Автореферат и диссертация по медицине (14.01.16) на тему:Клиническое течение и эффективность лечения туберкулеза в зависимости от степени цитотоксичности возбудителя

4

На правах рукописи

БАРНАУЛОВ Алексей Олегович

КЛИНИЧЕСКОЕ ТЕЧЕНИЕ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТЕПЕНИ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

14.01.16- фтизиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

~ 2 ЛЕЯ 2010

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2010

004616102

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского Росздрава»

Защита состоится «14» декабря 2010г. в 13 часов на заседании диссертационного совета при ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (191036, Санкт-Петербург, Лиговский пр., 2/4, тел. (812)579-25-84).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного учреждения «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий» (191036, г. Санкт-Петербург, Лиговский пр., д.2-4, тел.(812)579-25-87) и на сайте www.spbniif.ru.

Автореферат разослан «11» ноября 2010г.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Мария Васильевна Павлова доктор медицинских наук, профессор Борис Израйлевич Вишневский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Николай Андреевич Браженко доктор медицинских наук Лозовская Марина Эдуардовна

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор

Т. И. Виноградова

Актуальность проблемы. Снижение эффективности лечения туберкулеза органов дыхания в XXI веке во многом связано с появлением лекарственно устойчивых форм возбудителя. Развитие лекарственной устойчивости - закономерная реакция микроорганизма на новый неблагоприятный фактор окружающей среды. Длительное применение противотуберкулезных препаратов вызвало появление новых популяций возбудителя, исследование которых предполагает применение современных микробиологических и молекулярно-генетических исследований. Особое внимание уделяется изучению взаимоотношения биологических свойств МБТ и ответа макроорганизма на инфекцию.

Опыта на животных и эпидемиологические исследования показали, что чувствительные и лекарственно-устойчивые штаммы МБТ могут обладать разной степенью патогенности (Бастиан И., Портале Ф., 2003). Такие различия могут быть обусловлены выявленной в последние годы генетической неоднородностью вида Mycobacterium tuberculosis. У больных, выделяющих МБТ генотипа Beijing, наблюдаются более выраженные симптомы интоксикации, более распространенные поражения легочной ткани и прогрессирующее течение, чем у больных с возбудителем иных генотипов (Drobniewski F. et al., 2005). Ряд ранее проведенных исследований, посвященных изучению вирулентности на модели заражения мышей, также обнаружил более высокие вирулентные свойства МБТ генетического семейства Beijing (Вишневский Б.И. и др., Сапожникова Н.В., 2003; Lopez В. et al., 2003; Tsenova L. et al., 2005). В последнее время более выраженная клиническая картина и меньшая эффективность лечения пациентов, инфицированных МБТ этого генетического семейства, объясняется авторами как результат большей встречаемости МЛУ среди возбудителей этого генотипического кластера на Северо-Западе РФ - 64,6% (Нарвская О.В., 2003; Андреевская С.Н. и др., 2007; Земскова З.С. и др., 2010). Такие разноречивые сведения могут быть связаны с генетической неоднородностью кластера W (Андреевская С.Н. и др., 2006; Theus S.A. et.al., 2007). К 2002 г. у больных

v 3

хроническим деструктивным туберкулезом легких частота встречаемости штаммов МБТ с выраженной вирулентностью возросла в сравнении с аналогичными данными, полученными в 1987 г. (Вишневский Б.И. и др., 2006). Доказана корреляция такого биологического свойства МБТ, как жизнеспособность с течением диссеминированного туберкулеза легких (Корецкая Н.М., Ярыгина И.В., 2007). Молекулярно-генетические исследования выявили, что мутация в гене гроВ (замена 531 TCG—»•TTG, Ser—»Leu) обусловливает резистентность к высоким концентрациям рифамгшцина и не нарушает жизнеспособности МБТ (Ramaswamy S., Musser J., 3998; Billington О. et al„ 1999; Mariam D.H. et al„ 2004). D.van Soolingen et al. (2000) приводят данные об ассоциации мутации в гене katG (замена 315AGC—>АСС( Ser—»Leu)) с высокой трансмиссивностью штаммов МБТ. Мутанты Ser315-Thr не утрачивают вирулентности для мышей (Рут A.et al., 2002). Для мультирезистентных МБТ генетического семейства Beijing характерно наличие обеих этих мутаций (Нарвская О.В., 2003; Журавлев В.Ю. и др., 2007). Изменение характеристик МБТ в последние десятилетия требует пристального изучения роли биологических свойств возбудителя, таких как вирулентность, жизнеспособность, принадлежность к определенному генетическому семейству, лекарственная устойчивость в клиническом течении современного туберкулеза.

Активация гибели макрофагов (цитотоксичность) - одно из свойств вирулентности МБТ, которое можно оценить количественно с использованием клеточных макрофагоподобных линий in vitro.

В настоящей работе представлены особенности клинического течения и эффективности лечения впервые выявленного туберкулеза легких в зависимости от вирулентных свойств возбудителя, которые определялись по цитотоксическому тесту.

Цель работы: изучить значение цитотоксических свойств возбудителя в клинике туберкулеза легких.

Задачи исследования:

1. Дать оценку вирулентности штаммов МВТ по тесту цитотоксичности с использованием моноцитоподобных клеток человека линии ТНР-1, исследовать соотношение биологических свойств возбудителя.

2. Определить; особенности клинического течения туберкулезного процесса в сопоставлении с цитотоксичностью, лекарственной устойчивостью и генотипом возбудителя.

3. Оценить эффективность химиотерапии у больных с разной степенью цитотоксических свойств МВТ.

4. Определить значимость клинико-бактериологических показателей в клиническом течении туберкулеза органов дыхания.

Научная новизна. Впервые сопоставлены генотип и биологические свойства МВТ (цитотоксичность, жизнеспособность, лекарственная устойчивость). Обнаружена прямая достоверная корреляция цитотоксических свойств и жизнеспособности. Установлено, что высоковирулентные штаммы обладают наибольшей скоростью и массивностью роста. Изучена клинико-рентгенологическая характеристика туберкулезного процесса у больных, выделяющих МВТ с различным генотипом и биологическими свойствами возбудителя. Впервые установлена зависимость клинической картины и эффективности лечения туберкулеза органов дыхания (ТОД) от способности МВТ активировать гибель макрофагов на модели заражения клеточной линии ТНР-1. У больных, выделяющих штаммы с высокой цитотоксичностью, туберкулезный процесс характеризуется более тяжелым течением и низкой эффективностью лечения.

