Автореферат и диссертация по медицине (14.01.20) на тему:Клиническое применение метода электропорации для выявления повреждений эритроцитов

Казиев Гаджибек Рагимович

Клиническое применение метода электропорации для выявления повреждений эритроцитов

14.01.20 - Анестезиология и реаниматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о з [,;др 2011

Москва 2011

4856424

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» (Ректор -Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Янушевич О.О.) Росздрава.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Васильев Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Рабинович Соломон Абрамович

доктор медицинских наук,

профессор Свиридов Сергей Викторович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Защита состоится / 2011 года в 14.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 208.041.02 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127473, г. Москва, ул. Делегатская 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета по адресу: 125206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан ^ ^ — 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

О.В. Данилевская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Развитие любого заболевания сопряжено с нарушением структурно-функциональных свойств тех или иных клеток организма, поэтому большое значение в современной медицине имеет диагностика особенностей структурно-функциональной организации клеточных мембран при различных патологических процессах.

Мембраны эритроцитов являются моделью молекулярной организации плазматических мембран, отражают особенности биохимического строения клеточных мембран различных тканей (Головецкий И.Я. с соавт., 2007).

Внедрение в практическую медицину новых методик терапевтического воздействия требует и новых информативных, доступных, унифицированных и стандартизированных методик исследования.

При введении лекарства в организм человека в крови начинают происходить различные химические реакции и процессы. Такие процессы могут вызывать существенные изменения структуры и функции мембран клеток (Черняев А.П. и др., 2007).

Но на макроуровне они остаются «скрытыми», поскольку период проявления повреждения может достигать нескольких часов или даже суток. В результате повреждений на мембране возникают дополнительные дефекты, которые могут сразу не нарушить функцию клеток, но с течением времени нарушают их.

Выявляя изменение относительного числа скрытых повреждений мембран эритроцитов, можно сделать вывод о побочном характере воздействия лекарственного препарата или какого-либо фактора (Черныш A.M., Козлова Е.К.,2006).

Особую актуальность приобретает детектирование скрытых повреждений мембран клеток крови у наиболее тяжелых больных, находящихся в отделениях интенсивной терапии и при проведении анестезиологического пособия при оперативных вмешательствах.

Изучение механизма действия физико-химических факторов на клеточные мембраны и изыскание оптимальных лекарственных препаратов является актуальным у больных при проведении анестезиологического пособия.

Импульсное электрическое поле, воздействующее на мембраны, способствует выделению интересующих эффектов, позволяет

определить их направление в зависимости от концентрации препарата, температуры и других параметров системы (Алексеева П.Ю., 2007).

Метод калиброванной электропорации позволяет оценить степень поражения биологических мембран сразу после воздействия (Мороз В.В., Козлова Е.К., Алексеева П.Ю., Черныш A.M., 2005).

Поэтому изучение эритроцитарных мембран в условиях одновременного воздействия на них инородного химического агента и импульсного электрического поля представляется важным и с научной, и с практической точек зрения.

Необходимость решения этих вопросов определяет актуальность предпринятого исследования, его цель и задачи.

Цель исследования

Определить возможность применения метода электропорации в клинических условиях у разных групп больных для выявления повреждений эритроцитов.

Задачи исследования

1. Изучить возможность применения метода калиброванной электропорации для диагностики повреждений клеточных мембран в клинических условиях.

2. Выявить возрастные особенности состояния мембран эритроцитов у здоровых людей.

3. Определить методом электропорации скрытые повреждения биологических мембран при воздействии препаратов, применяемых в анестезиологической практике.

4. Исследовать воздействие курса гамма-облучения при раке молочной железы на функциональное состояние мембран эритроцитов.

5. Провести сравнительный анализ состояния мембран эритроцитов в зависимости от степени отравления этанолом.

Научная новизна работы

Впервые в клинических условиях применен метод электропорации для определения функционального состояния мембран эритроцитов.

Впервые проведена оценка влияния ряда анестезиологических средств на мембрану эритроцитов.

Впервые отмечено три варианта изменений функционального состояния мембран эритроцитов при воздействии различных фармпрепаратов: укрепление мембран в 39,5% случаях, негативное воздействие на мембраны - у 34,2% больных и в 26,3% - практически изменений не было.

Впервые показана степень изменения функционального состояния эритроцитарных мембран под воздействием лекарственных препаратов, этанола, гамма-терапии при злокачественных новообразованиях.

Практическая значимость работы

Определена возможность использования метода выявления «скрытых» повреждений мембран эритроцитов в качестве диагностического для исследования степени повреждения мембран и выбора анестезиологических средств для обеспечения адекватного общего обезболивания пациентов.

Предложенная модель может быть использована для оценки и количественного анализа степени повреждающего воздействия препаратов на мембраны.

Данный метод исследования действия различных факторов на биологические мембраны в сочетании с импульсным электрическим полем может быть применен в практической медицине, анестезиологии-реаниматологии и других медицинских специальностях: для мониторинга за состоянием эритроцитов в ходе общей анестезии и интенсивной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предлагаемый метод исследования результатов воздействия на биологические мембраны с помощью калиброванного импульсного электрического поля позволяет оценивать скрытые повреждения мембран эритроцитов через 1-30 мин после воздействия.

2. Анестезиологические препараты вызывают нестабильный ответ биологических наноструктур (в частности, мембран эритроцитов).

3. При воздействии импульсного поля на биологические мембраны определены концентрации ряда анестезиологических препаратов и терапевтических воздействий, уменьшающие и увеличивающие скрытые структурные дефекты мембраны.

4. В результате действия ряда факторов (или их высокой дозы) на мембраны уменьшается пороговый потенциал их электрического пробоя.

5. Предложенный метод позволяет оценить степень воздействия на мембраны различных препаратов в разных концентрациях (1-100 мкл/мл суспензии).

6. Данная методика позволяет оценить изменения функционального состояния клеточных мембран в зависимости от возраста исследуемого.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на:

1. Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященная 70-летиго ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН, Москва, 2006;

2. XIV Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2007;

3. 5-ой научно-практической конференции «Безопасность больного в анестезиологии-реаниматологии», Москва, 2007;

4. European Association for Red Cell Research , 16th Meeting, London, 2007;

5. 10-ой научно-практической конференции «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы», Москва, 2008;

6. 3-ем съезде токсикологов России, Москва, 2008;

7. 5-ой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва. 2008;

8. Научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения в экспериментальной и клинической реаниматологии», Москва, 2008;

9. 11-ой научно-практической конференции «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы», Москва, 2009;

10. 16 kongres slovenskych anesteziolôgov s medzinârodnou ucast'ou. Piest'any, 2009,

11. 17-th International Symposium, Italy, April 2009;

12. Научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии», Москва, 2009;

13. 12-ой научно-практической конференции «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы». Москва, 2010

Внедрение результатов в клиническую практику

Основные результаты проведенных исследований внедрены в клиническую практику отделений анестезиологии,

токсикореанимации, общей онкологии, Московской городской клинической больницы №33 им. проф. A.A. Остроумова.

