Автореферат и диссертация по медицине (14.00.01) на тему:Клиническое течение и особенности местного иммунитета при вульвовагинальном кандидозе у беременных

IIа прае ах рукоп и си

МАЛЬБАХОВА ЕКАТЕРИНА ТИМУРОВНА

КЛИНИЧЕСКОЕ ТЕЧЕНИЕ II ОСОБЕННОСТИ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ВУЛЫЮВАГИНАЛЫЮМ КАНДИДОЗЕ У

БЕРЕМЕННЫХ.

14.00.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 8 И!0Н 2003

Москва-2009

003473314

Работа выполнена на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и в родильном и научно-поликлиническом отделениях ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова Росмедтехнологий»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, Комиссарова Лариса Михайловна

профессор

доктор биологических наук Арзуманян Вера Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Торчинов Ампрхан Михайлович

(ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития РФ)

Каверина Ксения Георгиевна

(ФГУ РНГКЦ Росздрава)

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится

июня

_ 2009 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.125.01 при ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Росмедтехнологий по адресу: г.Москва, ул. Опарина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова Росмедтехнологий

Автореферат разослан

мая

2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Вулыювагинальный кандидоз (ВВК) наиболее часто встречается среди женщин репродуктивного возраста [Sobel J.D., 2000], причем хронической рецидивирующей формой ВВК,страдает от 5 до 15% женщин и число таких случаев неуклонно растет, а терапия представляет большие трудности [Климко Н.Н., Мирзабалаева А.К. с соавт., 2007]. Факторами, способствующими развитию дрожжевой инфекции, считают: наличие основных заболеваний (инфекционных, эндокринопатических, аутоиммунных и др.); механические травмы; химические факторы (применение кортикостероидов, цитостатиков, антибиотиков, оральных контрацептивов); физиологические факторы [Прилепская В.Н., 2006]. Среди физиологических факторов к наиболее важным относится беременность. Установлено, что с наступлением беременности вероятность возникновения кандидоза влагалища увеличивается в несколько раз и составляет 30-40% [Орджоникидзе Н.В., 2004]. Причинами этого считают резкое изменение местного иммунитета и уровня секретируемых гормонов, однако многое неизвестно в механизмах развития дрожжевого вульвовагинита [Mendling W., 2007]. Так, например, до сих пор не ясно, какой из показателей иммунитета является наиболее значимым, и не доказано, какими факторами обусловлен переход симбиотической дрожжевой культуры в патогенную, а острого течения вульвовагинита - в хроническое.

Из всего множества факторов местного иммунитета можно выделить несколько из них, которые непосредственно взаимодействуют с клетками оппортунистических дрожжей - это фагоцитирующие клетки [Nomanbhoy F et al., 2002], HMMyHonno6y.™iibi[Baroussc et al., 2004] и антимикробные пептиды (АМП - эндогенные антибиотики) [Valore E.V. et al., 2002, 2006]. Оценку фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами принято проводить in vitro [Vonk, Alieke G. et al., 2002], однако нам не удалось обнаружить публикаций, посвященных действию этих клеток на дрожжи in vivo. Известна особенность иммунитета слизистых оболочек, относящаяся к преимущественной продукции секреторного IgA [Сухих Г.Т, Ванько J1.B., 2003], однако в секретах слизистых оболочек половых путей человека содержится больше IgG, чем slgA [Mestecky, J. et al., 2005]. Но данные о взаимосвязи уровней иммуноглобулинов и кандиданосительством при ВВК немногочисленны и противоречивы [de Carvalho R.J. et al., 2003; Kumatowska A. et al., 2002; Mestecky, J. et al., 2005]. Однако и фагоцитоз и иммуноглобулины давно изучаемые и широко известные

параметры иммунитета, а АМП и их действие как объект исследования в медицинских науках стали использоваться не так давно и изучены мало.

В последние десятилетия с ростом числа и разнообразия иммунодефицитных состояний в человеческой популяции параллельно происходит переход микроорганизмов из категории сапротрофов в категорию условно патогенных. В 1980 г. было известно 10 видов 4-х родов клинически значимых дрожжей [Jawetz Е., 1980], а в 1998 г. - уже 36 видов 9-ти родов [Ahearn D.G., 1998]. Наиболее часто слизистые оболочки гениталий населяют дрожжи рода Candida, особенно С. albicans, однако, встречаются также Rhodotorula sp., Saccharomycopsis sp. и другие. Учитывая растущий список клинически значимых видов диагностика вульвовагинального кандидоза, основанная только на клинических проявлениях, без применения лабораторных исследований, ведет не только к неадекватной терапии и увеличению числа резистентных штаммов, но и к росту хронических, рецидивирующих форм заболевания.

На основании вышеизложенного очевидно, что периодическое мониторирование родовой/ видовой принадлежности и чувствительности штаммов дрожжей, выделяемых от пациентов с острым и хроническим вульвовагинитом имеет важное фундаментальное и прикладное значение.

Изучение взаимосвязи между обсемененностью, тяжестью течения и некоторыми показателями иммунитета должно способствовать уточнению механизмов трансформации симбиотической дрожжевой микрофлоры в патогенную и уточнить звенья патогенеза данного заболевания.

Цель исследования: оптимизация тактики ведения беременных женщин с вульвовагинальным кандидозом на основании определения взаимосвязи между клиническим течением заболевания у беременных, дрожжевой микрофлорой влагалища и показателями местного специфического иммунитета.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности клинической картины и характера течения ВВК во время беременности в современных условиях.

2. Изучить исходы беременности и родов у женщин с ВВК.

3. Определить видовой состав дрожжевой микрофлоры и ее чувствительность к набору антимикотиков в современных условиях и сравнить с ретроспективными данными за 10 лет.

4. Изучить взаимосвязь течения ВВК у беременных женщин с показателями местного иммунитета - фагоцитозом, иммуноглобулинами и антимикробными пептидами.

5. Оценить влияние проводимого лечения ВВК у беременных на микробиологические и иммунологические показатели.

Научная новизна

Впервые изучены показатели местного противогрибкового иммунитета -фагоцитоз, специфические иммуноглобулины и совокупная противогрибковая активность антимикробных пептидов (лактоферрин, кальпротектин, лизоцим, секреторный ингибитор лейкопротеазы, кателицидины, дефензины) - во взаимосвязи с тяжестью течения ВВК и показателями состояния дрожжевой популяции в данном локусе.

Показано, что именно совокупная активность антимикробных пептидов является первой линией местного иммунитета в противогрибковой защите влагалища.

Впервые показано, что низкий уровень антимикробной активности АМП является одной из причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности.

Проведение видовой идентификации изолятов, полученных от беременных пациенток с ВВК, более современными методами показало снижение удельного веса С.albicans и расширение родового состава дрожжей.

Практическая значимость

Выявление некоторых особенностей течения ВВК при беременности: стертость клинической картины, зависимость тяжести течения от формы течения заболевания и ее связь с микробиологическими показателями позволит проводить раннюю, более точную диагностику заболевания у беременных и, соответственно, адекватное лечение

На основании полученных данных по чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам было показано снижете активности таких популярных в акушерско-гинекологической практике препаратов, как азолы, и, напротив, повышение активности полиенов.

Среди прочих показателей местного иммунитета именно совокупная противогрибковая активность антимикробных пептидов может быть использована в качестве маркера перехода острой формы ВВК в хроническую.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клиническая картина ВВК при беременности носит стертый характер: типичные симптомы ВВК выявлялись достоверно реже, чем вне беременности; частота клинических симптомов превышала частоту предъявления типичных жалоб в среднем в 3 раза. Тяжесть течения ВВК у беременных напрямую связана с обилием дрожжевых клеток при микроскопии (г = 0,968) и частотой положительных культуральных тестов (г = 0,982) и достоверно выше при хронической форме, чем при первичной острой.

2. Выделенные штаммы относились к 3 родам: Rhodotorula sp. (5,9 %), Debaryomyces sp. (17,6 %) и Candida sp. (76,5%). Наиболее широко применяемые в акушерско-гинекологической практике препараты азольного ряда (клотримазол, кетоконазол, флюконазол, итраконазол) показали снижение активности в отношении клинических изолятов дрожжевых грибов в 2 раза за последние 10 лет, тогда как препараты полиенового ряда (пимафуцин и леворин) проявили повышение активности в 2,7 раза.