Практическая значимость. Сопоставление клинической картины заболевания, эффективности химиотерапии МЛУ туберкулеза с вирулентностью, генотипом, жизнеспособностью и лекарственной

устойчивостью МБТ дает возможность оценить вклад биологических свойств в характер течения ТОД. Полученные данные позволят выявить то сочетание клинико-лабораторных, рентгенологических и микробиологических показателей, ■, которое определяет благоприятное или неблагоприятное клиническое течение заболевания. Результаты исследования могут служить основой для разработок рациональных подходов к комплексной терапии туберкулеза.

Положения, выносимые на защиту

1. Цитотоксические свойства МБТ имеют прямую корреляционную связь с жизнеспособностью и не зависят от лекарственной устойчивости.

2. Туберкулезные процессы, вызванные МБТ с высокой цитотоксичностью и жизнеспособностью, характеризуются выраженными симптомами интоксикации, наиболее значительными изменениями периферической крови, обильным бактериовыделением, двухсторонней и полисегментарной распространенностью специфического процесса, наличием сформированных полостей.

3. Выявлена корелляция клинико-рентгенологических характеристик тяжести туберкулезного процесса и цитотоксических свойств возбудителя. Наиболее тяжелая клиническая картина заболевания характерна для возбудителя МБТ с высокой цитотоксичностью.

4. Эффективность лечения больных ТОД зависит от биологических свойств возбудителя: при высокой цитотоксичности МБТ заболевание характеризуется меньшей эффективностью лечения по срокам закрытия полостей распада.

5. Процессы, вызванные МЛУ МБТ генетического семейства Beijing с высокой цитотоксичностью и жизнеспособностью, отличаются наиболее тяжелой клинико-рентгено-лабораторной картиной процесса и прогрессирующим течением.

Реализация результатов работы. На основании полученных результатов разработаны практические рекомендации, использующиеся в лечебно-диагностической деятельности отделения терапии туберкулеза легких и лаборатории микробиологии ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий», ГУЗ «Пушкинский противотуберкулезный диспансер». Основные положения диссертации включены в унифицированную программу последипломного обучения на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава». Оформлена заявка на изобретение №2009139270 «Способ лечения инфильтративного туберкулеза легких, вызванного множественно-лекарственно-устойчивыми и высокоцитотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза» (приоритетная справка от 23.10.2009 г.).

Апробация диссертационной работы. Результаты исследования доложены на 3-м конгрессе "Инновацни в XXI веке: профессиональное образование, наука" (Санкт-Петербург, 2009); научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2009); научно-практической конференции "Совершенствование медицинской помощи во фтизиатрии" (Саша-Петербург, 2010).

По материалам работы опубликовано 5 печатных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 91 странице. Состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, включающего 105 источников (50 отечественных и 55 иностранных авторов). Работа содержит 17 таблиц и 4 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Обследовано 97 впервые выявленных больных туберкулезом органов дыхания, находящихся на стационарном лечении в клинике терапии туберкулеза легких ФГУ "СПб НИИФ Росмедтехнологий" за период 20072010 гг. Средний возраст пациентов составил 32,7+2,2 года, из них 43 лица мужского пола (44,3%) и 54 женского (55,7%). В клинической структуре преобладающей формой был инфильтративный туберкулез (п=91), у 6 пациентов установлен диссеминированный туберкулез. Клинические проявления заболевания в виде кашля и одышки регистрировались у большинства больных, в том числе кашель - у 76 пациентов (78,3 %), одышка -у 31 (32,1%). Симптомы интоксикации различной интенсивности отмечались у 89 обследованных, в том числе выраженные - у 14 (23,7%), умеренно выраженные - у 42 (43,3%), незначительные - у 33 (34,0%).

Количество лейкоцитов в периферической крови при поступлении в стационар было в пределах нормы у 59 больных (60,8%), не превышало 15x10% - у 29 (37,3%), более 15х109/л - у 9 (9,3%). Увеличение скорости оседания эритроцитов отмечено у 81 больного (83,5%), в том числе значительно (более 30 мм/час) - у 33 (34,0%). Лимфоиения выявлена у 52 обследованных больных (53,6%), в том числе значительная (менее 12%) - у 10 (10,3%). Сдвиг лейкоцитарной формулы в сторону палочкоядерных нейтрофилов наблюдался у 47 пациентов (48,5%), в том числе наиболее значительный (более 0,5x10%) в 8 случаях (8,2%).

Рентген-томографическое обследование выявило у 25 больных (25,8%) двухсторонний туберкулезный процесс. Изменения легочной ткани, распространенные на 3 и более сегментов, зарегистрированы в 40 случаях (41,2%). Специфический процесс, ограниченный 1-2 сегментами, обнаружен у 32 обследованных (33,0%). У большинства пациентов (87,6%) обнаружены деструктивные изменения, в том числе начинающийся распад - у 18 (18,6%),

формирующиеся полости - у 45 (46,4%), сформированные полости - у 22 (22,7%). Одиночные участки распада легочной ткани диагностированы в 42 наблюдениях (43,3%), множественные - в 43 (44,3%). Преобладающим типом тканевой реакции являлся экссудативный - 76,3% наблюдений (74 человека). Продуктивный и казеозный встречались в 18 (18,6%) и 5 (5,2%) случаях соответственно.

У больных ТОД оценивали характер специфического процесса на основании стандартных клинико-рентгенологических и лабораторных параметров исходно и в динамике (к 3 и 6 месяцу интенсивной терапии). Эффективность лечения учитывали по основным клинико-рентгенологическим показателям (исчезновение симптомов интоксикации, прекращение бактериовыделения и закрытие полостей распада к 3 и 6 месяцам стационарного лечения) и бактериостатической активности крови (в дальнейшем БАК).

БАК считали высокой, если сыворотка задерживала рост МБТ в 5-10 разведении (1:32 - 1:1024), средней - в 3-4 (1:8 - 1:16), низкой - в 1-2 (1:2 -1:4), нулевой - если сыворотка не задерживала рост МБТ ни в одном из разведений.

Клинические изоляты, выделенные от 97 больных ТОД, исследованы на предмет цитотоксических свойств, лекарственной устойчивости и жизнеспособности.