Результаты исследований используются при подготовке практических занятий и лекций для студентов, ординаторов и врачей анестезиологов-реаниматологов в НИИ общей реаниматологии им. В. А. Неговского РАМН, на кафедре анестезиологии и реаниматологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 5 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук.

Степень личного участия в работе

Личное участие аспиранта в разработке проблемы составляет 80% и основано на личном участии в применении метода электропорации для выявления повреждений эритроцитов; внедрении в клиническую практику разработанных рекомендаций; проведении медико-статистического анализа полученных результатов; оформлении научных статей и выступлениях на научно-практических конференциях и конгрессах; написании и оформлении диссертационной работы.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций и иллюстрирована 10 таблицами, 15 диаграммами и 37 рисунками.

Указатель литературы включает 246 источников, из них 133 отечественных и 113 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Основу клинической части работы составили результаты 432 исследований функционального состояния мембран эритроцитов у 61-го добровольца (здоровые люди) и у 210-и больных отделений анестезиологии и реаниматологии хирургического и токсикологического профиля ГКБ №33 им. проф. А.А.Остроумова.

Всего приняло участие в клинических исследованиях 107 женщин и 103 мужчин.

Средний возраст добровольцев составил 32,3±4,9 лет (минимальный возраст - 21 год, максимальный - 73 года). Женщин - 43 человека, мужчин —18.

Средний возраст больных, готовящихся к плановым операциям (п-78 человек) - 49,94±5,0 лет (минимальный возраст - 21 год, максимальный - 74 года).

Средний возраст больных с отравлением этанолом - 40,7±4,6 лет (минимальный возраст - 15 лет, максимальный - 66 лет). Женщин было 10, мужчин - 87 человек.

Средний возраст больных с предоперационным облучением по поводу рака молочной железы - 59,1±3,9 года (минимальный возраст - 39 лет, максимальный - 74 года). В данную группу вошли 35 женщин.

Кровь, взятую у исследуемых не центрифугировали, чтобы уменьшить механическое воздействие на эритроциты. В венозную кровь добавляли 0,1-0,2 мл гепарина, для предупреждения свертывания. Затем приготавливали суспензию в 0,9% растворе хлористого натрия, и выдерживали ее 15 мин в термостате при температуре 19-20°С. В 1 мл физиологического раствора содержалось 5 мкл крови. Учитывая, что в среднем в 1 мкл крови содержится 4,6 млн эритроцитов, в наших исследованиях в 1 мл суспензии в среднем находилось 23 млн. эритроцитов. Суспензию приготавливали перед исследованием в стеклянной кювете объемом 2,4 мл. Оптическую плотность исходной суспензии всегда доводили до 1,0.

В качестве источника импульсного электрического поля (ИЭП) использовали клинический дефибриллятор «1лГерак-7» (США), создающий в суспензии напряженность поля 1100 В/см, энергию

электрического импульса в 230 Дж, длительностью 10 мс. Для измерения степени гемолиза в суспензии, после воздействия импульсного электрического поля, наиболее удобным является спектрофотометрический метод. Уменьшение количества эритроцитов в результате гемолиза, приводит к уменьшению оптической плотности раствора. Гемолиз эритроцитов контролировали в течение 30-60 мин.

Измерение оптической плотности в течение определенного времени после физико-химического воздействия позволяет построить кинетическую кривую. Зная эту кривую, можно оценить следующие параметры гемолиза:

• количество эритроцитов в любой момент времени в суспензии;

• константу скорости уменьшения числа эритроцитов для любого заданного промежутка времени;

• среднюю константу скорости гемолиза;

• долю негемолизированных эритроцитов в результате заданного воздействия.

Статистическая обработка

Для анализа данных строятся кинетические кривые зависимости относительной константы скорости гемолиза и определения периода полураспада с помощью программы для построения математических графиков Origin Pro 8.0987 SR4.

Статистический анализ результатов исследования включал применение методов описательной статистики с вычислением средних величин и их стандартной ошибки (М±т), вычисление критерия Стьюдента при сравнении групп. Различия признавались достоверными при /><0,05.

Выполнен корреляционный анализ для оценки силы связи между изучаемыми показателями по Пирсону.

Результаты исследования

В ходе проведённых нами исследований мы получили следующие результаты.

С увеличением возраста доноров, в результате изменений индивидуальных особенностей функционирования клеток и организма в целом, отмечаются и изменения состояния мембран эритроцитов (табл. 1).

С возрастом наблюдается увеличение периода полураспада эритроцитов по сравнению с людьми молодого возраста, что говорит о включении дополнительных защитных реакций организма.

Таблица 1

Изменения периода полураспада эритроцитарных мембран после воздействия ИЭП в зависимости от возраста

Возраст Здоровые II, мин

20 - 30 лет 22,08±2,4

(27,2±1,9)

31 -50 лет 27,4±3,1

(42,6±2,о) р<0,05

51 - 60 лет 28,5±3,3

(56,1±3,8) р<0,01

Таким образом, с возрастом у здоровых людей при стандартном воздействии импульсного электрического поля отмечается достоверное увеличение периода полураспада эритроцитарных мембран (II), что означает снижение скорости гемолиза (включение компенсаторных механизмов организма для стабилизации мембран).

Нами проанализированы возрастные особенности функционального состояния эритроцитарных мембран после стандартной (атропин, промедол) премедикации у 67-и больных, готовящихся к плановым хирургическим вмешательствам (холецистэктомия) (табл. 2).

Таблица 2

Изменения периода Я после воздействия ИЭП

в зависимости от возраста и после премедикации

Возраст Здоровые После премедикации

20-30 лет 22,08±2,4 30,1±2,4 (п-15) р<0,01

31-50 лет 27,4±3,1 р<0,05 34,8±3,7 (п - 24)

51-60 лет 28,5±3,3 р<0,01 28,3±3,2 (п - 39)

Наибольшее укрепление мембран после проведения стандартной премедикации происходит у молодых людей. Период полураспада мембран увеличивается с 22,08±2,4 до 30,1±2,4 (А 8 мин). Примерно на таком же уровне меняется период полураспада эритроцитарных мембран в следующей возрастной группе 31-50 лет - 27,4±3,1 и 34,8±3,7 (А 7 мин).

При дальнейшем увеличении возраста (группа 51-60 лет) эта тенденция исчезает и практически изменений периода полураспада мембран эритроцитов после премедикации нет - 28,5±3,3 и 28,3±3,2 минуты.

Следовательно, в старших возрастных группах наблюдается снижение защитных реакций организма и уровня укрепления мембран под воздействием лекарственных препаратов, в частности, применяемых для стандартной премедикации.

Из полученных данных следует, что при использовании метода калиброванной электропорации необходимо учитывать индивидуальные возрастные особенности организма.

Препараты, применяемые в анестезиологической практике, могут оказывать влияние на мембраны эритроцитов. В одних случаях это влияние может быть нарушающим структуру мембран, в других -укрепляющим.

