Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Клиническое и прогностическое значение оксида азота при воспалительных заболеваниях кишечника (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи J

БАРЫШНИКОВ Евгений Николаевич

Клиническое и прогностическое значение оксида азота у больных воспалительными заболеваниями кишечника (клинико-экспериментальное исследование).

14 00 05 - внутренние болезни 14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степепи кандидата медицинских наук

□ Ü3 1G4706

Москва 2008 г.

003164706

Работа выполнена в Центральном научно-исследовательском институте гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г Москвы (директор - доктор медицинских наук, профессор Л Б Лазебник)

Научные руководители

Доктор медицинских наук, профессор В Н Дроздов

Доктор медицинских наук ИЕ Трубицына Официальные оппоненты

Доктор медицинских наук, профессор Е А Белоусова

Доктор медицинских наук, профессор Г А Дроздова

Ведущая организация1 Российский государственный медицинский университет

Защита состоится «ДЛ- » JX&plM/L_2008г в ^ ч. на заседании

диссертационного совета Д 850 002 01 Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии по адресу 111123, г Москва, ул Шоссе Энтузиастов, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии

Автореферат разослан » февраля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета*^

доктор медицинских наук, профессор К\ И А Комиссаренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В 1998 г была присуждена Нобелевская премия авторам, открывшим молекулу оксида азота (NO) Robert F Furchgott, Louis J Ignarro, Fend Murad Первоначально молекула рассматривалась как мессенджер сердечно-сосудистой системы Именно по этой причине большая часть последующих клинических исследований (работы Лазебника JIБ , 1998) была сосредоточена на изучении роли N0 в формировании эндотелиальной дисфункции

Со временем было показан универсальный характер молекулы, т е участие в физиологических процессах практически во всех тканях и органах В этой связи N0 привлек к себе внимание ученых разных медицинских специальностей В ряду научных исследований выделяются те, цель которых - установить роль N0 в патогенезе заболеваний желудочно-кишечного тракта Развитие данного направления научного поиска было поддержано разработкой специфических методов определения N0 Поскольку молекула является нестойким соединением и существует лишь считанные секунды, практически все методы по своей сути основаны на косвенной оценке Прорывом для клиницистов стало то, что был разработан простой и доступный метод определения стабильных метаболитов NO в сыворотке крови и моче (нитрита и нитрата) ( Wennmolm et al, 1992)

Было показано, что ряд заболеваний и патологических состояний желудочно-кишечного тракта сопровождается недостатком продукции N0 ахалазия кар-дии ([Mearin et al, 1993, Sivarao et al, 2001, Gelfond et al, 1982), функциональная диспепсия {Gil]a et al, 1997, Kuiken et al, 2002), медленно транзитный запор (Tomita et al, 2002), болезнь Гиршпрунга (Vanderwinden et al, 1993, 0"Kélly et al, 1994) хроническая анальная трещина (O'Kelly et al, 1993) A такие заболевания и патологические состояния, как целиакия (Sundqvist et al, 1998, van Straaten et al, 1999, Murray et al, 2003), коллагеновый колит (Perner et al, 2001), токсический гепатит (Sass et al, 2001, Koerber et al, 2002, Bourdi et al, 2002, Jaeschke et al, 2002), язвенный колит (ЯК) (Rachmilewitz et al, 1998, Vento et al, 2001, Goggins et al, 2001, Ljung et al, 2002), болезнь Крона (БК) (Oudkerk et al, 1995, Коек et al, 2002, Ljung et al, 2001) сопровождаются напротив повышением продукции NO

В ряду перечисленных патологических состояний воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) выделяются в силу нарастающей распространенности, сохраняющейся высокой частоты хирургических вмешательств, и, следовательно, серьезной медико-социальной значимости Проведенные клинические и экспериментальные исследования позволяют уверенно констатировать вовлеченность NO при воспалении кишечника Однако результаты исследований, особенно экспериментальных, зачастую неоднозначны Так, для уточнения роли N0 в патогенезе ВЗК проведено значительное число экспериментальных исследований с применением препаратов-ингибиторов продукции NO в одних показано смягчение экспериментального колита (Menchen et al, 2001, Yamaguchi et al, 2001, Yue et al, 2001), в других, напротив утяжеление (Yoshida Y, 2000, Armstrong AM, 2000)

Вызывает определенный оптимизм появившиеся сведения о прогностическом значении определения N0 у больных ВЗК (Rees DC, 1995) Показано, что высокий уровень NO опасен из-за развития токсической дилатации (Mourelle М, 1995) Однако четких критериев, которые позволили бы предположить бесперспективность гормональной терапии тяжелых форм ВЗК, еще до развития выраженных метаболических нарушений не разработано

Таким образом, истинная роль N0 при ВЗК до конца не определена Особое практическое значение в связи с сохраняющейся высокой частотой оперативных вмешательств, проводимых у больных ВЗК на фоне тяжелых метаболических нарушений, представляет диагностическое и прогностическое значение определения N0 с помощью простых и доступных методик

Цель исследования:

Повышение точности диагностики и эффективности лечения воспалительных заболеваний кишечника, за счет включения в программу обследования больных язвенным колитом и болезнью Крона метода определения сывороточного уровня оксида азота Задачи исследования:

1 Установить клинико-диагностическое значение уровня оксида азота для оценки активности и тяжести течения язвенного колита и болезни Крона

2 Выявить взаимосвязь продукции оксида азота и клинических, клинико-лабораторных симптомов язвенного колита и болезни Крона

3 Установить взаимосвязь продукции N0 и уровня провоспалительного цитокина ФНО-а

4. Установить влияние уровня оксида азота на эффективность лечения язвенного колита и болезни Крона

5 Определить продукцию оксида азота при экспериментальном колите у крыс

6 Исследовать влияние блокады синтеза оксида азота на течение экспериментального колита у крыс

Научная новизна:

Впервые в РФ проведено исследование продукции N0 у больных воспалительными заболеваниями кишечника Установлена взаимосвязь уровня N0 в крови с эндоскопическим и клиническим индексами активности заболевания, рутинными показателями активного воспаления, уровнем ФНО-а при язвенном колите и болезни Крона