Изучение вирулентности МБТ проведено in vitro на модели активации гибели макрофагов (цитотоксический тест) с использованием перевиваемой линии моноцитоподобных клеток человека ТНР-1. Морфологически эта клеточная линия представляет собой мутантный клон предшественников Т-лимфоцитов, полученный от больного острой моноцитарной лейкемией. Клетки ТНР-1 заражали штаммами в пропорциях 50:1 бактерий/макрофаг. Зараженные клетки инкубировали при + 37°С в 5% С02 в течение 96 часов. Содержимое лунок в планшетах фиксировали 10% раствором формалина и окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета в течение 30 минут, а затем

промывали проточной водой в течение 15 минут. После просушки и обработки 0,2% раствором Triton Х-100 (для лизирования клеточных структур и выхода красителя в раствор) супернатант перемещали в чистый 96-луночный планшет для дальнейшей оценки оптической плотности (ОП) в планшетном фотометре (EIA Microwell Reader 11, Sigma). Процент гибели инфицированных клеток вычисляли по формуле:

% погибших клеток = (ОП контроля-ОП образца/ ОП контроля) х 100%

[С]

Цитотоксичность штамма оценивали в сравнении с музейным штаммом H37Rv: как высокую, если процент гибели макрофагов был достоверно выше, среднюю - при значениях, колеблющихся в пределах доверительного интервала средних значений стандартного штамма, низкую - при достоверно меньших значениях (Castro-Garza J. et al., 2007). В общей сложности проведено 185 определений цитотоксичности для установления вирулентных свойств 97 клинических изолятов.

Жизнеспособность выделенных штаммов МБТ учитывали как низкую при массивности роста менее 20 колоний и длительности - более 30 дней (1 условная единица), как высокую - массивность роста более 100 колоний, длительность - менее 30 дней (3 условных единицы), среднюю - при других сочетаниях массивности и длительности роста (2 условных единицы) (Вишневский Б.И., 1971).

Все клинические изоляты исследованы на предмет лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Лекарственную чувствительность МБТ определяли стандартным непрямым методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена (Приказ № 109 Минздрава России).

Штаммы от эпидемиологически несвязанных больных ТОД генотипированы в лаборатории молекулярной микробиологии ФГУН СПб НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора, исследована генетическая

принадлежность штаммов МБТ с использованием метода сполиготипирования (Kamerbeek J. et al., 1997).

В лаборатории молекулярной генетики ФГУ «СПб НИИФ Росмедтехнологий» клинические изоляты МБТ исследованы на мутации в генах katG, inhA, ahpC и гроВ с помощью системы микрочипов «ГБ-БИОЧИП» ИМБ РАН.

В зависимости от степени цитотоксичности клинических изолятов сформировано 3 группы больных: 1-ю группу составили пациенты, выделяющие высокоцнтотоксичные МБТ (п=42), 2-ю группу - больные, выделяющие штаммы со средней цитотоксичностью (п=21), 3-ю группу - с низкой цитотоксичностью (п=34).

При статистической обработке результатов исследования использован статистический пакет Windows Statistical 6.0, обеспечивающий анализ однородности дисперсий по критерию Бартлета, корреляционный анализ - с использованием коэффициента Пирсона. Разница между показателями считалась достоверной при р<0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Для выполнения первой задачи изучены вирулентные свойства 97 клинических изолятов, полученных от больных туберкулезом органов дыхания, на предмет цитотоксических свойств, лекарственной устойчивости и жизнеспособности. Высокая цитотоксичность имела место у 42 (43,3%) из числа изученных клинических изолятов, средняя - у 21 (21,6%) и низкая - у 34 (35,1%). Установлено, что чувствительностью ко всем противотуберкулезным препаратам обладают 26 штаммов (26,8%), монорезистентность зарегистрирована в 4 случаях (4,1%), полирезистентность - в 15 (15,5%). Из 52 штаммов МЛУ МБТ 12 культур (12,4%) относились к штаммам с обширной лекарственной устойчивостью. Высокая жизнеспособность характерна для наибольшего количества

исследованных штаммов (49 случаев - 47,4%). Средняя и низкая жизнеспособность зарегистрирована в 28,9% (28 культур) и 20, 6% (20 изолятов) случаев соответственно.

Из общего числа исследованных клинических изолятов 50 отнесено к генетическому семейству Beijing (54,3%), 17 штаммов принадлежали семейству LAM (18,5%), в 25 наблюдениях (27,2%) регистрировались другие генетические кластеры (TI, T5Rusl, Н, HI). У 76 штаммов исследованы мутации в генах katG, inhA, abpC и гроВ с помощью системы микрочипов «ТБ-БИОЧИП» ИМБ РАН. Устойчивость к изониазиду в основном обусловлена заменой нуклеотидов (Ser315-Thr(l)) в гене katG - у 94,4% штаммов; у 11,1% из них обнаружено сочетание мутаций katG (Ser315-Thr(l)) и inhA_T15. При наличии устойчивости к изониазиду, выявленной на плотной среде, в 2 случаях этим тестом мутаций не обнаружено. Мугации в гене гроВ, определяющие устойчивость к рифампицину, чаще всего (в 80,6%) были связаны с заменой в 531 кодоне Ser-Leu. 19,4% штаммов, фенотипически устойчивые к R, не имели мутаций, обнаруживаемых используемым тестом.

При анализе биологических свойств возбудителя установлено, что 27 (64,3%) высоковирулентных штаммов обладают высокой жизнеспособностью, тогда как среди МБТ с низкой цитотоксичностью встречаются достоверно реже - 12(35,3%). Наименьшие скорость и массивность роста характерны для низковирулентных клинических изолятов (15 штаммов - 44,1%), учитывая, что сочетание низкой жизнеспособности и высокой цитотоксичности наблюдалось лишь в 4,8% случаев (р<0,05).

Частота чувствительных, моно- и полирезистентных, МЛУ штаммов была сопоставима во всех группах больных с преобладанием МЛУ в каждой.

Это подтверждается примерно одинаковым набором различных мутаций среди культур, различающихся по цитотоксичности. Наиболее часто встречающимся сочетанием нуклеотидных замен является KatG (Ser315-

Thr(l))+rpoB (Ser531-Leu) и составляет 30,3%, 25,0% и 29,6% в 1-ой, 2-ой и 3-ей группах соответственно.