Исследование действия анестезиологических препаратов на эритроцитарную мембрану в цельной крови пациента и на выделенную суспензию эритроцитов с использованием метода электропорации дает возможность, во-первых, оценить непосредственное действие препаратов на структуру клеточной мембраны и, во-вторых, оценить защитные свойства белков и других химических соединений крови при действии изучаемых анестезиологических препаратов.

В ряде случаев, для лучшего понимания действия химического агента, мы рассматривали действие на мембраны не только нормальных концентраций препаратов, употребляемых в клинической практике, но и повышенных - 10-кратные, 100-кратные.

Эсмерон - недеполяризующий миорелаксант средней продолжительности действия. При увеличении концентрации препарата в цельной крови, благодаря ее защитным механизмам относительная константа скорости гемолиза не увеличивалась, препарат не ускорял гибель эритроцитов, но в суспензии относительная константа скорости гемолиза эритроцитов резко

возрастала с увеличением концентрации препарата. Добавление эсмерона в суспензию приводило к возможности определения повреждений структуры мембран (скрытые повреждения становились видимыми).

Другой по характеру эффект был получен при исследовании тракриума.

Тракриум - недеполяризующий миорелаксант.

Тракриум оказал так называемое «укрепляющее» действие на эритроцитарные мембраны в суспензии. При комбинированном воздействии ИЭП и тракриума в нормальной концентрации, гемолиз эритроцитов был замедлен по сравнению с контролем, где влияние оказывало только ИЭП. То же наблюдалось и при десятикратной концентрации - 10N.

Для сравнения с предыдущими препаратами провели исследование действия на эритроцитарную мембрану местного анестетика маркаина-адреналина.

При воздействии маркаин-адреналина на суспензию достоверного изменения константы скорости гемолиза эритроцитов не наблюдалось.

Значение констант скорости гемолиза эритроцитов суспензии с маркаин-адреналином в концентрации N и ION совпадали со значением константы контрольной суспензии, кривые статистически неразличимы. Это свидетельствовало о том, что маркаин-адреналин в клинических концентрациях не влияет на состояние мембран эритроцитов.

Из результатов исследований следует, что эсмерон даже в терапевтической концентрации вызывал на мембранах эритроцитов скрытые повреждения - константа скорости гемолиза возрастала в 5 раз. При дальнейшем увеличении концентрации до 10N такая тенденция сохранялась, и константа скорости возрастала более, чем в 100 раз.

Тракриум в терапевтической концентрации укреплял мембрану -константа скорости гемолиза уменьшалась в 5 раз. При дальнейшем росте концентрации тракриума рост константы скорости гемолиза прекращался и сохранялся на прежнем уровне до десятикратной величины концентрации препарата.

Маркаин-адреналин в заданном диапазоне концентраций не вносил изменения в прочность эритроцитарной мембраны.

Нимбекс (Цисатракурия безилат) - недеполяризующий миорелаксант. Увеличение концентрации препарата приводило к уменьшению скорости гемолиза эритроцитов в суспензии.

Листенон - деполяризующий релаксант. От малых концентраций до нормальной концентрации листенона в крови/суспензии относительная константа скорости гемолиза мало отличалась от растворов с отсутствием препарата. При больших же концентрациях относительная константа скорости гибели клеток для цельной крови была меньше контрольного значения, а для суспензии - резко увеличивалась (р<0,01).

Таким образом, влияние листенона в цельной крови не вело к заметным нарушениям целостности структуры мембран эритроцитов, и препарат «укреплял» мембрану в высоких дозах. В суспензии же листенон приводил к нарушению структуры мембран при высоких концентрациях (10N и выше). Эти данные также подчеркивают наличие защитных возможностей цельной крови по сравнению с суспензией крови.

Гексенал - барбитурат короткого периода действия. Чем больше концентрация гексенала в крови или суспензии, тем меньше становилась относительная константа скорости гемолиза. Процесс гибели клеток в цельной крови в результате электрического пробоя замедлялся, а в суспензии - выражен сильнее.

Дормикум - короткодействующий бензодиазепиновый снотворный препарат. При нормальной концентрации C=N (1мкл/1мл суспензии) наблюдался эффект умеренного замедления гемолиза эритроцитов.

При увеличении концентрации препарата в 10 раз (C=10N) процесс гемолиза шел гораздо быстрее, чем при контроле и значение относительной константы скорости гемолиза увеличилось на порядок. Значительное увеличение концентрации препарата приводило к увеличению скорости гемолиза.

Дроперидол - быстродействующий нейролептик. При увеличении концентрации препарата в 10 раз (C=10N) процесс гемолиза шел гораздо быстрее, чем при контроле и значение относительной константы скорости гемолиза увеличилось на порядок.

А при увеличении концентрации дроперидол а в 100 раз (C=100N), наблюдается значительное увеличение относительной константы скорости гемолиза. Что говорит о сильном повреждении мембран эритроцитов при высокой концентрации дроперидола.

Фентанил - наркотический анальгетик. При увеличении концентрации препарата в цельной крови относительная константа скорости гемолиза не увеличивалась, препарат не ускорял гибель эритроцитов, но в суспензии относительная константа скорости гемолиза эритроцитов возрастала с увеличением концентрации препарата, что приводило к возможности определения повреждений структуры мембран (скрытые повреждения становились видимыми).

Состояние мембран эритроцитов у больных раком молочной железы после лучевой терапии

В связи с развитием применения ионизирующего излучения в медицинской практике является актуальным его действие на состояние клеточных мембран. А в сочетании с каким-либо препаратом эффективность воздействия излучения может измениться.

Нами проведено исследование функционального состояния мембран эритроцитов у больных раком молочной железы до и после лучевой терапии, которая проводилась общей дозой 20 Гр за 5 ежедневных фракций на область молочной железы и подмышечных лимфоузлов (табл. 3).

Исследовали состояние мембран эритроцитов у 13-и здоровых женщин в возрасте 20-30 лет (средний возраст 26,3±2,2 года), у 12-и здоровых женщин в возрасте 31-50 лет (средний возраст - 41,8±3,5 года), у 11 здоровых женщин в возрасте 51-70 лет (средний возраст 61,9±3,5 года) и у 7-и женщин в возрасте свыше 70 лет.

У 14-и женщин в возрасте 31-50 лет с диагнозом - рак молочной железы (средний возраст 43,6±3,6 года), у 13-и женщин, поступивших в стационар в возрасте 51-70 лет с диагнозом: рак молочной железы (средний возраст - 63,7±3,4 года) и у 8-и женщин старше 70 лет с раком молочной железы (средний возраст 72,3±2,7 года).

В первой подгруппе здоровых женщин до 30 лет период полураспада мембран эритроцитов составлял в среднем - 23,4±1,8 минут.

У здоровых женщин 31-50 лет во второй подгруппе - 26,7±2,3 минут (р<0,05).

У здоровых женщин 51-70 лет - К составлял в среднем 27,5±2,4 минуты (р<0,05).

