворотке крови и опухоли больных раком почки была выражена при размере новообразования до 7 см (г=0,72; р=0,001). Корреляционная зависимость между содержанием УЕОР в сыворотке крови и опухоли больных раком почки усиливалась в группе пациентов без гематурии до значения (г=0,6; р=0,003) и отсутствовала у больных с гематурией. В то же время величина соотношения содержания УЕОР в опухоли к его содержанию в сыворотке крови больных раком почки не была связана с клиническими признаками заболевания.

В сыворотке крови больных раком почки уровни УЕОР были связаны с УЕОРЯ-2 прямой достоверной корреляционной зависимостью (г5=0,37; р=0,026). Таким образом, повышенному исходному содержанию УЕвР в сыворотке крови больных раком почки чаще соответствовали высокие значения УЕОР11-2. В

непораженной паренхиме почки не обнаружили корреляционную зависимость между содержанием УЕОР и его рецептором.

В опухоли общей группы больных раком почки корреляционная зависимость между содержанием УЕОР и его рецептора не установлена (г5=0,18; р=0,29). Однако, в группе больных раком почки без инвазии псевдокапсулы опухоли выявили прямую корреляционную зависимость между содержанием УЕОР и его рецептора (г5=0,64; р=0,002), а также при индексе 01 (г5=0,74; р=0,14) и й2 (г5=0,55; р=0,04), при размерах опухоли менее 3,5 см (г5=0,77; р=0,07). В то же время у больных с неблагоприятными факторами: наличием инвазии псевдокапсулы опухоли, при показателях Т2-ТЗ, при критерии РиЬгшап 03-04, размере опухоли более 3,5 см эта зависимость отсутствовала. Таким образом, в опухоли больных с благоприятными клиническими признаками заболевания более высоким уровням УЕОР чаще соответствовали и более высокие показатели УЕ0РЯ-2.

Коэффициент соотношения показателей УЕ0Р/УЕ0РЯ-2 в опухоли больных раком почки достоверно отражал наиболее важные клинические факторы, определяющие отдаленные результаты лечения пациентов. Так, соотношение УЕ0Р/УЕ0РЯ2 в опухоли достоверно повышалось при увеличении стадии заболевания: 0,83±0,17 - при I, 1,39±0,88 - при И, 6,1+2,9 - при III стадии (р=0,031); при инвазии псевдокапсулы опухоли (4,6±1,9), чем без таковой (0,57±0,12) (р=0,002); по мере увеличения критерия РиЬппап (0,32±0,07 - при 01, 1,55±0,7 -при 02, 1,78±0,63 - при 03, 9,1±5,4 - при 04; р=0,035). Исходя из вышесказанного, определяемые в опухоли УЕОР и УЕ0РЯ2 могут быть перспективными дополнительными маркерами в оценке прогноза заболевания.

Заключение

Полученные данные указывают на сложные механизмы участия УЕОР и УЕ0РЯ-2 в механизмах прогрессии опухолевого роста у больных раком почки, однако данные маркеры имеют связь с такими характеристиками как критерий РиЬппап, показатель распространенности первичной опухоли, инвазия псевдокапсулы почки, которые тесно связаны с прогнозом заболевания. Кроме того, наличие высоких уровней УЕОР и УЕ0РЯ-2 в цитозоле опухоли почки позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры ангиогенеза в качестве

мишени при разработке и проведении патогенетических вариантов антиангиогенной терапии, подавляющих чрезмерную экспрессию этих активаторов ангиогенеза.

Выводы

1. Обнаружено достоверное повышение продукции ключевых активаторов неоангиогенеза (УЕОР и его рецептора УЕОР11-2) в цитозоле опухоли по сравнению с непораженной паренхимой почки у больных раком почки, что свидетельствует о высоком ангиогенном потенциале почечно-клеточного рака, подтверждая важную биологическую роль проангиогенных факторов в росте и развитии злокачественных новообразований.

2. Увеличение степени злокачественности почечно-клеточного рака (критерия РиЬгшап) - неблагоприятного фактора прогноза выживаемости данной категории больных сопровождается достоверным повышением уровней УЕОР, УЕОИ1-2 в сыворотке крови, при этом в цитозоле опухоли обнаружено снижение УЕОРЯ-2 и повышение продукции УЕОР.