Анализ распределения по генотипической принадлежности в группах, отличающихся по цитотоксичности возбудителя, не обнаружил достоверных различий. К семейству Beijing в каждой из групп (МБТ с высокой, средней и низкой цитотоксичностью) принадлежат 22 (59,4%), 12 (57,1%) и 16 (48,5%) штаммов; к семейству LAM - 8 (21,6%), 1 (4,8%) и 7 (21,2%); к другим - 13 (40,6%), 9 (60,0%) и 10 (52,6%) клинических изолятов соответственно.

Сравнительная оценка лекарственной устойчивости МБТ различных генотипов выявила, что среди клинических изолятов семейства Beijing МЛУ и полирезистентные МБТ встречаются в 1,7 раза чаще, чем среди штаммов другой генетической принадлежности. В группе, собранной из различных генетических семейств, не относящихся к W кластеру, на 30 % больше штаммов, чувствительных ко всем ПТП (р<0,05). Данный факт подтверждается большей частотой встречаемости среди МБТ генотипа Beijing сочетания мутаций, определяющих резистентность к Н и R - katG (Ser315-Thr(l))+rpoB (Ser531-Leu) - в 12,3 раза чаще, чем у штаммов другой генетической принадлежности (р<0,05).

Для выполнения второй задачи изучена клинико-рентгено-лабораторная характеристика 97 случаев заболевания с учетом биологических свойств и генотипа возбудителя.

Анализ клинико-рентгенологических данных у больных, выделяющих МБТ с различными цитотоксическими свойствами, показал, что 42 пациента (1-я группа) выделяли высоковирулентные МБТ, 21 - штаммы со средней вирулентностью (2-я группа), 34 - с низкой вирулентностью (3-я группа). Наиболее выраженные симптомы интоксикации выявлены у больных, выделяющих штаммы с высокой цитотоксичностью, в 18,6% наблюдений против 5,1% в 3-ей группе, тогда как процессы, вызванные маловирулентными МБТ, чаще характеризовались слабо выраженной симптоматикой (50,0% в третьей группе против 21,4% - в первой, р<0,05).

Обнаружена зависимость выраженности воспалительных изменений в периферической крови от цитотоксичности возбудителя. Повышение СОЭ более 30 мм/час (52,4%) и лейкоцитоз более 15х109/л (42,8%) наблюдался у больных 1-ой группы, тогда как в 3-ей группе эти показатели встречались в 5,95 и 20,6% случаев соответственно (р<0,05). Выраженная лимфоиения (менее 12%) также достоверно чаще регистрировалась у больных 1-ой группы (21,4% против 2,9% в 3 группе, р<0,05). Сдвиг лейкоцитарной формулы в сторону палочкоядерных нейтрофилов более характерен для больных, выделяющих высоковирулентные штаммы. Частота этого показателя в группах наблюдения составляет 69,1% в первой, 28,6% - во второй и 35,3% - в третьей (р<0,05). Таким образом, пациенты, выделяющие МБТ с высокой цитотоксичностью, достоверно отличаются более выраженными изменениями гематологических показателей в сравнении с больными 3 группы.

Скудное бактериовыделение сопровождало процессы, вызванные низковирулентными МБТ, в 3,7 раза чаще, чем случаи заболевания с выделением возбудителя с высокой цитотоксичностью. Умеренное бактериовыделение более характерно для 2 группы больных, выделяющих МБТ со средними свойствами вирулентности (частота встречаемости в среднем в 1,8 раза больше чем в 1 и 3 группах). В 1 группе 66,7% наблюдений характеризовались обильным бактериовыделением - в 1,9 раза чаще, чем в 3 группе (р<0,05).

При сравнении 1 и 3 групп больных, выделяющих полярные по вирулентным свойствам штаммы, получены достоверные различия по процентному соотношению распространенности поражений легких (р<0,05). В первой группе преобладали полисегментарные (50%) и двухсторонние процессы (31,0%), тогда как в 3 группе частота распространенного поражения легочной ткани составила 32,3% и 14,7% соответственно. Ограниченные формы туберкулезного процесса с распространенностью на 12 бронхолегочных сегмента чаще встречались при выделении клинических

изолятов с низкой цитотоксичностью - в 52,9%, тогда как в 1 группе составляли лишь 19,0% наблюдений.

Такая же тенденция сохраняется при анализе характера деструктивных изменений и цитотоксичности МБТ, что является репрезентативным при сопоставлении клинических случаев, полярных по вирулентным свойствам возбудителя (1 и 3 группы) (р<0,05). Сформированные полостные образования более характерны для процессов, вызванных высоковирулентными МБТ, и встречаются в 2 раза чаще, чем в 3 группе. В случаях регистрации начинающегося распада наблюдается обратная зависимость. В 3 группе частота встречаемости данного признака составляет 42,9% против 20,9% в 1 группе. Таким образом, раннее возникновение полостных образований более характерно для процессов, вызванных МБТ с высокой вирулентностью.

Анализ соотношения жизнеспособности возбудителя и клинической картины ТОД показал результаты, аналогичные зависимости клинико-лабораторных и рентгенологических характеристик от степени вирулентности МБТ, ввиду достоверной прямой корреляции вирулентности и жизнеспособности (г=0,37; расчетное значение 1=4,04; I критическое=1,98). Симптомы интоксикации регистрировали у всех больных, выделяющих МБТ с высокой жизнеспособностью (1группа), тогда как 25% пациентов с низкожизнеспособными клиническими изолятами МБТ (2 группа) характеризовались отсутствием этой симптоматики (р<0,05). Высокая жизнеспособность возбудителя ассоциирована с более тяжелой клинической картиной заболевания: наибольшей частотой интенсивных (18,4%) и средней степени выраженности симптомов интоксикации (51,0%), частыми изменениями гематологических показателей: лейкоцитоз в 57,1% случаев (против 10% во 2 группе), повышение СОЭ в 95,9% (против 70%) (р<0,05). Выявление высокожизнеспособных МБТ ассоциировано с более длительным сохранением полостных образований. К 3 месяцам лечения в 1 группе закрытие полостей распада составило лишь 8,7% больных, тогда как во

второй достигает 40%. На сроках интенсивной терапии 6 месяцев сохраняется тенденция к более быстрому закрытию деструкции во 2 группе и достигает достоверных различий между группами к окончанию срока терапевтического лечения.