Установлено прогностическое значение определения N0 в крови для оценки эффективности глюкокортикостероидной терапии и риска развития гормональной резистентности при язвенном колите

В экспериментальном исследовании доказана роль N0 в патогенезе воспалительных изменений в стенке кишечника

Установлено положительное влияние ингибиторов >Ю-синтазы на течение экспериментального колита у крыс (на двух разных моделях)

Практическая значимость:

Предложен новый критерий активности воспаления при воспалительных заболеваниях кишечника Предложен критерий эффективности противовоспалительного лечения больных воспалительными заболеваниями кишечника на основании изменения уровня N0

С вероятностными характеристиками сформулированы четкие критерии прогноза развития гормональной резистентности у больных язвенным колитом, на основании которых возможно раннее планирование базисного лечения (продолжение

5

лечения глюкокортикостероидами либо дополнительное назначение «резервных» иммунодепрессантов для того, чтобы избежать колэктомии) Апробация работы

Результаты исследования опубликованы в 5 печатных работах и доложены на XXVIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ, IX Международном Славяно-Балтийском форуме в г Санкт-Петербург, на European Bridging Meeting 2007 and EAGE Postgraduate Course в г Магдебург, Германия

Апробация работы проведена на заседании Ученого совета Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии Объем и структура работы

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, состоит из введения, 5 глав, в которых представлен обзор литературы, сведения о больных и методы исследования, результаты проведенных исследований и обсуждение полученного материала, выводов, практических рекомендаций и список литературы Работа иллюстрирована таблицей и рисунками Библиографический указатель включает 224 работы, из них на русском языке 12 источников и 212 работ на английском языке

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клиническая часть исследования Для решения поставленных задач было обследовано 88 больных обоего пола с воспалительными заболеваниями кишечника (язвенным колитом и болезнью Крона) в возрасте от 16 до 80 лет, находившихся на стационарном лечении в отделении патологии кишечника ЦНИИ гастроэнтерологии с 2005 по 2007 г

Больные включались в исследование независимо от длительности, тяжести, распространенности и активности заболевания

В соответствии с классификационно-клиническими критериями все больные были разделены на следующие группы по распространенности, тяжести, активности заболевания

У больных Ж тотальное поражение встречалось у 37 (59,7%), левосторонняя локализация процесса наблюдалась у 9 (14,5%), дистальное поражение у 16 (25,8%) больных У 50 больных заболевание имело хроническое течение с че-

редованием обострений и ремиссий (рецидивирующий тип - 42 (67,7%)) или протекало непрерывно (8 (12,9%) больных) В группе было 12 (19,4%) больных с первой атакой язвенного колита Для оценки степени тяжести атаки использовались критерии Truelove&Witts (1955), больные распределились следующим образом 21 больной (33,9%)- с атакой легкой степени тяжести, 33 больных (53,2%) - средне-тяжелая атака, 8 больных (12,9%) - тяжелая атака Клиническую и эндоскопическую активность заболевания оценивали с помощью специального индекса (CAI и El), введенного Rachmilewitz (1989) По распространенности процесса больные БК распределились следующим образом у 15 (57,7%) больных имелся колит, у 4 (15,4%) - илеит, у 7 (26,9%) -илеоколит Для оценки степени тяжести больных БК нами был использован общепринятый в мире индекс активности Best, позволяющий нивелировать неоднородность больных, сгруппировать их по тяжести В исследование было включено 11 больных (42,3%) с нетяжелой атакой, и 15 больных (57,7%) с тяжелой атакой БК

Соответственно задачам исследования всем больным воспалительными заболеваниями кишечника проводилось клиническое обследование больных, общелабораторное обследование; ректороманоскопия, колоноскопия с посегментарной оценкой активности воспаления, специальные лабораторные методы исследования, включающие исследование содержания метаболитов N0 (нитрита/нитрата) по методу Голикова с использованием реактива Грисса с последующей спектрофотометрией, исследование содержания ФНО-а в сыворотке крови методом ИФА За верхнюю границу нормы сывороточного уровня N0 было принято значение 40,5 мкмоль/л (Голиков П П , 2004)

Экспериментальная часть исследования Опыты проводили на белых крыс, обоего пола, весом 180-220 г Было выполнено две серии исследований В первой использована модель DSS-колита, во второй — модель PG-PS-энтероколита В качестве ингибитора синтазы оксида азота использовали 1%-ный водный раствор метиленового синего (MC), который вводился внутрибрюшинно

Первая серия исследования I опытная группа (п=10) - крысы с DSS-колитом II опытная группа (п=10) с DSS-колитом + MC, III (п=5) и IV (n=5) -

контрольные группы Животных забивали после 7 дней наблюдения Вторая серия исследования I опытная группа (п=10) с РО-Р8-энтероколитом П опытная группа (п=10) с РО-РБ-энтероколитом + МС Группа контроля (п=5) Животных забивали через 72 часа наблюдения

После забоя у животных проводили забор крови для лабораторных исследований (уровня N0) Слизистая толстой кишки каждого животного осматривалась Производился забор образцов для исследования содержания цитруллина (методом высокоэффективной жидкостной хроматографии) и гистологического исследования Используя систему баллов, рассчитывали индекс повреждения (ИП), отдельно макро- и микроскопический (гистологический)

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики Достоверность различий средних величин сравниваемых показателей оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа для множественных сравнений, сравнение двух величин с помощью критерия Стьюдента Применялся дисперсионный анализ повторных измерений, парный критерий Стьюдента, критерий ъ и точный критерий Фишера для оценки достоверности различий качественных признаков Проводился корреляционный анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показало изучение уровня стабильных метаболитов N0 в сыворотке крови больных ЯК, продукция N0 у них повышена по сравнению с нормой Средний уровень N0 у больных ЯК оказался равным 42,7 ± 2,7 мкмоль/л, что достоверно (р<0 05) выше нормы (по Голикову) (29,2 ± 1,9 мкмоль/л, п=35) Это соответствует литературным данным - изучение продукции N0 различными методами у больных ЯК неизменно показывает ее нарастание Однако у наших больных повышенный уровень N0 определялся не у всех это зависело от тяжести атаки