3. Основным фактором местного противогрибкового иммунитета является суммарная активность антимикробных пептидов. Уровень совокупной противогрибковой активности АМП (26,9%) у беременных и его взаимосвязь с тяжестью течения достоверно ниже, чем у небеременных (43,9%), что может являться одной из причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности. Данный показатель может быть использован в качестве прогностического при оценке рисков хронизации процесса.

Внедрение результатов работы в практику. Результаты исследования внедрены в клиническую практику в отделениях ФГУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова» Росмедтехнологии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на XV международном конгрессе «XV Congress of European Mycologists» , Санкт-Петербург, сентябрь 2007г Апробация диссертации была проведена на совместном заседании кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и апробационной комиссии ФГУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова Росмедтехнологий» 02 февраля 2009 г.

Гранты. В рамках работы был получен грант DAAD (Германское общество академических обменов) совместно с Ernst Schering Foundation для прохождения научной стажировки и выполнения части работы на базе медицинского университета Charite, г. Берлин, Германия.

Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендуемых ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 130 стр. компьютерного текста, содержит 23 таблиц и 24 рисунка. Библиография включает 118 литературных источника, в том числе 28 - отечественной и 91 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обследована 141 женщина: I группу (основную) - составили 64 беременных женщины с ВВК; II группу (контрольную) - составили 26 здоровых беременных женщин; в III группу (сравнения) - были включены 51 небеременная женщина. Были использованы ретроспективные данные о 27 коллекционных клинических изолятах, полученных и идентифицированных в период 1998-1999 г.г. в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.

Микробиологические тесты и исследование параметров местного иммунитета вагинального отделяемого всех женщин обеих групп были проведены в лаборатории клинической микробиологии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, (директор акад. В.В. Зверев)

Критерия включения: наличие клинических проявлений; обнаружение грибных клеток при микроскопии ВО; рост дрожжевых колоний при культуральном исследовании; наличие диагностированного ВВК в анамнезе. Критериями исключения явились: наличие тяжелой экстрагенитальной патологии; наличие эндокринных заболеваний; иммунодефицитные состояния; наличие сопутствующих ИППП в стадии обострения; бактериальный вагиноз на момент исследования.

При первичном обращении пациенток подробно собирали общий и специальный анамнез, проводили физикальное обследование, антропометрические измерения, а также наружное акушерское обследование.

Всем женщинам на протяжении беременности проводились клинико -лабораторные исследования. Особое внимание уделяли анамнезу вульвовагинального кандидоза: длительности течения, частоте рецидивов;

наличию характерных жалоб. Для оценки тяжести течения ВВК использовали совокупность основных симптомов ВВК. Каждый симптом оценивали и определяла тяжесть течения ВВК.

Таблица 1

Характеристика тяжести течения ВВК

Зуд/ Жжение/ Гиперемия / Отечность Боли при мочеиспускании/ Диспареуния/ Эрозии/ Дерматит Выделения

Характер Количество

0-нет 1 - умеренные 2 - выраженные 0 - слизистые 1- молочные 2 - творожистые 0- мало 1 - умеренные 2 - обильные

Посевы проводили стандартным методом на глюкозо-пептон-дрожжевую питательную среду, содержащую антибиотик. Микроскопию образца проводили при суммарном увеличении 1750. Эффективность фагоцитоза оценивали как соотношение между числом дрожжевых клеток, локализованных внутри фагоцитов, и общим числом дрожжевых клеток в поле зрения. Видовую идентификацию культур проводили с помощью коммерческой тест-системы "Auxacolor" (Sanofi Pasteur)H системы Барнетта. [Арзуманян В.Г., 2002 г.]. Исследование чувствительности штаммов дрожжей к набору противогрибковых препаратов: дифлюкану, клотримазолу, низоралу, орунгалу, экзодерилу, леворину, пимафуцину, нитрофунгину оценивали методом микроразведений [Espinel-Ingroff A. et al., 1995]. Для изучения параметров иммунитета и некоторых биохимических параметров проводили сбор вагинального отделяемого с помощью тампона в течении 10 минут, после чего тампон элюировали дистиллированной водой, элюат фильтровали через бактериальный мембранный фильтр Millipore, фильтрат лиофильно высушивали и разводили стерильной дистиллированной водой так, чтобы получить 10-кратный концентрат по отношению к исходному фильтрату. Иммуноблоттинг и дот-блот анализ проводили на базе Института диагностики и профилактики социально значимых заболеваний (Москва) под руководством к.б.н. Сердюк O.A. по совокупности методов [Towbin H. et al, 1979; Смирнова Е.Я. с соавт., 1990; Цыциков Э.Н. с соавт., 1988; Hong C.S. et al, 1986]. Для электрофореза белков в градиенте 5-20% полиакриламидного геля пользовались методом Лэммли [Laemmly U.K., 1970]. Для анализа использован высокоспецифический антигенный препарат из С. albicans. Определение совокупной противогрибковой активности ВО проводили

следующим образом: клетки тест-культуры Candida albicans инкубировали с аликвотами ВО, после чего делали высевы сразу после смешивания и через 2 часа инкубации. Результат выражали как процент дрожжевых клеток, убитых в процессе инкубации. Статистическая обработка полученных результатов. Коэффициент линейной корреляции Пирсона, стандартное отклонение и другие показатели рассчитывали по программе, вложенной в Microsoft Excel, пользуясь пособием Платонова [Платонов А.Е., 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клиническая характеристика обследованных женщин. Возраст обследованных женщин в основной группе колебался от 23 до 46 лет, составляя в среднем 29 ± 5,8, в контрольной группе - от 22-39, в среднем 26,3 ± 3,1, а в группе сравнения от 23 до 44 лет, в среднем 28,3 ± 5,4 года (р>0,5). В структуре экстрагенитальной патологии обращает на себя внимание высокая частота заболеваний органов пищеварения (20,3%, 19,2% и 23,5%) и аллергических заболеваний (10,9%, 15,6% и 17,6%), которые часто являются фоновыми для возникновения ВВК. Однако достоверных различий между группами обнаружено не было. Среди гинекологических заболеваний наиболее частыми явились: эктопия шейки матки (40.6%, 38,5% и 39,2%) и воспалительные заболевания матки и придатков (23,4%, 23% и 29,4%). Причем около 50% женщин с эктопией шейки матки страдали хронической формой ВВК. Достоверных различий в структуре гинекологических заболеваний между группами также выявлено не было. В контрольной группе первобеременными являлись 16 женщин (61,5%), а повторнобеременными 10 (38,5%).

Течение беременности и родов у женщин с ВВК. Из 64 женщин основной группы 45 женщин наблюдались в течении всей беременности и были родоразрешены в отделениях Центра. Течение беременности у пациенток основной группы у каждой 2-ой женщины осложнялось угрозой прерывания беременности, у 35,5% беременность протекала на фоне раннего токсикоза легкой формы. Водянка беременных отмечалась у 31,1 % женщин, преэклампсия легкой степени - у 8,8% женщин. У 11,1 % женщин беременность протекала на фоне плацентарной недостаточности. Оценку состояния фетоплацентарного комплекса проводили с помощью допплерометрии. Нарушения встречались в маточно-плацентарном звене кровообращения в 8,9% и в плодово-плацентарном в 2,2%. Признаки гипоксии плода по КТГ были выявлены у 10 (22,2%) женщин. Многоводие было

отмечено у 6 (13,3%) женщин. Маловодие, как один из признаков плацентарной недостаточности, отмечалось у 5 (11,1%). Преждевременное излитие околоплодных вод встречалось у 26,7% беременных. Путем кесарева сечения были родоразрешены 27 (60%) из 45 женщин, 18 женщин (40%) родили через естественные родовые пути. Всего родилось 45 детей. Из осложнений встречавшихся у женщин рожавших через естественные родовые пути (п=18) обращает на себя внимание высокая частота разрывов мягких родовых путей -55,5%, которая включала в себя 27,7% разрывов шейки матки, 16,7% разрывов стенок влагалища и 11,1% разрывов задней спайки влагалища. Интересно отметить, что все эти женщины страдали хронической рецидивирующей формой ВВК. Осложнений в послеродовом периоде у женщин отмечено не было. Срок пребывания в стационаре не превышал 7 дней и составлял в среднем 6,15 ± 0,77 дней. Таким образом, можно заключить, что беременные с хронической рецидивирующей формой ВВК составляют группу риска по развитию таких осложнений, как разрывы мягких родовых путей.