Анализ клинического течения болезни с учетом лекарственной устойчивости возбудителя показал, что у 52 больных, выделяющих МЛУ МВТ, туберкулезный процесс отличался 100% наличием симптомов, интоксикации и большей частотой наиболее выраженной симптоматики (23% против 6,7% и 3,3%). При поступлении в стационар наиболее часто лейкоцитоз регистрировался в случаях МЛУ туберкулеза (48,0% против 20,0% у больных, выделяющих полирезистентные штаммы и 33,4% в случаях заболевания, вызванного монорезистентными и чувствительными МВТ). Сохранение лейкоцитоза к 3 месяцу стационарного лечения отмечено у 1/3 больных туберкулезом с МЛУ возбудителя. У 30 пациентов, выделяющих монорезистентные и чувствительные к ПТП штаммы, преимущественно наблюдалась распространенность процесса на 1 -2 бронхолегочных сегмента. Двухстороннее и полисегментарное поражение легочной ткани встречалось у пациентов, выделяющих МЛУ штаммы, в три раза чаще по сравнению с процессами, вызванными моно- и полирезистентными МВТ. При анализе БАК у больных МЛУ туберкулезом наблюдалось нулевое значение БАК и преобладание низких (34,8% против 14,2% у пациентов с чувствительными к ПТП культурами) и средних значений (26,1% против 7,1%). Для группы больных, выделяющих полирезистентные (100%), чувствительные и монорезистентные штаммы МВТ (78,6%), более характерны высокие значения туберкулостатической пробы. У больных МЛУ туберкулезом достоверно чаще отмечаются длительные сроки нормализации гематологических показателей, прекращения бактериовыделения и закрытия полостных образований.

Для выполнения 3-ей задачи сравнили 2 группы пациентов, полярных по цитотоксическим свойствам возбудителя. Эффективность лечения

оценивали по основным клинико-рентгено-лабораторным показателям и срокам закрытия полостных образований.

По наблюдениям достоверное различие в группах по клеточному составу периферической крови отмечалось исключительно в исходных данных. На фоне интенсивной терапии в динамике наблюдалась нормализация данных показателей в обеих группах до приблизительно одинаковых значений. Однако, на всех этапах лечения и контроля параметров в первой группе выявлено несколько большее общее количество пациентов с повышенной СОЭ (более 15мм/час), которое достигает достоверной разницы к 6 месяцу лечения (рис. 1).

Рис.1. Динамика гематологических показателей (СОЭ) в зависимости от цитотоксичности возбудителя.

К 3 месяыдм общее количество больных с повышенным (по сравнению с нормой) уровнем СОЭ среди первой группы несколько больше и составляет 69,1%, а во второй - 47,1%. Нормализация указанного показателя у пациентов, выделяющих МБТ с высокой цитотоксичностью, к 3 месяцу интенсивной терапии наблюдается в 23,8%, тогда как во 2 группе - в 32,3%. К 6 месяцу среди больных, продолжающих стационарный курс, нормализация СОЭ отмечалась у 20 пациентов (71,4%) третьей группы и у 14 (40%) первой. Процентное соотношение количества пациентов с повышенным уровнем СОЭ в 1 и 2 группах - 60% и 29,6% соответственно. Различие в группах достоверно (%2=4,98, р=0,02).

Анализ эффективности лечения показал, что динамика прекращения бактериовыделения в группах приблизительно одинакова. К 3 месяцу у большинства больных на фоне адекватной химиотерапии удалось достигнуть абациллирования: у 32 человек (76,2%) в первой группе и 29 (85,3%) - в третьей. На 6 месяц наблюдения достоверных различий в группах также не наблюдалось (90,5% - в 1-ой группе и 96,1% - в 3-ей), Все 5 случаев сохранения бактериовыделения более 6 месяцев методом посева связаны с неэффективностью терапевтических мероприятий ввиду практически тотальной устойчивости возбудителя.

К 3 месяцам лечения полости распада достоверно не определялись у 29,4% больных 2-ой группы, тогда как в первой группе отмечается несколько меньшее количество - 16,7%. Разница в частоте данного показателя к 6 месяцу в группах достигает достоверно значимых величин и составляет 57,1% и 85,0% соответственно (р<0,05, рис.2).

Рис.2. Динамика закрытия полостей распада.

Представленные на рисунке 2 данные свидетельствуют о том, что длительное сохранение деструкции более характерно для больных, выделяющих высокоцитотоксичные МБТ.

Достоверные различия при сравнении групп больных, выделяющих МБТ различной генетической принадлежности, получены при анализе соотношения генотипа возбудителя и эффективности лечения. По срокам закрытия полостных образований достоверно отличались группы больных, выделяющих МБТ генетического семейства Beijing и других семейств.

Разница достигает достоверных различий к 6 и 8 месяцам лечения: процентное соотношение в 1 и 2 группах на этих сроках составляет 62,0% и 87,5%, 80,0% и 97,6% соответственно (р<0,05).

Для выполнения 4-ой задачи определено наиболее неблагополучное сочетание клинико-рентгенологических и бактериологических параметров. Среди всего контингента больных, выделено 11 случаев неблагоприятного течения туберкулезного процесса. У таких пациентов в течение всего наблюдения (8 мес.) на фоне интенсивной терапии сохранялись деструктивные изменения. Этот контингент характеризовался при поступлении в стационар большей частотой наиболее выраженных изменений периферической крови: СОЭ - более 30 мм/час (у 7 больных -63,7%), лейкоцитоз - более 15 тыс./мл (6 случаев - 54,5%), выраженной лимфопенией менее 12% (у 5 - 45,4%). В этой группе у 8 больных (72,7%) наблюдались интенсивные симптомы интоксикации; полисегментарная и двухсторонняя распространенность процесса - соответственно в 63,7% и 27,3%, обильное бактериовыделение установлено в 81,8%. Штаммы, выделенные от этих пациентов, обладали следующим набором бактериологических характеристик: высокая цитотоксичность и жизнеспособность - соответственно у 90,9% и 100%, принадлежность к генетическому семейству Beijing (81,8%), множественная лекарственная устойчивость - у всех изолятов. Вышеприведенное сочетание клинических и бактериологических критериев можно считать наиболее неблагоприятными в плане прогноза клинического течения процесса.

