Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Клиническое и прогностическое значение полиморфизма некоторых генов-кандидатов и маркеров эндотелиальной дисфункции у больных, перенесших острый коронарный синдром

На правах рукописи

ЩЕГЛОВА Елена Витальевна

КЛИНИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ И МАРКЕРОВ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ, ПЕРЕНЁСШИХ ОСТРЫЙ КОРОНАРНЫЙ СИНДРОМ

14.00.05 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Г1 з МАР 2Г

Владикавказ - 2008 г.

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Ягода Александр Валентинович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Бурдули Николай Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Елисеева Людмила Николаевна

Ведущая организация: Астраханская государственная

медицинская академия

Защита диссертации состоится «_»_2008 г в_

часов на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия Росздрава» (362019 г Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СевероОсетинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208 095 01

доктор медицинских наук, профессор И.Г. Джиоев

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АСС - Американский колледж кардиологии

ESC — Европейское сообщество кардиологов

ЕТ-1 - эндотелии-1

NO - оксид азота

NYHA - Нью-Йоркская ассоциация сердца

АПФ - ангиотензин превращающий фермент

Ген АСЕ — ген ангиотензин превращающего фермента

reHEDNl— генэндотелина-1

Ген NOS3 — ген эндотелиальной синтетазы оксида азота

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИМТ — индекс массы тела

НС - нестабильная стенокардия

ОИМ - острый инфаркт миокарда

ОКС - острый коронарный синдром

ФВ - фракция выброса

ФК - функциональный класс

ФР — фактор риска

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В большинстве экономически развитых стран ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из ведущих мест по распространённости среди населения и частоте летальных исходов Характерной чертой данной патологии является волнообразный характер течения, когда периоды относительной стабильности сменяются эпизодами обострения с развитием острого коронарного синдрома (ОКС) (Грацианский Н А, 1996) Больные, перенесшие ОКС, даже после стабилизации состояния имеют повышенный риск неблагоприятного исхода Так, летальный исход или нефатальный инфаркт миокарда (ИМ) за 1 год регистрируются у 4-5% больных стабильной стенокардией, тогда как в течение года после ОКС подобные коронарные события возникают в 3 раза чаще, по разным данным - в 14-15% случаев В связи с этим выявление предикторов неблагоприятного исхода в группе пациентов с нестабильным течением ИБС является одной из актуальных проблем (Braunwald Е,2000)

Одним из перспективных подходов для выделения групп повышенного риска развития летального исхода и нефатального инфаркта миокарда, прогнозирования характера течения патологического процесса и развития осложнений, а также выбора терапии является анализ полиморфизма генов-кандидатов (Cambien F, 1999) Генетические характеристики не изменяются в течение жизни, их можно отнести к немодифицируемым факторам риска Вместе с тем влияние генотипа на возникновение и течение патологического процесса осуществляется при его аддитивном взаимодействии с факторами внешней среды Более активное воздействие на модифицируемые причины прогрессирования ИБС у лиц, имеющих генетическую предрасположенность к тяжёлому течению заболевания, может воспрепятствовать реализации неблагоприятных генетических факторов. Поэтому выявление генов, ответст-

венных за прогрессирование коронарной патологии, представляет научный и клинический интерес

Ведущее место в патогенезе ОКС отводится нарушению функции сосудистого эндотелия (На1сох IР , 2006, 8сЬасЬт£ег V , 2000) При эндотели-альной дисфункции нарушается выработка практически всех синтезируемых эндотелием субстанций, в том числе таких регуляторов сосудистого тонуса, как оксид азота (N0), эндотелин-1 (ЕТ-1), ангиотензин превращающий фермент (АПФ) Дисфункция эндотелия может иметь генетическую основу Выявление ассоциативных связей полиморфных маркеров генов, кодирующих вещества - регуляторы сосудистого тонуса, с содержанием их активных продуктов в плазме крови и факторами риска развития и неблагоприятного течения ИБС позволит прояснить некоторые патогенетические аспекты возникновения и прогрессирования данной патологии

Цель исследования. Определение клинической и прогностической значимости полиморфизма генов ангиотензин превращающего фермента (АСЕ), эндотелина-1 (.ЕВИ1), эндотелиальной синтетазы оксида азота (N083), а также биохимических маркеров эндотелиальной функции - оксида азота и эндотелина-1 у больных ИБС после перенесённого острого коронарного синдрома

Задачи исследования:

1 Выявить изменчивость генов-кандидатов, связанных с развитием эндотелиальной дисфункции полиморфизм 1Ю гена ангиотензин превращающего фермента, полиморфизм ОЫ298А$р гена МЭ-синтетазы, полиморфизм Ьуз298Азп гена эндотелина-1 у больных, перенесших ОКС

2 Определить статус эндотелиалъных механизмов регуляции сосудистого тонуса путём оценки концентрации в плазме крови эндотелина-1 и оксида азота

3. Оценить взаимосвязь генотипа с клинико-анамнести-ческими ха-

рактеристиками пациентов, плазменным содержанием оксида азота и эндоте-лина-1

4 Провести оценку влияния изучаемых показателей на клиническое течение ИБС в течение 12 месяцев после эпизода обострения

5 Выделить предикторы прогрессирования ИБС и обосновать возможность их практического использования с целью выявления пациентов с высоким риском сердечно-сосудистых событий