Средняя масса новорожденных составила 3360±325,средний рост - 51 ± 1,5 см. 39 (86,7%) детей на 1 минуте жизни имели оценку по шкале Апгар 8-9 баллов, 6 (13,3%) детей были извлечены в состоянии асфиксии легкой степени. Однако на 5 минуте состояние всех новорожденных расценивалось как удовлетворительное. Здоровыми при рождении оказались 21 (46,7 %) новорожденный. Остальные дети имели различную патологию, в основном сочетанную. Неврологические нарушения по типу церебральной возбудимости или депрессии отмечались у 15,5% новорожденных, срыгивание новорожденных у 13,3%, гипотрофия у 6 (13,3,%), конъюгационная желтуха и кожно-геморрагический синдром у 11,1%.У 1 (2,2%) ребенка был отмечен врожденный конъюнктивит, а 3 (6,7%) детей водянка оболочек яичек. Срок пребывания новорожденных в стационаре практически всегда совпадал с материнским и составлял 6,5 ± 2,1 дней. По данным литературы, дети рожденные у матерей с ВВК часто страдают пеленочными дерматитами, атопическими дерматитами, стоматитами [Буслаева Г.Н, .Каск Г.Н., 2001]. Однако за время пребывания в стационаре у новорожденных не было отмечено ни пеленочных дерматитов, ни стоматитов. Мы связываем этот факт с тем, что все беременные обследуемой группы перед родами прошли курс лечения ВВК, и выздоровление было подтверждено лабораторными данными. Таким образом, можно заключить, что при проведении своевременной терапии ВВК у

беременных и контроля заболевания перед родами, характерных осложнений со стороны новорожденного можно избежать.

Особенности течения ВВК у беременных. Для обработки результатов после проведения клинических и лабораторных исследований основная группа и группа сравнения были разделены на подгруппы с учетом формы течения ВВК. В основной группе в первую очередь была выделена подгруппа с острым, впервые возникшим (или в анамнезе единичные случаи ВВК) во время беременности ВВК - подгруппа далее обозначается ОВВК(п=26). Женщины у которых в анамнезе отмечался хронический рецидивирующий ВВК, с несколькими диагностированными рецидивами в год и продолжительной длительностью заболевания были разделены на 2 подгруппы: подгруппа с хроническим ВВК в стадии обострения - ХВВКО (п=18) и подгруппа с хроническим ВВК в стадии ремиссии - ХВВКР (п=20), В группе сравнения была выделена подгруппа женщин, не страдавших ВВК ни на момент обследования, ни имевших его хроническую форму - данная подгруппа была обозначена как - ЗДОРОВЫЕ (п=10), далее подгруппа с хроническим вульвовагинальным кандидозом в стадии обострения - ХВВКО (п=15), с хроническим вульвовагинальным кандидозом в стадии ремиссии - ХВВКР (п=15), с острым вульвовагинальным кандидозом — ОВВК (п=11). В основной группе беременных в I триместре беременности находились 6 (9,4%) женщин, во II триместре 24 (37,5%), а в III триместре 34 (53,1%) женщин. Анализ жалоб и клинических проявлений у пациенток с острым или обострением хронического ВВК показал, что основной жалобой у беременных женщин с ВВК были выделения (у 86,4% женщин), причем часть из них отмечала лишь некоторое их увеличение, но не изменение их характера (рис.2). Такие же характерные симптомы как зуд и жжение тревожили лишь 45,5% и 13,6% соответственно, что достоверно ниже, чем в группе небеременных (р = < 0,001), в которой в подавляющем большинстве случаев основной ж&чобой был зуд -88,4%, изменившийся объем и характер выделений беспокоил 73,1% женщин, жжение - 53,8% женщин. Частота таких типичных клинических симптомов ВВК как творожистые выделения (73,1%) и гиперемия (69,2%) у небеременных женщин обнаруживались достоверно чаще чем в группе беременных (50% и 19%) (р= < 0,01).

Благодаря приведению симптомов ВВК к цифровым значениям было показано, что при сравнении подгрупп с острым течением ВВК (ОВВК и

ХВВКО) наиболее яркая клиническая картина с обилием жалоб и клинических проявлений наблюдается в подгруппах с хроническим рецидивирующим течением заболевания. Также можно отметить, что в основной группе беременных основную долю суммы всех симптомов в подгруппах - от 62,5 до 80% - составляли объективные симптомы, а жалобы предъявлялись достоверно реже (р < 0,01), тогда как в группе небеременных женщин сумма объективных симптомов колебалась в подгруппах от 0% до 62,5% и не превышала частоту предъявления типичных жалоб.

Таким образом, можно заключить следующее: 1) частота возникновения острого ВВК, а также обострение хронического ВВК во второй половине беременности, достоверно выше (р < 0,01); 2) тяжесть течения ВВК у беременных, выраженная в баллах, при хроническом рецидивирующем течении заболевания в 1,6 раза выше, нежели при первичном остром; 3) клиническая картина ВВК при беременности носит стертый характер: типичные симптомы встречаются достоверно реже, чем вне беременности (р < 0,01): так зуд встречается в 1,9 раза реже, жжение в 4 раза, а творожистые выделения имеют место в 1,6 раза реже; 4)структуре симптомов ВВК у беременных частота обнаружения объективных симптомов заболевания варьировала от 62,5% до 80%, что значительно выше частоты обнаружения субъективных симптомов (жалоб, предъявляемых пациентками) - от 20% до 32,5% (р < 0,01); 5) можно сделать вывод, что необходимость обязательного лабораторного обследования во 2 половине беременности на предмет наличия ВВК очевидна.

Исследование обсемененности, родового и видового состава дрожжевой микрофлоры у беременных. Микроскопия и культуральиое исследование. При анализе данных микроскопии в группах и сравнении с частотой положительных культуральных тестов было установлено, что при обнаружении менее 19 (медиана) дрожжевых клеток в поле зрения высев отсутствовал. При медиане - 30 грибных клеток в поле зрения число положительных культуральных тестов составляло от 61,5% до 72,7%. При медиане 40 грибных клеток и выше высев наблюдали в 100% случаев в обеих обследуемых группах. Сопоставление показателей микроскопии и культурального исследования с суммой симптомов в изученных группах выявило наличие высокой степени корреляции. Кроме того, коэффициент корреляции между частотой положительных культуральных тестов и медианами максимального числа дрожжевых клеток составил 0,953 в основной

группе и 0,902 в контрольной. Эти данные согласуются с результатами исследований, проведенных на больших выборках пациенток с ВВК (2861 чел.), где показано, что наличие гифов мицелия является маркером тяжести течения заболевания [Demirezen S., Beksac MS, 2004].

Таким образом, показано, что тяжесть течения ВВК у беременных напрямую связана с обилием дрожжевых клеток при микроскопии (г= 0,968) и частотой положительных культуральных тестов (г= 0,982). При хроническом вульвовагинальном кандидозе показатели микроскопии и культуральных тестов в 1,4-1,9 раза превышали таковые при первичном остром ВВК.

Родовое и видовое разнообразие культур, выделенных от беременных пациенток с ВВК. Родовое разнообразие сводилось к родам Candida, Rhodotorula, Debaryomyces. После проведенного видовой идентификации оказалось, что лишь 3 из 17 культур (17,6 %) являлись дрожжами С. albicans. Остальные культуры представляли собой: Debaryomyces hansenii (17,6%), Candida guillermondii (11,8 %), С. tropicalis (11,8 %), С. famata (11,8 %), С. haemulonii (5,9 %), С. insectorum (5,9 %) и Rhodotorula sp. (5,9 %). По данным различных авторов частота выделения Candida spp., не относящихся к виду Candida albicans, у больных хроническим ВВК составляет от 8% до 69% [Захарова Т.П., 2004; Кисина В.И., 2004; Asticcioli S. et al, 2004; Sobel J.D., 2007]. Таким образом, можно заключить, что роль С. albicans в возникновении ВВК не является основной, т.к. лишь 17,6 % полученных изолятов дрожжевых грибов составили С. albicans.