В группе больных, госпитализированных по поводу атаки легкой степени тяжести, было только 7 (33,3±10,3%) больных, имеющих повышенный уровень

N0 Далее по мере нарастания тяжести заболевания доля больных с повышенным уровнем N0 увеличивалась Так, в группе больных ЯК со средне-тяжелой атакой доля таких больных составила уже 48,5±8,7% (16 больных), тогда как группу госпитализированных с тяжелой атакой составили только больные с повышенной продукцией N0 (100%) При этом разница долей между первой (легкая атака) и второй (среднетяжелая атака) группами оказалась статистически не достоверной (р=0,41), а при сравнении третьей (тяжелая атака) группы с двумя остальными были выявлена статистически значимая разница между группами 3 и 2 - р = 0,024, группами 3 и 1 - р=0,005

Средний уровень N0 у больных БК достоверно не отличался от такого у больных ЯК, то есть также оказался выше нормы и составил 41,4 ± 2,6 мкмоль/л (различие статистически достоверно - р<0 05) Доля больных с повышенным уровнем N0 различалась в зависимости от тяжести атаки В группе больных с нетяжелой атакой БК оказалось 4 (33,3±13,6%) больных с повышенным уровнем N0, тогда как в группе с тяжелой атакой таких больных оказалось уже 57,1±13,2% (8 человек) Однако разница долей оказалась недостоверной (р=0 41)

Уровень N0 оказался достоверно выше у больных с тотальным поражением толстой кишки - 48,7±3,5 мкмоль/л, чем у больных левосторонним (29,9±4,3 мкмоль/л) и дистальным поражением (27,7±2,8 мкмоль/л) (таблица 1)

Уровень N0 оказался достоверно выше (66,3± 11,3 мкмоль/л) в группе больных, госпитализированных по поводу тяжелой атаки язвенного колита, чем в группах больных, госпитализированных по поводу средне-тяжелой (40,8±3,1 мкмоль/л) и легкой атаки (31,4±3,1 мкмоль/л) (таблица 1)

Для оценки степени зависимости уровня N0 от протяженности поражения толстой кишки и тяжести атаки у больных ЯК вычислялся коэффициент ранговой корреляции Спирмена Соответственно протяженности поражения -от дистального до тотального, и тяжести атаки — от легкой до тяжелой, присваивался ранг - от 1 до 3 Отмечалась корреляционная зависимость между протяженностью поражения толстой кишки и уровнем продукции N0 с коэффициентом гу= 0,57 (р<0 05), между тяжестью атаки и уровнем продукции N0 - с коэффициентом г5= 0,53 (р<0 05)

Важным, с нашей точки зрения, является наличие взаимосвязи продукции N0 с эндоскопическим индексом активности, который рассчитывался нами отдельно по 6 сегментам с последующим суммированием Достоверная разница имелась между группой больных, активность воспаления у которых соответствовала суммарному индексу меньше или равному 20 (31,6±2,1 мкмоль/л), и группами больных с эндоскопическим индексом активности от 20 до 40 баллов (52,9±4,7 мкмоль/л), и от 40 до 60 баллов (64,7±7,5 мкмоль/л) Методом ранговой корреляции, где каждой из групп был присвоен соответствующий степени активности ранг от 1 до 3 балла, выявлена сильная корреляционная зависимость - с коэффициентом г5=0,71 (р<0 05) Был проведен корреляционный анализ взаимосвязи продукции N0 с клиническим индексом и основными лабораторными показателями, позволяющими судить об активности Ж Продукция N0 достоверно взаимосвязана с клиническим индексом активности язвенного колита, рассчитанного по шкале КасЬгш1е\У11г (г=0 55), уровнем лейкоцитоза периферической крови (г=0 46), количеством палочкоядерных лейкоцитов в лейкоцитарной формуле (г=0 63), количеством тромбоцитов периферической крови (г=0 52) Имелась достоверная и сильная взаимосвязь между уровнем N0 и острофазовыми показателями СРБ (г=0 55), фибриногеном (г=0 8), величиной СОЭ (г=0 43), а также провоспалительным цитокином ФНО-а (г=0 87) Выявлена обратная корреляционная зависимость между продукцией N0 и содержанием гемоглобина, общего белка, и альбумина Очевидно, что в данном случае речь может идти не о корреляционной зависимости, а о корреляционном взаимоотношении Если рассматривать связь этих показателей попарно с показателем продукции N0, то между ними в каждой из пар, присутствует связующий фактор - активность заболевания Высокая активность язвенного колита ассоциируется с высокой продукцией N0, а также с более тяжелой анемией (а, следовательно, с низким уровнем гемоглобина) и более тяжелыми метаболическими нарушениями (а, следовательно, с низким уровнем альбумина и протеина)

Таблица 1.

Содержание стабильных метаболитов N0 в сыворотке крови у больных язвенным колитом в зависимости от протяженности поражения толстой кишки, тяжести атаки и активности воспаления в толстой кишке.

Категории больных Уровень NO, М ± m, мкмоль/л

Дистальное поражение (п = 16) 27,7±2,8

Левостороннее поражение (п = 9) 29,9±4,3

Тотальное поражение (п = 37) 48,7±3,5*

Легкая атака (п=21) 31,4±3,1

Средне-тяжелая атака (п=33) 40,8±3,1

Тяжелая атака (п=8) 66,3±11,3**

Невысокая активность воспаления (сумм энд индекс до 20) (п=37) 31,6±2,1***

Средняя активность воспаления (сумм энд индекс более 20, но менее 40) (п=14) 52,9±4,7

Высокая активность воспаления (сумм энд индекс более 40) (п= 10) 64,7±7,5

* - различие между группой больных с тотальным поражением и группами с левосторонним и дистальным поражением достоверно (р<0 05)