Научная новизна работы. Определение генотипов ACE, NOS3, EDN1 у больных ИБС позволило впервые оценить распространенность различных аллелей изучаемых генов среди пациентов Ставропольского края Впервые были выявлены ассоциации изучаемых полиморфных маркеров с особенностями течения ИБС D/D вариант гена АСЕ ассоциировался с развитием ОКС у более молодых пациентов с ранней дестабилизацией процесса, аллель Asp гена NOS3 обнаружил связь с выраженным нарушением систолической функции левого желудочка, Lys/Lys вариант гена EDN1 был взаимосвязан с таким фактором кардиоваскулярного риска, как избыточная масса тела Впервые были получены данные о взаимосвязи полиморфизма I/D гена АСЕ - генотипа D/D с уровнем оксида азота в плазме крови у больных, перенесших ОКС Впервые установлена зависимость плазменного содержания эндо-телина-1 от генотипа EDNJ, варианта ОКС и взаимосвязь уровня оксида азота с количеством факторов риска и частотой достижения конечных точек в течение 1 года после острого коронарного синдрома Впервые изучено распределение генотипов полиморфных маркеров генов ACE, NOS3, EDN1 и плазменный уровень регуляторов сосудистого тонуса у пациентов с различными исходами в течение 12 месяцев после ОКС Впервые показана ассоциация аллеля D и D/D генотипа гена АСЕ и низкого> плазменного уровня оксида азота, наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса левого желудочка, с неблагоприятным прогнозом у больных ИБС - частыми

эпизодами дестабилизации и низкой выживаемостью По итогам исследования, создана математическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность наступления неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после ОКС

Практическая значимость работы Установленный факт взаимосвязи генетического маркера АСЕ с низким уровнем оксида азота и ранней дестабилизацией ИБС позволяет на начальных стадиях заболевания выявить пациентов, предрасположенных к развитию ОКС Обнаружение аллеля Asp маркера Glu298Asp гена эндотелиальной синтетазы оксида азота может указывать на возможность формирования дисфункции левого желудочка у больных ИБС Выявленные ассоциации гомо- и гетерозиготности по аллелю D гена АСЕ и низкого уровня NO в плазме у больных после ОКС, с одной стороны, и высокой частоты дестабилизации ИБС в виде нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда и сравнительно более низкой выживаемости, с другой, дают возможность использовать эти показатели для прогнозирования течения заболевания на протяжении ближайшего года Предложенная математическая модель оценки прогноза после перенесённого ОКС, включающая, наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса левого желудочка, генотип D/D гена АСЕ и уровень NO, может применяться на стационарном и постстационарном этапах для выработки оптимальной тактики лечения

Выявленные гено-фенотипические предикторы осложненного течения хронической ИБС в виде развития инфаркта миокарда обосновывают показания к коррекции лечебной тактики

Внедрение результатов работы Результаты исследования внедрены в практику работы кардиологических отделений ГУЗ «Краевой клинический кардиологический диспансер» г Ставрополя и терапевтического отделения ГУЗ «Ставропольский краевой клинический центр специализированных ви-

дов медицинской помощи» Основные положения диссертационной работы используются в лекциях и на практических занятиях по кардиологии со студентами лечебного факультета Ставропольской государственной медицинской академии

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- связь полиморфного маркёра 01и298А$р гена N083 и Ьу$198Ат гена ЕБИ! с некоторыми клиническими характеристиками и факторами риска ИБС,

- ассоциация уровня эндотелина-1 в плазме крови с тяжестью обострения ИБС, а также содержания оксида азота с количеством факторов риска и течением ИБС после перенесенного ОКС,

- влияние генетических факторов на плазменное содержание оксида азота и эндотелина-1 у больных ИБС,

- ассоциация полиморфного маркёра ///> гена АСЕ с характером течения ИБС и риском неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после ОКС;

- математическая модель прогнозирования вероятности неблагоприятного исхода ИБС в течение 1 года после ОКС на основе комплекса независимых предикторов

Публикации и апробация работы. Материалы исследования изложены в 8 печатных работах, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ- «Кардиоваскулярная терапия и профилактика» (2007), «Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им И.И Мечникова» (2007), доложены на научно-практической конференции «Современная кардиология наука и практика» (Санкт-Петербург, 2007), VI съезде кардиологов Южного федерального округа (Ростов-на-Дону, 2007), XV межрегиональной научной конференции студентов и молодых ученых СтГМА (Ставрополь, 2007), 52-й научно-методической конференции препо-

давателей и студентов Ставропольского государственного университета «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2007)

Апробация работы проведена на объединенном заседании кафедр внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии и пропедевтики внутренних болезней Ставропольской государственной медицинской академии

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит 147 страниц машинописного текста, 7 рисунков, 51 таблицу, 3 клинических наблюдения, состоит из введения, четырех глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 245 литературных источников, из которых 38 на русском и 207 на иностранных языках

Диссертационная работа выполнена на базе кафедры внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии Ставропольской государственной медицинской академии в соответствии с планом научных исследований в рамках отраслевой научно-исследовательской программы №18 «Профилактическая медицина»

Номер государственной регистрации 01200600722

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. В исследование были включены 86 больных (64 мужчины и 22 женщины) в возрасте от 33 до 70 лет (средний возраст 56,1±9,2 лет), госпитализированных в Ставропольский краевой клинический кардиологический диспансер по поводу острого коронарного синдрома Включение больных в исследование осуществлялось после стабилизации их состояния - при отсутствии прогрессирования стенокардии и рецидивов ишемии миокарда на ЭКГ в течение 10 и более суток Все обследованные были жителями Ставропольского края и не состояли в родстве, характеризовались сходным социально-экономическим и этническим составом

Возраст дебюта ИБС составил, в среднем, 50,5±8,6 лет Наиболее распространенными факторами кардиоваскулярного риска были артериальная гипертензия и избыточная масса тела (75% и 73% соответственно) У большинства пациентов (72%) определялась сниженная фракция выброса левого желудочка