Оценка чувствительности дрожжей к ряду противогрибковых препаратов; сравнение с ретроспективными данными за 10 лет. Нами было проведено сравнение данных по чувствительности изолятов, полученных в основной и контрольной группах (всего 33 штамма), с данными 10-тилетней давности (всего 48 штаммов), полученными в той же лаборатории с использованием тех же методов (рис. 1). Учитывая, что препаратами выбора при лечении ВВК остается группа азолов, обращало на себя внимание снижение чувствительности дрожжевых культур к этому ряду препаратов. Чувствительность к препарату флюконазол, наиболее широко используемому в гинекологической практике, оцененная по числу абсолютно чувствительных штаммов, за последние 10 лет снизилась в 2,2 раза. Чувствительность дрожжевых грибов к другим препаратам этой группы также значительно снизилась: к клотримазолу - в 1,9 раза, к кетоконазолу - в 2,7 раза, к

итраконазолу - в 1,7 раза. Такое снижение чувствительности штаммов,циркулирующих в популяции, можно объяснить фунгистатическим механизмом их воздействия и широтой применения. Ранее нами было показано, что при инкубации изолятов дрожжей с азолами в течении длительного времени (14 дней) клетки не только не погибали, но даже медленно размножались [Арзуманян В.Г.с соавт., 2000]. Также снизилась чувствительность к нитрофунгину в 3 раза. Напротив чувствительность в группе полиеновых антимикотиков возросла: к леворину в 2 раза, а к пимафуцину в 3,4 раза.

100% 80°'о 60% 409-4 20% 0%

ТГ Ф К Ке И Т Л П Нф

Ф-флюконазол: К - клотримазол, Ке - кетоконазол. И - итраконазол, Т - тербинафин, Л - леворин, П - пимафуцин, Нф -нитрофунгин, А - амфотерицин, 5Н - нитроксолин , М мирамистин, Ц - цитросепт.

Рис. 1 Чувствительность дрожжевых культур к противогрибковым препаратам: А - данные за 2006-2008 г.г.; Б - данные за 1998-1999 г.г.

1) все нижние столбцы - нечувствительные 2)все средние столбцы - умеренно устойчивые 3)все верхние столбцы - чувствительные

Такую динамику можно объяснить с одной стороны более частым и широким применением за последние 10 лет азольных препаратов, с другой стороны особенностями механизмов воздействия азолов и полиенов на клетки дрожжей. Азолы ингибируют синтез эргостерола в клеточной стенке грибов, причем проявляют скорее фунгистатический, нежели фунгицидный эффект, что способствует селекции резистентных штаммов [Ghannoum М.А., Rice L.B., 1999]. В то же время полиеновые антимикотики действуют как фунгициды путем деструкции цитоплазматической мембраны дрожжевых клеток [Sheehan DJ.et al, 1999]. Помимо упомянутых препаратов была оценена чувствительность к амфотерицину, нитроксолину, мирамистину и цитросепту.

причем последние три проявили высокую - 71,8%, 61,5%, 74,4% -противогрибковую активность. Оценка взаимосвязи между степенью вагинальной обсемененности и суммарной чувствительностью культур к противогрибковым препаратам показала отсутствие корреляции (г = 0,03).

Таким образом, можно заключить, что за последние 10 лет произошло снижение чувствительности к препаратам наиболее часто используемой в клинической практике азолыюй группы (в 1,7-2,7 раза), и препаратами выбора могут служить антимикотики полиеновой группы, т.к. чувствительность к ним возросла в 2-3,4 раза.

Исследование некоторых показателей местного иммунитета во взаимосвязи с течением ВВК у беременных. Для обработки результатов полученных при изучении параметров местного иммунитета все женщины основной и контрольной групп были разделены на три подгруппы с учетом срока беременности. Далее были подсчитаны медианы уровней эффективности фагоцитоза, частоты встречаемости и я1§А и совокупная

противомикробная активность ВО групп в целом вне зависимости от формы течения заболевания. Было установлено, что статистически достоверной разницы уровней изученных параметров местного иммунитета в зависимости от срока беременности обнаружено не было. Кроме того было проведено разделение пациенток основной группы в зависимости от срока беременности внутри ранее описанных подгрупп, учитывавших форму течения заболевания. Однако и в этом случае статистически достоверных различий уровней изученных параметров местного иммунитета в зависимости от срока беременности обнаружено не было. Таким образом, можно заключить, что местный специфический противогрибковый иммунитет не связан со сроком беременности.Далее анализ параметров местного иммунитета проводили в зависимости от формы течения заболевания.

Фагоцитоз. Среди клеток, участвующих в процессе фагоцитоза при кандидозах различной локализации, перечисляют - нейтрофилы, макрофаги и мононуклеарные клетки [В1есЬег й а!, 1971; Оагаа-Татауо I й а1., 1978; ТавЬрал СЬ й а1., 1971]. После оценки данных микроскопии и их статистической обработки, получены следующие результаты: в группе беременных пациенток (п=64) самая высокая эффективность фагоцитоза (медиана - 80 %) отмечена в подгруппе ХВВКР. Интересно отметить, что такой высокий показатель фагоцитоза сопровождался низкой обсемененностью.

Показатель эффективности фагоцитоза был значительно ниже в острой фазе (группа ОВВК - 50%) и при обострении хронического процесса (40%), а у пациенток контрольной группы он был самый низкий (15%). Достоверных различий с группой небеременных обнаружено не было. Сопоставление показателей эффективности фагоцитоза с суммой симптомов в изученных группах не выявило наличия корреляции (г = 0,216 и г = 0,321). Не отмечено взаимосвязи между медианами эффективности фагоцитоза и обсемененности (г = 0,194 и г = 0,008), а также между медианами эффективности фагоцитоза и частотами положительных культуральных тестов (г = - 0,134 и г — - 0,189).

Таким образом, можно заключить, что вклад фагоцитоза в местный противогрибковый иммунитет незначителен.

Иммуноглобулины. Ранее показано, что специфические иммуноглобулины обладают непосредственной противомикробной активностью. Наиболее представленными во влагалище являются иммуноглобулины класса О, в меньшей степени - секреторные иммуноглобулины класса А (б^А) [Мез1еску, I. еГ а1., 2005]. Попытки установления взаимосвязи между тяжестью течения ВВК и уровнями иммуноглобулинов не дали однозначных результатов [с1е СагуаШо ЯЛ.У. е! а1., 2003; Кигпаи^Бка А., М^по\У51а I, 2002; Мея1еску, 1 е1 а1., 2005]. Исследование наличия и уровней иммуноглобулинов в ВО при ВВК должно дать информацию об их роли в развитии и течении данного заболевания.

В основной группе беременных пациенток (п=64) при острых фазах ВВК отмечено значительное увеличение частоты обнаружения особенно в подгруппе ОВВК (62,5%). При обострении хронического рецидивирующего ВВК 1§0 встречались у 50% женщин и даже в стадии ремиссии эта цифра снижалась незначительно - 42,9%. Иммуноглобулины класса э^А вообще не встречались у пациенток подгруппы ХВВКР, однако при обострении хронического процесса эти антитела обнаруживались в 25% случаев, а при ОВВК - в 50% случаев. Интересно, что даже в контрольной группе встречались пациентки с Б1§А-антителами (33,3%). Изучение взаимосвязи между частотой выявления ^С-антител, с медианами тяжести течения и обсемененности вагинального отделяемого показало наличие корреляции высокой степени: 0,798 и 0,772 соответственно, тогда как Б^А-антитела не были связаны с этими показателями: 0,156 и 0,143 соответственно. Между наличием и

совокупной противогрибковой активностью ВО пациенток отмечена обратная

корреляционная связь -0,950 и -0,403 соответственно. В группе

небеременных пациенток (п=51) наибольшая частота обнаружения IgG-антител была выявлена в подгруппе с обострением хронической формы ВВК, а не при первичной острой как в группе беременных. В остальных же случаях распределение уровней встречаемости иммуноглобулинов обоих классов в подгруппах совпадало. Коэффициенты корреляции частот выявления иммуноглобулинов с показателями течения ВВК у небеременных женщин идентичны таковым в основной группе. Между наличием иммуноглобулинов и совокупной противогрибковой активностью ВО пациенток обратная корреляционная связь высокой степени также сохранилась (-0,912 и -0,542). Кроме того, было обнаружено, что частота встречаемости и IgG-антител и sIgA-антител к антигену С. albicans у небеременных пациенток была примерно в 1,3 раза выше при всех формах течения ВВК, чем пациенток основной группы.. Так, например, при обострении хронического рецидивирующего ВВК (женщины подгрупп ХВВКО) частота встречаемости IgG-антител в группе беременных составляла 50%, а в группе небеременных 73,3%, а частота встречаемости sIgA-антител 25% составляла и 46,7% соответственно.

