Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинические варианты течения и принципы иммунотерапии врожденных инфекций, вызванных вирусами простого герпеса и цитомегалии, у детей различного гестационного возраста

На правах рукописи

4851725

Гетия Екатерина Гивиевна

Клинические варианты течения и принципы иммунотерапии врожденных инфекций, вызванных вирусами простого герпеса и цитомегалии, у детей различного гестационного возраста.

14.01.08- педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 Ш ?011

Москва, 2011

4851725

Работа выполнена на кафедре неонатологии факультета усовершенствования врачей Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Володин Николай Николаевич

Доктор медицинских наук, профессор Дегтярева Марина Васильевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

Рюмина Ирина Ивановна Финогенова Наталия Анатольевна

Ведущее учреждение: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» (ГОУ ДПО РМАПО Росздрава).

Защита состоится «26» августа 2011 года в_часов на заседании диссертационного совета

Д 208.050.01. при ФГУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» Минздравсоцразвития России, по адресу: 117997, Москва, Ленинский проспект, 117, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России и на сайте www.niidg.ru

Автореферат разослан «_»_2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Чернов Вениамин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

За последние годы в клинической практике значительно увеличилось число больных, страдающих хроническими рецидивирующими герпесвирусными инфекциями, которые сопровождаются нарушениями иммунного статуса и трудно поддаются лечению. Согласно данным литературы, рецидивирующие герпесвирусные инфекции наблюдаются у 20-25% жителей разных стран (Борисенко JI.K, 2003; Исаков В.А., 2006). Вирусы простого герпеса и цитомегалии представляют серьезную угрозу для здоровья населения, вызывая неонатальный герпес, самопроизвольные выкидыши, мертворождение, формирование пороков развития плода, менингоэнцефалит, увеличивая показатели летальности новорожденных детей, приводя к формированию инвалидности с детства и увеличению экономического ущерба для государства (Corey L. et al, 2000; Сафонова М.М., 2003).

Патогенез развития тяжелых форм герпесвирусных инфекций до сих пор не вполне ясен. С учетом экспериментальных данных о взаимодействии разных вирусов группы герпеса и их пантропизма нам представилось актуальным изучить распространенность прямых маркеров вируса простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловируса (ЦМВ) у здоровых и больных новорожденных детей различного срока гестации для оценки возможного вклада этих вирусов в патогенез заболеваний неонатального периода, а также оценить частоту развития осложнений у пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН), инфицированных ЦМВ и ВПГ.

Разработанные и внедренные в клиническую практику современные методы лабораторной диагностики позволяют проводить не только верификацию этиологического агента (идентификация самого вируса, его генома или антигенов) и обнаружение серологических маркеров иммунного ответа (специфических антител), но и определять остроту инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса и раздельное определение специфических антител классов IgM и IgG с их авидностью). Однако эффективность и информативность этих методов при диагностике неонатальных герпесвирусных инфекций (ГВИ) не одинаковы.

Разработка современного эффективного алгоритма диагностики и лечения герпесвирусных инфекций у новорожденных и детей раннего возраста является важной задачей педиатрии, имеющей не только научное, но и практическое значение. Именно поэтому чрезвычайно важной с научной и практической точек зрения является разработка четких клинико-лабораторных критериев диагностики и эффективных методов лечения герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. Все вышеизложенное и явилось основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: разработать патогенетически обоснованные показания к назначению иммунокорригирующей терапии и оценить клиническую эффективность иммунотерапии у новорождённых детей различного гестационного возраста с различными формами перинатальных герпесвирусных инфекций.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить распространенность и клиническое значение инфицирования вирусами простого герпеса и цитомегалии недоношенных детей с низкой и экстремально низкой массой тела в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных, а также в отделении физиологии новорожденных детей.

2. Проанализировать взаимосвязь перинатальной герпесвирусной инфекции с анамнезом матери, установить клинико-иммунологические особенности течения неонатального периода у детей различного гестационного возраста, инфицированных ЦМВ и ВПГ.

3. Установить характер изменений показателей противовирусного иммунитета у новорожденных детей различного гестационного возраста, инфицированных ЦМВ и ВПГ, в том числе в динамике на фоне иммунокорригирующей терапии.

4. Обосновать показания к назначению иммунокорригирующей терапии и оценить эффективность иммунотерапии препаратом рекомбинантного интерферона-а2Ь человека («Виферон»®) при герпесвирусных инфекциях у новорожденных детей различного гестационного возраста.

Научная новизна. При выполнении исследования впервые использован комплексный подход к лабораторной диагностике с одновременным применением комбинации методов: вирусологическое исследование (быстрый культуральный метод), полимеразная цепная реакция, серологические методы: исследование концентраций специфических анти-ВПГ-антител и анти-ЦМВ-антител классов и 1§М методом иммуноферментного анализа, определение индекса авидности специфических кв.

Путем комплексного лабораторного обследования установлено, что частота внутриутробного инфицирования ВПГ и ЦМВ недоношенных новорожденных с осложненным течением неонатального периода составляет 25,7% и 16,5%, соответственно.

Установлено, что выявление инфекционно активных герпесвирусов в крови недоношенных детей в 62,5% случаев сопровождалось клинической картиной некротизирующего энтероколита.

Доказана взаимосвязь между фактом наличия прямых маркеров герпесвирусных инфекций в спинномозговой жидкости и высокой частотой развития таких осложнений неонатального периода, как перивентрикулярная лейкомаляция, неонатальные судороги, ВЖК 2-3 ст., тяжелые стадии ретинопатии недоношенных детей, бронхолегочная дисплазия у недоношенных детей.

Научно-практическое значение. На основании полученных данных о распространенности герпесвирусных инфекций (ВПГ и ЦМВ) среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга на маркеры ГВИ в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

При подозрении на внутриутробные инфекции доказана необходимость использования двух методов лабораторной диагностики: быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции для исследования биологического материала хотя бы из двух локусов - крови и мочи (желательно исследовать также аспират из трахеи или слюну, по показаниям - ликвор) в динамике (до 14 суток жизни и в 1-3 месяца жизни).

Для уточнения фазы течения герпесвирусной инфекции рекомендовано применение серологических методов диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими проявлениями генерализованной инфекционной болезни, пневмонией, учитывая высокий риск развития хронического заболевания легких и некротизирующего энтероколита, в неонатальном периоде обосновано использование препарата рекомбинантного интерферона-а2Ь («Виферон»®).

Внедрение результатов работы. Разработанные в результате исследования практические рекомендации внедрены в практику отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных, а также отделений патологии недоношенных детей Городской Больницы №8 Департамента здравоохранения г.Москвы, неонатального центра, отделения реанимации, отделения .патологии новорожденных, отделения хирургии новорожденных Детской городской клинической больницы №13 им.Н.Ф.Филатова Департамента здравоохранения г.Москвы. Результаты данной научной работы используются в учебном процессе, проводимом для врачей-педиатров, неонатологов, анестезиологов-реаниматологов из различных регионов России на кафедре неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Ежегодных Конгрессах Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011), на 1-ом Объединенном научно-практическом форуме детских врачей (Орел, 2008 г.), на 2-ом Объединенном Российском иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008 г.), на Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2009, 2010, 2011 гг.), на VII-OM Съезде аллергологов и иммунологов стран СНГ (г.Санкт-Петербург, 2009), на 27-ом Конгрессе Европейского Общества по детским инфекционным болезням (27th Annual Meeting of the European Society For Paediatric Infectious Diseases, Brussels, Belgium, June 9-13,2009), на 22-ом Европейском Конгрессе по перинатальной медицине (Испания, Гранада, 25-29 мая 2010

г.) Апробация работы проведена 30 декабря 2010 года на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры неонатологии ФУВ РГМУ, кафедры госпитальной педиатрии РГМУ и сотрудников ДГКБ №13 им. Н.Ф.Филатова Департамента здравоохранения г. Москвы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на_страницах и состоит из

введения, обзора литературы, описания групп обследованных детей и методов исследования, главы, в которой представлены результаты собственных наблюдений, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Текст диссертации

содержит_таблицы и_рисунков. Указатель литературы включает в себя_источников, из

них_работ отечественных авторов и_работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена на кафедре неонатологии ФУВ РГМУ (зав. кафедрой - д.м.н., профессор Дегтярева М.В.) за период с декабря 2006 года по октябрь 2010 года. Проспективное наблюдение за новорождёнными детьми проводилось на базе отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных №1 (зав. отд. - к.м.н. Воронцова Ю.Н.) и №2 (зав. отд. - к.м.н. Бабак O.A.), отделений физиологии новорожденных (зав.отд. - Лакшина М.М.), отделений патологии новорожденных №1 (зав.отд. - к.м.н. Потапова О.В.) и №2 (зав.отд. - Миронюк О.В.) Городской Больницы №8 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач - Дуленков А.Б.), а также на базе неонатального центра (зав. отд. - к.м.н. Эверстова Т.Н.), отделения хирургии новорожденных (зав. отд. - к.м.н. Голоденко Н.В.) и патологии новорожденных (зав. отд. -Кыштымов М.В.) Детской городской клинической больницы № 13 им. Н.Ф. Филатова Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач - к.м.н. Константинов К.В.) Проведение данного исследования было одобрено Этическим Комитетом ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Объем и методы исследования. С целью изучения распространенности герпесвирусов (ВПГ, ЦМВ) у новорожденных детей различного гестационного возраста были выделены 2 группы: группа 1 включала 47 здоровых детей из отделения физиологии; возраст детей составил от 1 до 11 суток жизни. Мальчиков было 30, девочек - 17. Доношенных детей было 32, детей со сроком гестации от 32 до 37 недель - 15. В эту группу включено 2 двойни. Средняя масса тела при рождении по группе составила 3155 [2710; 3580] (Ме [LQ; UQ]) граммов (1480 - 4530 г) (min-max), длина тела - 50 [48; 51] см (38 - 55 см). Оценка по шкале Апгар на 1 минуте жизни составила 7,5 (4-8) баллов, на 5 минуте жизни - 8,45 (7-9) баллов.