В старшей возрастной группе (старше 70 лет) - 29,9±3,3 минуты 0*0,01).

Увеличение показателя К указывает на большую сохранность оптической плотности раствора и свидетельствует о наличии большего количества не разрушенных эритроцитов после воздействия ИЭП.

Наблюдаемое возрастное достоверное «укрепление» мембран, по всей видимости, является защитной реакцией организма, препятствующей ранней гибели эритроцитов.

Больным за неделю перед операцией проводилась дистанционная гамма-терапия. Забор крови осуществляли до и после лучевой терапии.

Лучевая терапия проводилась в течение 5 дней - 5 курсов общей дозой 20 Грей.

Исследование крови в общей совокупности больных после проведенного курса лучевой терапии показало повышение средней величины изучаемого параметра Я до 118,5% от исходного уровня перед облучением (р<0,05).

Это свидетельствует о том, что подаваемая доза облучения способствует «укреплению» мембран эритроцитов за счет включения организмом резервных возможностей для сохранения мембран эритроцитов от воздействия негативных факторов, что мешает развитию гемолиза.

Однако у 60% больных имелись негативные изменения состояния мембран.

У 12-и пациентов (34,3%) зафиксировано скрытое повреждение мембран эритроцитов, у 9-и человек (25,7%) отмечалось укрепление мембран после лучевой терапии, а у остальных 14-и человек (40%) изменений мембран не происходило. Из тех больных, у кого наблюдались изменения периода полураспада после облучения, показатель II увеличился у 42,9% больных до 152,8% (средний возраст - 57,2±3,7 года). II стал равен 41,9±3,6 минутам.

Уменьшился у 57,1% больных до 82,7% от исходного уровня (средний возраст - 65,9±4,3 года). Период полураспада эритроцитарных мембран стал равен 29,3±2,3 минутам. Это подчеркивает, что у лиц старше 60 лет исчерпываются резервы для сохранения мембран эритроцитов от действия внешних неблагоприятных факторов.

У онкологических больных в возрасте 31-50 лет средний уровень И. до лучевой терапии составил 19,9±2,0 минут или 85,3% от уровня показателя здоровых женщин (р<0,05).

В подгруппе онкологических больных с диапазоном возраста 51-70 лет-23,7±2,1 минуты.

У онкологических больных в возрастной подгруппе старше 70 лет - 27,2±2,3 минуты (116,2% от показателя контрольной группы до 30 лет).

У онкологических больных изначально период полураспада мембран эритроцитов был в каждой возрастной группе ниже, чем у здоровых женщин. Это может говорить о снижении функционального состояния мембран эритроцитов при онкологическом заболевании (в данном случае - рак молочной железы) и скрытых повреждениях мембран.

Таблица 3

Период полураспада мембран эритроцитов _в разных возрастных группах__

Возраст Здоровые К, мин Онкологические больные до облучения Р Онкологические больные после облучения Р

20-30 лет 23,4±1,8 - -

31-50 лет 26,7±2,3 19,9±2,0 <0,05 30,2±2,7 <0,001

51-70 лет 27,5±2,4 23,7±2,1 <0,05 26,8±2,3 <0,05

>70 лет 29,9±3,3 27,2±2,3 20,2±1,9 <0,01

Если сравнивать подгруппы онкологических больных по возрастным категориям, то видна такая же динамика, как и у здоровых - нарастание с возрастом периода полураспада мембран эритроцитов после воздействия НЭП.

После проведенного курса дистанционной гамма-терапии в возрастной подгруппе 31-50 лет уровень показателя К увеличился до значений 30,2±2,7 минуты (р<0,001).

В следующей возрастной подгруппе 51-70 лет это увеличение наблюдалось в меньшей степени - до 26,8±2,3 минуты. Удлинение периода полураспада мембран в этих двух подгруппах тоже подчеркивает способность организма противостоять неблагоприятным внешним воздействиям и укреплять клеточные мембраны.

Но у больных более старшего возраста отмечено достоверное снижение показателя до 20,2±1,9 минут (р<0,01), что подтверждает наличие скрытых повреждений эритроцитарных мембран и исчерпание компенсаторных механизмов.

Такая динамика изменений может говорить о сохраненных внутренних компенсаторных реакциях организма, включающихся при лучевой нагрузке у лиц зрелого возраста и их отсутствии у лиц старше 70 лет.

Таким образом, анализ полученных результатов показал, что после проведенного курса облучения мембраны эритроцитов укрепляются, но с возрастом резервы исчерпываются.

Функциональное состояние эритроцитарных мембран под влиянием этанола

Злоупотребление алкоголем является основной причиной смертности мужчин работоспособного возраста. В последние годы почти в 3 раза увеличилось количество отравлений алкоголем (Лужников Е.А. и др., 1999; Идрисова Л.Т. и др., 2007).

Самый высокий показатель летальных исходов от острых отравлений химической этиологии по многолетним данным приходится на токсическое действие алкоголя - 16,41 на 100000 населения (Виноградова Л.В. и др., 2008).

В наших исследованиях мы сопоставили функциональное состояние клеточных мембран у 33-х здоровых людей и при отравлении этанолом (97 человек с различной степенью алкогольного опьянения, госпитализированных в токсикологическое отделение городской клинической больницы №33 им. проф. А.А.Остроумова).

В общей совокупности исследуемой крови здоровых добровольцев средняя величина периода полураспада мембран эритроцитов после воздействия импульсного электрического поля -25,11± 2,90 мин.

В группе пациентов с алкогольным отравлением средняя величина периода полураспада составила 21,10±2,32 мин (р<0,05).

Это подтверждает негативное действие этанола на устойчивость мембран эритроцитов и ускорение их распада.

Нами прослежена динамика изменения И. в зависимости от концентрации алкоголя в крови (табл. 4)

Таблица 4.

Величина полураспада эритроцитарных мембран в зависимости от концентрации этанола в крови.

Показатель Без этанола До 1%о До 2%о До 3% До 4%о До 5%о Выше 5%

Кол-во 33 14 19 18 19 18 9

исследо-

ваний

Средние значения 0 0,4±0,03 1,71 ±0,22 2,38±0,26 3,48±0,37 4,52±0,39 5,23±0,46

°/оо в

крови

R, мин 25,1±2,9 24,5±2,8 22,3±2,4 21,5±2,2 20,1±1,9 18,9±1,7 19,3±1,8

Измене-

ния от 100 97,6 89,1 85,6* 80,2* 75,2 ** 77,1*

нормы %

Д,% 0 50,0 68,4 83,3 94,7 100,0 100,0

Примечание: Д,% - количество пациентов (в процентах от общего количества в группе), у которых отмечено снижение II в зависимости от концентрации этанола в крови; * - достоверностьр < 0,05; ** - достоверностьр<0,01.