У 40 (46,7%) больных ОКС реализовался в нестабильную стенокардию, у 46 (53,4%) - в острый инфаркт миокарда

Наряду со стандартным обследованием, проводили типирование полиморфных маркеров I/D гена ангиотензин превращающего фермента (АСЕ), Glu298Asp гена эндотелиальной синтетазы оксида азота (NOS3) и Lysl98Asn гена эндотелина-1 (EDN1), определяли плазменное содержание оксида азота (NO) и эндотелина-1 (ЕТ-1)

Выделение геномной ДНК из лимфоцитов крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции Идентификацию аллелей полиморфных маркеров осуществляли при помощи полимеразной цепной реакции

Забор крови для определения уровня NO производили после предварительной отмены пролонгированных нитратов в свободный период, составляющий не менее 16 часов, и короткодействующих нитратов в период не менее 6 часов. Оценку концентрации оксида азота в сыворотке крови проводили калориметрическим методом с использованием набора Total NO/Nitrite/Nitrate («R&D Systems», США) Результаты выражали в мкмоль/л Минимально определяемый уровень N0 составил 0,25 мкмоль/л Анализ плазменного содержания эндотелина-1 осуществляли методом ИФА с использованием диагностического набора Enzyme immunoassay for the quantitative determination of human endothelin 1-21 («Biomedica Gruppe», Австрия^ Результаты выражали в фмоль/мл, минимально детектируемый уровень ЕТ-1 0,02 фмоль/мл

Контрольную группу по показателям плазменного содержания оксида

азота и эндотелина-1 составили 20 практически здоровых людей, сопоставимых с больными по полу и возрасту, не имеющих факторов риска атеросклероза' Концентрация ЕТ-1 в плазме здоровых людей составила 0,46±0,11 фмоль/мл, оксида азота - 53,8±10,9 мкмоль/л

Больные находились под наблюдением в течение 12 месяцев Неблагоприятными исходами (конечными точками) считали развитие документированного эпизода НС, нефатального ОИМ, смерти от сердечно-сосудистых причин, все случаи проведения процедур реваскуляризации Дату и причину летального исхода устанавливали на основании данных патологоанатомиче-ского исследования или медицинского заключения о смерти

Поддерживающее лечение больных после клинической стабилизации ИБС проводили в соответствии с рекомендациями по диагностике и лечению стабильной стенокардии Всероссийского научного общества кардиологов

На фоне лечения у пациентов сохранялись симптомы стенокардии напряжения различных функциональных классов ФК I - 10%, ФК И - 53%, ФК III - 35% У двоих больных имела место безболевая ишемия миокарда Степень сердечной недостаточности в большинстве случаев (56%) соответствовала ФК II по классификации ИУНА Доли пациентов, имеющих ФК I (21%) и ФК III (23%), были примерно равными Целевой уровень артериального давления был достигнут в 81 % случаев

За весь период наблюдения конечных точек достигли 45 больных, в том числе умерло 6 Причиной смерти у пятерых оказалась острая коронарная недостаточность, у одного пациента - прогрессирование хронической сердечной недостаточности 7 больных перенесли нефатальный ОИМ, у 32 отмечалось прогрессирование стенокардии Однократное обострение ИБС в течение периода наблюдения перенесли 20 (44%) больных, дважды конечные точки были достигнуты в 19 (42%) случаях, а у 6 пациентов ОКС был зафиксирован трижды

Статистическую обработку результатов проводили с помощью стандартных прикладных пакетов программ Statistica 6 0 for Windows, SPSS 13 О for Windows Правильность распределения частот генотипов определяли соответствием равновесию Харди-Вайнберга Для протяженных переменных рассчитывали средние величины и стандартные отклонения (М±т) При сравнении независимых групп использовали i-критерий Стьюдента, а также непараметрические методы - тесты Mann-Whitney и Kruskal-Walus Корреляционный анализ осуществляли при помощи коэффициента Спирмена Дискретные величины сравнивали по критерию ^ Пирсона Для сравнения частот благоприятного и неблагоприятного исхода в несвязанных группах вычисляли отношение шансов {odds ratio - OR) с определением доверительного интервала (ДИ). Различия по изучаемому бинарному признаку считали статистически значимыми, если ДИ для OR не включал в себя единицу Для оценки выживаемости строили кривые Каплана-Майера Под выживаемостью понимали вероятность отсутствия неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после ОКС Достоверность различий оценивали с помощью критерия log rank

Факторы, связь которых с неблагоприятным прогнозом носила достоверный характер, были включены в бинарный логистический регрессионный анализ На основании данных этого анализа была создана статистическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность наступления неблагоприятного исхода

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распределение I и D вариантов гена АСЕ среди обследованных больных оказалось следующим 18 пациентов (21%) имели I/I генотип, 22 (26%) -D/D и 45 (53%) пациентов были гетерозиготными по изучаемому аллелю Распределение аллелей и генотипов гена АСЕ соответствовало равновесию Харди-Вайнберга В зависимости от генотипа (1/1, 1/D, D/D) было выделено 3

группы больных

Выделенные группы больных с различными генотипами АСЕ были сопоставимы по распространённости большинства факторов кардиоваскуляр-ного риска, а также по основным клиническим характеристикам Получены данные, свидетельствующие о взаимосвязи генотипа АСЕ с клиническим течением и прогнозом ИБС Для многих больных характерным было раннее начало ИБС, однако на момент ОКС пациенты с генотипом D/D были достоверно моложе носителей I/D (52,1±8,7 против 56,7±8,2 лет, /з=0,04) и 1/1 (52,1±8,7 против 59,5±11 лет, jo=0,01) генотипов Можно предположить, что генотип D/D имеет отношение к ранней дестабилизации патологического процесса, тогда как аллель I ассоциирован с более продолжительным периодом стабильного течения ИБС