Группа 2 - 109 детей с осложненным течением неонатального периода, у которых первое исследование маркеров ВПГ и ЦМВ проводилось в первые 14 суток жизни в отделении реанимации; средняя масса тела при рождении по 2-ой группе составила 1350 [1040; 2000] граммов (640-3940 г); ), длина тела - 39 [35; 44] см (29 - 53 см). Мальчиков было 59 (54,1%),

девочек - 50 (45,9%), доношенных детей (38-41 неделя гестации) было 7 из 109 (6,4%), детей 33-37 недель гестации - 26 из 109 (23,9%), детей со сроком гестации 28-32 недели - 61 из 109 (56%), детей со сроком гестации 25-27 недель - 15 (13,7%). Было обследовано 39 детей от многоплодных беременностей: одна четверня, одна тройня, 16 двоен.

С целью уточнения кпинико-лабораторных особенностей течения неонатального периода по результатам выявления прямых маркеров герпесвирусных инфекций дети из ОРИТН (группа 2) были разделены на 2 подгруппы: подгруппа 2А - дети с положительными результатами исследования маркеров ГВИ, подгруппа 2Б - дети, у которых результаты исследования маркеров ГВИ при обследовании в возрасте до 14 суток жизни были отрицательными.

В работу по изучению эффективности препарата рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®) был включен 151 ребенок (109 детей 2-ой группы, а также еще 42 пациента ОРИТН, которым первое обследование на ВПГ и ЦМВ было проведено позднее 14 суток жизни во время пребывания в отделении реанимации). Независимо от наличия или отсутствия маркеров ВПГ и/или ЦМВ всем этим детям в ОРИТН был поставлен диагноз внутриутробной инфекции по совокупности клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных. Были выделены 2 группы детей с внутриутробными инфекциями: основная группа (дети, получившие в составе стандартной базисной терапии препарат «Виферон»®, п=94) и группа сравнения (дети, получавшие стандартную базисную терапию; п=57). В рамках данного проспективного наблюдения рандомизации не проводилось.

Нами был проведен тщательный сбор акушерско-гинекологического и соматического анамнеза матерей наблюдаемых детей. Осуществлялось динамическое клиническое наблюдение за новорожденными детьми, базисное лабораторное обследование, в том числе общий анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, микроскопическое исследование спинномозговой жидкости, микробиологическое исследование крови, ликвора, аспирата из трахеи, мочи. При постановке клинического диагноза учитывали результаты инструментальных методов исследования (рентгенография грудной клетки и брюшной полости, электрокардиография, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и головного мозга).

Исследуемый материал. Материалами для исследования служили моча, кровь, слюна (или аспират из трахеи в случае ИВЛ) и ликвор - по показаниям. Венозную кровь получали путём пункции периферической вены в асептических условиях в объёме 1-1,5 мл, собирали её в стерильные пластиковые пробирки с ЭДТА (или с гепарином для исследования иммунного статуса). Цельную кровь и мочу центрифугировали в течение 10 мин при 1000 оборотах в минуту, затем стерильно отбирали фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. В лунки 24-луночной панели с клетками ФЛЭЧ вносили по 0,2 мл лейкоцитарной фракции и по 0,2 мл клеток из осадка мочи. Ликвор и слюну разводили в 2 раза средой Игла-МЕМ без сыворотки и вносили в культуру клеток в объеме 0,2 мл.

Быстрый культуральный метод (БКМ) проводили в лаборатории клеточной инженерии ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России (зав. лабораторией - д.б.н., профессор Кущ A.A.) для определения наличия инфекционно активных вирусов в клиническом материале согласно методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.030-08 (Москва, 2008). Клетки линии ФЛЭЧ выращивали в среде Игла-МЕМ, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коровы (ЭТС), 2 мМ глутамина, 50 мкг/мл гентамицина в 24-луночных панелях на покровных стеклах, либо в 48-луночных панелях без стекол в течение 1 суток до достижения полного монослоя. В культуру вносили клинический материал и проводили совместное центрифугирование клеток ФЛЭЧ с клиническими образцами в течение 35 минут при 2500 об./мин при 37°С. После отмывки вносили среду поддержки - среду Игла-МЕМ с 2% ЭТС. Через 24 часа клетки фиксировали в холодном ацетоне 10 минут и проводили реакцию непрямой иммунофлюоресценции, либо в охлажденном метаноле (-20°С) в течение 20 минут для реакции иммунопреципитации, иммунопероксидазного окрашивания. Для обнаружения белков ЦМВ использовали моноклональные антитела (МКА) к ЦМВ (Макарова Н.Е., 1994). Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные с FITC и/или конъюгированные с пероксидазой хрена. Подсчет окрашенных клеток проводили на 2,5x105 клеток ФЛЭЧ. Положительные результаты представляли в количестве вирусных частиц (в.ч.) на 0,2 мл клинического материала. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл (Адиева A.A., 2008). Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили клинический материал от детей и инкубировали в течение 1 часа при температуре°37 С в атмосфере 5% С02 Через 24 часа проводили детекцию ВПГ с помощью моноклональных антител в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК ВПГ и ЦМВ проводили с помощью сертифицированных коммерческих наборов «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В». ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора: «АмплиСенс ЦМВ», «АмплиСенс HSV 1, 2 типов» согласно инструкции производителя. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология») при определенной температурной программе по рекомендации производителя.

Выявление специфических IgG и IgM антител и определение авидности IgG антител. Сыворотки крови детей исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) на наличие антител классов IgG и IgM к ВПГ и к ЦМВ. Определяли авидность антител класса IgG к обоим вирусам и вычисляли индекс авидности (ИА). Выявление антител к ВПГ проводили с помощью тест-систем ЗАО "Вектор-Бест": «ВектоВПГ-IgM», «BeKTOBnr-IgG-стрип», «ВектоВПГ 1,2-IgG-авидность». Для определения антител к ЦМВ использовали тест-системы НПО «Диагностические системы»: «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G», «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G-АВИДНОСТЬ». Анализы проводили согласно инструкциям фирм-производителей.

8

Определение авидности ^О позволяет не только дифференцировать первичную инфекцию и реактивацию (при первичной инфекции вырабатываются низкоавидные антитела, при реактивации - высокоавидные), но может сориентировать врача и в сроках возникновения инфекции. Результаты выдаются в процентах индекса авидности (табл. 1). Индекс авидности (ИА) специфических к ЦМВ в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-0 Авидность» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Таблица 1. Интерпретация различных значений индекса авидности специфических IgG против ЦМВ и ВПГ _

Результат Значение Интерпретация

<40% низкоавидные Подтверждает факт острой инфекции от 10 до 100 дней назад

41-59% переходные Подтверждает факт острой инфекции от 101 до 160 дней назад

>60% высокоавидные После острой инфекции или контакта прошло более 161 дня, антитела являются протективными, «анамнестическими»

Определение цитокинового и интерферонового статуса. Интерфероновый статус исследовали культуральным методом, предложенным С.С.Григорян и Ф.И.Ершовым (1988), совместно с лабораторией онтогенеза и коррекции системы интерферона ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России (зав. лабораторией - д.б.н., проф. В.В.Малиновская). Концентрации провоспалительных цитокинов ИЛ-1 ß, ИЛ -6, ИЛ-8, ИФН-а и ИФН-у в сыворотке крови, величину спонтанной и индуцированной продукции данных цитокинов в культурах клеток крови новорожденных определяли методом твердофазного ИФА в системе бидетерминантного определения антигена (ELISA) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Для определения концентраций ИФН-а использовали тест-систему производства «Bender Medsystems» (Австрия), для тестирования концентраций ИЛ-lß, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-у применяли наборы реагентов Biosource (Бельгия), использовали ридер Anthos. В качестве индукторов использовали: для ИФН-а - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для ИФН-у и провоспалительных цитокинов - ФГА.

Исследуемый материал брали в двух точках (1-я точка - до 14 суток жизни, 2-я точка - от 28 суток до 3 месяцев жизни).

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием пакета прикладных

программ «Statistica 6.0» (Stat. Soft Inc., США). Количественные признаки, имевшие нормальное

распределение, описывались средними и среднеквадратическими отклонениями (M±s); не

имевшие нормального распределения, описывались медианами и квартилями (Me [LQ; UQ]).

Качественные признаки описывались абсолютными и относительными частотами их значений.

Для количественных признаков сравнение несвязанных групп проводилось с использованием

непараметрического теста Манна-Уитни (U-test), сравнение связанных групп проводилось с

использованием непараметрического теста Вилкоксона (Wilcoxon matched pairs test; W-test). Для

9

сравнения частот значений признаков в группах применялся двухсторонний точный критерий Фишера (ТКФ). Различия считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Возраст детей на момент первичного обследования составил от 1 до 14 суток жизни. Характеристика обследованных детей представлена в табл. 2. Таблица 2. Характеристика новорожденных детей 1-ой и 2-ой групп

Показатели Здоровые новорожденные дети (1 группа; п=47) Дети в критическом состоянии в ОРИТН (2 группа; п=109) Р (II-геэО

Ме [Ь0;и0] М[гшп;тах] Ме [Ь0;и0] М [Мт-Мах]

Гестационный возраст 39 [36; 39] 38,2 [33;41] 30 [28; 33] 31,5 [25; 41] <0,001

Масса тела при рождении 3175 [2770; 35801 3089 [1480;4530] 1350 [1040;2000] 1547 [640;39401 <0,001

Рост 50 [48; 51] 49 [38; 55] 39 [35; 44] 39 [29; 53] <0,001

Окружность головы 35 [34; 36] 34,6 [30;37] 29 [26; 32] 28,9 [21; 37] <0,001

Окружность груди 33 [33; 35] 33,2 [25;40] 25 [22; 28] 25,6 [19; 35] <0,001

Оценка по шкале Апгар на 1 минуте жизни 8 [7; 8] 7,4 [4; 8] 6 [4; 7] 5,4 [0; 9] <0,001

Оценка по шкале Апгар на 5 минуте 9 [8; 9] 8,4 [7; 9] 7 [6; 7] 6,4 [0; 9] <0,001

Таблица 3. Частота выявления прямых маркеров ВПГ и ЦМВ у детей 1-ой группы методом

Материалы Частота выявления прямых маркеров ВПГ, абс. (%) Частота выявления прямых маркеров ЦМВ, абс. (%)

БКМ ПЦР БКМ ПЦР

Кровь п=46 3 (6,5) 1 (2,2) 0(0) 0(0)

Моча п=44 7(16) 1 (2,3) 0(0) 3 (6,8)

Слюна п=16 4(25) 1 (6,3) 0(0) 0(0)

В отделении физиологии у 47 детей исследовано 106 проб, из них 46 образцов крови, 44 пробы мочи и 16 проб слюны (табл. 3). У детей из физиологического отделения прямые маркеры ВПГ в крови методом ПЦР выявлены у 1 ребенка, методом БКМ - у 3 детей. Прямые маркеры ВПГ с наибольшей частотой выявлялись в моче, при этом методом БКМ прямые маркеры ВПГ в моче выявлены в 7 случаях (15,9%), а методом ПЦР - в 1 случае (2,3%). Из 16 исследованных проб слюны здоровых детей на первой неделе жизни маркеры ВПГ обнаружены методом БКМ в 4 случаях (25%), методом ПЦР - в 1 случае (6,25%).