На первый взгляд создается впечатление, что состояние мембран эритроцитов в первой группе по среднесуммарному уровню достоверно не меняется при воздействии небольших концентраций алкоголя (0,42±0,03%о), и период полураспада эритроцитарных мембран приблизительно равен таковому у здоровых людей. Однако у 50% больных первой группы наблюдается снижение периода полураспада мембран эритроцитов. У второй половины больных этой группы отмечается увеличение периода полураспада мембран, так называемое «укрепление» мембран.

Данные представленной таблицы показывают, что при низких концентрациях этанола в крови у ряда больных отмечается некоторое «укрепление» мембран эритроцитов. Число этих пациентов с увеличением уровня этанола в крови уменьшается. Так, при концентрации этанола в крови до 1%о у половины пациентов наблюдается некоторое увеличение II. В последующих группах это

число динамично уменьшается и составляет, соответственно: 31,6% -16,7% - 5,3% - 0%.

Эту же тенденцию можно увидеть и при проведении тендерных исследований. У 10-и женщин (средний возраст 26,5±2,8 лет) с отравлением этанолом при среднем уровне этанола в крови 2,07±1,9%о, период полураспада мембран составил 25,83±2,7 мин, что несколько выше значений общей совокупности здоровых людей.

Значения Л у всех обследованных мужчин при поступлении в стационар изначально составили в среднем 20,07±1,9 мин. На снижение уровня II повлияли более высокие значения концентрации этанола в крови (3,56±3,4%о) и более высокий средний возраст с исчерпанными компенсаторными возможностями (43,3±4,5 лет).

Проведен анализ состояния клеточных мембран у всех больных при различной концентрации этанола в крови. Больные с отравлением этанолом разделены на 6 групп.

В первой группе (п-14) концентрация этанола в крови составляла до 1%о этанола в крови, во второй группе (п-19 человек) - от 1 до 2%о, в третьей (п-18) - от 2-х до 3%о, в четвертой (п-19) - в диапазоне 3 -4%о, в пятой (п-18) - от 4 до 5%о и в шестой группе (9 человек) - более 5%о этанола в крови.

Первая группа составила 14,4 % от всей совокупности больных с отравлением этанолом, 2-я группа - 19,6%, 3-я группа - 18,6%, 4-я группа - 19,6%, 5-я группа - 18,6% и шестая группа - 9,3%.

Небольшие дозы алкоголя у 50% больных приводят к включению защитных механизмов по сохранению целостности мембран и период полураспада эритроцитов у них увеличивается. Но в целом II в этой группе в среднем равен 24,50±2,8 минутам

С увеличением концентрации алкоголя количество больных, способных стабилизировать мембраны эритроцитов уменьшается. А количество больных с ухудшением функционального состояния мембран эритроцитов непрерывно возрастает и, соответственно, составляет 68,4% - 83,3% - 94,7%, а в 5-й и 6-й группах достигает 100%.

Во второй группе (п-19), где концентрация этанола в крови составила в среднем 1,71%о, наблюдается снижение Я до 22,3±2,4 минут.

В третьей группе (п-18) с содержанием этанола в крови в среднем 2,38±0,26%о, уровень интоксикации увеличивается и наблюдается снижение К до 21,5±2,2 минут.

В четвертой группе (п-19) средняя концентрация этанола составила 3,48±0,37%о, период полураспада мембран эритроцитов снизился до 20Д±1,9 минут (82% от первой группы).

В пятой группе (п-18), где концентрация этанола в крови составила в среднем 4,52±0,39%о, наблюдается достоверное (р<0,05) снижение Я до 18,9±1,7 минут (77% от первой группы и 75% от уровня контрольной группы), что подчеркивает ослабление (ухудшение состояния) мембран под воздействием высоких концентраций этанола.

В шестой группе (п-9) средняя концентрация этанола в крови равнялась 5,23±0,46%о, а уровень Я составил 19,3±1,8 минут.

В последней группе изменение Я выбивается из общей тенденции к снижению, вероятно, из-за небольшого количества поступивших с такой концентрацией алкоголя (п -9), но по абсолютному показателю все равно показатель достоверно снижен от исходного уровня (р< 0,05).

Тенденция к снижению периода полураспада клеточных мембран в динамике после небольшого их «укрепления» при малых концентрациях этанола может говорить об исчерпании компенсаторных защитных механизмов.

Эти данные говорят о том, что при действии небольших концентраций этанола у ряда больных отмечается умеренное «укрепление» мембран эритроцитов, но при нарастании уровня алкоголя - период полураспада мембран уменьшается, что подтверждает неблагоприятное действие больших доз алкоголя на клеточные мембраны.

Таблица 5

Величина полураспада эритроцитарных мембран

Возраст Здоровые Этанол Концентрация

II, мин Я, мин этанола, %о

20-30 22,08±2,4 24,45±2,1 2,252±0,207

лет

31-50 27,4±3,1 23,27±2,2 3,580±0,313

лет

51-60 28,5±3,3 22,72±2,1 3,123±0,274

лет

Разбивка по возрастным группам 20-30 лет; 31-50 лет и 51-60 лет показала, что Я, соответственно, при отравлении этанолом, составил: в первой возрастной группе - 24,45±2,1 мин; во второй группе (31-50 лет) - 23,27±2,2 мин, что составило 95,2% от уровня в первой возрастной группе; и в старшей возрастной группе - 22,72±2,1 мин (92,9% от исходного показателя) (табл. 5).

Если в группе здоровых людей отмечается постепенное увеличение с возрастом периода полураспада клеточных мембран, то под воздействием этанола наблюдается возрастное уменьшение этого периода.

Превышение величины Я в первой возрастной группе с отравлением этанолом по сравнению с аналогичным показателем II у здоровых происходит за счет более выраженной компенсаторной реакции по стабилизации мембран у людей более молодого возраста и с менее высокой концентрацией этанола.

В младшей возрастной группе содержание алкоголя в крови в среднем составило 2,252± 0,207%о, в средней - 3,580±0,313%о, а в старшей - 3,123±0,274%о.

Эти данные показывают, что с возрастом снижаются защитные реакции организма и увеличивается негативное влияние алкоголя на клеточные мембраны. В группе старше 50 лет концентрация этанола в крови несколько ниже, чем в предыдущей группе, но, несмотря на это, продолжает уменьшаться период полураспада эритроцитарных мембран.

Таким образом, снижение периода полураспада мембран эритроцитов под воздействием этанола подтверждает его негативное действие в различных возрастных группах.

Если у здоровых людей с возрастом отмечается увеличение периода полураспада эритроцитарных мембран после импульсного воздействия, то у поступивших в стационар пациентов с отравлением этанолом отмечается тенденция возрастного снижения К, несмотря на более низкие концентрации этанола, что говорит о более худшем исходном состоянии мембран эритроцитов в связи с негативным воздействием алкоголя, сопутствующих заболеваний, истощением резервных возможностей организма.

ВЫВОДЫ:

1. Определение периода полураспада эритроцитарных мембран после воздействия калиброванной электропорации является

чувствительным методом диагностики скрытых повреждений эритроцитарных мембран, позволяющим регистрировать состояние мембран эритроцитов в клинических условиях.