3. Низкие показатели УЕОР11-2 в цитозоле опухоли больных почечно-клеточным раком характеризуют его инвазивный потенциал и сопровождаются у большинства пациентов инвазией псевдокапсулы опухоли.

4. Уровень экспрессии \TEGF в цитозоле опухоли следует считать перспективным биологическим маркером почечно-клеточного рака при оценке распространенности первичной опухоли.

5. Показатели УЕОР и УЕОРК-2 в периферической крови больных раком почки не претерпевают значимых изменений по сравнению со здоровыми людьми, поэтому не могут быть использованы в целях первичной диагностики заболевания.

Практические рекомендации

1. Определение в цитозоле опухоли почки содержания УЕОР следует считать важным ' биологическим маркером при оценке распространенности первичной опухоли.

2. Высокие уровни УЕОР, УЕОР11-2 в сыворотке крови, низкие значения УЕСРЯ-2 и высокие показатели УЕОР в опухоли характеризуют высокую степень злокачественности почечноклеточного рака и его инвазивный потенциал.

3. Исходные (до лечения) показатели VEGF и VEGFR-2 в периферической крови больных раком почки не следует использовать в качестве диагностических маркеров заболевания.

4. Повышенная продукция VEGF и VEGFR-2 в цитозоле опухоли почки позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры ангиогенеза в качестве мишени таргетной антиангиогенной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ангиогенные факторы при почечно-клеточном раке // Онкоурология. -2008. - №4. - С.82-87. (Трапезникова М.Ф., Глыбин П.В., Морозов А.П., Кылычбеков М.Б., Кушлинский Н.Е.)

2. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецептор 2-го типа в опухолях и сыворотке крови больных раком почки // Клиническая лабораторная диагностика. / Тезисы докладов в материалах конгресса «Национальные дни лабораторной медицины. - Москва 7-9 октября 2008г. - №9. - С.26. (Герштейн Е.С., Глыбин П.В., Казанцева И.А., Морозов А.П., Шибаев А.Н., Кычаков A.A., Трапезникова М.Ф., Кушлинский Н.Е.)

3. Ангиогенные факторы при почечно-клеточном раке (Обзор) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - Москва. - 2008. - №5. -С.12-17. (Трапезникова М.Ф., Глыбин П.В., Морозов А.П., Кычаков A.A., Кушлинский Н.Е.)

4. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор 2 типа (VEGFR-2) в опухолях и сыворотке крови больных раком почки // Тезисы докладов в материалах XII Российского онкологического конгресса. - Москва 18-20 ноября 2008г. - С.208. (Трапезникова М.Ф., Глыбин П.В., Морозов А.П., Казанцева И.А., Герштейн Е.С., Кычаков A.A., Кушлинский Н.Е.)

5. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор VEGFR-2 в опухолях и сыворотке крови больных раком почки // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология». -Новосибирск 1-3 октября 2008г. - С.95-96. (Герштейн Е.С., Глыбин П.В., Морозов А.П., Шибаев А.Н., Казанцева И.А., Трапезникова М.Ф., Кушлинский Н.Е.)

6. Фактор роста эндотелия сосудов и его 2 тип рецептора при раке почки // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - №5. -

С.31-33. (Кушлинский Н.Е., Трапезникова М.Ф., Герштейн Е.С., Глыбин П.В., Казанцева И.А., Кычаков A.A., Морозов А.П.)

7. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецептор 2-го типа в опухолях и сыворотке крови больных раком почки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 145. - №6. - С.691-694. (Кушлинский Н.Е., Трапезникова М.Ф., Герштейн Е.С., Глыбин П.В., Казанцева И.А., Кылычбеков М.Б.)

8. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор 2 типа (VEGFR-2) в опухолях и сыворотке крови больных раком почки // Материалы VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность». -Москва. - 2009. - С.225-226. (Трапезникова М.Ф., Глыбин П.В., Шибаева А.Н., Туманян В.Г., Кычаков A.A., Казанцева И.А.)

9. Факторы ангиогенеза в сыворотке крови и опухоли больных раком почки // Материалы XIII Российского онкологического конгресса. - Москва 17-19 ноября 2009г. - С.386-387. (Трапезникова М.Ф., Туманян В.Г., Казанцева И.А., Глыбин П.В., Дутов В.В., Шибаев А.Н., Морозов А.П.)