** - различие между группой больных с тяжелой атакой и группами со среднетяжелой и легкой атакой достоверно (р<0 05)

*** - различие между группой больных с невысокой и группами с высокой и средней активностью воспаления в толстой кишке достоверно (р<0 05)

Как известно, при БК не принято системы классификации, которая позволяла бы дифференцировать больных по протяженности воспалительного процесса, эндоскопической активности Имеющийся в распоряжении индекс Best позволяет оценивать тяжесть заболевания в определенный момент времени Используя данный индекс тяжести, мы разделили больных на больных с нетяжелой атакой заболевания (п=12), и тяжелой атакой (п=14) Уровень продукции N0 у первой группы больных не превышал уровень здоровых и составил

11

37,1 ±3,4 мкмоль/л, у больных с тяжелой атакой продукция N0 превышала уровень N0 у здоровых и составила 45,1±3,6 мкмоль/л Различие между двумя группами больных оказалось недостоверным Однако тенденция чем больше величина индекса Вев^ тем выше продукция N0, показалась нам очевидной

Мы провели анализ связи уровня N0 и известных показателей, отражающих активность воспаления, с помощью метода корреляции Достоверной корреляционной взаимосвязи уровня N0 с клиническим индексом ВеБ1 не выявлено Однако при исследовании корреляционной взаимосвязи уровня продукции N0 с такими маркерами активности воспаления, как лейкоцитоз, палочкоядерный сдвиг, тромбоцитоз, уровень С-реактивного белка выявлена достоверная средней силы корреляционная зависимость Коэффициент корреляции уровня N0 с величиной лейкоцитоза г=0 5, палочкоядерным лейкоцитозом г=0 5, величиной тромбоцитоза г=0 б, уровнем СРБ г=0 56 Корреляционный анализ показал наличие тесной взаимосвязи (г=0 91) между продукцией N0 и уровнем провоспалительного цитокина ФНО-а Достоверной взаимосвязи уровня N0 с такими показателями, как уровень гемоглобина, общего белка, альбумина, фибриногена не выявлено

Мы провели дополнительный корреляционный анализ исследовали взаимосвязь уровня N0 и индекса ВеБ1 у больных с появившимися в течение последних 2 лет симптомами заболевания, исключив из анализа больных, которым в течение этого периода назначались цитостатики Мы рассчитывали исключить влияние на итоговую сумму индекса накопленных признаков заболевания В этом случае была выявлена достоверная, умеренной силы корреляционная связь исследуемых показателей

Полученные данные убедительно показывают, что продукция N0 достоверно отражает активность, тяжесть заболевания у больных Ж, сывороточный уровень N0 коррелирует с клинико-лабораторными показателями активности ЯК Продукция N0 повышается по мере нарастания протяженности поражения толстой кишки При БК уровень продукции N0 скорее отражает активность текущего в настоящий момент воспаления, чем тяжесть заболевания

Основываясь на выявленном нами клиническом значении N0, было изучено влияние проводимого лечения на продукцию N0

В рамках диссертационного исследования мы обследовали больных до начала терапии, и на 21 день продолжающегося лечения (таблица 4)

Таблица 4.

Изменение продукции N0 на фоне проводимого лечения.

Группы больных Уровень N0 исходно М±т, мкмоль/л Уровень NO на 21 сутки М±ш, мкмоль/л Р

Язвенный колит (п=62) 42,7±2,7 26,1±0,9 <0 001

Болезнь Крона (п=24) 41,4±2,6 25,2±1,6 <0 001

ЯК, легкая атака (п=21) 31,4±3,1 24,8±1,3 0 041

ЯК, среднетяжелая атака (п=33) 40,8±3,1 25,8±1,2 <0 001

ЯК, тяжелая атака (п=8) 66,3±11,3 25,3±0,3 <0 001

БК, нетяжелая атака (п=11) 37,1±3,4 28,8±2,1 0 003

БК, тяжелая атака (п=13) 45,1±3,6 25,0±1,3 <0 001

ЯК, лечение аминосалицилатами (п=41) 33,6±2,2 24,6*0,9 <0 001 t=4 5

ЯК, лечение ГКС (п=20) 61,6±5,1 29,0±1,7 <0 001 t=7 1

Выявлено достоверное снижение продукции N0 у всех групп больных на фоне лечения У больных с более высокой активностью заболевания, которым требовалось назначение глюкокортикостероидов (ГКС), наблюдалась и более заметная динамика снижения продукции N0 Так, у больных, которых лечили аминосалицилатами, уровень N0 до лечения составил 33,6±2,2 мкмоль/л, после лечения - 24,6±0,9 мкмоль/л Парный критерий Стьюдента в этом случае составил 4,5 У больных, которых лечили ГКС, уровень N0 до лечения составил 61,6±5,1 мкмоль/л, после лечения 29,0±1,7 мкмоль/л Парный критерий Стьюдента 7,1

Был исследован темп снижения продукции N0 после назначения ГКС. У больных заборы крови делали до начала терапии, через 6, 12, 24 часа после назначения кортикостероидов. Было обследовано 16 больных язвенным колитом (рисунок 1), и 7 больных болезнью Крона (рисунок 2).

N0. мкмоль/л 70

40 30 20 10 0

67

65,8

/ щ 51 ,£ 47 Ч

У щ

■ ЩЩ

8Ш

жщ Ш1- винаа |11 ЩУ

ДО

6 ч

12 ч

24 ч

Рисунок 1. Изменение продукции N0 у больных язвенным колитом (п=16) после назначения глюкокортикостероидов.

До лечения уровень N0 у обследованной группы больных составил 67,0±5,6 мкмоль/л, через 6 часов после назначения препарата - 65,8 мкмоль/л, через 12 часов - 51,5±2,6 мкмоль/л, через 24 часа - 47,9±6,4 мкмоль/л. Уровень N0 достоверно снижается уже через 12 часов после назначения ГКС. Продолжающееся в стационаре наблюдение за больными позволило разделить обследованных больных на 2 группы, исходя из эффективности ГК терапии. Первая группа (п=12), с устойчивым ответом на проводимую терапию ГКС -больные, которые ответили на лечение отчетливым клинико-эндоскопическим улучшением. Вторая группа (п=4) — гормонально-рефрактерные (син. гормонально-резистентные) больные, с сохраняющей активностью заболевания, несмотря на терапию высокими дозами ГКС в течение 7 дней, что потребовало для достижения ремиссии заболевания назначения циклоспорина А (таблица 5).