2. Применение метода электропорации показало изменения состояния мембран в возрастном аспекте. С возрастом период полураспада мембран эритроцитов в суспензии имел тенденцию к увеличению. Но в старшей возрастной группе (больше 70 лет) период полураспада уменьшается.

3. Результаты применяемого метода трактуются с учетом трех вариантов изменения функционального состояния мембран эритроцитов при воздействии различных фармпрепаратов: укрепление мембран, негативное воздействие на мембраны и отсутствие изменений. При изначально быстром распаде эритроцитарных мембран не следует применять препараты, вызывающие скрытые их повреждения, в частности, миорелаксант эсмерон.

4. Предлагаемый метод позволяет контролировать функциональное состояние эритроцитарных мембран до и после курса гамма-облучения. При дозе облучения 20 Гр отмечается укрепление мембран, кроме старшей возрастной группы, где наблюдается уменьшение периода полураспада в связи со снижением общих защитных реакций организма.

5. Метод электропорации позволяет диагностировать состояния мембран эритроцитов при отравлении этанолом. При низких концентрациях этанола у ряда больных отмечается укрепление мембран, а с возрастом и повышением концентрации этанола наблюдается ухудшение состояния эритроцитарных мембран.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Метод электропорации может применяться в клинических условиях для определения функциональной способности эритроцитарных мембран.

2. Этот метод позволяет диагностировать влияние различных фармпрепаратов на мембраны эритроцитов, что дает возможность врачам отделения анестезиологии и реанимации подбирать тактику проведения анестезиологического пособия и лечения больных с учетом влияния препарата на мембраны эритроцитов. При возможности выбора различных препаратов одного класса

необходимо ориентироваться на полученные данные с помощью метода электропорации.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Елагина В.М. Влияние анестезиологических препаратов на мембраны эритроцитов // Мат. 14-го Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва 2007.- С. 108.

2. Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Алексеева П.Ю. Определение скрытого повреждения мембран эритроцитов при применении анестезиологических препаратов // Мат. 5-ой научно -практическая конференция «Безопасность больного в анестезиологии - реаниматологии». Москва 2007.-С. 31.

3. Алексеева П.Ю., Близнюк У.А., Ермаков А.Н., Казиев Г.Р. Исследование воздействия ионизирующего излучения в сочетании с химфармпрепаратами на биологические мембраны // Медицинская физика. - 2007- №3 (35). - С. 53-55.

4. Алексеева П.Ю., Мороз В.В., Близнюк У.А., Елагина В.М., Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Черныш A.M., Богушевич М.С. Выявление скрытых повреждений эритроцитарных мембран при фармакологических воздействиях // Общая реаниматология.-2007.-Т. 3. - №4. - С. 102-105.

5. Alexeeva P.Yu., Chernysh A.M., Chernyaev A.P., Kozlova E.K. Vasilyev V.Yu., Kaziev G.R. The investigation of ionizing radiation and medicine combined action on red cell membrane. L7 international conference on nuclear physics «NUCLEUS 2007» Saint-Petersburg 2007, p. 275.

6. Алексеева П.Ю., Мороз B.B., Васильев В.Ю., Казиев Г.Р., Козлова Е.К., Черныш A.M., Богушевич М.С., Козлов А.П., Близнюк У.А. Воздействие анестезиологических препаратов на мембрану эритроцитов // Общая реаниматология,- 2007. - Т. 3.- №5-6.- С. 134-138.

7. Васильев В.Ю., Казиев Г.Р., Симонов О.В., Васильев C.B. Диагностика повреждений мембран эритроцитов при инфаркте миокарда // Мат.- Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно - сосудистой системы. Москва 2008.- С. 4-7.

8. Васильев В.Ю., Казиев Г.Р., Гордова A.M. Функциональное состояние эритроцитарных мембран при изменениях

показателей красной крови // Мат. 11-го Всероссийского конгресса анестезиологов и реаниматологов. Санкт-Петербург

2008,- С. 505-506.

9. Васильев В.Ю., Казиев Г.Р., Симонов О.В., Васильев C.B. Скрытые повреждения мембран эритроцитов при инфаркте миокарда // Мат. Всероссийского форума «Вопросы неотложной кардиологии». Москва 2008.- С. 21-22.

10. Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Гордова A.M., Рысаева P.M. Диагностика скрытых повреждений мембран эритроцитов при раке молочной железы // Ж. Патогенез - Москва 2008,- С. 64.

11. Васильев В.Ю., Левитэ Е.М., Казиев Г.Р., Гордова A.M. Оптимизация проведения операционного периода при радикальных мастэктомиях // Общая реаниматология.- 2008,-4.-С. 46-50.

12. Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Меркулов И.А. Состояние мембран эритроцитов у больных раком молочной железы после лучевой терапии // Мат .- Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно - сосудистой системы. Москва 2008.- С. 320-323.

13. Васильев В.Ю., Казиев Г.Р., Колесникова И. В. Состояние мембран клеток и баланс кислорода при алкогольном отравлении // Мат. - Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно - сосудистой системы. Москва 2009.- С. 2224.

14. Rysaeva R.M., Kaziev G.R. The investigation of structural inhomogeneities of erythrocyte surface by the atomic force microscope. 17th International Symposium. Triuggio (Milano, Itali)

2009, p. 76.

15. Казиев Г.Р., Васильев В.Ю., Боровик И.В., Есипов П.С. Оценка структурно-функционального состояния мембран эритроцитов при отравлении опиатами // Мат.- Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии. Москва, 2009.- С. 35-37.

16. Алехнович A.B., Васильев В.Ю., Ливанов A.C., Казиев Г.Р., Саутин М.Е. Эндотоксемия, перекисный гомеостаз и стабильность мембран эритроцитов при острых отравлениях психотропными препаратами // Медицина катастроф.- 2010.-№ 4,- С. 41-43.

17. Боровик И.В., Васильев В.Ю., Есипов П.С., Казиев Г.Р., Ливанов A.C. Состояние эритроцитарных мембран у больных с опиатной интоксикацией // Мат. - Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно - сосудистой системы. Москва 2010.- С. 52-53.

Перечень сокращений, используемых в работе.

ИЭП - импульсное электрическое поле, ФЭК - фотоэлектроколориметр, R - период полураспада эритроцитарных мембран, Фл - фемтолитр (10"15)

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 404. Тираж 100 экз.

Воздействие внешних факторов на организм человека является вмешательством в нормальное функционирование его систем, нарушением стабильности метаболических процессов, а также изменением свойств тканей, клеток, мембран на микроуровне.

В результате внешнего воздействия возникает интегральный ответ систем организма, вклад в который вносят и центральная нервная система, и репарационные механизмы, и иммунная система. В организме в целом функционирует сложная и разнообразная система защиты и восстановления, как генетической информации, так и сложных мембранных комплексов.

Развитие любого заболевания сопряжено с нарушением структурно-функциональных свойств тех или иных клеток организма, поэтому большое значение в современной медицине имеет диагностика особенностей структурно-функциональной организации клеточных мембран при различных патологических процессах (Бархоткина Т.М. и др., 2006).