При сравнительном анализе данных об иммуноглобулинах класса G между основной (50%) и контрольной группой беременных (16,7%), а также между подгруппами с ВВК (63,6%) и подгруппой ЗДОРОВЫЕ (20%) группы сравнения была установлена статистически достоверная разница, которая указывала на значительно меньший уровень встречаемости противокандидозных иммуноглобулинов обоих классов у здоровых женщин(р = 0,02). В частоте встречаемости sIgA-антител не было обнаружено достоверной разницы ни между группами беременных (40% в основной группе и 33,3% в контрольной группе), ни между подгруппами небеременных пациенток (46,7% - у женщин с ВВК и 40% - у здоровых женщин) (р =< 0,5).

Таким образом, можно заключить, что: А) частота встречаемости и уровень местных специфических противокандидозных IgG в высокой степени коррелировала с клиническими проявлениями ВВК и обсемененностыо, т.е. IgG отражают тяжесть течения ВВК. В) Между наличием иммуноглобулинов и совокупной противогрибковой активностью ВО пациенток отмечена обратная корреляционная связь высокой степени, т.е. вклад антител в совокупную противогрибковую активность ВО незначителен. Другими словами совокупная противогрибковая активность в данном локусе, скорее всего, представлена

суммарным действием антимикробных пептидов.

Совокупная противогрибковая активность вагинального отделяемого

Одной из определяющих задач исследования стало изучение противогрибковой активности ВО. Совокупная противогрибковая активность неклеточной фракции вагинального отделяемого складывается из суммарной активности антимикробных пептидов - дефензинов, лактоферрина, кальпротектина, лизоцима, секреторного ингибитора лейкопротеазы и кателицидинов, а также, возможно, иммуноглобулинов [Сухих Г.Т., Ванько .В., 2003; Carvalho R.J.V. 2003; Mestecky, J. et al, 2005; Valore E. et al, 2002-2006].

Для определения наличия АМП было проведено разделение пептидов в ВО методом электрофореза. Было установлено, что набор АМП строго индивидуален для каждой пациентки, что согласуется с литературными данными [Valore Е. et al, 2002-2006] . Кроме того, известно о синергичном и антагонистическом взаимодействии АМП. Таким образом, стала очевидна необходимость определения совокупной противогрибковой активности АМП. Мы оценивали совокупный результат действия АМП на клетки тест-культуры С. albicans . Клетки тест - культуры подвергали воздействию различных доз ВО, полученного от женщины не страдающей ВВК. и наблюдали противогрибковый эффект через 2 часа после начала воздействия. Установлено что повышение дозы ВО сопровождалось увеличением числа убитых клеток, т.е. можно утверждать, что ВО обладает фунгицидным дозозависимым эффектом.

Распределение уровней противогрибковой активности в группах было следующим: наибольшей активностью в отношении дрожжевых клеток обладали препараты, полученные из вагинального отделяемого пациенток контрольной группы беременных (71,9%, медиана) и подгруппы ЗДОРОВЫХ группы сравнения (78,1%, медиана), что было достоверно выше чем у соответствующих подгрупп женщин с ВВК (основная группа беременных и подгруппы небеременных с ВВК). Разброс величин активности составил 34,4 -=-92,5 % в группе беременных и 63,8 -ь 93,8 % в группе небеременных. В подгруппах пациенток с хроническим ВВК в стадии ремиссии (ХВВКР) у беременных основной группы этот показатель был достоверно ниже, чем в группе сравнения (р = 0,02) и варьировал в пределах 25 + 63,8 % у беременных и 30 60,9 % у небеременных пациенток. Самые низкие цифры отмечались в подгруппах с обострением хронического рецидивирующего ВВК (ХВВКО) и

составляли 0 38,4 % у беременных и 0 37% у небеременных; и в подгруппах с первичным острым ВВК (ОВВК) - 0 ^26,9 % и 0 + 30,1% соответственно.

Также было установлено, что уровни совокупной противогрибковой активности АМП у беременных с ВВК достоверно ниже, чем у небеременных женщин с ВВК. Так было обнаружено, что уровень противогрибковой активности АМП (медиана) у беременных женщин с ВВК (26,9%) достоверно ниже, чем у небеременных с ВВК (43,9%) (р = 0,01). Кроме того, как в основной группе беременных с ВВК, так и в группе сравнения была отмечена обратная корреляционная связь между медианами совокупной противогрибковой активности ВО и медианами основных исследуемых показателей.

Так в основной группе были получены следующие данные: корреляция с тяжестью течения ВВК (г = - 0,741), с частотой высева (г = - 0,822), обсемененностью (г =- 0,707), частотой обнаружения ^О-антител (г - - 0,893), 51§А-аптител (г = - 0,953). фагоцитоза (г = - 0,897). В группе сравнения для подгрупп с ВВК данные распределились следующим образом: корреляция с тяжестью течения ВВК (г = - 0,909), с частотой высева (г = - 0,857), обсемененностью (г = - 0,795), частотой обнаружения 1§С-анти[сл (г = - 0,912), в^А-антител (г = - 0,542). Так же не обнаружена корреляция между медианами противогрибковой активности ВО и эффективности фагоцитоза (г= - 0,256). Мы попытались схематически отобразить взаимосвязь формы течения заболевания и параметров местного специфического противогрибкового иммунитета (рис.2). Так на рисунке видно, что в группе здоровых женщин отмечается наиболее высокий уровень активности АМП и наиболее низкие уровни фагоцитоза и иммуногло булинов.

Фагоцитоз Иммуноглобулины АМП

ХВВКО __ __V

ХВВКР

ОВВК ^

ЗДОРОВЫЕ ^ ^

Рис. 2 Схематическое отображение взаимосвязи формы течения заболевания с параметрами местного специфического противогрибкового иммунитета. ( 'Ш- низкий уровень; _ высокий уровень)

При обострении хронического ВВК и при первичном остром ВВК уровни активности АМП резко снижались, а уровни иммуноглобулинов и эффективность фагоцитоза возрастали. При ХВВКР наблюдали относительное повышение всех исследуемых показателей иммунной защиты. Таким образом, непосредственная противогрибковая активность растворимой фракции вагинального отделяемого, по-видимому, является первым условием, сдерживающим увеличение грибной популяции при снижении данного показателя организм вынужден восполнять дефицит АМП с помощью альтернативных механизмов - активизации местной фагоцитарной функции и увеличения синтеза специфических секреторных иммуноглобулинов. Учитывая полученные результаты можно заключить, что совокупная противогрибковая активность АМП является первой линией защиты влагалища при ВВК и ведущим компонентом местного противогрибкового иммунитета и возможно одной из причин более частого возникновения ВВК во время беременности и может служить маркером возможной хронизации процесса.

Оценка эффективности проводимого лечения ВВК у беременных. При обнаружении признаков ВВК у беременных пациенток и при подтверждении диагноза микробиологическими исследованиями назначали лечение соответственно полученным результатам по чувствительности штаммов дрожжей к набору антимикотиков. Учитывая, что выбор препаратов для беременных, страдающих ВВК, достаточно ограничен, для лечения наиболее часто мы использовали два широко известных препарата: Пимафуцин и клотримазол, которые согласно нашим исследованиям по чувствительности в большинстве случаев оказывались самыми эффективными. В связи с этим было решено провести анализ результатов проведенного лечения в зависимости от использовавшегося препарата. Препараты назначали по общепринятым схемам лечения. Таким образом, из всех беременных женщин, нуждавшихся в лечении, пимафуцин получали 63,4 %, 36,4% женщин получали клотримазол. Эффективность проведенного лечения оценивали по улучшению самочувствия женщин и отсутствию жалоб, исчезновению клинических проявлений, а также после подтверждения излечения микробиологическими тестами. Контрольный визит и обследование назначалось через 2-3 недели после проведенного лечения. Все женщины отмечали, что уже на 2-3 сутки после начала приема антимикотических препаратов происходило уменьшение зуда и других жалоб.

Достоверной разницы в клинической эффективности между двумя подгруппами, получавшими два разных препарата, нами обнаружено не было.