10. Фактор роста эндотелия сосудов и растворимая форма его рецептора 2 типа при раке почки // Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва 12-16 апреля 2010г. - С.274-275. (Туманян В.Г., Герштейн Е.С., Глыбин П.В., Шибаев А.Н., Казанцева И.А., Дутов В.В., Трапезникова М.Ф.)

Подписано в печать г з.о 4.1о Формат 60 * 84/16 Бумага офисная «ЗуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ № 408 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Рак почки в структуре онкологических заболеваний составляет 2-3% [М.Ф.Трапезникова, 1978] и 85% среди всех первичных злокачественных опухолей почки [Jacobsen J. et al., 2006].

Прирост абсолютного числа заболевших раком почки в России за период с 1993 по 2003г. составил 55%. Средний возраст заболевших - 62 года, умерших - 66 лет. В России по данным за 2003г. смертность от рака почки составила 7,9 тысяч человек. В структуре умерших от злокачественных новообразований на его долю приходится 2,7% [Е.М.Аксель, 2005].

Общая выживаемость при раке почки зависит от многих причин (стадия заболевания, степень дифференцировки (Fuhrman grade), выбранная оперативная тактика и др.) и составляет в среднем 77%- пятилетняя и 69%-десятилетняя. В случае обращения пациента на поздних стадиях заболевания, эти показатели резко снижаются (28 и 16,3% при 4 стадии) [Ficarra V. et al., 2006].

Многие ученые полагают, что рак почки является самым неблагоприятным в прогностическом плане злокачественным урологическим заболеванием [Patel N.S. et al., 2009].

По данным некоторых авторов, лишь 50-60% выявляемых опухолей паренхимы почки операбельны [Tsui К.Н. et al., 2000].

При первичном обращении у 25-30% больных имеются отдаленные метастазы, а после хирургического лечения больных с локализованной и местнораспространенной стадиями заболевания вероятность возникновения рецидива и метастазов составляет 20-30% [Keane Т. et al., 2007].

Положительные клинические результаты, получаемые при использовании в процессе лечения распространённых форм рака почки таких веществ, как интерлейкин 2 (IL2), альфа интерферон (IFN-a) и др. как в монорежимах, так и в комбинациях неубедительны - частота объективных эффектов - всего 18-20% [Д.А.Носов, С.А.Тюляндин, 2005].

Рак почки резистентен к гормональной и химиотерапии. Лучевая терапия при лечении распространенных форм рака почки практически неэффективна и применяется для снижения болевого симптома при наличии костных метастазов [О.Б.Лоран и соавт., 2008].

Последнее время ученые все большее внимание уделяют процессам неоангиогенеза, происходящим в развивающейся опухолевой ткани. Доказано, что опухолевая ткань, равно как и любая другая ткань, с определенного момента не может дальше расти без адекватного снабжения кислородом, которое, в свою очередь, достигается путем развития сосудистой сети в подверженных гипоксии участках [Folkman J., 1972].

Изучение молекулярных механизмов ангиогенеза в течение последних 5-10 лет привело к обнаружению целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, динамический баланс которых обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли. Бесспорно, важнейшим положительным регулятором ангиогенеза является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [Н.Е.Кушлинский, Е.С.Герштейн, 2008].

VEGF является наиболее изученным ангиогенным фактором. Это мультифункциональный цитокин, вызывающий пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Уникальность этого фактора заключается в том, что, в отличие от всех других факторов роста, он митогенен только по отношению к эндотелиальным клеткам. Кроме того, он активирует урокиназу и коллагеназу, в результате чего происходит лизис эндотелиального матрикса, что повышает способность эндотелиальных клеток к миграции, а опухолевых к инвазии и метастазированию [Ferrara N., 1997].

Развитие кровеносных и лимфатических сосудов зависит от воздействия членов семейства VEGF и их рецепторов [Dvorak H.F., 2002; Ferrara N. et al., 2003].

Фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF А) имеет множество эффектов, направленных на развитие и сохранность сосудистой сети в ткани. К ним относятся: индукция пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, защита от апоптоза и старения клеток. Он является основным фактором в отношении осуществления опухолевого ангиогенеза при раке почки.