При проспективном наблюдении выявлено, что аллель D и D/D генотип были ассоциированы с неблагоприятным прогнозом после ОКС Среди больных, достигших конечных точек на протяжении 12 месяцев, достоверно чаще встречались носители D/D генотипа (35% против 15%, р=0,03, СУ?(ДИ) = 0,32(0,11,0,92)), тогда как у пациентов со стабильным течением заболевания более распространен был генотип III (33% против 11%, /5=0,04, OR(ДИ) = 3,85(1,23,12,1)) Пациенты гомо- и гетерозиготные по аллелю D в течение года после ОКС имели большее количество эпизодов дестабилизации, уровень значимости различий (р) составил 0,04 при сравнении I/D и 1/1 генотипов (0,97 против 0,5) и 0,03 при сравнении гомозиготных носителей аллелей Си/ (1,04 против 0,5) Выживаемость пациентов - носителей D аллеля была значительно ниже, чем при 1/1 генотипе Показатель выживаемости в группе больных с 1/1 вариантом составил 0,72 и достоверно превышал аналогичные данные в группах с I/D (0,72 против 0,4, 0,03) и D/D (0,72 против 0,27, /?=0,004) генотипами (рис 1, 2)

Количество дней наблюдения

Рис.1. Кривые выживаемости больных ИБС с /// и 1/Э вариантами гена АСЕ в течение года наблюдения.

- - i/i

Количество дней наблюдения

Рис. 2. Кривые выживаемости больных ИБС с I/I и D/D вариантами гена

АСЕ в течение года наблюдения. ** -р< 0,01 между носителями различных генотипов (критерий log rank).

При анализе распределения генотипов гена NOS3 получены следующие результаты: генотип Glu/Glu имели 38 больных (45%), Glu/Asp - 41 (48%), Asp/Asp - 6 больных. Распределение аллелей и генотипов гена NOS3 соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Учитывая, что гомозиготны-

14

ми по аллелю Asp оказались лишь 6 пациентов, при математической обработке данных больные были разделены на две подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия данного аллеля в генотипе 1-я подгруппа - носители генотипов Glu/Asp или Asp/Asp, 2-я подгруппа - носители генотипа Glu/Glu Подгруппы больных с различными вариантами данного гена не различались по клинико-анамнестическим характеристикам, распространенности факторов риска атеросклероза У носителей аллеля Asp гена NOS3 отмечалось более выраженное, чем при генотипе Glu/Glu, нарушение систолической функции левого желудочка, что выражалось в достоверно меньших показателях у этих больных ФВ левого желудочка (48±7,4 против 52,2±7,10%,/>=0,021)

По данным динамического наблюдения ассоциации генотипа NOS3 с течением ИБС после ОКС выявлено не было Среди пациентов с неблагоприятным прогнозом за 12 месяцев наблюдения количество носителей аллеля Asp составило 22 (49%), а гомозигот по аллелю Glu - 23 (51%) Среди больных, не достигших конечных точек, носители Glu/Glu генотипа встречались несколько реже (38%), а пациенты, имеющие аллель Asp, наоборот, чаще (62%) Шанс достижения конечной точки был несколько ниже у больных, имеющих аллель Asp (р=0,29, Ш(ДИ) = 0,57 (0,24,1,3)) Выживаемость больных в течение 1 года после ОКС не зависела от генотипа NOS3, составив 0,44 и 0,52 для носителей аллеля Asp и гомозигот Glu/Glu соответственно (р=0,35) Количество неблагоприятных исходов, приходящихся на одного человека, у носителей и не носителей аллеля Asp также не различалось (0,8 и 1,0 соответственно, р=0,3)

Количество больных ИБС, гомозигот Lys/Lys и гетерозигот по Lysl98Asn полиморфизму гена EDN1 оказалось примерно равным (40 и 44 больных соответственно), один пациент имел генотип Asn/Asn В дальнейшем лица, имеющие в генотипе аллель Asn, были объединены в общую группу Распределение аллелей и генотипов гена EDN1 соответствовало равновесию Харди-Вайнберга Обнаружена достоверная связь между Lys/Lys генотипом и

избыточной массой тела индекс массы тела у пациентов с этим генотипом был достоверно выше, чем у носителей аллеля Asn (28,9±4,1 против 26,8±3,7 кг/м2, р=0,01) По результатам проспективного анализа влияния генотипа EDN1 на прогноз ИБС после ОКС выявлено не было Более половины больных, достигших в течение 1 года после ОКС конечных точек, имели в генотипе аллель Asn (25 больных, 56%), среди пациентов с благоприятным прогнозом количество носителей и не носителей данного аллеля было равным (/9=0,76, ОИ(ДИ) = 0,8 (0,34,1,9)) Выживаемость в течение года после ОКС составила 0,49 при генотипе Asn/Asn или Lys/Asn и 0,42 для больных с генотипом Lys/Lys (р=0,62) При сравнении среднего количества достигнутых конечных точек, приходящихся на одного пациента, установлено, что носители аллеля Asn имеют несколько большее количество эпизодов дестабилизации за год, чем гомозиготы Lys/Lys, (различия статистически не значимы, р= 0,12)

Различия средних уровней NO между больными и здоровыми были недостоверны (57,6±20,4 против 53,8±10,9 мкмоль/л, р=0,55) Доказана ассоциация уровня NO с профилем имеющихся у пациента факторов кардиова-скулярного риска Содержание NO в плазме было достоверно выше у некурящих пациентов как по сравнению с курящими больными (65,8±19,3 против 51,6±19,3, /?=0,003), так и с контрольной группой (65,8±19,3 против 53,8±10,9 мкмоль/л, р=0,015) Установлено достоверное снижение уровня NO в группе пациентов с 4 и более факторами риска по сравнению с больными, имеющими 0-3 фактора (53,1±18,9 против 63,9±18,8 мкмоль/л, ¿>=0,02)