Однако в ходе дальнейшего наблюдения было обнаружено, что через 2-3 недели у части пациенток отмечался рецидив заболевания. Так в подгруппе женщин получавших пимафуцин, повторный курс терапии ВВК в связи с рецидивом потребовался 17,9% беременных, а в подгруппе беременных, у которых лечение проводилось клотримазолом, рецидив ВВК наблюдался у 25% беременных, однако достоверной разницы в частоте рецидивов между подгруппами отмечено не было (р - 0,5). Интересно отметить, что все женщины, у которых был диагностирован рецидив, страдали хронической формой ВВК. Всем женщинам с повторными жалобами, характерными для ВВК повторяли микробиологические исследования, при подтверждении диагноза - назначали лечение. Для повторного курса терапии предпочитали смену антимикотического препарата.

Кроме того, нами был проведен сравнительный анализ микробиологических параметров и параметров местного иммунитета до и после лечения. Как видно из таблицы 2 в ходе лечения антимикотическими препаратами происходило уменьшение не только таких параметров как тяжесть течения, обсемененность влагалища грибными клетками, частота положительных культуральных тестов, но также было достоверное изменение параметров местного противогрибкового иммунитета.

Таблица 2

Изменение клинических, микробиологических и иммунологических параметров до и после лечения ВВК у беременных женщин (п-44).__

Параметры Пимафуцин (п=28) Клотримазол (п=16) /'

До лечения После лечения До лечения После лечения

Тяжесть течения 6 2 - 6 2 -

Клеток в поле зрения 42 12 - 40 9 -

Частота высевов (%) 81,1 0 0.0П1 100 0 0.0(11

Эффек фагоцитоза (%) 70 55 > п.; 70 50

ТкО (%,медиана) 53,6 32,1 • 0.2 56,3 37,5 >0.2

б1{:А (%, медиана) 50 0 11.0(11 43,8 0 0.001

Активность АМП (%) 15,2 52,2 <0.И2 15,8 58,1 • 0.02

Так частота обнаружения IgG-антител и sIgA-антител в ВО после выздоровления значительно снижалось, однако если sIgA-антитела не обнаруживались после лечения ни в одном из случаев, то IgG-антитела были определены у 10 женщин. Совокупная противогрибковая активность АМП также увеличивалась более чем втрое в обеих подгруппах, до лечения она варьировала в пределах от 0 % до 37 %, а после лечения от 43,2 % до 92,5%.

Однако достоверной разницы в изменении микробиологических и иммунологических параметров между подгруппами получавшими, различные параметры установлено не было. Таким образом, можно заключить, что снижение суммы симптомов ВВК и обсемененности сопровождались достоверным увеличением противогрибковой активности АМП вагинального отделяемого в 3,4 раза (р < 0,01), которое не зависело от используемого антимикотического препарата.

ВЫВОДЫ

1. Клиническая картина ВВК при беременности носит стертый характер: типичные симптомы ВВК обнаруживаются достоверно реже, чем вне беременности (р < 0,01) - зуд в 1,9 раза; жжение в 4 раза и творожистые выделения в 1,6 раза; частота обнаружения клинических симптомов заболевания превышала частоту предъявления типичных жалоб в 2,9 раза. Тяжесть течения ВВК у беременных при хроническом рецидивирующем течении заболевания в 1,6 раза выше, чем при первичном остром его течении.

2. Тяжесть течения ВВК у беременных напрямую связана с обилием дрожжевых клеток при микроскопии (г = 0,968) и частотой положительных культуральных тестов (г = 0,982). При хроническом вульвовагинальном кандидозе показатели микроскопии и культуральных тестов в 1,4 и 1,9 раза соответственно превышали таковые при первичном остром ВВК.

3. У беременных с хронической рецидивирующей формой ВВК в родах в 55,5% отмечались разрывы мягких родовых путей, из них в 27,7% разрывы шейки матки, в 16,7% разрывы стенок влагалища и 11,1% разрывы задней спайки влагалища.

4. Большинство полученных изолятов дрожжевых грибов относились к роду Candida (76,5 %) , кроме того, 17,6 % обнаруженных дрожжей были идентифицированы как Debaryomyces hansenii, а 5,9 % Rhodotorula sp. Сравнение чувствительности клинических изолятов дрожжевых грибов к 12 противогрибковым препаратам показало, что за последние 10 лет произошло

снижение чувствительности к препаратам азольной группы в среднем в 2 раза и повышение чувствительности к полиеновым препаратам в 2,7 раза.

5. Фагоцитоз не является значимым параметром местного противогрибкового иммунитета, т.к. его уровень, не коррелировал ни с тяжестью течения ВВК (г = 0,216), ни с другими исследуемыми показателями. Частота встречаемости и уровень местных специфических противокандидозных 1§С-антител проявляли высокую степень прямой корреляции с тяжестью течения ВВК (г = 0,798) и обсемененностью (г = 0,772), а также проявляли высокую степень обратной корреляции с совокупной противогрибковой активностью вагинального отделяемого (г = - 0,950). Т.е. отражают тяжесть течения ВВК, но не оказывают прямого противогрибкового действия.

6. Совокупная противогрибковая активность, представленная суммой действия антимикробных пептидов, является ведущим фактором местного противогрибкового иммунитета, т.к. находится в обратной корреляционной взаимосвязи с тяжестью течения ВВК у беременных (г = - 0,741), с показателями микроскопии и культуральных тестов.

7. У беременных уровень совокупной противогрибковой активности АМП (26,9%) и его взаимосвязь с тяжестью течения ВВК достоверно ниже, чем у небеременных (43,9%), что может быть одной из основных причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности.

8. Оценка эффективности лечения ВВК у беременных показала, что снижение суммы симптомов ВВК и обсеменегаюсти сопровождались достоверным увеличением противогрибковой активности АМП вагинального отделяемого в 3,4 раза (р < 0,01), которое не зависело от используемого антимикотического препарата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Необходимо выделять в группу риска по развитию латентных форм рецидивирующего ВВК, беременных имеющих в анамнезе неоднократные эпизоды ВВК, т.к. течение заболевания у женщин с хроническим ВВК во время беременности может носить клинически стертый характер течения в сочетании с высокой патологической активностью дрожжей.

2. Учитывая высокую частоту рецидивов ВВК у беременных во 2 и 3 триместрах, а также высокую частоту разрывов мягких тканей влагалища во время родов у женщин, страдающих хронической рецидивирующей формой ВВК необходимо проводить обязательное микробиологическое

исследование (нативная микроскопия и культуральное исследование) перед предполагаемым сроком родов и при необходимости провести санацию влагалища.

3. Препаратом выбора для лечения вульвовагинального кандидоза во время беременности, является препараты полиенового ряда, т.к. изучение чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам и сравнение их с данными 10-летней давности, показало снижение активности таких широко используемых в акушерско-гинекологической практике препаратов, как препараты азольного ряда (клотримазол, кетоконазол, флюконазол, итраконазол) и, напротив, повышение активности препаратов полиенового ряда (пимафуцин и леворин).

4. В качестве маркера перехода острой формы ВВК в хроническую и определения тактики дальнейшей терапии заболевания может быть использовано определение совокупной противогрибковой активности антимикробных пептидов. Данное исследование может быть внедрено в практическое здравоохранение, как доступный и не дорогостоящий метод исследования местного иммунитета.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Мальбахова Е.Т. Изучение чувствительности дрожжевых культур, выделенных от пациентов с хроническим вульвовагинитом, к набору противогрибковых препаратов/ Е.Т.Мальбахова, В.Г. Арзуманян // Научно-практическая конференция по медицинской микологии (IX Кашкинские чтения). Проблемы медицинской микологии. - 2006.- Т.8,- С. 63.

2. Арзуманян В.Г. Усовершенствование диагностического антигенного препарата из дрожжей Candida albicans/ Арзуманян В.Г., Мальбахова Е.Т., Сердюк O.A. // Мат. Конф. «Вакцинология -2006»,- Москва, ноябрь 2006,- С. 16.

3. Арзуманян В.Г. Антигенный препарат из поверхностных белков дрожжей Candida albicans для диагностики кандидозов / Арзуманян В.Г., Мальбахова Е.Т., Сердюк O.A., Комисарова Л.М. // Мат. IX Съезда ВНПО эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» - Москва, апрель 2007. - С. 7-8.