Таким образом, высокие цитотоксические свойства МБТ ассоциированы с более тяжелой клинической картиной ТОД (г=0,53; расчетное значение t=6,17; t критическое =1,98), высокой жизнеспособностью возбудителя (г=0,37; расчетное значение t=4,04; t критическое=1,98) при отсутствии корреляции с лекарственной устойчивостью (г=0,04; расчетное значение t=0,36; t критическое=1,98) и генотипом (г=0,07; расчетное значение t=0,73; t критическое=1,98). Наиболее неблагоприятное течение заболевания

отмечается у больных, выделяющих МБТ с высокой цитотокеичностью и жизнеспособностью, которые относятся к г енетическому семейству Beijing.

ВЫВОДЫ

1. Доказана ассоциация высоких цитотоксических свойств и жизнеспособности МБТ при отсутствии корреляционных связей с лекарственной устойчивостью, набором мутаций и генотипом. Среди МБТ генотипа Beijing наиболее часто встречается сочетание мутаций katG (Ser315-Thr(l))+rpoB (Ser531-Leu), которое определяет большее количество МЛУ штаммов в этом кластере.

2. При высокой цитотоксичности, жизнеспособности и МЛУ МБТ чаще диагностируются выраженные симптомы интоксикации, наиболее значительные изменения периферической крови, обильное бактериовыделение, двухсторонняя и полисегментарная распространенность специфического процесса, наличие сформированных полостей в более ранние сроки после выявления.

3. Эффективность лечения зависит от биологических свойств возбудителя. Для процессов, вызванных МЛУ МБТ с высокой цитотокеичностью и жизнеспособностью, характерна низкая эффективность лечения.

4. Больные с наиболее тяжелой клинико-рентгено-лабораторной картиной процесса и непрерывным прогрессированием часто выделяют МЛУ МБТ с высокой цитотокеичностью и жизнеспособностью, принадлежащие к генетическому семейству Beijing.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Цитотоксический тест с использованием моноцитоподобной клеточной линии ТНР-1 - методика, позволяющая провести скрининговую оценку вирулентных свойств МБТ в течение 4 суток после выделения культуры возбудителя, которая может использоваться в референс-лабораториях.

2. У больных МЛУ туберкулезом с наиболее тяжелым, прогрессирующим течением процесса показано определение генотипа возбудителя, а также таких биологических свойств как цитотоксичность и жизнеспособность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маничева, О. А. Лекарственная чувствительность Mycobacterium tuberculosis в сопоставлении с их жизнеспособностью, цитотоксичностыо, генотипом и течением процесса у больных туберкулезом органов дыхания / О.А. Маничева, Е.Б. Ласунская, В.Ю. Журавлев, Т.Ф. Оттен, А.О. Барнаулов, И.В. Мокроусов, М.В. Павлова, Б.И. Вишневский, О. В. Нарвская // Пробл.туб. и болезней легких. - 2008. - № 12. - С. 18-21.

2. Барнаулов, А.О. Способ прогнозирования течения туберкулеза органов дыхания на основе изучения вирулентных свойств возбудителя / А.О. Барнаулов, М.В. Павлова, М.Н. Кондакова, Н.В. Сапожникова // Профессиональное образование, наука, инновации в XXI веке: труды третьего Санкт-Петербургского конгр. - СПб., 2009. - С.246-247.

3. Барнаулов, А.О. Изучение взаимосвязи клинического течения туберкулеза органов дыхания и цитотоксических свойств возбудителя / А.О.Барнаулов // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей: материалы науч.-практ. конф. молодых ученых, посвящ. Всемирному дню борьбы с туберкулезом. - М., 2009. - С. 11-12.

4. Павлова, М.В. Эффективность лечения больных туберкулезом органов дыхания / М.В. Павлова, М.Н. Кондакова, Н.В. Сапожникова, А.О. Барнаулов // Пермский медицинский журнал. - 2010. - Т. XXVII. - №3. - С. 39-44.

5. Барнаулов, А.О. Влияние цитотоксических свойств возбудителя на клиническое течение туберкулеза органов дыхания. / А.О. Барнаулов, М.В. Павлова, Б.И. Вишневский, О.А. Маничева, М.Н. Кондакова, Н.В.

Сапожникова // Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. -СПб., 2010.-С.311-312.

Список сокращений и условных обозначений:

БАК - бактериостатическая активность крови

МБТ - микобактерия туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ТОД - туберкулез органов дыхания

Подписано в печать 09.10.2010 Формат 60x90/16. Объем 0.75 усл. п.л. Печать ризографическая. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 463.

Отпечатано в типографии ООО «Фирма «Стикс» 196128, Санкт-Петербург, ул. Кузнецовская, 19

В настоящее время изучению вирулентности микобактерий туберкулеза (МБТ) в мировой литературе посвящено большое количество работ. Вирулентность является показателем степени патогенности и определяет характер взаимодействия микроб - хозяин, что представляется особенно актуальным в современной эпидемиологической обстановке. Оценку вирулентности микобактерий проводят с помощью самых разных методов, начиная с молекулярно-генетических и кончая моделями на животных (Джэкобс У .Р., 2002).

В экспериментальных моделях туберкулеза на животных - мышах, морских свинках, кроликах - вирулентность МБТ оценивают по продолжительности жизни зараженных животных и степени бактериальной обсемененности их органов, объему поражений легких (Васильева С.Н. и др, 2003; Smith I., 2003). Преимущество моделей на животных заключается в том, что они позволяют оценить течение процесса на всех его стадиях. К недостаткам можно отнести тот факт, что модели на животных длительны, результаты зависят от индивидуальных особенностей и состояния животных, и потому не позволяют выявить различия в вирулентности достаточно большого числа штаммов МБТ. Кроме того, следует отметить, что нельзя в полной мере экстраполировать на человека данные, полученные с помощью животных.

Сложность оценки молекулярно- генетическими методами факторов вирулентности МБТ определяется генетическими особенностями возбудителя. В отличие от других патогенов, МБТ присуща чрезвычайная генетическая гомогенность: доля идентичных нуклеотидных последовательностей у видов комплекса достигает 99,9% (Dos Vultos T. et al., 2008) при весьма разнообразных фенотипических характеристиках. Можно сказать, что разнообразие клинических ответов на инфекцию определяется не столько наличием того или иного гена патогенности, сколько регуляцией экспрессии этого гена у микроорганизма в условиях макроорганизма.