Внедрение в практическую медицину новых методик терапевтического воздействия требует и новых информативных, доступных, унифицированных и стандартизированных методик исследования.

Оценка состояния мембран клеток крови при действии на них различных физических и химических факторов и лекарственных средств является одной из важных проблем клинической медицины.

Удобным объектом для разрешения ряда дискуссионных вопросов в этой области являются мембраны эритроцитов, поэтому изучение различных свойств эритроцитов находит широкое применение в клинической диагностике [Рубин А.Б., 2000; Головецкий И.Я. с соавт., 2007].

От структурной организации мембран красных кровяных клеток во многом зависят их агрегация и деформируемость, являющиеся важнейшими компонентами гемореологического профиля [Ройтберг Г.Е., 2007].

Это представляется важным, поскольку мембраны играют ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток.

Ряд научных работ посвящен вопросам исследования механизмов мембранных повреждений в результате воздействия различных физико-химических факторов [Вепёепйег М. е! а1., 2003; Кудряшов Ю.Б., 2004; Козлова Е.К., 2005].

Для эффектов воздействия различных физико-химических факторов на биологические объекты характерно появление скрытых повреждений [Черняев А.П. и др., 2007].

В результате повреждений клеточной мембраны возникают дополнительные ее дефекты, которые могут не настолько развиться, чтобы изменить функцию клеток сразу после введения препарата, но со временем могут нарушить ее и вызвать патологические процессы в крови. Такие повреждения могут на протяжении длительного времени не обнаруживать себя изменением функционального состояния биологических объектов различной степени сложности. В результате увеличения силы физических и химических воздействий или временного интервала их воздействия возможно возникновение в крови реакций, которые носят необратимый характер и с течением времени функции мембраны эритроцита нарушаются.

Применение методики калиброванной электропорации [Черныш А.М с соавт., патент № 2269127, 2005] позволило авторам детектировать скрытые повреждения мембран эритроцитов при действии на клетки малых доз излучения пучка заряженных частиц, при слабом ультрафиолетовом облучении, при введении малых концентраций поверхностно-активных веществ и ряда химических агентов.

Для успешной реализации проводимой терапии лекарственные препараты не должны нарушать клеточное морфологическое строение и функции.

Выявляя изменение степени скрытых повреждений мембран эритроцитов, можно сделать вывод об отрицательном побочном характере воздействия ряда факторов и лекарственных препаратов.

Определяя относительную величину скорости гемолиза эритроцитов можно сделать вывод о влиянии различных факторов на мембрану. Особую актуальность приобретает детектирование скрытых повреждений мембран клеток крови у наиболее тяжелых больных, находящихся в отделениях интенсивной терапии и при проведении анестезиологического пособия при оперативных вмешательствах.

Известно много фактов структурных изменений биологической мембраны эритроцитов под воздействием излучений: уменьшение связи гемоглобина с мембраной эритроцита при увеличении дозы от 10 до 10 Гр [Древаль В.И. и др., 2000].

При этом физические процессы могут не только приводить к формированию структурных повреждений, но и инициировать цепи биологических реакций, приводящих к дальнейшему изменению структуры и функций биологических мембран.

Сразу после воздействия лекарственных препаратов и других факторов на микроуровне могут возникать необратимые процессы, а на макроуровне они остаются скрытыми (потенциальными). Длительность скрытого (латентного) периода зависит от уровня организации биологических объектов и может варьировать в зависимости от дозы и концентрации физико-химических факторов, а также от выбранной для наблюдения функции.

При дополнительных воздействиях, например, при повышении парциального давления кислорода, при нагревании и т.д., скрытое повреждение может проявляться быстрее.

Чтобы ускорить диагностическую составляющую исследований, на мембраны клеток, кроме воздействия препарата, дополнительно воздействуют стандартизированным электрическим импульсным полем.

Кровь, в которую введён химически активный агент и на которую при этом действует импульсное электрическое поле разряда дефибриллятора, представляет собой сложную систему, в которой развиваются нелинейные эффекты.

Если собственные свойства системы изменяются при внешнем воздействии, такие системы считаются нелинейными, отличительным признаком которых является нарушение в них принципа суперпозиции, а именно: аддитивность причин не приводит к аддитивности следствий.

Поэтому, актуальным остается исследование действия на мембраны лекарственных препаратов в дозах, при которых наблюдается нелинейный отклик системы.

Импульсное электрическое поле, воздействующее на мембраны, способствует выделению интересующих эффектов, позволяет определить их направление в зависимости от концентрации препарата, температуры и других параметров системы.

Решение этой задачи затруднено тем, что ряд эффектов взаимодействия этих структур проявляются не сразу после введения препарата в суспензию крови, а лишь спустя значительный промежуток времени после этого, например, через сутки и более. Таким образом, изучаемый эффект оказывался "замаскированным". За это время исходная суспензия эритроцитов крови может изменить собственные параметры, в этом случае выделить результат прямого действия препарата на мембраны эритроцитов на фоне изменившихся параметров системы весьма затруднительно, а зачастую невозможно.

Индуцированная электропорация позволяла выделить «замаскированные» эффекты взаимодействия системы мембрана — фармацевтический препарат.

Для выявления непосредственного действия лекарственных препаратов, мембраны эритроцитов подвергались воздействию импульсного электрического поля. Индуцированная электропорация позволяла выделить «замаскированные» эффекты взаимодействия системы мембрана - фармацевтический препарат.

Выявляя изменение степени скрытых повреждений мембран эритроцитов, можно сделать вывод о побочном характере воздействия лекарственного препарата.

Изучение механизма действия физико-химических факторов на отдельные структуры, в том числе, клеточные мембраны, и установление оптимальных доз лекарственных препаратов, является актуальным.

Метод калиброванной электропорации позволяет оценить степень поражения биологических мембран сразу после воздействия. Представляется интересным использование метода для исследования динамики повреждений мембран клеток.

Поэтому изучение поведения эритроцитарных мембран в условиях одновременного воздействия на них инородного химического агента и импульсного электрического поля представляется важным и с научной, и с практической точек зрения.

Целью данной работы является определение возможности применения метода электропорации в клинических условиях для выявления повреждений эритроцитарных мембран при воздействии различных факторов и фармпрепаратов.

Задачи исследования

1. Изучить возможность применения метода калиброванной электропорации для диагностики повреждений клеточных мембран в клинических условиях.

2. Выявить возрастные особенности состояния мембран эритроцитов у здоровых людей.

3. Выявить методом электропорации скрытые повреждения биологических мембран при воздействии препаратов, применяемых в анестезиологической практике.

4. Исследовать воздействие курса гамма-облучения при раке молочной железы на функциональное состояние мембран эритроцитов.

5. Провести сравнительный анализ состояния мембран эритроцитов в зависимости от степени отравления этанолом.

Научная новизна работы

Впервые в клинических условиях применен метод электропорации для определения функционального состояния мембран эритроцитов.