4. Арзуманян В.Г. Сравнение чувствительности штаммов дрожжей, выделенных от пациенток с кандидозным вульвовагинитом, к набору

противогрибковых препаратов / Арзуманян В.Г., Комиссарова JI.M., Касабулатов Н.М., Мальбахова Е.Т. // Мат. I Международного семинара «Инфекция в акушерстве и перинатологии» - Москва, апрель 2007. - С. 26.

5. Мальбахова Е.Т. Чем отличается лекарственная чувствительность штаммов дрожжей при остром и хроническом вульвовагините? / Мальбахова Е.Т., Арзуманян В.Г., Комиссарова JI.M. // Мат. IV Всерос. конг. по мед. микологии «Успехи мед. Микологии»,- Москва, март 2007

6. Arzumanian V.G. Factors of local immunity directed against opportunistic yeasts in pregnant women with vulvovaginal candidiasis / Arzumanian V.G., Malbakhova E.T., Serdiuk O.A., Komissarova L.M // Mat. Of XV Congress of European Mycologists, Saint Petersburg, Sep. 2007, P.212

7. Арзуманян В.Г. Новое в диагностике, оценке местного иммунитета и прогнозировании вульвовагинального кандидоза./ Арзуманян В.Г., Мальбахова Е.Т.,Сердюк О.А., Комисарова Л.М., Сердюк О.А. // Мат. V Всерос. конг. по мед. микологии «Успехи мед. Микологии».- Москва, март 2008, С.408.

8. Арзуманян В.Г. Антимикробные пептиды как факторы местного иммунитета при вульвовагиналыюм кандидозе./ Арзуманян В.Г., Мальбахова Е. Т. , Комиссарова Л.М. // Эпидемиология и инфекционные болезни -№ 4, 2008, С. 46-49.

9. Арзуманян В.Г. Местный противогрибковый иммунитет при вульвовагинальном кандидозе у беременных/ Арзуманян В.Г., Мальбахова Е.Т.,Сердюк О.А., Комисарова Л.М., Н.М. Касабулатов // Акушерство и гинекология -№6, 2008 С. 23-26.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМП Антимикробные пептиды

ВВК Вульвовагинальный кандидоз

ВО Влагалищное отделяемое

КОЕ Колонеобразующие единицы

ОВВК Острый вульвовагинальный кандидоз

ИМИ Полиморфноядерные нейтрофилы

ХВВКО Хронический ВВК в стадии обострения

ХВВКР Хронический ВВК в стадии ремиссии

IgG/sIgA Иммуноглобулин а секреторный иммуноглобулин А

25

Подписано в печать 22 мая 2009 г.

Формат 60x90/16

Объём 1.5 п.л.

Тираж 110 экз.

Заказ №220509217

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес: 119333, г. Москва, Университетский проспект, д. 6, кор. 3.

Тел. 740-76-47, 125-22-73.

Ьйр:/Л\лу\у.ишуегрпп1.ги

Актуальность темы

Вульвовагинальный кандидоз наиболее часто встречается среди женщин детородного возраста, причем по данным I.D. Sobel, 75% женщин в течение жизни имеют хотя бы один, а 40-45% — два и более эпизода кандидоза мочеполовых органов [Sobel J.D., 2000]. Особое внимание уделяют хронической рецидивирующей форме вульвовагинального кандидоза, так как от 5 до 15% женщин репродуктивного возраста страдают этим заболеванием, причем число таких случаев неуклонно растет, а терапия представляет большие трудности [Климко Н.Н., Мирзабалаева А.К. с соавт., 2007]. Особенностью данной инфекции является длительное течение, возможность распространения на другие органы и системы с развитием в 20-30% случаев генерализованных форм кандидоза у иммунокомпроментированных больных [Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В., 2000]. Факторами, способствующими развитию дрожжевой инфекции, считают: наличие основных заболеваний (инфекционных, эндокринопатических, аутоиммунных и др.); механические травмы; химические факторы (применение кортикостероидов, цитостатиков, антибиотиков, оральных контрацептивов); физиологические факторы [Прилепская В.Н., 2006]. Среди физиологических факторов к наиболее важным относится беременность. Установлено, что с наступлением беременности вероятность возникновения кандидоза влагалища увеличивается в несколько раз и составляет 30-40%) [Орджоникидзе Н.В., 2004]. Причинами этого считают резкое изменение местного иммунитета и уровня секретируемых гормонов, однако многое неизвестно в механизмах развития дрожжевого вульвовагинита [Mendling W., 2007]. Так, например, до сих пор не ясно, какой из показателей иммунитета является наиболее значимым, и не доказано, какими факторами обусловлен переход симбиотической дрожжевой культуры в патогенную, а острого течения вульвовагинита - в хроническое.

Из всего множества факторов местного иммунитета можно выделить несколько из них, которые непосредственно взаимодействуют с клетками оппортунистических дрожжей — это фагоцитирующие клетки [Nomanbhoy F et al., 2002], иммуноглобулины^ВагошБе et al., 2004] и антимикробные пептиды (АМП - эндогенные антибиотики) [Valore E.V. et al., 2002, 2006]. Оценку фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами принято проводить in vitro [Vonk, Alieke G. et al., 2002], однако нам не удалось обнаружить публикаций, посвященных действию этих клеток на дрожжи in vivo. Известна особенность иммунитета слизистых оболочек, относящаяся к преимущественной продукции секреторного IgA [Сухих Г.Т, Ванько JLB., 2003], однако в секретах слизистых оболочек половых путей человека содержится больше IgG, чем slgA [Mestecky, J. et al., 2005]. Но данные о взаимосвязи уровней иммуноглобулинов и кандиданосительством при ВВК немногочисленны и противоречивы [de Carvalho R.J. et al., 2003; Kurnatowska A. et al., 2002; Mestecky, J. et al., 2005].

Однако и фагоцитоз и иммуноглобулины давно изучаемые и широко известные параметры иммунитета, а АМП и их действие как объект исследования в медицинских науках стали использоваться не так давно и изучены мало.

В последние десятилетия с ростом числа и разнообразия иммунодефицитных состояний в человеческой популяции параллельно происходит переход микроорганизмов из категории сапротрофов в категорию условно патогенных. В 1980 г. было известно 10 видов 4-х родов клинически значимых дрожжей [Jawetz Е., 1980], в 1987 г. — 18 видов 5-ти родов [Hurley R., 1987], а в 1998 г. - уже 36 видов 9-ти родов [Ahearn D.G., 1998]. Наиболее часто слизистые оболочки гениталий населяют дрожжи рода Candida, особенно С. albicans, однако, встречаются также Rhodotorula sp., Saccharomycopsis sp., Pichia sp., а возможно и многие другие. Учитывая растущий список клинически значимых видов диагностика вульвовагинального кандидоза, основанная только на клинических проявлениях, без применения лабораторных исследований, таких как микроскопия отделяемого и культуральное исследование, ведет не только к неадекватной терапии и увеличению числа резистентных штаммов, но и к росту хронических, рецидивирующих форм заболевания.

На основании вышеизложенного очевидно, что периодическое мониторирование родовой/ видовой принадлежности и чувствительности штаммов дрожжей, выделяемых от пациентов с острым и хроническим вульвовагинитом имеет важное фундаментальное и прикладное значение. Изучение взаимосвязи между обсемененностью, тяжестью течения и некоторыми показателями иммунитета должно способствовать уточнению механизмов трансформации симбиотической дрожжевой микрофлоры в патогенную и уточнить звенья патогенеза данного заболевания.

Цель и задачи исследования

Цель исследования: оптимизация тактики ведения беременных женщин с вульвовагинальным кандидозом на основании определения взаимосвязи между клиническим течением заболевания у беременных, дрожжевой микрофлорой влагалища и показателями местного специфического иммунитета.

Задачи исследования:

1. Определить особенности клинической картины и характера течения ВВК во время беременности в современных условиях.

2. Изучить исходы беременности и родов у женщин с ВВК.

3. Определить видовой состав дрожжевой микрофлоры влагалища и ее чувствительность к антимикотическим препаратам в современных условиях и сравнить с ретроспективными данными за 10 лет.

4. Исследовать показатели местного иммунитета - фагоцитоз, иммуноглобулины и антимикробные пептиды — во взаимосвязи с течением ВВК у беременных женщин.

5. Оценить влияние проводимого лечения ВВК у беременных на клинические, микробиологические и иммунологические показатели.