На поверхности эндотелиальных клеток имеется три рецептора VEGF, являющихся типичными рецепторными тирозинкиназами: рецептор VEGFR-1 (flt-1), рецептор VEGFR-2 (KDR/Flk-1) и рецептор 3 типа - продукт гена flt-4, в отличие от VEGFR-1 и 2 взаимодействующий не с классическим VEGF (VEGF А), а с его гомологом — VEGF С, обладающим лимфоангиогенной активностью. VEGF А (далее в тексте употребляется, как VEGF) проявляет свой биологический эффект посредством взаимодействия с рецептором (VEGFR). После прикрепления VEGF к экстрацеллюлярной области рецептора, димеризации и аутофосфорилирования последнего, внутриклеточный участок рецептора способствует запуску каскадной активации протеинов, которые в свою очередь воздействуют на различные составляющие ангиогенеза [Rini B.I., Small E.J., 2005].

По мере изучения процессов ангиогенеза возник вопрос - может ли VEGF служить независимым прогностическим фактором при раке почки?

V.Paradis et al. (2000) исследовали 74 образца опухолевой ткани почки (62 - светлоклеточный, 12 - папиллярный подтипы). Экспрессия VEGF в цитоплазме клеток зафиксирована в 30% (26 из 74 образцов). 18 из 62 (29%) при светлоклеточном раке и 8 из 12 (67%) при папиллярном раке (р=0,02). В группе образцов светлоклеточного рака зафиксирована позитивная корреляция между уровнем экспрессии VEGF и размером опухоли (р=0,05) и степенью дифференцировки (Fuhrman grade) (р=0,05). Наконец, общая выживаемость в группе пациентов с светлоклеточной опухолью, экспрессирующей VEGF, была достоверно ниже (р=0,01). Также авторы полагали, что уровень экспрессии VEGF может выступать независимым прогностическим фактором наряду со стадией и степенью дифференцировки [Paradis V. et al., 2000].

В отличие от V.Paradis et al. (2000) авторы другого исследования полагают, что экспрессия VEGF опухолевой тканью не может служить независимым прогностическим показателем. Авторы также не отмечают достоверную разницу между уровнями экспрессии VEGF различными подтипами почечно-клеточного рака [Jacobsen J. et al., 2004].

D.Minardi et al. (2005) провели иммуногистохимическое исследование опухолей небольшого размера после выполнения резекции почки. Исследовались VEGF, микрососудистая плотность и рецептор фактора роста эндотелия сосудов VEGFR-2 (Flk-1). Предполагалось оценить прогностическую значимость этих параметров в отношении выживаемости пациентов за длительный период наблюдения. Пациенты с уровнем экспрессии VEGF в гистологическом образце выше 25% демонстрировали худшую выживаемость по сравнению с пациентами, у которых экспрессия VEGF была ниже 25%. Различия в экспрессии VEGFR-2 не были статистически достоверными в отношении выживаемости. Исследование подтвердило важность оценки степени дифференцировки в прогностическом плане. Данное исследование продемонстрировало, что рецидив заболевания и смертельный исход вполне возможны у пациентов с небольшими опухолями почек. Микрососудистая плотность (MVD), экспрессия VEGF и VEGFR-2 не зависят от размера опухоли при раке почки рТ1а. Доказано, что раке почки с маленьким размером опухоли только степень дифференцировки является прогностическим фактором в отношении выживаемости. В то время как VEGF как единственный параметр, основанный на проценте его экспрессии (ниже или выше 25%), в данном исследовании не показал своей прогностической роли, он позволяет распределять пациентов на 2 группы, отличающиеся в прогностическом отношении [Minardi D. et al., 2005].

Цель похожего исследования состояла в том, чтобы проанализировать и сопоставить уровень экспрессии VEGF со средней величиной микрососудистой плотности и другими клинико-патологическими параметрами светлоклеточного рака почки для определения его прогностического значения. Хирургические образцы 93 опухолей светлоклеточного рака почки были подвергнуты иммуногистохимическому исследованию на предмет экспрессии VEGF, MVD и пролиферативного индекса KÍ67. Результаты данного исследования показали, что при светлоклеточном раке почки гиперэкспрессия VEGF является очень плохим прогностическим признаком, посредством того, что она ассоциируется с критерием Fuhrman опухоли, размером опухоли, уровнем пролиферативной активности [Djordjevic G. et al., 2007].

В другой научной работе уровни общего VEGF были исследованы в фрагментах ткани хирургических образцов 65 пациентов, перенесших оперативное вмешательство по поводу светлоклеточного рака почки. Выяснилось, что уровни VEGF в экстрактах цитозоля опухолевой ткани были больше по сравнению с внеопухолевой тканью почки(р<0,0001). При этом безсобытийная выживаемость зафиксирована достоверно выше у пациентов с уровнем VEGF в цитозоле ниже пограничного значения (р=0,02) [Rivet J. et al., 2008].