В отделении реанимации и интенсивной терапии первично у 109 детей в возрасте от 2 до 14 суток жизни было исследовано 292 пробы биологических материалов: кровь - 103 пробы, моча -101 проба, ликвор - 48 проба, слюна (или аспират из трахеи) - 47 проб (табл. 4).

Таблица 4. Частота выявления прямых маркеров герпес-вирусов (ВПГ, ЦМВ) у детей в возрасте от 1 до 14 суток жизни в отделении реанимации и интенсивной терапии_

ВПГ, абс. (%) ЦМВ, абс. (%)

кровь моча слюна СМЖ кровь моча слюна СМЖ

Всего проб 103 101 47 48 103 101 47 48

БКМ 10(9,7) 22 (21,7) 1 (2,1) 7(14,5) 6 (5,8) 9(8,9) 5(10,6) 5(10,4)

положительный

ПЦР 4 6(5,9) 2(4,3) 4(8,3) 15 (14,6) 9(8,9) 10(21,3) 5(10,8)

положительный (3,9)

Совпадение 3 3 0 3 5 4 3 1

положительных

результатов 2-х

методов

Степень 0,395 0,133 0,029 0,492 0,429 0,390 0,301 0,107

согласия [0,067; [0,063; [-0,070; [0,115; [0,161; [0,085; [0,033; [-0,250;

(каппа) 0,723] 0,330] 0,012] 0,868] 0,697] 0,695] 0,635] 0,464]

При проведении анализа частоты выявления прямых маркеров герпесвирусных инфекций среди детей, находящихся на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии, было показано, что прямые маркеры ВПГ методом БКМ выявлялись в 2 раза чаще в моче 22/101 (21,7%), чем в крови 10/103 (9,7%), (р=0,021 (ТКФ)). ДНК ВПГ выявлялась одинаково часто в крови, моче, слюне и спинномозговой жидкости. Одновременно двумя методами маркеры ВПГ были обнаружены в 3 пробах крови и в 3 пробах мочи (табл. 4), степень согласия между двумя методами была низкой, на уровне случайного совпадения. Поскольку в повседневной практике для верификации диагноза герпесвирусных инфекций у новорожденных детей наиболее часто используется метод ПЦР, то полученные результаты позволяют сделать заключение о необходимости дополнительного исследования прямых маркеров ГВИ методом БКМ в случае отрицательного результата ПЦР.

При исследовании проб крови у детей 2-ой группы прямые маркеры ЦМВ выявлялись в 2 раза чаще методом ПЦР по сравнению с БКМ, однако различия не были статистически значимыми. Одновременно двумя методами в крови маркеры ЦМВ выявлялись в 5 случаях. В моче и слюне прямые маркеры ЦМВ обнаруживались одинаково часто как методом ПЦР, так и БКМ; одновременно двумя методами маркеры ЦМВ в слюне были обнаружены в 3-х случаях.

В отделении физиологии новорожденных родильного дома прямые маркеры вируса простого герпеса в крови были обнаружены у 8,6% детей, при этом специфических клинико-лабораторных симптомов герпесвирусных инфекций в раннем неонатальном периоде не выявлялось. Прямые маркеры ЦМВ не были обнаружены ни в одном из исследованных образцов крови детей из отделения физиологии ни методом ПЦР, ни быстрым культуральным методом.

Таблица 5. Частота выявления маркеров инфекционио активного ЦМВ методом БКМ в крови, в моче, в слюне или в ликворе на 1-14 сутки жизни у новорожденных детеП различного гестационного возраста

Гестационный возраст (в неделях) Выявление маркеров ЦМВ методом БКМ Количество обследованных детей (п=156) абс. (%) Р (ТКФ)

Здоровые новорожденные дети (1 группа; п=47) Дети в критическом состоянии в ОРИТН (2 группа; п=109)

25-41 (п=156) маркёр (+) 0 18 (16,5) 0,002

маркёр (-) 47(100) 91 (83,5) -

25-27 (п=15) маркёр (+) 1/15 (6,7) -

28-32 (п=61) маркёр (+) 9/61 (14,8) -

33-37 (п=38) маркёр (+) 0/12 (0) 8/26 (30,8) 0,039

38-41 (п=42) маркёр (+) 0/35 (0) 0/7 (0) -

При изучении распространенности инфекционно активного цитомегаловируса в крови,

моче, слюне и/или СМЖ в возрасте до 14 суток жизни включительно прямые маркеры ЦМВ были обнаружены только у детей 2-ой группы по сравнению с детьми 1-ой группы (табл. 5).

При изучении распространенности инфекционно активного ВПГ в крови, моче, слюне и/или ликворе 109 детей в ОРИТН прямые маркеры ВПГ были выявлены у 28 (25,7% 95%С1 [17,834,9%]), а в отделении физиологии частота детекции активного ВПГ составила 19,1% 95%С1 [9,133,2%]) (9 из 47 детей); статистически значимых различий выявлено не было. У детей 25-27 недель гестации с экстремально низкой массой тела частота выявления инфекционно активного ВПГ составляет 20%, у детей 28-32 недель гестации - 24,6%, 33-37 недель - 38,5% (р>0,05).

Таким образом, нами были установлены различные эпидемиологические закономерности для ВПГ и ЦМВ с точки зрения их распространенности у здоровых и больных новорожденных детей в первые 14 суток жизни. Инфекционно активный ЦМВ чаще выявлялся в биологических средах пациентов ОРИТН и не обнаруживался ни в одном случае у здоровых детей в роддоме.

В то же время статистически значимых различий в распространенности инфекционно активного ВПГ у пациентов 1-ой и 2-ой групп в первые 2 недели жизни выявлено не было. Обнаружение инфекционно активного ВПГ в крови детей 1-й группы не сопровождалось развитием клинико-лабораторного симптомокомплекса герпетической инфекции и не являлось показанием к проведению специфической противовирусной химиотерапии.

Анализ анамнеза матерей детей из отделения физиологии в зависимости от обнаружения маркеров герпесвирусных инфекций показал, что в подгруппе детей, у которых обнаружены прямые маркеры герпесвирусных инфекций, матери реже были здоровы (1/8 (12,5%) против 21/35

(60%), соответственно; р=0,021) и чаще имели клинико-лабораторные признаки урогенитальных инфекций по сравнению с матерями детей, не имевших прямых маркеров ГВИ (5/8 (62,5%) против 6/35 (17,1%), соответственно; р=0,02 (ТКФ)).

Был проведен анализ количества специфических анти-ЦМВ и анти-ВПГ антител классов IgM и IgG в сыворотках крови детей 1-ой и 2-ой групп. При первом обследовании на ЦМВ было изучено 118 проб сыворотки крови: 41 проба у детей 1-ой группы и 77 проб у детей 2-ой группы. Серологические тесты показали, что IgG к антигенам вируса цитомегалии обнаружены в 37 из 41 образца сыворотки крови детей 1-ой группы (90,2%), а в 4 из 41 пробы (9,8%) специфические анти-ЦМВ IgG отсутствовали. У детей 2-ой группы IgG к антигенам вируса цитомегалии обнаружены в 71 из 77 проб сыворотки крови (92,2%), а в 6 из 77 проб (7,8%) специфические анти-ЦМВ IgG отсутствовали. Анти-ЦМВ антитела класса IgM не были выявлены ни в одном случае у детей 1-ой и 2-ой групп в возрасте до 14 суток жизни. Как следует из табл. 6, не было установлено различий частот низкоавидных анти-ЦМВ IgG у детей 1-ой и 2-ой групп, а также при сравнении пациентов ОРИТН в зависимости от срока гестации и от наличия или отсутствия инфекционно активного ЦМВ.

При первом серологическом исследовании на ВПГ было изучено 143 пробы сыворотки крови - 45 проб у детей 1-ой группы и 102 пробы у детей 2-ой группы. IgG к вирусу простого герпеса были выявлены во всех 45 образцах сыворотки крови детей 1-ой группы (100%). У пациентов ОРИТН IgG к антигенам вируса простого герпеса были обнаружены в 101 из 102 проб сыворотки крови (99%), а в 1 из 101 проб (1%) специфические анти-ВПГ IgG отсутствовали. Анти-ВПГ антитела класса IgM не были выявлены ни в одном случае у детей 1-ой и 2-ой групп.

Таблица 6. Частота встречаемости анти-ЦМВ-антител класса различной авидности у детей в критическом состоянии и у здоровых детей_

Авидность Здоровые новорожденные Дети в критическом состоянии в ОРИТН

антител класса дети

IRG (1 группа; п= =41) абс. (%) (2 группа; п= =77) абс. (%)

33-37 38-41 25-27 28-32 33-37 38-41

нед.(п=15) нед.(п=26) нед.(п=10) нед.(п=48) нед.(п=15) нед.(п=4)

<40% 1 1 2 5 0 1

(6,6) (3,8) (20) (10,4) (0) (25)

40-60% 4 4 3 13 3 0

(26,6) (15,3) (30) (27) (20) (0)

> 60% 7 20 5 24 12 3

(46,6) (76,9) (50) (50) (80) (75)

Отрицательные 3 1 0 6 0 0

результаты (20) (3,8) (0) (12,5) (0) (0)

(нет анти-ЦМВ

IgG)

При сравнении 1-ой и 2-ой групп не было выявлено различий по частоте низкоавидных против ВПГ, антител промежуточной авидности и отсутствия анти-ВПГ 1§С в первые 14 суток жизни ни в целом, ни по отдельным гестационным подгруппам, а также в зависимости от наличия

или отсутствия инфекционно активного вируса простого герпеса в средах. Не удалось выявить различий по частоте анти-ВПГ низкой или высокой авидности в зависимости от наличия или отсутствия инфекционно активного ВПГ у детей 2-ой группы.