Результаты анализа плазменного содержания нитрата у носителей различных вариантов генов ACE, NOS3 и EDN1 представлены в таблице 1 Выявлена связь концентрации NO и генотипа АСЕ уровень нитрата был максимальным при I/I варианте и снижался при наличии аллеля D, становясь минимальным у гомозигот D/D Ассоциации полиморфных маркеров Glu298Asp и Lysl98Asn с уровнем NO у больных ИБС обнаружено не было

Таблица 1

Содержание нитрата в плазме крови больных ИБС в зависимости от генотипов генов АСЕ, N083, ЕРШ_

№ Генотип Средняя концентрация нитрата, мкмоль/л Достоверность (критерий X2)

1 ///(п=14) 63,5±15,3 Р,.у=0,02

2 I/D (п=36) 58,5±19,9 Pi-f*0,4

3 D/D (п=18) 51,4±14,1 Р2-3=0,1В

4 Asp/Asp, Asp/Glu (n=39) 57,5±21,5 P4-s=0,95

5 Glu/Glu (n=29) 57,8±19,1

6 Lys/Lys (n=35) 56,5±21,2

7 Lys/Asn, Asn/Asn (n=33) 58,7±19,1 Рб-т=0,69

По данным проспективного наблюдения установлено, что уровень N0 после ОКС взаимосвязан прогнозом у пациентов с ИБС, достигших на протяжении года конечных точек, данный показатель был достоверно ниже (53,1±19,5 мкмоль/л), чем при стабильном течении заболевания (63,03±19,2 мкмоль/л, /з=0,04)

Уровень эндотелина-1 в плазме крови больных ИБС не отличался от нормы (р=0,52) и варьировал в широком диапазоне значений (от 0,03 до 2,9 фмоль/мл), характер его распределения не соответствовал нормальному, в связи с чем при проведении статистического анализа были выделены группы с пониженной (менее 0,36 фмоль/мл, п=33), нормальной (0,36-0,6 фмоль/мл, п=14) и повышенной (более 0,6 фмоль/мл, п=12) концентрацией ЕТ-1 Уровень ЕТ-1 оказался ассоциированным с вариантом ОКС большинство больных с НС имели пониженную концентрацию пептида (81% против 36% при ОИМ, р=0,002), тогда как для пациентов с ОИМ более характерными были нормальные (36% против 8% при НС, р=0,02) или повышенные показатели

(28% против 11% при НС,/>=0,24) На концентрацию ЕТ-1 оказывал влияние генотип EDN1 ' Так, установлено, что 84% больных с Lys/Lys вариантом гена EDN-J имели пониженный уровень ЕТ-1 Среди носителей аллеля Asn больные с пониженной плазменной концентрацией ЕТ-1 встречались значительно реже (40%,/7=0,001), а с нормальной и повышенной - чаще, чем при генотипе Lys/Lys (р=0,02 и />=0,06 соответственно) При сравнении количества пациентов, достигших конечных точек, в группах с пониженным, нормальным и повышенным уровнем ЕТ-1 установлено, что неблагоприятные исходы наступили примерно у половины больных во всех трех группах Таким образом, ассоциации между содержанием ЕТ-1 и прогнозом течения ИБС в течение 12 месяцев выявлено не было

Анализ влияния клинико-анамнестических характеристик и факторов риска на прогноз в течение 12 месяцев после перенесенного ОКС показал, что группа больных с благоприятным прогнозом не отличалась по полу, возрасту, варианту ОКС, наличию отягощенного по сердечно-сосудистым заболеваниям семейного анамнеза от лиц, достигших конечных точек Частота наступления неблагоприятных исходов была достоверно выше в случаях ассоциации ИБС с артериальной гипертензией гипертонической болезнью страдали 84% больных, достигнувших конечных точек, и лишь 64% пациентов с благоприятным прогнозом (/>=0,04) Достоверным предиктором неблагоприятного течения коронарной болезни на протяжении года после перенесённого острого коронарного синдрома явилось снижение фракции выброса левого желудочка у пациентов, достигших конечных точек, данный показатель был достоверно ниже, чем у пациентов с благоприятным течением ИБС (47,7±11,5 против 52,6±7,2%, /7=0,04) С частыми периодами дестабилизации коронарной патологии были ассоциированы отягощенность семейного анамнеза (р-0,04), артериальная гипертензия (/7=0,007), а также сочетание 4 и более факторов кардиоваскулярного риска (р=0,04)

Таким образом, среди больных, достигнувших на протяжении 1 года после ОКС конечных точек, преобладали пациенты, страдающие артериальной гипертензией, имеющие низкую фракцию выброса левого желудочка, сниженный плазменный уровень оксида азота и D/D вариант гена АСЕ

При помощи многомерного нелинейного регрессионного анализа была построена экспоненциальная математическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность наступления неблагоприятного исхода на основании выделенных признаков Структура модели включает коэффициенты регрессии, оценку их значимости, уравнение прогноза и уровень значимости модели

В таблице 2 представлены рассчитанные регрессионные коэффициенты (Ь) для каждого из оцениваемых факторов

Таблица 2

Коэффициенты регрессии для факторов, определяющих прогноз после ОКС

Прогностический фактор Регрессионный коэффициент Ъ Р

Артериальная гипертензия 2,413 0,017*

Фракция выброса ЛЖ -0,123 0,027*

Уровень NO -0,066 0,007**

D/D вариант гена АСЕ 3,13 0,002**

* -р < 0,05, ** -р < 0,01 (по критерию Вальдовского)