Таблица 5.

Изменение продукции N0 у больных язвенным колитом, по-разному ответивших на лечение глюкокортикостероидами.

Уровень метаболитов N0, мкмоль/л

До лечения Через 6 ч Через 12 ч Через 24 ч

Больные, ответившие на лечение (п=12) 67,5 ± 7,3 65,5 ± 4,2 50,6 ± 3,0* 36,6 ±2,8*

Гормонально-рефрактерные (п=4) 65,7 ±7,5 66,8 ± 5,0 54,5 ± 5,7 81,9 ± 15,2

*- разница с исходньм уровнем N0 достоверна (р<0 05)

Изменение продукции N0 у двух групп больных ответивших на лечение ГКС и проявивших себя гормонально-рефрактерными сильно отличается В первой группе больных сохраняется выявленная ранее тенденция - через 12 часов (50,6±3,0 мкмоль/л) происходит достоверное снижение уровня N0 по сравнению с исходным его уровнем (67,5а=7,3 мкмоль/л) Через 24 часа после назначения ГКС уровень N0 у больных первой группы соответствовал нормальному - 36,6±2,8 мкмоль/л Во второй же группе больных достоверного снижения уровня N0 по сравнению с исходным не отмечено ни в одной точке измерения Более того, через сутки средний уровень N0 в группе даже превышал исходный уровень, но обнаруженная разница не была достоверной из-за серьезного разброса данных, поэтому выявленное повышение нельзя признать тенденцией

Динамика снижения продукции N0 после начала лечения ГКС у больных БК была сходной Сывороточный уровень N0 до лечения, и через 6,12,24 чч после начала лечения соответственно составил 49,3±6,3 мкмоль/л, 55,9±8,6 мкмоль/л, 40,3±6,6 мкмоль, 36,3±3,4 мкмоль/л Достоверное снижение сывороточного уровня N0 наблюдалось через 12 часов после начала лечения

Все обследованные больные были выписаны в состоянии клинической ремиссии Полученные данные не позволили нам высказываться о прогностической роли определения уровня N0 у больных БК Однако можно предположить

предсказательную роль (в отношении эффективности кортикостероидов) исследования уровня N0 до и после назначения стероидов у больных с высокой активностью заболевания (и соответственно имеющие высокий уровень продукции N0), с впервые появившимися симптомами заболевания

Доказанным можно считать тот факт, что активное воспаление стенки кишечника при ВЗК сопровождается повышением уровня N0 Однако следовало решить принципиальный вопрос - является ли повышение концентрации N0 лишь маркером активного воспаления или молекула N0 - участник патогенеза воспаления, оказывающая влияние на течение заболевания

Многими исследователями были получены достаточно убедительные экспериментальные данные, свидетельствующие о повреждающем действии N0 при ВЗК Об этом свидетельствовало смягчение проявлений заболевания, макроскопического и гистологического индексов повреждения при применении неселективных ингибиторов КО-синтазы, блокирующих и конститутивную и индуцибельную продукцию N0, и селективных ингибиторов индуцибельной продукции N0

Для ответа на поставленный вопрос мы провели собственное экспериментальное исследование, используя две модели экспериментального колита В качестве ингибитора продукции N0 был использован раствор метиленового синего, который вводился внутрибрюшинно, что обеспечивало определенную направленность воздействия на воспаление в толстой кишке В обеих моделях развитие колита сопровождалось повышением продукции N0, определяемое по уровню метаболитов N0 в сыворотке крови и содержанию цитруллина в ткани толстой кишки При ОБЗ-колите и Рв-РЗ-энтероколите у крыс уровень N0 в сыворотке крови возрастал практически в 2 раза по сравнению с контролем 57,9±4,4 мкмоль/л, 56,7±3,3 мкмоль/л, 30,2±2,5 мкмоль/л соответственно Возрастание продукции цитруллина в ткани толстой кишки при развивающемся воспалении было более значительным Уровень цитруллина при Б88-колите возрастал более чем в 3 раза, по сравнению с контролем, а при РО-РБ-энтероколите - практически в 6 раз При ОЗБ-колите содержание цитруллина возрастало до 138,1±27,3 мкг/г ткани, при РС-Р8-энтероколите - до 213,1±9,0 мкг/г ткани, содержание цитруллина в ткани интактной толстой кишки составило 36,1±6,9 мкг/г ткани

Воздействие МС в качестве ингибитора продукции N0 в нашем исследовании доказывалось снижением уровня метаболитов N0 в крови и цитруллина в ткани толстой кишки У животных, которым одновременно вводили ББЗ и МС, уровень N0 в сыворотке крови и содержание цитруллина в ткани толстой кишки оказалось сопоставимым с контролем - 39,2±2,3 мкмоль/л и 64,7±14,5 мкг\г ткани соответственно для N0 сыворотки и цитруллина А по сравнению с группой животных, которым не вводился МС, эти значения оказались достоверно ниже

Практически аналогичные данные были получены при моделировании Рв-РБ энтероколита за тем исключением, что продукция N0 здесь при одновременном воздействии стрептококкового токсина и МС была достоверно выше, чем у контрольных животных Уровень N0 в сыворотке крови составил 40,3±2,9 мкмоль/л, содержание цитруллина - 93,4±10,8 мкг/г ткани Достоверная разница в продукции N0 по сравнению с животными, которым вводился лишь токсин, выявлялась и в этом случае

Было выявлено, что снижение продукции N0 сопровождалось уменьшением проявлений экспериментального колита, отмеченное во время наблюдения за животньми, уменьшением степени повреждения слизистой, что оценивалось путем визуального осмотра и гистологического исследования образцов слизистой толстой кишки после забоя животных Забор образцов для гистологического исследования из нескольких сегментов толстой кишки, вычисление макро- и микроскопического (гистологического) индексов повреждения повышало точность оценки и снижало вероятность влияния субъективизма исследователя и его направленность на результат