Таблица 7. Показатели цнтокинов у детей 1-ой и 2-ой групп до 14 суток жизни

Концентрации цитокинов (пг/мл) Здоровые новорожденные дети 1 группа Дети в критическом состоянии в ОРИТН 2 группа Р (иЧеэО

п Ме [Ь0;ЬТ01 N Ме[1Х};и(31

ИЛ-8 в сыворотке 16 40,8 Г8,8; 84,9] 44 124,4 [50; 282,9] 0,005

Индуцированная продукция ИЛ-8 44 34,9 [21,5; 55] 101 23,08 [12,1; 39,6] 0,001

Спонтанная продукция ИЛ-13 45 10 [10; 15] 102 4,9 [3; 10] <0,001

Индуцированная продукция ИЛ-1(3 46 83 [61; 147] 103 236 [83,3; 576,3] <0,001

Индуцированная продукция ИЛ-6 46 10756 [6137; 20741] 104 7143 [3111; 13076] 0,005

Индуцированная продукция ИФН-а 46 20 [5; 63] 44 57,4 [20,8; 137,1] <0,001

С целью изучения особенностей системы цитокинов у недоношенных детей с

внутриутробными инфекциями мы исследовали показатели спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-а, ИФН-у лейкоцитами периферической крови, а также концентрации данных цитокинов в сыворотке крови, моче, спинномозговой жидкости. При сравнении концентраций цитокинов в сыворотках крови детей 1-ой и 2-ой групп мы получили результаты, подтверждающие факт увеличения выработки ИЛ-1[3 и ИФН -а и снижения индуцированной продукции ИЛ-8 и ИЛ-6 у детей с течением врожденной инфекции (табл. 7).

Таблица 8. Характеристика подгрупп детей из ОРИТН с учетом вирусной нагрузки

Показатели Подгруппа 2А Дети с наличием маркеров ЦМВ и/или ВПГ (п=55) Подгруппа 2Б Дети с отсутствием маркеров ЦМВ и/или ВПГ (п=54) Р (ШевО

Ме [ЬО;иО] Ме [ЬО;иО]

Гестационный возраст (нед.) 31,5 [29; 34] 30 [28; 32] 0,52

Вес (граммы) 1395 [1110; 1960] 1300 [980; 1870] 0,27

Рост(см) 39 [35;44] 38,5 [35;42] 0,39

Окружность головы (см) 29 [27;32] 27 [26;32] 0,11

Окружность груди (см) 26 [23;29] 25 [22;28] 0,14

Оценка по шкале Апгар на 1 минуте 6 [5;7] 6 [4;7] 0,3

Оценка по шкале Апгар на 5 минуте 7 [6;7] 7 [6;7] 0,17

Далее нами был проведен анализ клинико-лабораторных особенностей у детей 2-ой группы в зависимости от наличия (подгруппа 2А) или отсутствия (подгруппа 2Б) прямых маркеров герпесвирусов. Подгруппы 2А и 2Б были сопоставимы (табл. 8).

Одной из задач нашей работы было выявить клинико-лабораторные особенности неонатального периода у новорожденных детей с прямыми маркерами герпесвирусных инфекций. Структура основного клинического диагноза у новорожденных детей с положительными результатами исследования прямых маркеров ГВИ в биологических средах представлена на рисунке 1. В подгруппе 2Б врожденная пневмония (Р23.8) была основным клиническим диагнозом у 39 из 54 детей (72,2%), неонатальный сепсис (Р36.8) - у 6 детей (11,1%), церебральная ишемия (Р91.0) - у 5 детей (9,3%), врожденные пороки развития (С>20.8) - у 3 детей (5,6%), другие врожденные вирусные инфекции (Р35.8) — у 1 ребенка (1,8%). У всех пациентов ОРИТН отмечался широкий спектр патологических состояний перинатального периода. Частоты развития таких патологических состояний неонатального периода, как врожденная пневмония, некротизирующий энтероколит, менингоэнцефалит, инфекции мочевыводящих путей, кандидоз, перинатальные поражения ЦНС гипоксически-ишемического и гипоксически-геморрагического генеза, геморрагический синдром, БЛД, ПВЛ, ретинопатия недоношенных, сепсис, конъюгационная желтуха, синдром холестаза, недоношенность и пр., не различались при сравнении подгрупп 2А и 2Б.

□ Врожденная пневмония

■ Врохеденная цитомегаловирусная инфекция

□ Врожденная инфекция, вызванная вирусом простого герпеса

□ Врожденные пороки развития О Врожденный сепсис

ЕВ Церебральная ишемия

Рис.1. Структура основного клинического диагноза у новорожденных детей с положительными результатами исследования прямых маркеров герпесвирусных инфекций в биологических средах в первые 14 суток жизни в отделении реанимации и интенсивной терапии

При выделении группы детей, у которых инфекционно активные ВПГ и/или ЦМВ были обнаружены в крови методом БКМ, нами получены статистически значимые различия по частоте развития некротизирующего энтероколита (табл. 9).

Таблица 9. Частота возникновения НЭК у детей из ОРИТН в зависимости от наличия или отсутствия прямых маркеров ВПГ и/или ЦМВ в крови, выявленных методом БКМ

Патологическое состояние Дети из ОРИТ с наличием прямых маркеров ГВИ, выявленных БКМ в крови Дети из ОРИТ с отсутствием прямых маркеров ГВИ, выявленных БКМ в крови Р (ТКФ)

Некротизирующий энтероколит 10/16 62,5% 6/87 6,8% <0,001

OR 22,5 95% CI [6,08; 83,262] RR 9,063 95% CI [3,834; 21,423] NNH=2 95% CI [1;31

Таблица 10. Частота патологических состояний у детей с положительными и отрицательными результатами детекции прямых маркеров герпесвирусных инфекций в спинномозговой жидкости_

Патологическое состояние Дети с наличием прямых маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости (п=15) Дети без прямых маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости (п=43) Р (ТКФ)

Неонатапьные судороги 14/15 (93,3%) 20/43 (46,5%) 0,0018

OR 16,1 95% CI [1,941; 133,522] RR 2,007 95% CI [1,417; 2,842] NNH=3 95% CI [2;5]

Перивентрикулярная лейкомаляция 5/15 (35,3%) 4/43 (9,3%) 0,04

OR 4,875 95% CI [1,102; 21,568] RR 3,583 95% CI [1,105; 11,616] NNH=5 95% CI [2;48]

Внутрижелудочковое кровоизлияние II-III ст. 7/15 (46,6%) 7/43 (16,3%) 0,009

OR 4,5 95% CI [1,229; 16,477] RR 2,867 95% CI [1,204; 6,824] NNH=4 95% CI [2,-221

Ретинопатия недоношенных, явившаяся показанием к проведению лазеркоагуляции сетчатки 4/15 (26,6%) 1/43 (2,3%) 0,01

OR 15,273 95% CI [1,547; 150,771] RR 11,467 95% CI [1,389; 94,68] NNH=5 95% CI [2; 17]

Бронхолегочная дисплазия 10/15 (66,6%) 15/43 (34,8%) 0,03

OR 3,733 95% CI [1,077; 12,944 RR 1,911 95% CI [1,11; 3,289] NNH=4 95% CI [2;37]

У недоношенных новорожденных детей, имеющих прямые маркеры герпесвирусных

инфекций в спинномозговой жидкости, чаще встречаются такие осложнения неонатального

периода, как перивентрикулярная лейкомаляция, неонатальиые судороги, ВЖК 2-3 ст., тяжелые стадии ретинопатии недоношенных (РН) детей, бронхолегочная дисплазия (табл. 10).

При проведении двухлетнего катамнеза под нашим наблюдением находилось 11 из 15 детей с наличием прямых маркеров герпесвирусных инфекций в СМЖ на первом месяце жизни и 22 из 43 детей с отрицательными результатами исследования на ГВИ в спинномозговой жидкости в ОРИТН (табл.11). В катамнезе к 2 годам жизни детский церебральный паралич (ДЦП) был диагностирован у 5/11 (45,5%) детей; задержка речевого развития отмечалась у 2/11 (18,2%) детей; тугоухость выявлена в одном случае 1/11 (9%); летальные исходы имели место в 2 случаях из 11 (18,2%) (один ребенок умер в возрасте 1 месяца жизни с диагнозом «Генерализованная внутриутробная инфекция вирусно-бактериальной этиологии», второй - в возрасте 7 месяцев жизни, диагноз «Менингококковый менингит»). Отклонений от нормы в соматическом и неврологическом статусе не было выявлено только у 1 ребенка из 11 (9%), в то время как в группе детей, не имевших прямых маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости в неонатальном периоде, здоровыми к двум годам были 8 из 22 детей (36,4%; р=0,212 (ТКФ)).

Таблица 11. Психоневрологическая инвалидность детей с неонатальпыми инфекциями по результатам двухлетнего катамнеза__

Патологическое состояние Дети с наличием прямых маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости в неонатальном периоде (п=11) Дети без прямых маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости в неонатальном периоде (п=22)

Детский церебральный паралич 5 (45,5%) 1 (4,5%)

р=0,0096 (ТКФ) 01117,5 95% С1 [1,701; 180,027] Ш* 10 95% С1 (1,325; 75,489] NN11=3 95% С1 [1; 9]

Мы изучали особенности показателей гемограммы у новорожденных детей с осложненным

течением неонатального периода в зависимости от вирусной и бактериальной нагрузки (табл.12).