Константа уравнения прогноза - Ь0 равна 7,218 Вероятность (Р) наступления неблагоприятного исхода для конкретного пациента может быть рассчитана по следующей формуле

Р=1/(1+ег),

где е - математическая константа, равная 2,72, а z = 7,218 + 2,41 ЗхАГ* - 0,123*ФВ(%) - 0,066 хМ?(мкмоль/л) + 3,13хЯС£**

Примечания

* - при наличии АГ в формулу подставляется 1, при отсутствии - 0 ** - при D/D варианте гена АСЕ в формулу подставляется 1, при I/I и I/D вариантах - 0

После расчета Р полученный показатель умножается на 100 и выражается в процентах риска неблагоприятного исхода у конкретного больного

Уровень статистической значимости для модели в целом составил <0,01

ВЫВОДЫ:

1 Генотип D/D полиморфного маркёра I/D гена ангиотензин превращающего фермента ассоциирован с ранней дестабилизацией ишемической болезни сердца и сравнительно низким уровнем оксида азота в плазме крови

2. Наличие у пациентов с ишемической болезнью сердца аллеля Asp маркёра Glu298Asp гена эндотелиальной синтетазы оксида азота ассоциировано с более выраженным, чем при генотипе Glu/Glu, нарушением систолической функции левого желудочка Взаимосвязи полиморфизма гена NOS3 с течением заболевания после острого коронарного синдрома и с прогнозом не выявлено

3 Больные с вариантом Lys/Lys гена эндотелина-1 чаще имеют избыточную массу тела, а носители аллеля Asn - сравнительно более высокий, чем у пациентов гомозиготных по аллелю Lys, уровень эндотелина-1 в плазме крови Не установлено влияние маркёра Lysl98Asn гена эндотелина-1 на прогноз у пациентов с ИБС после острого коронарного синдрома

4. Содержание нитрата - активного продукта синтетазы оксида азота и эндотелина-1 в плазме крови больных, перенесших острый коронарный синдром, после стабилизации состояния не отличается от нормы Уровень эндотелина-1 снижен у пациентов после эпизода нестабильной стенокардии и увеличен либо нормальный после острого инфаркта миокарда Показатель NO не зависит от варианта ОКС, но характеризуется снижением при наличии 4 и более факторов риска и у больных, достигших в течение 1 года конечных точек

5. У больных ИБС с генотипом D/D гена АСЕ в течение 1 года после ОКС более часто наблюдается обострение заболевания (достижение конечных точек) в виде нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда или сердечной смерти У больных гомо- и гетерозиготных по аллелю D наблюдается

большее количество эпизодов дестабилизации и сравнительно более низкая выживаемость Пациентам с генотипом 1/1 свойственны стабильное течение болезни и более высокая выживаемость в течение года

6 Генотип D/D гена ангиотензин превращающего фермента и уровень оксида азота, наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса левого желудочка, рассматриваются как независимые предикторы неблагоприятных коронарных событий в течение 1 года после острого коронарного синдрома

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1 Выполнять типирование полиморфных маркеров Glu298Asp гена синте-тазы оксида азота и I/D гена ангиотензин превращающего фермента при первом выявлении ИБС с целью выделения больных, предрасположенных к раннему развитию острого коронарного синдрома (гомозиготы по аллелю D) и прогрессированию систоли-ческой дисфункции левого желудочка (аллель Asp)

2 Определять концентрацию N0 в плазме крови и вариант генотипа полиморфного I/D маркера гена АСЕ у больных, перенёсших ОКС, для выделения групп повышенного риска неблагоприятного течения ИБС, ассоциированных с генотипом D/D и сниженным плазменным уровнем NO

3 Использовать клинико-генетическую математическую модель для индивидуализации подхода к оценке прогноза после перенесённого ОКС и, соответственно, для выработки оптимальной тактики лечения на постстационарном этапе.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Полиморфизм гена эндотелина-1 у больных ишемической болезнью сердца // Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им И И.Мечникова -2007.-№1(8) -С 78-81 (соавт Ягода А В, Боева О И.)

2. Полиморфизм гена эндотелиальной синтетазы оксида азота у больных ишемической болезнью сердца // Вестник Санкт-Петербургской государ-

ственной медицинской академии им И И Мечникова Приложение - 2007 -№2(2) - С 22 (соавт Боева О И , Ягода А В )

3 Прогностическая ценность полиморфизма генов ангиотензин превращающего фермента, эндотелина-1 и синтетазы оксида азота при ИБС // Материалы Российского национального конгресса кардиологов — Кардиова-скулярная терапия и профилактика Приложение 1 - 2007 - №6(5) - С 351 (соавт Боева О И, Ягода А В )

4 Полиморфизм гена ангиотензин превращающего фермента у больных ишемической болезнью сердца - жителей Ставропольского края // Материалы VI съезда кардиологов Южного Федерального округа - Ростов-на-Дону, 2007 - С 265-266 (соавт Боева О И, Ягода А В )

5 Анализ полиморфизма некоторых генов - кандидатов при ишемической болезни сердца // Фундаментальные исследования в биологии и медицине Сборник научных трудов - Ставрополь, 2007 - С 254-257 (соавт Боева О И, Ягода А В , Еременко Е И, Цыганкова О И , Цыганкова Е А )

6 Полиморфизм генов ангиотензин-превращающего фермента и эндотелина-1 у больных ишемической болезнью сердца - жителей Ставропольского края // Материалы XV итоговой (межрегиональной) научной конференции студентов и молодых учёных - Ставрополь, 2007 - С 484-485

7 Уровень оксида азота в плазме больных ишемической болезнью сердца // Материалы XV итоговой (межрегиональной) научной конференции студентов и молодых ученых - Ставрополь, 2007 - С 485-486 (соавт Терен-тьева И В , Ромашкина Т В , Минасова Е Н, Веденева ЕВ)

8 Возможности прогнозирования неблагоприятного исхода у больных, перенесших острый коронарный синдром // Медицинский вестник Северного Кавказа -2007 -№3 - С 19-23 (соавт БоеваОИ)

ЩЕГЛОВА Елена Витальевна

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЛР № 020326 от 20 января 1997 г.