Научная новизна

Впервые изучены показатели местного противогрибкового иммунитета — фагоцитоз, специфические иммуноглобулины и совокупная противогрибковая активность антимикробных пептидов (лактоферрин, кальпротектин, лизоцим, секреторный ингибитор лейкопротеазы, кателицидины, дефензины) — во взаимосвязи с тяжестью течения ВВК и показателями состояния дрожжевой популяции в данном локусе.

Показано, что именно совокупная активность антимикробных пептидов является первой линией местного иммунитета в противогрибковой защите влагалища.

Впервые показано, что низкий уровень антимикробной активности АМП является одной из причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности.

Проведение видовой идентификации изолятов, полученных от беременных пациенток с ВВК, более современными методами показало снижение удельного веса С. albicans и расширение родового состава дрожжей. Практическая значимость

Выявление некоторых особенностей течения ВВК при беременности: стертость клинической картины, зависимость тяжести течения от формы течения заболевания и ее связь с микробиологическими показателями позволит проводить раннюю, более точную диагностику заболевания у беременных и, соответственно, адекватное лечение

На основании полученных данных по чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам было показано снижение активности таких популярных в акушерско-гинекологической практике препаратов, как азолы, и, напротив, повышение активности полиенов.

Среди прочих показателей местного иммунитета именно совокупная противогрибковая активность антимикробных пептидов может быть использована в качестве прогностического параметра и маркера перехода острой формы ВВК в хроническую.

Положения, выносимые па защиту:

1. Клиническая картина ВВК при беременности носит стертый характер: типичные симптомы ВВК выявлялись достоверно реже, чем вне беременности; частота клинических симптомов превышала частоту предъявления типичных жалоб в среднем в 3 раза. Тяжесть течения ВВК у беременных напрямую связана с обилием дрожжевых клеток при микроскопии (г = 0,968) и частотой положительных культуральных тестов (г = 0,982) и достоверно выше при хронической форме, чем при первичной острой.

2. Выделенные штаммы относились к 3 родам: Rhodotorula sp. (5,9 %), Debaryomyces sp. (17,6 %) и Candida sp. (76,5%). Наиболее широко применяемые в акушерско-гинекологической практике препараты азольного ряда (клотримазол, кетоконазол, флюконазол, итраконазол) показали снижение активности в отношении клинических изолятов дрожжевых грибов в 2 раза за последние 10 лет, тогда как препараты полиенового ряда (пимафуцин и леворин) проявили повышение активности в 2,7 раза.

3. Основным фактором местного противогрибкового иммунитета является суммарная активность антимикробных пептидов. Уровень совокупной противогрибковой активности АМП (26,9%) у беременных и его взаимосвязь с тяжестью течения достоверно ниже, чем у небеременных (43,9%), что может являться одной из причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности. Данный показатель может быть использован в качестве прогностического при оценке рисков хронизации процесса.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на XV международном конгрессе «XV Congress of European Mycologists» , Санкт-Петербург, сентябрь 2007г.; на V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии «Успехи мед. Микологии», Москва, март 2008 г. Апробация диссертации была проведена на совместном заседании кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова и апробационной комиссии ФГУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова Росмедтехнологий» 02 февраля 2009 г.

Гранты

В рамках работы был получен грант DAAD (Германское общество академических обменов) совместно с Ernst Schering Foundation для прохождения научной стажировки и выполнения части работы на базе медицинского университета Charite, г. Берлин, Германия.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендуемых ВАК.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 3 работы в журналах, рекомендуемых ВАК.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования внедрены в клиническую практику в отделениях ФГУ «Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова» Росмедтехнологии.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 130 стр. компьютерного текста, содержит 22 таблицы и 22 рисунка. Библиография включает 118 литературных источника, в том числе 29 — отечественной и 89 — зарубежной литературы.

выводы

1. Клиническая картина ВВК при беременности носит стертый характер: типичные симптомы ВВК обнаруживаются достоверно реже, чем вне беременности (р < 0,01) - зуд в 1,9 раза; жжение в 4 раза и творожистые выделения в 1,6 раза; частота обнаружения клинических симптомов заболевания превышала частоту предъявления типичных жалоб в 2,9 раза. Тяжесть течения ВВК у беременных при хроническом рецидивирующем течении заболевания в 1,6 раза выше, чем при первичном остром.

2. Тяжесть течения ВВК у беременных напрямую связана с обилием дрожжевых клеток при микроскопии (г = 0,968) и частотой положительных культуральных тестов (г = 0,982). При хроническом вульвовагинальном кандидозе показатели микроскопии и культуральных тестов в 1,4 и 1,9 раза соответственно превышали таковые при первичном остром ВВК. ;

3. У беременных с хронической рецидивирующей формой ВВК в родах в 55,5% отмечались разрывы мягких родовых путей, из них в 21,1% разрывы шейки матки, в 16,7% разрывы стенок влагалища и 11,1% разрывы задней спайки влагалища.

4. Большинство полученных изолятов дрожжевых грибов относились к роду Candida (76,5 %) , кроме того, 17,6 % обнаруженных дрожжей были идентифицированы как Debaryomyces hansenii, а 5,9 % Rhodotorula sp. Сравнение чувствительности клинических изолятов дрожжевых грибов к 12 противогрибковым препаратам показало, что за последние 10 лет произошло снижение чувствительности к препаратам азольной группы в среднем в 2 раза и повышение чувствительности к полиеновым препаратам в 2,7 раза.

5. Фагоцитоз не является значимым параметром местного противогрибкового иммунитета, т.к. его уровень, не коррелировал ни с тяжестью течения ВВК (г = 0,216), ни с другими исследуемыми показателями. Частота встречаемости и уровень местных специфических противокандидозных IgG-антител проявляли высокую степень прямой корреляции с тяжестью течения ВВК (г — 0,798) и обсемененностью (г = 0,772), а также проявляли высокую степень обратной корреляции с совокупной противогрибковой активностью вагинального отделяемого (г = - 0,950). Т.е. IgG отражают тяжесть течения ВВК, но не оказывают прямого противогрибкового действия.

6. Совокупная противогрибковая активность АМП находится в обратной корреляционной взаимосвязи с тяжестью течения ВВК у беременных (г — - 0,741), с показателями микроскопии и культуральных тестов. Т.е. совокупная противогрибковая активность, представленная суммой действия антимикробных пептидов, является ведущим фактором местного противогрибкового иммунитета.

7. У беременных уровень совокупной противогрибковой активности АМП (26,9%) и его взаимосвязь с тяжестью течения ВВК достоверно ниже, чем у небеременных (43,9%), что может быть одной из основных причин наиболее частого возникновения заболевания во время беременности.

8. Оценка эффективности лечения ВВК у беременных показала, что снижение суммы симптомов ВВК и обсемененности сопровождались достоверным увеличением противогрибковой активности АМП вагинального отделяемого в 3,4 раза (р < 0,01), которое не зависело от используемого антимикотического препарата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Необходимо выделять в группу риска по развитию латентных форм рецидивирующего ВВК, беременных имеющих в анамнезе неоднократные эпизоды ВВК, т.к. течение заболевания у женщин с хроническим ВВК во время беременности может носить клинически стертый характер течения в сочетании с высокой патологической активностью дрожжей.

Учитывая высокую частоту рецидивов ВВК у беременных во 2 и 3 триместрах, а также высокую частоту разрывов мягких тканей влагалища во время родов у женщин, страдающих хронической рецидивирующей формой ВВК необходимо проводить обязательное микробиологическое исследование (нативная микроскопия и культуральное исследование) перед предполагаемым сроком родов и при необходимости провести санацию влагалища.

Препаратом выбора для лечения вульвовагинального кандидоза во время беременности, является препараты полиенового ряда, т.к. изучение чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам и сравнение их с данными 10-летней давности, показало снижение активности таких широко используемых в акушерско-гинекологической практике препаратов, как препараты азольного ряда (клотримазол, кетоконазол, флюконазол, итраконазол) и, напротив, повышение активности препаратов полиенового ряда (пимафуцин и леворин).

В качестве маркера перехода острой формы ВВК в хроническую и определения тактики дальнейшей терапии заболевания может быть использовано определение совокупной противогрибковой активности антимикробных пептидов. Данное исследование может быть внедрено в практическое здравоохранение, как доступный и не дорогостоящий метод исследования местного иммунитета.