Таблица 12. Показатели общего анализа крови у детей до 14 суток жизни в отделениях реанимации и интенсивной терапии с учетом микробиологического статуса и наличия

Показатели Общего Анализа Крови Дети с наличием маркеров ГВИ и отсутствием роста патологической флоры Дети с наличием роста условно патогенной флоры и отсутствием маркеров ГВИ Р (ШеэО

п Ме [Ь(5;и0] п Ме [ЬО;иС>]

Тромбоциты (х109/л) 23 215 [126; 295] 28 280 [200; 392] 0,029

Лимфоциты (%) 24 20 [15; 30,5] 29 28 [19; 38] 0,045

Лимфоциты (х107л) 17 3,4 [2,2; 4,6] 22 4,8 [3,7; 6,95] 0,011

Анализ гемограммы детей из ОРИТ показал, что персистенция герпесвирусов в биологических средах организма новорожденных детей сопровождается более выраженной лимфопенией и тромбоцитопенией по сравнению с воздействием бактериальных агентов при отсутствии инфицирования герпесвирусами (табл.12).

Было проанализировано влияние вирусной нагрузки на изменение показателей цитокинов крови у детей с осложненным течением неонатального периода (табл.13, 14).

Таблица 13. Показатель спонтанной продукции ИЛ-1Р (иг/мл) лейкоцитами детей с положительными и отрицательными результатами теста на наличие маркеров ВПГ в крови

Уровни цитокинов в крови (пг/мл) Дети из ОРИТ с наличием прямых маркеров ВПГ в крови Дети из ОРИТ с отрицательными результатами теста на ЦМВ и ВПГ в крови и других локусах Р (ШеэО

п Ме [1Л}; ир] п Ме [Ь(3; ид]

ИЛ-1Р спонтанная продукция 22 3 [3; 10] 37 Ю [3; 34,7] 0,019

Таблица 14. Показатель спонтанной продукции ИФН-у (пг/мл) лейкоцитами детей с положительными и отрицательными результатами теста на наличие маркеров ЦМВ в крови

Цитокин в крови (пг/мл) Дети из ОРИТ с наличием прямых маркеров ЦМВ в крови Дети из ОРИТ с отрицательными результатами теста на ЦМВ и ВПГ в крови и других локусах р (ШевО

п Ме [ьд;ид] N ме [ьд;и]д]

ИФН-у спонтанная продукция 22 3[1;3] 37 5 [3; 21,1] <0,001

Таблица 15. Сравнение показателей цитокинов (пг/мл) у детей с наличием в крови прямых маркеров ВПГ и/или ЦМВ и без таковых в отделениях реанимации и интенсивной терапии до 14 суток жизни

Концентрации цитокинов (пг/мл) Дети из ОРИТ с наличием прямых маркеров ЦМВ и/или ВПГ в крови Дети из ОРИТ с отрицательными результатами теста на ЦМВ и ВПГ в крови и других локусах Р (ШезО

п ме [ьд;ид] N Ме [ьд;ид]

Спонтанная продукция ИЛ-1(3 31 3 [2,1; 10] 63 10 [3; 10] 0,028

Спонтанная продукция ИФН-а 32 5 [1,6;5] 65 5 [5; 5] 0,028

Спонтанная продукция ИФН-у 31 3 [2; 7,5] 63 5,6 [3; 20,5] 0,007

Индуцированная продукция ИФН-у 31 5,7 [3; 15,6] 63 14,4 [4,1; 27,3] 0,018

Данные, приведенные в табл. 13, 14 и 15, свидетельствуют о том, что у новорожденных детей с положительными прямыми маркерами герпесвирусных инфекций в крови снижена величина спонтанной продукции ИЛ-1, ИНФ-а и ИФН-у и индуцированной продукции ИНФ-у. Таблица 16. Сравнение показателей спонтанной продукции ИФН-а (пг/мл) у детей 1-ой и 2-

Цитокины (пг/мл) Дети с наличием высокоавидных анти-ЦМВ (трансплацентарных) Дети с наличием низкоавидных анти-ЦМВ (острая форма ЦМВ-инфекции) Р (ичеэО

п Ме [Ь(2; и(3] п Ме [КЗ; и(2]

Величина спонтанной продукции ИФН-а 40 19,4 [10; 30,1] 7 5 [5; 12] 0,023

Было установлено, что дети Той и 2-ой групп с наличием низкоавидных анти-ЦМВ антител класса ^О имеют сниженный уровень спонтанной продукции ИФН-а по сравнению с детьми, имевшими высокоавидные анти-ЦМВ (табл. 16).

Дети, у которых прямые маркеры герпесвирусных инфекций были зарегистрированы в спинномозговой жидкости, имели дисбаланс в системе цитокинов по сравнению с детьми, не имевшими прямых маркеров ГВИ в СМЖ (табл. 17).

Таблица 17. Показатели цитокннов в спинномозговой жидкости детей с наличием прямых маркеров ЦМВ и/или ВПГ и детей без маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости

Концентрации цитокинов (пг/мл) Дети из ОРИТ с наличием маркеров ЦМВ и/или ВПГ в спинномозговой жидкости (п=15) Дети из ОРИТ без маркеров ГВИ в спинномозговой жидкости (п=43) Р (ичевО

п Ме [Ь<3; Щ] п Ме [Ь(2; иО]

ШЫрвСМЖ 3 3 [3; 3] 8 10 [3,5; 10] 0,04

ИЛ-6 в ликворе 4 170 [112; 612] 17 10 [10; 36] 0,007

Уровень индуцированной продукции ИЛ-8 лейкоцитами крови 13 1638 [1613; 19032] 36 30769 [13562; 48037] 0,009

ИЛ-6 в сыворотке крови 9 42,7 [25,4; 67] 14 11 [10; 20,9] 0,03

У детей с наличием прямых маркеров ГВИ в СМЖ отмечается сниженная концентрация ИЛ-1Р в ликворе и подавление индуцированной продукции ИЛ-8 лейкоцитами крови при увеличении концентрации ИЛ-6 в ликворе и сыворотке крови.

При оценке системы цитокинов необходимо учитывать результаты микробиологического исследования. Существует точка зрения, что глубоконедоношенные дети обладают сниженной способностью к синтезу провоспалительных медиаторов в случае генерализации бактериальной инфекции (Нацие К., 2010). С учетом этих данных целесообразно было выделить группы детей с наличием или отсутствием патогенной бактериальной микрофлоры и одновременным выявлением прямых маркеров герпесвирусных инфекции и/или без таковых.

Таблица 18. Сравнение показателей цитокинов у детей 2-ой группы до 14 суток жизни с учетом микробиологического статуса и наличия маркеров герпесвирусных инфекций_

Концентрация (пг/мл) Дети с наличием маркеров ГВИ и отсутствием роста патологической флоры Дети с наличием роста условно патогенной микрофлоры и отсутствием маркеров ГВИ Р (ШеэО

п Ме [Ь(5; и0] п Ме [1.0; и<3]

Уровень спонтанной продукции ИЛ-1Р 22 5 [1,84; 21,5] 26 1,65 [1,5; 5] 0,037

Как видно из табл. 18, у детей с наличием вирусной нагрузки уровень спонтанной выработки ИЛ-1Р был статистически значимо выше, чем у детей с отсутствием прямых маркеров герпесвирусов при наличии роста условно патогенной бактериальной флоры.

Одной из важнейших проблем неонатологии является разработка эффективной терапии герпесвирусных инфекций у новорожденных детей. Перспективным подходом к лечению ВУИ является использование препаратов интерферонов, способных усиливать цитотоксическую активность лимфоцитов и макрофагов и способствовать тем самым повышению противовирусного иммунитета. В Российской Федерации для лечения новорожденных детей разрешен препарат «Виферон»®, основой которого является рекомбинантный интерферон-а2Ь человека. Действие препарата «Виферон»® оценивали путем сравнительного анализа клинико-лабораторных показателей и исходов заболевания при базовом комплексном лечении ВУИ и при той же терапии с включением препарата «Виферон»®.

С целью изучения клинической эффективности препарата рекомбинантного интерферона-а2Ъ человека (Виферон®) при инфекционных заболеваниях в неонатальном периоде все дети были разделены на 2 группы: получающие в составе комплексной терапии препарат «Виферон»® (основная группа) и получающие аналогичную стандартную комплексную терапию без иммунокоррекции (группа сравнения). Сравнительная характеристика подгрупп пациентов ОРИТН, страдающих внутриутробными инфекциями, в зависимости от включения препарата «Виферон»® в комплексную терапию представлена в табл. 19. На момент включения детей в исследование подгруппы были сопоставимы по основным клиническим параметрам (количеству очагов инфекции, количеству детей находившихся на полном парентеральном питании и на вспомогательной вентиляционной терапии и т.д.) и базисной комплексной терапии.

Таблица 19. Характеристика групп детей с внутриутробными инфекциями, получавших и не

получавших препарат «Виферон»®

Клинические параметры Дети, получившие Дети, не получившие

терапию препаратом терапию препаратом P

«Виферон»® «Виферон»® (U-iest)

(основная) (группа сравнения)

(п =94) (п =57)

Me [LQ; UQ] Me [LQ; UQ]

(min-max) (min-max)

Гестационный возраст 31 [28; 35] 30 [28; 32] 0,07

(недели) (25-41) (26-41)

Масса тела (граммы) 1390 [1110; 2080] 1305 [997,5; 1900] 0,18

(650-4400) (450-3940)

Длина тела (см) 40 [35; 45] 38 [35; 42] 0,12

(29-54) (25-53)

Окружность головы (см) 29 [27;31] 28 [26;32] 0,30

(23-26) (20-37)

Окружность груди (см) 25 [23;27] 24 [22;28] 0,53

(20-35) (15-35)

Оценка по Апгар на 1 6 [4,5; 7] 6 [4; 7] 0,76

минуте жизни (баллы) (2-9) (0-8)

Оценка по Апгар на 5 7 [6; 7] 7 [6; 7] 0,53

минуте жизни (баллы). (5-9) (0-9)

В данном проспективном исследовании показанием к назначению препарата «Виферон»®

детям являлось тяжелое течение внутриутробной инфекции (особенно при" выявлении инфекционно активного вируса или ДНК ВПГ или ЦМВ). Препарат «Виферон»® вводили ректально по 1 свече, содержащей 150 ООО ME рекомбинантного интерферона-а2Ь человека, каждые 12 часов в течение 7 дней.