Сдано в набор 27 02 08 Подписано в печать 27 02 08 Формат 60x84 '/16 Бумага типогр №2 Печать офсетная Гарнитура офсетная Уел печ 1,0 Уч-изд л 1,2 Заказ 1951 Тираж 100 экз

Ставропольская государственная медицинская академия, 355017, г. Ставрополь, ул. Мира, 310.

Актуальность исследования

В большинстве экономически развитых стран ишемическая болезнь сердца (ИБС) занимает одно из ведущих мест по распространённости среди населения и частоте летальных исходов. Характерной чертой данной патологии является волнообразный характер течения, когда периоды относительной стабильности сменяются эпизодами обострения с развитием острого коронарного синдрома (ОКС) [8]. Больные, перенёсшие ОКС, даже после стабилизации состояния имеют повышенный риск неблагоприятного исхода. Так, летальный исход или нефатальный инфаркт миокарда (ИМ) за 1 год регистрируются у 4-5% больных стабильной стенокардией, тогда как в течение года после ОКС подобные коронарные события возникают в 3 раза чаще, по разным данным — в 14-15% случаев. В связи с этим выявление предикторов неблагоприятного исхода в группе пациентов с нестабильным течением ИБС является одной из актуальных проблем современной кардиологии [56].

Одним из перспективных подходов для выделения групп повышенного риска развития летального исхода и нефатального инфаркта миокарда, прогнозирования характера течения патологического процесса и развития осложнений, а также выбора терапии является анализ полиморфизма генов-кандидатов [61]. Генетические характеристики не изменяются в течение всей жизни, их можно отнести к немодифицируемым факторам риска. Вместе с тем влияние генотипа на возникновение и течение патологического процесса осуществляется при его аддитивном взаимодействии с факторами внешней среды. Более активное воздействие на модифицируемые причины прогрессирования ИБС у лиц, имеющих генетическую предрасположенность к тяжёлому течению заболевания, может воспрепятствовать реализации неблагоприятных генетических факторов. Поэтому выявление генов, ответственных за прогрессирование коронарной патологии, несомненно, представляет научный и клинический интерес.

Ведущее место в патогенезе ОКС отводится нарушению функции сосудистого эндотелия [108, 198]. При эндотелиальной дисфункции нарушается выработка практически всех синтезируемых эндотелием субстанций, в том числе и таких регуляторов сосудистого тонуса, как оксид азота (NO), эндотелии-1 (ЕТ-1), ангиотензин превращающий фермент (АПФ). Дисфункция эндотелия может иметь генетическую основу. Выявление ассоциативных связей полиморфных маркеров генов, кодирующих вещества - регуляторы сосудистого тонуса, с содержанием их активных продуктов в плазме крови и факторами риска развития и неблагоприятного течения ИБС позволит прояснить некоторые патогенетические аспекты возникновения и прогрессирования данной патологии.

Цель исследования

Определение клинической и прогностической значимости полиморфизма генов ангиотензин превращающего фермента (АСЕ), эндотелина-1 (EDN1), эндотелиальной синтетазы оксида азота (NOS3), а также биохимических маркёров эндотелиальной функции - оксида азота и эндотелина-1 у больных ИБС после перенесённого острого коронарного синдрома.

Задачи исследования:

1. Выявить изменчивость генов-кандидатов, связанных с развитием эндотелиальной дисфункции: полиморфизм I/D гена ангиотензин-конвертирующего фермента, полиморфизм Glu298Asp гена МЗ-синтетазы, полиморфизм Lys298Asn гена эндотелина-1 у больных, перенёсших ОКС.

2. Определить статус эндотелиальных механизмов регуляции сосудистого тонуса путём оценки концентрации в плазме крови эндотелина-1 и оксида азота.

3. Оценить взаимосвязь генотипа с клинико-анамнестическими характеристиками пациентов, плазменным содержанием оксида азота и эндотелина-1.

4. Провести оценку влияния изучаемых показателей на клиническое течение ИБС в течение 12 месяцев после эпизода обострения.

5. Выделить предикторы прогрессировать ИБС и обосновать возможность их практического использования с целью выявления пациентов с высоким риском сердечно-сосудистых событий.

Научная новизна работы

Определение генотипов ACE, NOS3, EDN1 у больных ИБС позволило впервые оценить распространённость различных аллелей изучаемых генов среди пациентов Ставропольского края. Впервые были выявлены ассоциации изучаемых полиморфных маркёров с особенностями течения ИБС: D/D вариант гена АСЕ ассоциировался с развитием ОКС у более молодых пациентов, с ранней дестабилизацией процесса, аллель Asp гена NOS3 обнаружил связь с выраженным нарушением систолической функции левого желудочка, Lys/Lys вариант гена EDN1 был взаимосвязан с таким фактором кардиоваскулярного риска, как избыточная масса тела. Впервые были полученыг данные о взаимосвязи полиморфизма I/D гена АСЕ - генотипа D/D с уровнем оксида азота в плазме крови у больных, перенёсших ОКС. Впервые установлена зависимость плазменного содержания эндотелина-1 от генотипа EDN1 и варианта ОКС и взаимосвязь уровня оксида азота с количеством факторов риска и частотой достижения конечных точек в течение 1 года после острого коронарного синдрома. Впервые изучено распределение генотипов полиморфных маркеров генов ACE, NOS3, EDN1 и плазменный уровень регуляторов сосудистого тонуса у пациентов с различными исходами в течение 12 месяцев после ОКС. Впервые показана ассоциация аллеля D и D/D генотипа гена АСЕ и низкого плазменного уровня оксида азота наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса левого желудочка с неблагоприятным прогнозом у больных ИБС - частыми эпизодами дестабилизации и низкой выживаемостью. По итогам исследования создана математическая модель, позволяющая прогнозировать вероятность наступления неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после ОКС.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Связь, полиморфного маркёра Glu298Asp гена NOS3 и Lysl98Asn гена EDN1 с некоторыми клиническими характеристиками и факторами риска ИБС.