В нашем исследовании МИП был достоверно ниже у животных с ББЙ-колитом, которым параллельно вводили МС, чем у тех, кому не вводили ингибитор продукции N0 3,5±0,5 баллов и 11,6±1,2 баллов соответственно ГИП также достоверно различался у двух групп больных и составил 5,0±0,3 баллов и 6,8±0,2 баллов соответственно В исследовании с РО-Р5-энтероколитом у животных, которым параллельно вводили МС, МИП составил 11,0±2,4 баллов, что было достоверно ниже, чем у группы животных, которым не вводили ингибитор N0

22,4±2,5 баллов ГИП также достоверно различался у двух групп больных и составил 6,8±0,4 баллов и 8,8±0,5 баллов соответственно.

Таким образом, общим для двух экспериментов являлось то, что высокая продукция N0 ассоциируется с большей интенсивностью воспаления, а подавление продукции NO под воздействием ингибитора NO-синтазы приводило к снижению интенсивности воспаления Из этого можно сделать вывод, что N0 является провоспалительным медиатором воспаления

Выявленный у гормонально-рефрактерных больных феномен, отражающий сохраняющуюся на высоком уровне продукцию NO, несмотря на терапию ГКС, позволяет выдвинуть ряд предположений Во-первых, продукция N0 в течение суток после назначения кортикостероидов может быть маркером, указывающим на реализацию противовоспалительного действия последних Во-вторых, можно предположить, что высокая продукция NO - не только маркер развивающейся гормональной резистентности, но и один из механизмов ее формирования Так показано, что гиперпродукция N0 блокирует функцию ГК рецепторов и, тем самым, снижает эффективность гормональной терапии (Galigniana et al, 1999) Вероятно, имеет значение нитрозилирование SH-групп в глюкокортикоидных рецепторах с последующим снижением связывания рецепторов с лигандом, то есть с глюкокортикостероидным препаратом Более того, показано, что у гормонально-рефрактерных больных снижения экспрессии индуцибельной NOS в слизистой толстой кишки после назначения ГКС терапии не происходит {Leonard, 1998)

Результаты клинической части нашего исследования в сопоставлении с экспериментальными данными позволяют надеяться на возможность преодоления гормональной резистентности назначением специфических ингибиторов индуцибельной NO-синтазы Однако это является перспективным направлением научного поиска в будущем

Полученные же нами данные, касающиеся динамики сывороточного уровня N0 в течение суток после назначения ГКС у больных, по-разному отвечающих на лечение, позволили нам однозначно выдвинуть метод определения сывороточного уровня N0 в качестве маркера развития гормональной резистентности В качестве рабочей гипотезы была принято следующее положение при повы-

шении уровня N0 через 24 часа после приема глюкокортикостероидного препарата или при снижении его, менее чем на 25% по сравнению с исходным, устанавливают рефрактерность к ГК

Составляли таблицу сопряженности 2x2 (таблица 6) Для проверки гипотезы вычислялся точный критерий Фишера Результаты вычисления оказались статистически достоверны р=0 003 Соответственно принятую гипотезу можно считать верной Для оценки эффективности найденного метода прогнозирования гормональной резистентности нами были вычислены специфичность, чувствительность, прогностическая ценность отрицательного результата, прогностическая ценность положительного результата

Для расчета указанных показателей использовалась та же четырехпольная система Чувствительность составила 100%, специфичность 92%, прогностическая ценность положительного результата составила 80%, прогностическая ценность отрицательного результата 100%, отношение правдоподобия положительного результата составило 13 1, отношение правдоподобия отрицательного результата составило 0 1

Таблица 6.

Таблица сопряженности после заполнения.

Гормональная рефрактерность Эффективное лечение

Отсутствие снижения уровня N0 на 25% по сравнению с исходным 4 1

Снижение уровня N0 более чем на 25% по сравнению с исходным 0 11

п = 4 п= 12

Таким образом, предложенный нами метод имеет высокую чувствительность и специфичность Наиболее высокую прогностическую ценность имеет отрицательный результат теста Это означает, что при снижении продукции N0 через сутки после назначения ГКС более чем на 25% от исходного со 100%-ной вероятностью можно утверждать, что лечение окажется эффективным

По нашему мнению, применение описанного метода позволит на начальном этапе лечения прогнозировать развитие гормональной резистентности и при условии своевременного назначения резервной иммуносупрессивной или антицитокиновой терапии поможет избежать оперативного лечения на фоне тяжелых метаболических нарушений (что значительно повышает операционный риск)

Выводы:

1 Сывороточный уровень N0 повышается относительно нормального значения у 100% больных с тяжелой атакой, 48,5±8,7% больных со средне-тяжелой атакой и у 33,3±10,3% больных с атакой легкой степени тяжести язвенного колита

2 Уровень N0 повышен у 57,1±13,2% больных с тяжелой атакой и у 33,3±13,6% больных с нетяжелой атакой болезни Крона

3 При язвенном колите увеличение протяженности и активности воспалительного поражения толстой кишки сопровождается повышением сывороточного уровня N0, который достоверно коррелирует с уровнем ФНО-а, клиническим индексом активности заболевания и рутинными показателями активного воспаления (лейкоцитоз, палочкоядерный лейкоцитоз, СОЭ, тромбоцитоз, С-реактивный белок, фибриноген)

4 При болезни Крона сывороточный уровень N0 отражает «остроту» текущего воспаления имеется корреляция с индексом Вев! у больных с давностью заболевания не более 2 лет, с сывороточным уровнем ФНО-а, рутинными показателями активного воспаления (лейкоцитоз, палочкоядерный лейкоцитоз, тромбоцитоз, С-реактивный белок) у всех больных болезнью Крона

5. Отсутствие снижения сывороточного уровня N0 более чем на 25% от исходного через 24 часа после назначения глюкокортикостероидов с 80% вероятностью позволяет прогнозировать развитие у больного гормональной резистентности Снижение сывороточного уровня N0 более чем на 25% от исходного через 24 часа после назначения глюкокортикостерои-