Показатели спонтанной продукции интерферонов и их концентрации в сыворотке крови приближались к порогу чувствительности тест-систем и значимо не различались у детей 1-й и 2-й групп. В связи с высокой вариабельностью значений индуцированной продукции ИФН-а дети с ВУИ были разделены на две подгруппы: в первую подгруппу (1А) включены дети с высоким исходным показателем (>62,4 [Me] пг/мл) индуцированной продукции ИНФ-а, во вторую подгруппу (1Б)~ с низким показателем индуцированной продукции цитокина (<62,4 [Me] пг/мл) до лечения. Количественный анализ ИНФ-а показал, что в первой подгруппе в результате базового лечения с применением препарата «Виферон»® показатель индуцированной продукции ИНФ-а снижался в 1,5 раза (медианы: 126,3 пг/мл - до лечения и 88 пг/мл - после лечения, р=0,046; W-test). Во второй подгруппе, напротив, выявлено увеличение индуцированной продукции ИНФ-а (медианы 26,2 пг/мл - до лечения и 84,5 пг/мл после лечения, р=0,027; W-test) и индекса стимуляции продукции ИНФ-а (табл.20). Это свидетельствует об иммуномодулирующем действии препарата «Виферон»®, которое выражалось в разнонаправленном изменении уровней

индуцированной продукции ИФН-а лейкоцитами недоношенных детей с ВУИ в зависимости от величины исходного уровня (рис.2).

Рисунок I. Изменение показателя индуцированной продукции ИФН-а у недоношенных детей с врожденной инфекцией в результате лечения с применением препарата «Виферон»® в I зависимости от исходного уровня индуцированной продукции ИФН-а.

Рисунок 3. Изменение показателя индуцированной продукции ИФН-у у недоношенных детей с клиническими признаками врожденной инфекции в результате базового лечения с применением препарата «Виферон»®.

Таблица 20. Сравнение индекса стимуляции продукции ИФН-а до и после применения препарата «Виферон»®_

Группы детей Индекс стимуляции Р (W-test)

1 -я точка исследования (до лечения) 2-я точка исследования (после лечения)

Дети с препаратом «Виферон»® с исходно низкими уровнями 2,5 [1,5;6,9] 17 [3,4;21] 0,02

Дети без препарата «Виферон»® с исходно низкими уровнями 3,4 [1;6] 3,4 [1;8] 0,9

Дети с препаратом «Виферон»® с исходно высокими уровнями 25 [21;37] 11,4 [8,8;2] 2 0,003

Дети без препарата «Виферон»® с исходно высокими уровнями 34,5 [17;80] 15,4 [5,4;42,7] 0,006

22

У детей с исходно низким показателем индуцированной продукции ИНФ-у после лечения препаратом «Виферон»® показатель индуцированной продукции ИНФ-у статистически значимо возрастал (медианы 5 пг/мл и 31 пг/мл, соответственно, р=0,001, \V-test). У детей с исходно высоким показателем индуцированного ИНФ-у после терапии этот показатель значимо не изменялся (р=0,75; \V-test) (рис. 3). У детей, не получавших препарат «Виферон»® в составе комплексной терапии, в динамике не происходило значимых изменений показателя индуцированной продукции ни ИФН-а, ни ИФН-у.

При сравнении патологической симптоматики и нозологических форм заболеваний, их тяжести и исходов у детей, получавших и не получавших препарат «Виферон»®, было получено статистически значимое различие по частоте формирования бронхолегочной дисплазии и тяжелых форм ретинопатии (табл. 21).

Таблица 21. Частота развития бронхолегочной дисплазии и тяжелых форм ретинопатии недоношенных у детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции, получавших и не получавших терапию препаратом «Виферон»® _

Диагноз Основная rovnna с препаратом «Виферон»® Группа сравнения без препарата «Виферон»® Р (ТКФ)

Бронхолегочная дисплазия (БЛД) 16/94 17% 18/57 31,53% 0,04

OR 0,444 95% CI [0,205; 0,965] RR 0,539 95% CI [0,3; 0,97]

Задняя агрессивная ретинопатия недоношенных среди детей с РН 1/35 2,8% 4/19 21% 0,04

OR 0,11 95% CI [0,011; 1,072] RR 0,136 95% CI [0,016; 1,129]

В соответствии с международными критериями оценки выживаемости при исследовании

эффективности препаратов в клинической практике учитывали летальность в течение 28 суток, следующих за введением препарата «Виферон»® (табл. 22).

Таблица 22. Сравнение показателей летальности у детей с клиническими признаками врожденной инфекции, получавших н не получавших терапию препаратом «Внферон»®

Диагноз Основная группа с препаратом «Виферон»® Группа сравнения без препарата «Виферон»® P (ТКФ)

ВУИ 4/94 (4,2%) 10/57(17,5%) 0,009

OR = 0,21 95% CI [0,05 - 0,67] NNT=8 95% CI [4; 29] RR = 0,26 95% CI [0,07 - 0,69]

Некротизирующий энтероколит (НЭК) 3/50(6%) 7/25 (28%) 0,01

C)R = 0,15 95% CI [0,017-0,716] NNT=5 95% CI [2; 20] RR = 0,21 95% CI [0,03 - 0,741 ]

Пневмония 2/84 (2,3%) 10/55(18%) 0,002

OR = 0,12 95% CI [0,015-0,615] NNT=7 95% CI [4; 17] RR = 0,11 95% CI [0,019 - 0,65]

выводы

1. Распространенность инфекционно активного ВПГ в биологических средах пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных (25,7% 95%С1 [17,834,9%]) и детей из отделения физиологии новорожденных (19,1% 95%С1 [9,1-33,2%]) не различалась. Распространенность прямых маркеров ВПГ у новорожденных детей не зависит от срока гестации: у детей 25-27 недель гестации с экстремально низкой массой тела при рождении частота выявления инфекционно активного ВПГ составляет 20%, у детей 28-32 недель гестации - 24,6%, 33-37 недель - 38,5% (р>0,05).

2. Инфекционно активный цитомегаловирус выявляется чаще у пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных (16,5% 95%С1 [10-24,8%]) по сравнению со здоровыми детьми из отделения физиологии новорожденных (0% 95%С1 [07,5%]; р=0,002 (ТКФ)). У детей 25-27 недель гестации с экстремально низкой массой тела при рождении частота выявления инфекционно активного ЦМВ составляет 6,7%, у детей 28-32 недель гестации - 14,8%, 33-37 недель - 30,8% (р>0,05).

3. В анамнезе матерей детей из отделения физиологии новорожденных с наличием прямых маркеров герпесвирусных инфекций в биологических средах статистически значимо чаще выявлялись указания на клинико-лабораторные признаки урогенитальных инфекций по сравнению с матерями детей, не имевших прямых маркеров герпесвирусных инфекций (62,5% против 17,1%, соответственно; р=0,02 (ТКФ)).

4. Частота развития некротизирующего энтероколита у новорожденных детей с внутриутробными инфекциями при наличии в крови инфекционно активных вирусов цитомегалии и/или простого герпеса выше, чем у детей с внутриутробными инфекциями и отрицательными результатами исследования инфекционно активных герпесвирусов в крови (62,5% против 6,8%, соответственно; р<0,001 (ТКФ)).

5. Неонатальные судороги, перивентрикулярная лейкомаляция, внутрижелудочковые кровоизлияния 2-3 степени, тяжелые стадии ретинопатии недоношенных, бронхолегочная дисплазия статистически значимо чаще развиваются у недоношенных детей при выявлении прямых маркеров цитомегаловируса и/или вируса простого герпеса в спинномозговой жидкости по сравнению с детьми с отрицательными результатами исследования прямых маркеров герпесвирусных инфекций в спинномозговой жидкости. Формирование детского церебрального паралича в раннем детском возрасте чаще отмечалось у тех детей, у которых в неонатальном периоде в спинномозговой жидкости обнаруживали прямые маркеры ЦМВ и/или ВПГ, по сравнению с детьми без таковых (45,5% против 4,5%, соответственно; р<0,01 (ТКФ)).

6. Показатели врожденного иммунитета у новорожденных детей, имеющих прямые маркеры цитомегаловируса и/или вируса простого герпеса в спинномозговой жидкости и/или в

24

крови, характеризуются сниженными уровнями продукции интерферона-а, интерферона-у, интерлейкина-1|3 по сравнению с детьми без прямых маркеров герпесвирусных инфекций (р<0,05), что свидетельствует о снижении у них противовирусного иммунитета.

7. Выявление низкоавидных анти-ЦМВ антител класса вырабатывающихся в начале первичного иммунного ответа на вирус, ассоциировано со снижением спонтанной продукции эндогенного ИФН-а, что подчеркивает необходимость применения патогенетически обоснованных способов иммунокоррекции, направленных на нормализацию уровня ИФН-а и усиление цитотоксической активности лимфоцитов и макрофагов.

8. Включение препарата рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®) в состав комплексной терапии внутриутробных инфекций способствует модулирующему влиянию на величину индуцированной продукции ИФН-а лейкоцитами недоношенных детей, статистически значимо снижает показатель летальности, частоту возникновения бронхолегочной дисплазии и тяжелых форм ретинопатии недоношенных детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Распространенность вирусов простого герпеса и цитомегалии у новорожденных детей в отделениях реанимации и взаимосвязь наличия маркеров герпесвирусов в биологических средах детей с развитием тяжелых, инвалидизирующих патологических состояний свидетельствуют о необходимости проведения диагностики ЦМВ и ВПГ методом ПЦР и быстрым культуральным методом в качестве скрининговой процедуры при поступлении детей в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. Учитывая низкую степень согласия между методами ПЦР и БКМ, необходимо дополнительное исследование прямых маркеров ЦМВ и ВПГ быстрым культуральным методом в случае отрицательного результата ПЦР при подозрении на вирусную этиологию врожденной инфекции.

2. Снижение продукции эндогенных интерферонов у недоношенных детей, находящихся в критическом состоянии в отделении реанимации, с наличием прямых маркеров герпесвирусов в крови, спинномозговой жидкости и других локусах, является иммунопатогенетическим обоснованием для назначения заместительной терапии препаратом рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®).