2. Ассоциация уровня эндотелина-1 с тяжестью обострения ИБС и связь содержания оксида азота в плазме крови с количеством факторов риска и течением ИБС после перенесённого ОКС.

3. Влияние генетических факторов на плазменное содержание оксида азота и эндотелина-1 у больных ИБС.

4. Ассоциация полиморфного маркёра //О гена АСЕ с характером течения ИБС и риском неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после ОКС.

5. Математическая модель прогнозирования вероятности неблагоприятного исхода ИБС в течение 1 года после ОКС на основе комплекса независимых предикторов.

Научно-практическая значимость работы

Установленный факт взаимосвязи генетического маркёра^ СЕ с низким уровнем, оксида азота и ранней дестабилизацией ИБС позволяет на начальных стадиях заболевания выявить пациентов, предрасположенных к развитию ОКС. Обнаружение аллеля Asp маркёра Ghi298Asp гена эндотелиальной синтетазы оксида азота может указывать на возможность формирования дисфункции левого желудочка у больных ИБС. Выявленные ассоциации гомо- и гетерозиготности по аллелю D гена АСЕ и низкого уровня NO в плазме у больных после ОКС, с одной стороны, и высокой частоты дестабилизации ИБС в виде нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда и сравнительно более низкой выживаемости, с другой, дают возможность использовать эти показатели для прогнозирования течения заболевания на протяжении ближайшего года. Предложенная математическая модель оценки прогноза после перенесённого ОКС, включающая, наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса ЛЖ, генотип D/D гена АСЕ и уровень NO, может применяться на стационарном и постстационарном этапах для выработки оптимальной тактики лечения.

11

ВЫВОДЫ

1. Генотип D/D полиморфного маркёра I/D гена ангиотензин превращающего фермента ассоциирован с ранней дестабилизацией ишемической болезни сердца и сравнительно низким уровнем оксида азота в плазме крови.

2. Наличие у пациентов с ишемической болезнью сердца аллеля Asp маркёра Ghi298Asp гена эндотелиальной синтетазы оксида азота ассоциировано с более выраженным, чем при генотипе Glu/Glu, нарушением систолической функции левого желудочка. Взаимосвязи гена NOS3 с течением заболевания после острого коронарного синдрома и с прогнозом не выявлено.

3. Больные с вариантом Lys/Lys гена эндотелина-1 чаще имеют избыточную массу тела, а носители аллеля Asn — сравнительно более высокий, чем у пациентов гомозиготных по аллелю Lys, уровень, эндотелина-1 в плазме крови. Не установлено влияние маркёра Lysl98Asn гена эндотелина-1 на прогноз у пациентов с ИБС после острого коронарного синдрома.

4. Содержание нитрата - активного продукта синтетазы оксида азота и эндотелина-1 в плазме крови больных, перенесших острый коронарный синдром, после стабилизации состояния не отличается от нормы. Уровень эндотелина-1 снижен у пациентов после эпизода нестабильнее стенокардии и увеличен либо нормальный после острого инфаркта миокарда. Показатель NO не зависит от варианта ОКС, но характеризуется снижением при наличии 4 и более факторов риска и у больных, достигших в течение 1 года конечных точек.

5. У больных ИБС с генотипом D/D гена АСЕ в течение 1 года после ОКС более часто наблюдается обострение заболевания (достижение конечных точек) в виде нестабильной стенокардии, инфаркта миокарда или сердечной смерти. У больных гомо- и гетерозиготных по аллелю D наблюдается большее количество эпизодов дестабилизации и сравнительно более низкая выживаемость: Пациентам с генотипом I/I

119 „ свойственны стабильное течение болезни и более высокая выживаемость в течение года.

6. Генотип D/D гена ангиотензин превращающего фермента и уровень оксида азота, наряду с артериальной гипертензией и сниженной фракцией выброса левого желудочка, рассматриваются как независимые предикторы неблагоприятных коронарных событий в течение 1 года после острого коронарного синдрома.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выполнять типирование полиморфных маркёров Glu298Asp гена синтетазы оксида азота и I/D гена ангиотензин превращающего фермента при первом выявлении ИБС с целью выделения больных, предрасположенных к раннему развитию острого коронарного синдрома (гомозиготы по аллелю D) и прогрессированию систолической дисфункции левого желудочка (аллель Asp).

2. Определять концентрацию N0 в плазме крови и вариант генотипа полиморфного I/D маркёра гена АСЕ у больных, перенёсших ОКС, для выделения групп повышенного риска неблагоприятного течения ИБС, ассоциированных с генотипом D/D и сниженным плазменным уровнем NO.

3. Использовать клинико-генетическую математическую модель для индивидуализации подхода к оценке прогноза после перенесённого ОКС и, соответственно, для выработки оптимальной тактики лечения на постстационарном этапе.