Оптимальной моделью определения вирулентных свойств МБТ in vitro нам представляется цитотоксический тест (индукция гибели зараженных клеток) с использованием культуры клеток макрофагов, в особенности клеточных линий человека, т.к. они уменьшают вариабельность результата, исключая влияние видовых и индивидуальных факторов на инфекцию. Эти модели более простые, чем модели на животных, с их помощью изучают различные аспекты взаимодействия возбудителя и клеток хозяина. Их недостаток заключается в том, что они применимы для изучения только ранних этапов инфекции, так как отсутствует регуляция иммунного ответа, присущая целому организму. С другой стороны изучение вирулентных свойств МБТ представляет особый интерес именно у впервые выявленных больных, поскольку на ранних этапах инфекции патоген должен обладать высокой метаболической и пролиферативной активностью, способностью прорывать иммунную защиту хозяина путем продукции веществ, влияющих на пролиферацию и дифференциацию иммунокомпетентных клеток.

Наиболее подходящая с этой точки зрения - перевиваемая» линия человеческих моноцитарных клеток ТНР-1. Дифференцированные с помощью форболового эфира, эти клетки сходны по своему ответу с макрофагами, полученными из моноцитов периферической крови здоровых доноров (Stokes R.W., Doxsee D., 1999; Li Q. et al., 2002), а также точно моделируют апоптозный ответ человеческих альвеолярных макрофагов (Riendeau С. J., Kornfeld Н., 2003).

Снижение эффективности лечения туберкулеза органов дыхания в XXI веке во многом связано с появлением лекарственно устойчивых форм возбудителя. Развитие лекарственной устойчивости (ЛУ) - закономерная реакция микроорганизма на новый неблагоприятный фактор окружающей среды. Длительное применение противотуберкулезных препаратов вызвало появление новых популяций возбудителя, исследование которых предполагает применение современных микробиологических и молекулярно-генетических исследований. Особое внимание уделяется изучению взаимоотношения биологических свойств МБТ и ответа макроорганизма на инфекцию.

В 50-70 г. прошлого века было обнаружено, что развитие устойчивости к изониазиду сопровождается снижением вирулентности для морских свинок (Wolinsky Е. et al., 1956; Mitchison DA et al., 1960) и мышей (Гинзбург T.C., 1957; Драбкина P.O. и др., 1978; Middlebrook G. et.al., 1953). Исследования, проведенные 20 лет спустя, показали, что вирулентность возбудителя туберкулеза для белых мышей не снижалась при развитии устойчивости к этому препарату (Ordway D. et.al., 1998). В дальнейшем данные о соотношении чувствительности МБТ к изониазиду и их вирулентности были разноречивыми. В целом, опыты на животных и эпидемиологические исследования показали, что чувствительные и лекарственно-устойчивые штаммы МБТ обладают разной степенью патогенности (Бастиан И., Портале Ф., 2003). Такие различия могут быть обусловлены выявленной в последние годы генетической неоднородностью вида Mycobacterium tuberculosis. Так, штаммы МБТ семейства Beijing, циркулирующих на Северо-Западе РФ, характеризуются высокой степенью множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) - 64,6%; (Нарвская О.В., 2003) и достоверно более высокой частотой высокой и средней вирулентности для мышей в сравнении с штаммами других генотипов. У больных, выделяющих МБТ генотипа Beijing, наблюдаются более выраженные симптомы интоксикации, более распространенные поражения легочной ткани и прогрессирующее течение, чем у больных с возбудителем иных генотипов (Сапожникова Н.В., 2003). С другой стороны, данные литературы свидетельствуют о разной степени вирулентности МБТ этого генотипа для мышей (Ordway D. et.al., 1998). Следует отметить и такой факт, что в 2002 г. у больных хроническим деструктивным туберкулезом легких частота встречаемости штаммов МБТ с выраженной вирулентностью возросла в сравнении с аналогичными данными, полученными в 1987 г. (Вишневский Б.И. и др., 2006) Доказана корреляция такого биологического свойства МБТ, как жизнеспособность, с течением диссеминированного туберкулеза легких (Корецкая Н.М., Ярыгина И.В., 2007), а также динамики туберкулезного процесса, жизнеспособности и генотипа МБТ (Кондакова М.Н., 2005). Молекулярно-генетические исследования выявили, что мутация в гене гроВ (замена 531 TCG—»TTG, Ser-^Leu) обусловливает резистентность к высоким концентрациям рифампицина и не нарушает жизнеспособности МБТ (Ramaswamy S., Musser J., 1998; Billington О. et al., 1999). D.van Soolingen et al.(2000) приводят данные об ассоциации мутации в гене katG (замена 315AGC—>АСС( Ser—>Leu)) с высокой трансмиссивностью штаммов МБТ. Мутанты Ser315-Thr не утрачивают вирулентности для мышей (Рут A.et al., 2002). Для мультирезистентных МБТ генетического семейства Beijing характерно наличие обеих этих мутаций (Нарвская О.В., 2003; Журавлев В.Ю. и др., 2007). Приведенные факты свидетельствуют об изменении свойств МБТ в последние десятилетия, что требует пристального изучения роли биологических свойств возбудителя, таких как вирулентность, жизнеспособность, принадлежность к определенному генетическому семейству, лекарственная устойчивость в патогенезе современного туберкулеза.

На сегодняшний день определение лекарственной устойчивости, жизнеспособности, а также генотипирование МБТ являются в целом хорошо разработанными технологиями. Однако оценка вирулентности возбудителя туберкулеза - задача весьма сложная, об этом говорит огромное количество работ в мировой литературе, посвященных данной теме. Использование моделей на животных с этой целью имеет как свои плюсы, так и минусы. К положительным моментам относится то, что они позволяют оценить течение процесса на уровне организма на всех его стадиях. К недостаткам можно отнести тот факт, что модели на- животных длительны, результаты зависят от индивидуальных особенностей и состояния животных, и потому не позволяют выявить различия в вирулентности достаточно большого числа штаммов МБТ.

Активация гибели макрофагов (цитотоксичность) - одно из свойств вирулентности МБТ, которое можно оценить количественно с использованием клеточных макрофагоподобных линий in vitro. Эта модель позволяет провести скрининговую оценку вирулентных свойств штаммов МБТ, выделенных от больных туберкулезом органов дыхания (ТОД), сопоставить уровень цитотоксичности возбудителя с течением процесса в каждом конкретном случае заболевания. Необходимость проведения таких исследований диктуется отсутствием сведений о влиянии способности МБТ активировать некроз макрофагов на клиническую картину ТОД.