Особый интерес представляла вероятная возможность выявления рака почки, а также прогнозирования поведения данного заболевания на дооперационном этапе, путем изучения уровня VEGF в сыворотке крови.

В одном исследовании проводилось изучение сывороточного уровня VEGF у пациентов с раком почки. Сывороточный VEGF в образцах периферической крови был проанализирован у 40 пациентов, страдающих раком почки и у 40 практически здоровых лиц (контроль), с использованием сэндвич - иммуноферментного анализа. Исследователи установили, что при уровне сывороточного VEGF выше отметки 100 пкг/мл его чувствительность при раке почки составляет 80%, а специфичность 72,7%. Они также предположили, что сывороточный VEGF может являться маркером для рака почки [Sato К. et al., 1999].

С целью выяснения, может ли уровень УЕОБ в сыворотке крови являться прогностическим фактором при раке почки .Г.ДасоЬзеп е1 а1. (2000) оценивали уровни УЕОБ в сыворотке крови и сравнивали с клинико-патологическими данными и клиническим исходом у больных раком почки. Образцы сыворотки забирали перед хирургическим вмешательством у 164 пациентов, страдающих раком почки, и измеряли уровень УЕОР165 в сыворотке. В результате уровень УЕОР165 в сыворотке крови был значительно выше (р=0,0001) у больных раком почки (медиана 343,4 пкг/мл) по сравнению с контрольной группой (медиана 103,8 пкг/мл). Уровень УЕвР сыворотки коррелировал со стадией заболевания и степенью дифференцировки. Пациенты с уровнями УЕОР165 ниже срединного значения имели достоверно более длительный период выживаемости, чем пациенты, у которых уровень УЕОР165 был выше срединного уровня (р=0,0001). Значимость УЕОР165 в отношении выживаемости особенно выражена среди пациентов с опухолью, имеющей венную инвазию (рТЗв-сМ)М0) и у пациентов с клиническими стадиями 1-Ш (р=0,024 и р=0,0023 соответственно). Но после использования многовариантного анализа установлено, что только стадия опухоли и критерий РиЬппап являются независимыми прогностическими параметрами. Хотя по данным исследования УЕвР не является независимым прогностическим параметром, исследование уровня УЕОР165 в сыворотке крови может быть полезным для идентификации пациентов с потенциально быстрым прогрессированием заболевания, особенно у пациентов с инвазией нижней полой вены расоЬзеп I. е! а1., 2000].

Ряд ученых также отвергают прогностическую значимость уровня УЕвР сыворотки крови при раке почки, при этом утверждают, что только стадия и критерий РиИгтап являются независимыми прогностическими факторами в отношении выживаемости [8сЫрБ Ь. е1 а1., 2007].

Для выяснения вероятной значимости ангиогенных факторов при прогнозировании метастатического рака почки выполнено следующее исследование. Образцы сыворотки были взяты у 120 пациентов, страдающих метастатическим раком почки, которым выполнили радикальную нефрэктомию. Различные клиникопатологические параметры, уровни VEGF, VEGFR-1, основного фактора роста фибробластов (BFGF) и уровень эритропоэтина в сыворотке были сопоставлены с клиническим течением. Средний период выживаемости пациентов составил 9 месяцев. 6 пациентов (5%) умерли в послеоперационном периоде, но все они имели Karnofsky performance status (KPS) от 2 до 3. Ни один из ангиогенных факторов (VEGF, VEGFR-1, BFGF, эритропоэтин) не показали никакой прогностической значимости, за исключением того, что VEGF был связан с выживаемостью у пациентов с хорошим PS (р=0,002). После проведения мультивариантного анализа данных стало ясно, что только KPS (р=0,002), количество метастатических участков (р=0,003) и инвазия капсулы (р=0,017) являются независимыми прогностическими факторами в отношении выживаемости [Alamdari F.I. et al., 2007].

Учитывая тот факт, что блокирование процессов ангиогенеза является перспективным направлением в терапии рака почки, а результаты проведенных ранее работ, посвященных процессам неоангиогенеза, порой противоречат друг другу, необходимо дальнейшее изучение данной проблемы, анализ взаимосвязи неоангиогенной активности опухолевой ткани с основными клинико-морфологическими характеристиками данного заболевания, что и является целью нашего исследования.