Впервые проведена оценка влияния ряда анестезиологических средств на мембрану эритроцитов.

Впервые отмечено три варианта изменений функционального состояния мембран эритроцитов при воздействии различных фармпрепаратов: укрепление мембран в 39,5% случаях, негативное воздействие на мембраны - у 34,2% больных и в 26,3% - практически изменений не было.

Впервые показана степень изменения функционального состояния эритроцитарных мембран под воздействием лекарственных препаратов, этанола, гамма-терапии злокачественных новообразований.

Практическая значимость работы

Определена возможность использования метода выявления «скрытых» повреждений мембран эритроцитов в качестве диагностического для исследования степени повреждения мембран и выбора анестезиологических средств для обеспечения адекватного общего обезболивания пациентов.

Предложенная модель может быть использована для оценки и количественного анализа степени повреждающего воздействия препаратов на мембраны.

Данный метод исследования действия различных факторов на биологические мембраны в сочетании с импульсным электрическим полем может быть применен в практической медицине, анестезиологии-реаниматологии и других медицинских специальностях: для мониторинга за состоянием эритроцитов в ходе общей анестезии и интенсивной терапии.

Результаты, полученные в диссертации, могут быть включены в программу обучения студентов высших учебных заведений, и врачей, специализирующихся в области анестезиологии-реаниматологии, кардиологии, гематологии, хирургии.

Степень обоснованности и достоверности научных результатов и выводов обеспечена использованием хорошо апробированных методик, строгим соблюдением условий экспериментов, высокой степенью воспроизводимости экспериментальных данных, основаны на результатах обследования большого числа пациентов.

Полученные новые данные согласуются с экспериментальными данными и выводами работ других авторов и согласуются с современными представлениями по рассматриваемой проблеме.

Полученные данные обрабатывались с помощью стандартных статистических методик.

Для обработки полученных данных использовалась программа для построения математических графиков Origin Pro 8.0987 SR4.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предлагаемый метод исследования результатов воздействия на биологические мембраны с помощью калиброванного импульсного электрического поля позволяет оценивать скрытые повреждения мембран эритроцитов через 1-30 мин после воздействия.

2. Анестезиологические препараты вызывают нестабильный ответ биологических наноструктур (в частности, мембран эритроцитов).

3. При воздействии импульсного поля на биологические мембраны определены концентрации ряда анестезиологических препаратов и терапевтических воздействий, уменьшающие и увеличивающие скрытые структурные дефекты мембраны.

4. В результате действия ряда факторов (или их высокой дозы) на мембраны уменьшается пороговый потенциал их электрического пробоя.

5. Предложенный метод позволяет оценить степень воздействия на мембраны различных препаратов в разных концентрациях (1-100 мкл/мл суспензии).

6. Данная методика позволяет оценить изменения функционального состояния клеточных мембран в зависимости от возраста исследуемого.

Апробация работы

Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих форумах:

Всероссийская научная конференция с международным участием, посвященная 70-летию ГУ НИИ общей реаниматологии РАМН, Москва 2006;

XIV Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва 2007;

5-я научно-практическая конференция «Безопасность больного в анестезиологии-реаниматологии», Москва 2007; L

European Association for Red Cell Research , 16 Meeting, London, 2007;

10-я научно-практическая конференция «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы», Москва 2008;

3-й съезд токсикологов России, Москва 2008;

5-я Российская конференция «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция», Москва, 2008;

Научно-практическая конференция «Современные методы диагностики и лечения в экспериментальной и клинической реаниматологии», Москва 2008;

11-я научно-практическая конференция «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы», Москва 2009;

16 kongres slovenskych anestziolôgov s medzinârodnou ucast'ou. Piest'any, 2009,

17-th International Symposium, Italy, April 2009;

Научно-практическая конференция «Современные методы диагностики и лечения в реаниматологии», Москва, 2009;

12-я научно-практическая конференция «Диагностика и лечение нарушений регуляции сердечно-сосудистой системы», Москва 2010.

Выражаю глубокую благодарность за помощь в работе: доктору физико-математических наук, профессору Чернышу А.М. и доктору физико-математических наук, профессору Козловой Е.К.

ВЫВОДЫ:

1. Определение периода полураспада эритроцитарных мембран после воздействия калиброванной электропорации является чувствительным методом диагностики скрытых повреждений эритроцитарных мембран, позволяющим регистрировать состояние мембран эритроцитов в клинических условиях.

2. Применение метода электропорации показало изменения состояния мембран в возрастном аспекте. С возрастом период полураспада мембран эритроцитов в суспензии имел тенденцию к увеличению. Но в старшей возрастной группе (больше 70 лет) период полураспада уменьшается.

3. Результаты применяемого метода трактуются с учетом трех вариантов изменения функционального состояния мембран эритроцитов при воздействии различных фармпрепаратов: укрепление мембран, негативное воздействие на мембраны и отсутствие изменений. При изначально быстром распаде эритроцитарных мембран не следует применять препараты, вызывающие скрытые их повреждения, в частности, миорелаксант эсмерон.

4. Предлагаемый метод позволяет контролировать функциональное состояние эритроцитарных мембран до и после курса гамма-облучения. При дозе облучения 20 Гр отмечается укрепление мембран, кроме старшей возрастной группы, где наблюдается уменьшение периода полураспада в связи со снижением общих защитных реакций организма.

5. Метод электропорации позволяет диагностировать состояния мембран эритроцитов при отравлении этанолом. При низких концентрациях этанола у ряда больных отмечается укрепление мембран, а возрастом и повышением концентрации этанола наблюдается ухудшение состояния эритроцитарных мембран.

Практические рекомендации.

Метод электропорации может применяться в клинических условиях для определения функциональной способности эритроцитарных мембран.

К венозной крови, взятой у исследуемого, добавляется 0,1-0,2 мл гепарина для предупреждения свертывания крови. Приготавливается суспензия в 0,9% растворе хлористого натрия, выдерживается 15 мин в термостате при температуре 19-20°С.

На суспензию воздействуют импульсным электрическим полем (метод калиброванной электропорации), создающим в суспензии эритроцитов напряженность поля 1100 В/см, энергией электрического импульса в 230 Дж и длительностью 10 мс.

Оценка воздействия электрического импульса на клеточные мембраны проводится по скорости гемолиза эритроцитов в суспензии в данный момент времени. Степень гемолиза в суспензии измеряется с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2МП. Для анализа данных строятся кинетические кривые зависимости относительной константы скорости гемолиза и определения периода полураспада с помощью программы для построения математических графиков Origin Pro 8.0987 SR4.

Этот метод позволяет диагностировать влияние различных фармпрепаратов на мембраны эритроцитов, что дает возможность врачам отделения анестезиологии и реанимации подбирать тактику проведения анестезиологического пособия и лечения больных с учетом влияния препарата на мембраны эритроцитов. При возможности выбора различных препаратов одного класса необходимо ориентироваться на полученные данные с помощью метода электропорации.