3. С целью коррекции выработки эндогенного интерферона-а2Ь, для снижения показателей летальности и частоты тяжелых инвалидизирующих осложнений у недоношенных детей, страдающих врожденными инфекциями, рекомендуется в отделении реанимации и интенсивной терапии включать в состав комплексной терапии врожденных инфекций препарат рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®) в дозе 150000 МЕ ректально каждые 12 часов в течение 7 дней.

25

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Солдатова И.Г., Гетия Е.Г., Ашиткова Н.В., Бирюкова Т.В., Булгакова Н.Т., Попова И.Д., Худолеева Е.Б., Кыштымов М.В., Эверстова Т.Н., Володин H.H., Дегтярева М.В. Клиническая эффективность препарата Виферон-1 в комплексной терапии бактериальных пневмонии у новорожденных детей различного гестационного возраста. // Педиатрия им. Сперанского - 2007. -Т.86, №4. -С.105-111.

2. Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Федорова Н.Е., Щербо С.Н., Евсегнеева Ж.В., Гущин B.C., Выжлова E.H., Малиновская В.В., Кущ А.А, Гстия Е.Г., Дегтярева М.В. Выявление маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей. // VI Конгресс детских инфекционистов России "Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики", 13-14 декабрь, Москва - 2007, стр. 18-19.

3. Гаджиева З.С., Павлова М.В., Гетия Е.Г., Н.Н.Володин, Ж.В. Евсегнеева, С.Н. Щербо, E.H. Выжлова, P.P. Климова, Н.Е. Федорова, М.В. Дегтярева, В.В. Малиновская, A.A. Кущ. Динамика маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей в отделениях реанимации и интенсивной терапии.//Педиатрия им. Сперанского - 2008. -Т..87, №3. -С. 143-144.

4. Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гаджиева З.С., Павлова М.В., Климова P.P., Володин H.H., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Кущ A.A. Интерфероновый статус недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и его коррекция вифероном. // Российский аллергологический журнал - 2008. - №6. - С.74-81.

5. Pavlova M.V., Fedorova N.E., Gadzhieva Z.S., Kushch A.A. Getiya E.G., Degtyareva M.V., Malinovskaya V.V., Shcherbo S.V., Evsegneeva Zh.V. Quantitative methods of analysis of cytomegalovirus infection in preterm infants during the 6 months. // Clinical Virology Annual Meeting, Saariselkä, 12-15 March, Lapland, Finland - 2008, p.28.

6. Павлова M.B., Федорова H.E., Гаджиева 3.C., Евсегнеева Ж.В., Щербо С.Н., Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин H.H., Малиновская В.В., Кущ A.A. Алгоритм лабораторной диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции у недоношенных новорожденных детей и влияние терапии Вифероном на течение внутриутробной инфекции у детей первого года жизни. // Педиатрия им. Сперанского - 2009. - Т.87, №2. - С.55-62.

7. Кущ A.A., Дегтярева М.В., Малиновская В.В., Солдатова И.Г., Климова P.P., Серова Е.В., Гетия Е.Г., Цибизов A.C., Гаджиева З.С. Эффективность лечения рекомбинантным интерфероном! -2 (Вифероном®) недоношенных детей с тяжелыми внутриутробными инфекциями // Детские инфекции - 2009. - №3. - С.40-44.

8. Degtyareva M.V., Soldatova I.G., Volodin N.N., Getiya E.G., Malinovscaya V.V., Adieva A.A., Klimova R.R., Kushch A.A. Prevalence of CMV-markers in premature neonates and efficacy of human recombinant interferon-a2b (VIFERON) in treatment of neonatal infections. 27 Annual Meeting of the European Society For Paediatric Infectious Diseases -ESPID- Brussels, 2009, стр.143.

9. Гетия Е.Г., Солдатова И.Г., Володин H.H., Бабак O.A., Павлова М.В., Федорова Н.Е., Гаджиева З.С., Адиева A.A., Выжлова E.H., Малиновская В.В., Кущ A.A., Дегтярева М.В. Динамика маркеров цитомегаловирусной инфекции у пациентов отделений реанимации недоношенных детей на первом году жизни и влияние терапии вифероном на исход внутриутробной инфекции. //Российский журнал кожных и венерических болезней (приложение «Герпес») -2010.-№1, с.23-28.

10. Климова P.P., Малиновская В.В., Гусева Т.С., Паршина О.В., Гетия Е.Г., ., Дегтярева М.В., Солдатова И.Г., Володин H.H., Гаджиева З.С., Цибизов A.C., Кущ A.A. Анализ провоспалительных цитокинов у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции и маркерами вируса простого герпеса до и после лечения

вифероном. // Сборник аннотированных докладов 3-ей Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные аспекты соматической патологии у детей >>, г. Москва, 19-20 мая 2010,- стр. 81-83,11. Malinovskaya V.V., Parshina O.V., Guseva T.S., Klimova R.R., Getiya E.G., Gadzhieva A.S., Tsibisov I.G., Soldatova I.G., Volodin N.N., Kushch A.A. Analysis of proinflammatory cytokines in preterm newborns with markers of herpes simplex virus (HSV) and/or cytomegalovirus (CMV) infections. //The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. Vol.23.suppl.l, p. 609. 2010.

Список использованных сокращений

БКМ - быстрый культуральный метод

БЛД - бронхолегочная дисплазия

ВПГ - вирус простого герпеса

вжк -внутрижелудочковое кровоизлияние

ВУИ - внутриутробная инфекция

гв - гестационный возраст

гви - герпесвирусные инфекции

ДГКБ - детская городская клиническая больница

дцп -детский церебральный паралич

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

ИА - индекс авидности

ивл - искусственная вентиляция легких

ил - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН-а - интерферон - а

ИФН-у -интерферон-у

Me - медиана

МКА - моноклонапьные антитела

НЭК - некротизирующий энтероколит

ОРИТН - отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных

пвл - перивентрикулярная лейкомаляция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РН - ретинопатия недоношенных

смж - спинномозговая жидкость

ТКФ - точный двухсторонний критерий Фишера

цмв - цитомегаловирус

цмви - цитомегаловирусная инфекция

УГИ - урогенитальная инфекция

ФГБУ - Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение

ФЛЕЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

CI - confidential interval (доверительный интервал)

LQ - нижний квартиль

NNH - number needed to harm (количество пациентов, которых надо подвергнуть действию

фактора риска для получения одного неблагоприятного исхода)

NNT - number needed to treat (количество пациентов, которых надо пролечить для предотвращения

одного летального исхода)

OR - Odds Ratio (отношение шансов)

RR - Relative Risk (относительный риск)

UQ - верхний квартиль

U-test - непараметрический тест Манна-Уитни

W-test - непараметрический тест Вилкоксона

Заказ № 07-А/07/2011 Подписано в печать 07.07.2011 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1.0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таН: info@cfr.ru

Актуальность проблемы. За последние годы в клинической практике значительно увеличилось число больных, страдающих хроническими рецидивирующими герпесвирусными инфекциями, которые сопровождаются определенными нарушениями иммунного статуса и трудно поддаются лечению. Согласно данным литературы, рецидивирующие герпесвирусные инфекции наблюдаются у 20-25% жителей разных стран [3, 5, 17, 32, 35, 42, 43, 55, 63 , 67 , 111, 122, 126 , 154 , 170 , 177 ]. Вирусы простого герпеса и цитомегалии представляют серьезную угрозу для репродуктивного здоровья населения, вызывая клинически манифестные формы тяжелой цитомегаловирусной и герпетической инфекции, самопроизвольные выкидыши, мертворождение, формирование пороков развития плода, менингоэнцефалит, последующую инвалидизацию [23, 33, 69, 84, 90, 96, 107, 109, 132, 138, 157,166, 179, 180, 184].

Главными биологическими и патогенетическими особенностями герпес-вирусов являются их пожизненное персистирование в организме инфицированного ими человека, зависимость течения хронического инфекционного процесса от состояния иммунитета вирусоносителя и склонность к рецидивированию при ослаблении иммунного контроля [30, 46, 122, 139, 176]. Ослабление иммунной защиты может индуцироваться самими вирусами, обладающими большим набором белков, подавляющих иммунную систему и снижающих роль факторов противовирусной защиты, клеточного звена иммунитета, естественных киллерных клеток и системы интерферона [28,47, 65,66, 73,91, 97, 1 19]. Сама реактивация вирусов вследствие увеличения выработки вирусных белков - "супрессоров" усугубляет вторичный иммунодефицит со всеми вытекающими из этого последствиями [29,48, 101, 102, 118, 143].

С учетом экспериментальных данных о взаимодействии разных лимфотропных вирусов группы герпеса и их способности поражать клетки разных органов и систем представляется актуальным определить распространенность вирусов простого герпеса и цитомегалии среди новорожденных детей — пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии, страдающих тяжелыми формами перинатальной патологии. Очень важно установить распространенность сочетанного присутствия данных вирусов в биологических средах у новорожденных детей и проанализировать их влияние на динамику клинико-лабораторных показателей с целью оценки возможного вклада этих вирусов в патогенез и отдаленные исходы заболевания, что необходимо для разработки патогенетически обоснованных схем комплексного лечения этой категории больных.

За последние годы было разработано и внедрено в клиническую практику большое количество современных методов лабораторной диагностики, включающих не только верификацию этиологического агента (идентификация самого вируса, его генома или антигенов) и обнаружение-серологических маркеров иммунного ответа (специфических антител), но и определение остроты инфекционного процесса (изучение активности репликации вируса и раздельное определение анти-ЦМВ-АТ классов ^М и с их авидностью) [22, 33, 37, 44, 68, 70, 71, 75-79, 95, 99, 114, 149, 160, 165]. Однако эффективность и информативность указанных методов при диагностике неонатальной ЦМВИ и ВПГ-инфекции неодинаковы [80, 89, 98, 105,1 13,1 15, 117,12 0,1 28, 140,1 42, 175]. Разработка современного эффективного алгоритма диагностики, профилактики и лечения инфекций, вызванных ЦМВ и/или ВПГ, у новорожденных и детей раннего возраста является важной задачей педиатрии, имеющей не только научное, но и практическое значение.