Таким образом, проведение исследования, направленного на изучение содержания VEGF и VEGFR-2 в сыворотке крови, ткани рака и непораженной опухолью ткани почки является своевременным и актуальным.

Цель настоящего исследования — сравнительное изучение содержания фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и растворимой формы его рецептора второго типа (УЕОБЯ-2) в сыворотке крови, в ткани рака и непораженной опухолью ткани почки с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

Достижение указанной цели требует решения следующих задач:

1. Изучить исходные концентрации фактора роста эндотелия сосудов и растворимой формы его рецептора второго типа в сыворотке крови больных раком почки и сравнить их с таковыми показателями у практически здоровых людей.

2. Провести сравнительное изучение концентрации фактора роста эндотелия сосудов и растворимой формы его рецептора второго типа в сыворотке крови у больных раком почки с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания (топографической локализации в органе и стадии опухолевого процесса, возраста и пола пациентов, выраженности клинических симптомов, гистологического строения и критерия РиЬгшап).

3. Изучить концентрации фактора роста эндотелия сосудов и растворимой формы его рецептора второго типа в цитозоле опухоли и сравнить уровни этих маркеров в ткани почки, непораженной опухолевым процессом с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.

4. Оценить клиническое значение показателей фактора роста эндотелия сосудов и растворимой формы его рецептора второго типа в сыворотке и цитозоле опухоли у больных раком почки.

Научная новизна исследования

Впервые в отечественной практике на клиническом материале проведено сравнительное иммупоферментное определение содержания УЕвР и УЕОРИ.-2 в сыворотке крови, опухоли и непораженной паренхиме почки у больных почечно-клеточным раком. Не выявлено достоверных различий в исходных показателях УЕвР и УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки и контроле у здоровых людей. При этом значения УЕСРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки мужчин были достоверно ниже, чем у женщин выше, чем в контроле, не зависели от стадии заболевания, показателя распространенности первичной опухоли «Т», характера роста опухоли, но достоверно повышались при увеличении степени ядерной дифференцировки (критерия БиЬгтап) новообразования. Кроме этого, с увеличением критерия РиЪгтап рака почки и при наличии инвазии псевдокапсулы опухоли отмечено достоверное повышение уровней УЕОРЯ-2 в сыворотке крови и снижение в ткани опухоли. Показатели УЕОБ в сыворотке здоровых людей и больных раком почки не отличались, не были связаны с полом пациентов, стадией опухоли и ее гистологическим строением, критерием «Т», наличием инвазии нсевдокапсулы опухоли, симптомами боли и гематурии, но достоверно повышались при увеличении критерия РиЬгшап. Таюке были обнаружены достоверно высокие показатели УЕОР в раке почки по сравнению с непораженной тканью. При этом уровни УЕОР в опухоли не были связаны со стадией процесса и гистологическим строением опухоли, но достоверно повышались при увеличении критерия РиИгтап опухоли и увеличении показателя распространенности первичной опухоли «Т». Показатель УЕОР также не был связан с такими клиническими симптомами как боль и гематурия.

Практическая значимость исследования

На основании полученных данных исследования выявлена тесная связь содержания УБвР его растворимой формы его рецептора 2 типа (УЕОРЯ-2) в сыворотке крови, в опухоли и непораженной паренхимы почки с основными клиническими и морфологическими характеристиками почечно-клеточного рака. У больных раком почки с благоприятными клинико-морфологическими характеристиками процесса высоким уровням УЕвР в сыворотке крови соответствовали высокие показатели УЕОРЯ-2, а коэффициент соотношения показателей УЕОРЛ/ЕОРЯ-2 в опухоли достоверно отражал наиболее важные клинические факторы болезни, определяющие отдаленные результаты лечения пациентов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины (Москва, 7-9 октября 2008г.); на XII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 18-20 ноября 2008г.); на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 1-3 октября 2008г.); на VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009г.); на XIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 17-19 ноября 2009г.).

Апробация диссертации проведена 10 апреля 2010г.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Достоверных различий в исходных показателях УЕОБ и V БОБ Я-2 в сыворотке крови больных раком почки и у практически здоровых людей не выявлено.