дов с 100% вероятностью позволяет прогнозировать положительный эффект глюкокортикостероидной терапии 6. Оксид азота является фактором патогенеза развития воспалительных изменений в стенке кишечника при экспериментальном ОЗБ-колите и РО-РБ-энтероколите При экспериментальном колите угнетение продукции N0 ингибиторами КО-синтазы приводит к смягчению течения заболевания и уменьшению степени повреждения слизистой оболочки толстой кишки Практические рекомендации:

1 При обследовании больных воспалительными заболеваниями кишечника исследовать уровень N0 в крови, как дополнительный и чувствительный маркер активности заболевания

2 Больным язвенным колитом перед назначением гормональной терапии исследовать уровень N0 до первого введения стероидов и через 24 часа после

3 При снижении сывороточного уровня N0 через 24 ч после начала лечения более чем на 25% от исходного уровня продолжать лечение глюкокортикостероидами

4 При снижении сывороточного уровня N0 через 24 ч после начала лечения менее чем на 25%, или при повышении его (по сравнению с исходным уровнем) планировать включение в терапию препаратов из группы резерва циклоспорина, инфликсимаба

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1 Барышников Е Н Раннее прогнозирование развития гормональной рефрактерности при воспалительных заболеваниях кишечника // «Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология» -М, 2007г, №5, с 138-144

2 Лазебник Л Б, Барышников Е Н, Дроздов В Н, Петраков А В, Румянцев В Г, Нилова Т В Оксид азота как маркер воспаления при неспецифическом язвенном колите и болезни Крона // «Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология» -М, 2006г, №3, с 4-8

3 Лазебник Л Б, Дроздов В Н, Барышников Е Н Роль оксида азота (N0) в этиопатогенезе некоторых заболеваний органов пищеварения II «Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология» -М, 2005г, №2, с 4-12

4 Барышников Е Н, Дроздов В Н, Петраков А В , Румянцев В Г Влияние кортикостероидов на продукцию оксида азота у больных воспалительными заболеваниями кишечника // «VII съезд научного общества гастроэнтерологов России, посвященный 40-летию Всесоюзного научно-исследовательского института гастроэнтерологии - Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии», - М, с 273-274

5 Baryshmkov Е N Early prognosis of corticosteroids treatment m patients with inflammatory bowel disease // European Bridging Meeting 2007 and EAGE Postgraduate Course- Magdeburg, Germany, p 14

Список сокращений

БК — болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ГИП - гистологический индекс повреждения

ГКС, ГК - глюкокортикостероиды

МИЛ - макроскопический индекс повреждения

МС - метиленовый синий

СОЭ — скорость оседания эритроцитов

СРВ - С - реактивный белок

ФНО-а - фактор некроза опухоли-а

ЯК - язвенный колит

CAI - индекс клинической активности

DSS-колит — колит, индуцированный декстраном натрия сульфатом EI - индекс эндоскопической активности NO- оксид азота

PG-PS - энтероколит - индуцированный пептидогликаном-полисахаридом

Подписано в печать 18 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 89 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Актуальность темы

В 1998 г была присуждена Нобелевская премия авторам, открывшим молекулу оксида азота (NO): Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad. Первоначально молекула рассматривалась как мессенджер сердечно-сосудистой системы. Именно по этой причине большая часть последующих клинических исследований (работы Лазебника Л.Б., 1998) была сосредоточена на изучении роли N0 в формировании эндотелиальной дисфункции.

Со временем было показан универсальный характер молекулы, т.е. участие в физиологических процессах практически во всех тканях и органах. В этой связи N0 привлек к себе внимание ученых разных медицинских специальностей. В ряду научных исследований выделяются ?е, цель которых - установить роль NO в патогенезе заболеваний желудочно-кишечного тракта. Развитие данного направления научного поиска было поддержано разработкой специфических методов определения N0. Поскольку молекула является нестойким соединением и существует лишь считанные секунды, практически все методы по своей сути основаны на косвенной оценке. Прорывом для клиницистов стало то, что был разработан простой и доступный метод определения стабильных метаболитов N0 в сыворотке крови и моче (нитрита и нитрата) (Wennmolm et al., 1992). Было показано, что ряд заболеваний и патологических состояний желудочно-кишечного тракта сопровождается недостатком продукции N0: ахалазия кардии (Mearin et al., 1993; Sivarao et al., 2001; Gelfond et al, 1982); функциональная диспепсия (Gilja et al., 1997; Kuiken et al, 2002); медленно транзитный запор (Tomita et al., 2002); болезнь Гиршпрунга (Vanderwinden et al., 1993; ОЖе11у et al., 1994) хроническая анальная трещина (ОЖеПу et al., 1993). А такие заболевания и патологические состояния, как целиакия (Sundqvist et al., 1998; van Straaten et al., 1999; Murray et al., 2003); коллагеновый колит (Perner et al, 2001), токсический гепатит {Sass et al., 2001; Koerber et al., 2002; Bourdi et al, 2002; Jaeschke et al., 2002), язвенный колит (Ж) {Rachmilewitz et al., 1998; Vento et al., 2001; Goggins et al., 2001; Ljitng et al, 2002), болезнь Крона (БК) (Oudkerk et al., 1995; Коек et al., 2002; Ljimg et al., 2001) сопровождаются напротив повышением продукции NO.

В ряду перечисленных патологических состояний воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) выделяются в силу нарастающей распространенности, сохраняющейся высокой частоты хирургических вмешательств, и, следовательно, серьезной медико-социальной значимости. Проведенные клинические и экспериментальные исследования позволяют уверенно констатировать вовлеченность NO при воспалении кишечника. Однако результаты исследований, особенно экспериментальных, зачастую неоднозначны. Так, для уточнения роли NO в патогенезе ВЗК проведено значительное число экспериментальных исследований с применением препаратов-ингибиторов продукции NO: в одних показано смягчение экспериментального колита (Menchen et al., 2001; Yamaguchi et al., 2001; Yue et al., 2001), в других, напротив утяжеление (Yoshida Y., 2000; Armstrong AM., 2000).