Цель работы: изучить значение цитотоксических свойств возбудителя в клинике туберкулеза легких.

Задачи исследования:

1. Дать оценку вирулентности штаммов МБТ по тесту цитотоксичности с использованием моноцитоподобных клеток человека линии ТНР-1, исследовать соотношение биологических свойств возбудителя.

2. Определить особенности клинического течения туберкулезного процесса в сопоставлении с цитотоксичностью, лекарственной устойчивостью и генотипом возбудителя.

3. Оценить эффективность химиотерапии у больных с разной степенью цитотоксических свойств МБТ.

4. Определить значимость клинико-бактериологических показателей в клиническом течении туберкулеза органов дыхания.

Научная новизна. Впервые сопоставлены генотип и биологические свойства МБТ (цитотоксичность, жизнеспособность, лекарственная устойчивость). Обнаружена прямая достоверная корреляция цитотоксических свойств и жизнеспособности. Установлено, что высоковирулентные штаммы обладают наибольшей скоростью и массивностью роста. Изучена клинико-рентгенологическая характеристика туберкулезного процесса у больных, выделяющих МБТ с различным генотипом и биологическими свойствами возбудителя. Впервые установлена зависимость клинической картины и эффективности лечения туберкулеза органов дыхания (ТОД) от способности МБТ активировать гибель макрофагов на модели заражения клеточной линии ТНР-1. У больных, выделяющих штаммы с высокой цитотоксичностью, туберкулезный процесс характеризуется более тяжелым течением и низкой эффективностью лечения.

Практическая значимость. Сопоставление клинической картины заболевания, эффективности химиотерапии МЛУ туберкулеза с вирулентностью, генотипом, жизнеспособностью и лекарственной устойчивостью МБТ дает возможность оценить вклад биологических свойств в характер течения ТОД. Полученные данные позволят выявить то сочетание клинико-лабораторных, рентгенологических и микробиологических показателей, которое определяет благоприятное или неблагоприятное клиническое течение заболевания. Результаты исследования могут служить основой для разработок рациональных подходов к комплексной терапии туберкулеза.

Положения, выносимые на защиту

1. Цитотоксические свойства МБТ имеют прямую корреляционную связь с жизнеспособностью и не зависят от лекарственной устойчивости.

2. Туберкулезные процессы, вызванные МБТ с высокой цитотоксичностью и жизнеспособностью, характеризуются выраженными симптомами интоксикации, наиболее значительными изменениями периферической крови, обильным бактериовыделением, двухсторонней и полисегментарной распространенностью специфического процесса, наличием сформированных полостей.

3. Выявлена корелляция клинико-рентгенологических характеристик тяжести туберкулезного процесса и цитотоксических свойств возбудителя. Наиболее тяжелая клиническая картина заболевания характерна для возбудителя МБТ с высокой цитотоксичностью.

4. Эффективность лечения больных ТОД зависит от биологических свойств возбудителя: при высокой цитотоксичности МБТ заболевание характеризуется меньшей эффективностью лечения по срокам закрытия полостей распада.

5. Процессы, вызванные МЛУ МБТ генетического семейства Beijing с высокой цитотоксичностью и жизнеспособностью, отличаются наиболее тяжелой клинико-рентгено-лабораторной картиной процесса и прогрессирующим течением.

Реализация результатов работы. На основании полученных результатов разработаны практические рекомендации, использующиеся в лечебно-диагностической деятельности отделения терапии туберкулеза легких и лаборатории микробиологии ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий», ГУЗ «Пушкинский противотуберкулезный диспансер». Основные положения диссертации включены в унифицированную программу последипломного обучения на кафедре фтизиатрии ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава». Оформлена заявка на изобретение №2009139270 «Способ лечения инфильтративного туберкулеза легких, вызванного множественно-лекарственно-устойчивыми и высокоцитотоксичными штаммами микобактерий туберкулеза» (приоритетная справка от 23.10.2009 г.).

Апробация диссертационной работы. Результаты исследования доложены на 3-м конгрессе "Инновации в XXI веке: профессиональное образование, наука" (Санкт-Петербург, 2009); научно-практической конференции молодых ученых, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» (Москва, 2009); научно-практической конференции "Совершенствование медицинской помощи во фтизиатрии" (Санкт-Петербург, 2010).

По материалам работы опубликовано 5 печатных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 91 странице. Состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка, включающего 105 источников (50 отечественных и 55 иностранных авторов). Работа содержит 17 таблиц и 4 рисунка.

выводы

1. Доказана ассоциация высоких вирулентных свойств и жизнеспособности МБТ при отсутствии корреляционных связей с лекарственной устойчивостью, набором мутаций и генотипом. Среди МБТ генотипа Beijing наиболее часто встречается сочетание мутаций katG (Ser315-Thr(l))+rpoB(Ser531-Leu), которое определяет большее количество МЛУ штаммов в этом кластере.

2. При высокой цитотоксичности, жизнеспособности и МЛУ МБТ чаще диагностируются выраженные симптомы интоксикации, наиболее значительные изменения периферической крови, обильное бактериовыделение, двухсторонняя и полисегментарная распространенность специфического процесса, наличие сформированных полостей в более ранние сроки после выявления.

3. Эффективность лечения зависит от биологических свойств возбудителя. Для процессов, вызванных МЛУ МБТ с высокой вирулентностью и жизнеспособностью, характерна низкая эффективность лечения.

4. Больные с наиболее тяжелой клинико-рентгено-лабораторной картиной процесса и непрерывным прогрессированием часто выделяют МЛУ МБТ с высокой цитотоксичностью и жизнеспособностью, принадлежащие к генетическому семейству Beijing.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Цитотоксический тест с использованием моноцитоподобной клеточной линии ТНР-1 - методика, позволяющая провести скрининговую оценку вирулентных свойств МБТ в течение 4 суток после выделения культуры возбудителя, которая может использоваться в референс-лабораториях.

2. У больных МЛУ туберкулезом с наиболее тяжелым, прогрессирующим течением процесса показано определение генотипа возбудителя, а также таких биологических свойств как цитотоксичность и жизнеспособность.