2. Значения УЕОРЯ-2 в сыворотке крови больных раком почки мужчин были достоверно ниже, а у женщин выше, чем в контроле, не зависели от стадии заболевания, показателя Т, характера роста опухоли, но достоверно повышались при увеличении критерия РиЬппап новообразования, а у мужчин обратно коррелировали с возрастом.

3. Показатели УЕОРЯ-2 в опухолях почки достоверно выше у женщин и ниже у мужчин по сравнению с непораженной тканью, не зависели от возраста пациентов, стадии заболевания, критерия Т, гистологического строения опухоли, но достоверно снижались при увеличении критерия РиЬгтап и при наличии инвазии псевдокапсулы опухоли.

4. Отмечено достоверное повышение уровней УЕОРК-2 в сыворотке крови и снижение в опухоли с увеличением критерия РиЬгтап рака почки и при наличии инвазии псевдокапсулы новообразования.

5. Показатели УЕвР в сыворотке крови практически здоровых людей и больных раком почки не отличались, не были связаны с полом, стадией опухоли и ее гистологическим строением, критерием Т, наличием инвазии псевдокапсулы опухоли, симптомами боли и гематурии, но достоверно повышались при увеличении критерия РиИгтап опухоли.

6. Обнаружены достоверно высокие показатели УЕСР в опухоли почки по сравнению с непораженной тканью. При этом уровни УЕОР в опухоли не были связаны со стадией процесса и гистологическим строением опухоли, но достоверно повышались при увеличении критерия РиЬгтап опухоли и увеличении критерия Т.

7. Показатель УЕОР также не был связан с такими клиническими симптомами как боль и гематурия.

8. У больных раком почки с благоприятными клинико-морфологическими характеристиками процесса высоким уровням УБвР в сыворотке крови соответствовали высокие показатели УЕСРК-2, а коэффициент соотношения показателей УЕСР/УЕОРК-2 в опухоли достоверно отражал наиболее важные клинические факторы болезни, определяющие отдаленные результаты лечения пациентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Внедрение

Полученные результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику урологической клиники ГУ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 175 листах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, обсуждения полученных результатов, выводов, и указателя литературы, включающего в себя 22 отечественных и 151 зарубежных источников. Работа содержит 50 рисунков и 47 таблиц.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено достоверное повышение продукции ключевых активаторов неоангиогенеза (УЕСР и его рецептора УЕОРЯ-2) в цитозоле опухоли по сравнению с непораженной паренхимой почки у больных раком почки, что свидетельствует о высоком ангиогенном потенциале рака почки, подтверждая важную биологическую роль проангиогенных факторов в росте и развитии злокачественных новообразований.

2. Увеличение степени злокачественности почечно-клеточного рака (критерия РиЬгтап) - неблагоприятного фактора прогноза выживаемости данной категории больных сопровождается достоверным повышением уровней УЕСР, УЕСРЫ-2 в сыворотке крови, при этом в цитозоле опухоли обнаружено снижение УЕОРЯ-2 и повышение продукции \nEGF.

3. Низкие показатели УЕСРЫ-2 в цитозоле опухоли больных почечно-клеточным раком характеризуют его инвазивный потенциал и сопровождаются у большинства пациентов инвазией псевдокапсулы опухоли.

4. Уровень экспрессии УЕСР в цитозоле опухоли следует считать перспективным биологическим маркером почечноклеточного рака при оценке распространенности первичной опухоли.

5. Показатели УЕСР и УЕСРЫ-2 в периферической крови больных раком почки не претерпевают значимых изменений по сравнению со здоровыми людьми, поэтому не могут быть использованы в целях первичной диагностики заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение в цитозоле опухоли почки содержания УЕОБ следует считать важным биологическим маркером при оценке распространенности первичной опухоли.

2. Высокие уровни УЕвБ, УЕОРИ-2 в сыворотке крови, низкие значения УЕСРЯ-2 и высокие показатели УЕвБ в опухоли характеризуют высокую степень злокачественности почечноклеточного рака и его инвазивный потенциал.

3. Исходные (до лечения) показатели УЕвР и УЕСРЯ-2 в периферической крови больных раком почки не следует использовать в качестве диагностических маркеров заболевания.

4. Повышенная продукция УЕОБ и УЕСРЯ-2 в цитозоле опухоли почки позволяет рассматривать эти молекулярные маркеры ангиогенеза в качестве мишени таргетной антиангиогенной терапии.