Вызывает определенный оптимизм появившиеся сведения о прогностическом значении определения N0 у больных ВЗК. (Rees D.C., 1995). Показано, что высокий уровень N0 опасен из-за развития токсической дилатации (Mourelle М., 1995). Однако четких критериев, которые позволили бы предположить бесперспективность гормональной терапии тяжелых форм ВЗК, еще до развития выраженных метаболических нарушений не разработано. Таким образом, истинная роль N0 при ВЗК до конца не определена. Особое практическое значение в связи с сохраняющейся высокой частотой оперативных вмешательств, проводимых у больных ВЗК на фоне тяжелых метаболических нарушений, представляет диагностическое и прогностическое значение определения NO с помощью простых и доступных методик.

Цель исследования:

Повышение точности диагностики и эффективности лечения воспалительных заболеваний кишечника, за счет включения в программу обследования больных язвенным колитом и болезнью Крона метода определения сывороточного уровня оксида азота. Задачи работы:

1. Установить клинико-диагностическое значение уровня оксида азота для оценки активности и тяжести течения язвенного колита и болезни Крона.

2. Выявить взаимосвязь продукции оксида азота и клинических, клинико-лабораторных симптомов язвенного колита и болезни Крона.

3. Установить взаимосвязь продукции NO и уровня провоспалительного цитокина ФНО-а.

4. Установить влияние уровня оксида азота на эффективность лечения язвенного колита и болезни Крона.

5. Определить продукцию оксида азота при экспериментальном колите у крыс.

6. Исследовать влияние блокады синтеза оксида азота на течение экспериментального колита у крыс.

Научная новизна:

Впервые в РФ проведено исследование продукции NO у больных воспалительными заболеваниями кишечника. Установлена взаимосвязь уровня NO в крови с эндоскопическим и клиническим индексами активности заболевания, рутинными показателями активного воспаления, уровнем ФНО-а при язвенном колите и болезни Крона.

Установлено прогностическое значение определения NO в крови для оценки эффективности глюкокортикостероидной терапии и риска развития гормональной резистентности при язвенном колите.

В экспериментальном исследовании доказана роль NO в патогенезе воспалительных изменений в стенке кишечника. Установлено положительное влияние ингибиторов NO-синтазы на течение экспериментального колита у крыс (на двух разных моделях). Практическая значимость:

Предложен новый критерий активности воспаления при воспалительных заболеваниях кишечника. Предложен критерий эффективности противовоспалительного лечения больных воспалительными заболеваниями кишечника на основании изменения уровня NO. С вероятностными характеристиками сформулированы четкие критерии прогноза развития гормональной резистентности у больных язвенным колитом, на основании которых возможно раннее планирование базисного лечения (продолжение лечения глкжокортикостероидами либо дополнительное назначение «резервных» иммунодепрессантов для того, чтобы избежать колэктомии). Апробация работы

Результаты исследования опубликованы в 5 печатных работах и доложены на XXVIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ, IX Международном Славяно-Балтийском форуме в г. Санкт-Петербург, в виде стендового доклада на European Bridging Meeting 2007 and EAGE Postgraduate Course в г. Магдебург, Германия.

Апробация работы проведена на заседании Ученого совета Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии.

Выводы: 1. Сывороточный уровень N0 повышается относительно нормального значения у 100% больных с тяжелой атакой, 48,5±8,7% больных со средне-тяжелой атакой и у 33,3± 10,3% больных с атакой легкой степени тяжести язвенного колита.

2. Уровень NO повышен у 57,1±13,2% больных с тяжелой атакой и у 33,3±13,6% больных с нетяжелой атакой болезни Крона.

3. При язвенном колите увеличение протяженности и активности воспалительного поражения толстой кишки сопровождается повышением сывороточного уровня NO, который достоверно коррелирует с уровнем ФНО-а, клиническим индексом активности заболевания и рутинными показателями активного воспаления (лейкоцитоз, палочкоядерный лейкоцитоз, СОЭ, тромбоцитоз, СI

1 реактивный белок, фибриноген). 4. При болезни Крона сывороточный уровень NO отражает «остроту» текущего воспаления: имеется корреляция с индексом Best у больных с давностью заболевания не более 2 лет, с сывороточным 1 уровнем ФНО-а, рутинными показателями активного воспаления ! (лейкоцитоз, палочкоядерный лейкоцитоз, тромбоцитоз, С-реактивный белок) у всех больных болезнью Крона.

5. Отсутствие снижения сывороточного уровня NO более чем на 25% 1 от исходного через 24 часа после назначения глюкокортикостероидов с 80% вероятностью позволяет прогнозировать развитие у больного гормональной резистентности. Снижение сывороточного уровня NO более чем на 25% от исходного через 24 часа после назначения глюкокортикостероидов с ! 100% вероятностью позволяет прогнозировать положительный эффект глюкокортикостероидной терапии. 6. Оксид азота является фактором патогенеза развития 1 воспалительных изменений в стенке кишечника при 1 экспериментальном DSS-колите и PG-PS-энтероколите. При экспериментальном колите угнетение продукции NO ингибиторами NO-синтазы приводит к смягчению течения заболевания и уменьшению степени повреждения слизистой оболочки толстой кишки.

Практические рекомендации:

1. При обследовании больных воспалительными заболеваниями кишечника исследовать уровень NO в крови, как дополнительный и чувствительный маркер активности заболевания.

2. Больным язвенным колитом перед назначением гормональной терапии исследовать уровень NO до первого введения стероидов и через 24 часа после.

3. При снижении сывороточного уровня NO через 24 ч после начала лечения более чем на 25% от исходного уровня продолжать лечение глюкокортикостероидами.

4. При снижении сывороточного уровня NO через 24 ч после начала лечения менее чем на 25%, или при повышении его (по сравнению с исходным уровнем) планировать включение в терапию препаратов из группы резерва: циклоспорина, инфликсимаба.