По данным литературы, внутриутробное попадание ЦМВ в околоплодные воды или организм плода в 82-95% случаев не сопровождается клиническими проявлениями в неонатальном периоде [15, 19, 50, 74, 83, 181]. У 5-18% инфицированных детей вскоре после рождения выявляются манифестные клинические формы, при этом большая часть симптомов обусловлена нарушением внутриутробного развития плода и системной воспалительной реакцией организма плода и новорожденного ребенка [2, 10, 11, 13, 21, 24, 60]. В то же время у многих недоношенных детей симптомы внутриутробной инфекции могут протекать стерто, под маской и на фоне хронической внутриутробной гипоксии. При этом системная воспалительная реакция слабо выражена, а признаки инфекционного токсикоза, вызванного ЦМВ или ВПГ, трудноотличимы от симптомов полиорганной недостаточности, связанной с неинфекционными причинами [7, 9, 24, 39]. У 80% детей, перенесших тяжелую форму внутриутробной ЦМВИ, в дальнейшем отмечаются разнообразные соматические и психоневрологические осложнения. При бессимптомном течении внутриутробной ЦМВИ у 5-17% детей впоследствии также имеются различные нарушения здоровья (сенсорная глухота, задержка психомоторного, речевого развития) [8, 58, 82, 84, 173].

Внутриутробное инфицирование плода ЦМВ в ряде случаев создает предпосылки для развития иммунной толерантности к этому возбудителю с формированием его персистенции и реактивации в постнатальном периоде [40, 54, 59, 106, 108, 158]. В некоторых случаях внутриутробная ЦМВИ носит генерализованный характер, протекая с преимущественным поражением центральной нервной системы, желудочно-кишечного тракта, печени, почек и легких [112, 116, 152, 153, 159, 161].

При инфицировании женщины вирусом простого герпеса за несколько дней или за месяц до родов, возможность заражения плода является наибольшей и составляет 70% [121, 12 4, 181]. Для уменьшения риска инфицирования плода показано родоразрешение путём операции кесарева сечения. Чаще всего встречается рецидивирующий герпес гениталий. При рецидиве генитального герпеса за несколько дней до родов риск поражения плода равен 2—5%. В этой ситуации также рекомендуется кесарево сечение. В случае обострения генитального герпеса за 4 недели до родов или наличия его в анамнезе риск инфицирования плода существенно ниже (0,1%). При этом возможно родоразрешение через естественные родовые пути. При обнаружении вируса герпеса в нижних отделах генитального тракта без клинических проявлений генитального герпеса никаких специальных мероприятий не проводится, т. к. риск поражения плода при этом составляет 0,01% [1, 37, 57, 129, 131, 137, 147].

В последние годы основное внимание исследователей было обращено на молекулярно-биологические аспекты развития и методы выявления вирусной инфекции. Были идентифицированы ДНК-последовательности, кодирующие ряд белков ЦМВ и ВПГ человека, и установлено функциональное значение некоторых из них [65, 66, 73].

Особый интерес представляют исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию. Так, было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках, способствует существенному увеличению митотического индекса в инфицированной культуре. В середине 90-х годов появилось несколько работ, опровергающих эти данные. Было установлено, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из в! - периода в фазу синтеза ДНК и переход из стадии С2 в М, в точке, обозначаемой как С2/М [29, 30, 91, 97]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Таким образом, в настоящее время нет точных сведений о распространенности герпес-вирусных инфекций у новорожденных детей различного срока гестации, особенно у пациентов отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН), о клинико-лабораторных параллелях и клинических формах. Не определены особенности системы врожденного иммунитета, цитокинового статуса у новорожденных детей с тяжелой перинатальной патологией в зависимости от наличия или отсутствия маркеров ВПГ и ЦМВ, не установлено прогностическое значение изменений уровней цитокинов при неонатальных герпесвирусных инфекциях, не оценено влияние иммуномодулирующей терапии препаратом рекомбинантного интерферона-а2Ь человека на клиническую симптоматику, вирусную нагрузку и динамику лабораторных показателей у пациентов ОРИТН. В силу вышеизложенных факторов и было предпринято настоящее исследование.

Цель исследования: разработать патогенетически обоснованные показания к назначению иммунокорригирующей терапии и оценить клиническую эффективность иммунотерапии у новорождённых детей различного гестационного возраста с различными формами перинатальных герпесвирусных инфекций.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить распространенность и клиническое значение инфицирования вирусами простого герпеса и цитомегалии недоношенных детей с низкой и экстремально низкой массой тела в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных, а также в отделении физиологии новорожденных» детей.

2. Установить клинические и иммунологические особенности течения неонатального периода у детей различного гестационного возраста, инфицированных ЦМВ и ВПГ.

3. Установить характер изменений показателей противовирусного иммунитета у новорожденных детей различного гестационного возраста, инфицированных ЦМВ и ВПГ, в том числе в динамике на фоне иммунокорригирующей терапии.

4. Обосновать показания к назначению иммунокорригирующей терапии и оценить эффективность иммунотерапии препаратом рекомбинантного интерферона-а2Ь человека («Виферон»®) при осложненном течении неонатального периода у новорожденных детей различного гестационного возраста.

Научная новизна. При выполнении исследования впервые использован комплексный подход к лабораторной диагностике с одновременным применением комбинации методов: вирусологическое исследование (быстрый культуральный метод), полимеразная цепная реакция, серологические методы: исследование концентраций специфических анти-ВПГ-антител и анти-ЦМВ-антител классов 1^0 и ^М методом иммуноферментного анализа, определение индекса авидности специфических

Показано, что частота внутриутробного инфицирования ВПГ и ЦМВ недоношенных новорожденных с осложненным течением неонатального периода составляет 25,7% и 16,5%, соответственно.

Установлено, что выявление инфекционно активных герпесвирусов в крови недоношенных детей в 62,5% случаев сопровождалось клинической картиной некротизируюгцего энтероколита.

Доказана взаимосвязь между фактом наличия прямых маркеров герпесвирусных инфекций в спинномозговой жидкости и высокой частотой развития таких осложнений неонатального периода, как перивентрикулярная лейкомаляция, неонатальные судороги, внутрижелудочковые кровоизлияния 2-3 степени, тяжелые стадии ретинопатии недоношенных детей, бронхолегочная дисплазия у недоношенных детей.

Научно-практическое значение. На основании полученных данных о распространенности герпесвирусных инфекций (ВПГ и ЦМВ) среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга на маркеры ГВИ в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

При подозрении на внутриутробные инфекции у новорожденных детей доказана необходимость использования двух методов лабораторной диагностики: быстрого культурального метода и метода полимеразной цепной реакции для исследования биологического материала хотя бы из двух локусов - крови и мочи (желательно исследовать также аспират из трахеи или слюну, по показаниям — спинномозговую жидкость) в динамике (до 14 суток жизни и в 1-3 месяца жизни).

Для уточнения фазы течения герпесвирусной инфекции рекомендовано применение серологических методов диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими проявлениями генерализованной инфекционной болезни и/или пневмонии, учитывая высокий риск развития бронхолегочной дисплазии и некротизирующего энтероколита, в неонатальном периоде обосновано использование препарата рекомбинантного интерферона-а2Ь человека («Виферон»®).

Внедрение результатов работы. Разработанные в результате исследования практические рекомендации внедрены в практику отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных, а также отделений патологии недоношенных детей Городской Больницы №8 Департамента здравоохранения г.Москвы, неонатального центра, отделения реанимации, отделения патологии новорожденных, отделения хирургии новорожденных Детской городской клинической больницы №13 им.Н.Ф.Филатова Департамента здравоохранения г.Москвы. Результаты данной научной работы используются в учебном процессе, проводимом для врачей-педиатров, неонатологов, анестезиологов-реаниматологов из различных регионов России на кафедре неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

выводы

1. Распространенность инфекционно активного ВПГ у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных (25,7% 95%С1 [17,834,9%]) и детей из отделения физиологии новорожденных (19,1% 95%С1 [9,1-33,2%]) не различалась. Распространенность прямых маркеров ВПГ у новорожденных детей не зависит от срока гестации: у детей 25-27 недель гестации с экстремально низкой массой тела при рождении частота выявления инфекционно активного ВПГ составляет 20%, у детей 28-32 недель гестации - 24,6%, 33-37 недель - 38,5% (р>0,05).

2. Инфекционно активный цитомегаловирус выявляется чаще у пациентов отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных (16,5% 95%С1 [10-24,8%]) по сравнению со здоровыми детьми из отделения физиологии новорожденных (0% 95%С1 [0-7,5%]; р=0,002 (ТКФ)). У детей 25-27 недель гестации с экстремально низкой массой тела при рождении частота выявления инфекционно активного ЦМВ составляет 6,7%, у детей 28-32 недель гестации - 14,8%, 3 3-37 недель - 30,8% (р>0,05).

3. Изолированная герпетическая инфекция, документированная наличием маркеров инфекционно активного ВПГ, протекала латентно у 96,9% детей за исключением одного случая манифестного герпетического энцефалита. Изолированная цитомегаловирусная инфекция, подтвержденная наличием маркеров инфекционно активного ЦМВ, протекала латентно у недоношенных детей в 95% случаев за исключением одного случая генерализованной цитомегаловирусной инфекции. У новорожденных детей с внутриутробными инфекциями при наличии в крови инфекционно активных вирусов цитомегалии и/или простого герпеса некротизирующий энтероколит документировался статистически значимо чаще, чем у детей с внутриутробными инфекциями и отрицательными результатами исследования инфекционно активных герпесвирусов в крови (62,5% против 6,8%, соответственно; р<0,001 (ТКФ)).

4. Частота выявления прямых маркеров ВПГ и/или ЦМВ в спинномозговой жидкости у недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода составила 25,9%. Неонатальные судороги, перивентрикулярная лейкомаляция, внутрижелудочковые кровоизлияния 2-3 степени, тяжелые стадии ретинопатии недоношенных статистически значимо чаще развиваются у недоношенных детей при выявлении прямых маркеров цитомегаловируса и/или вируса простого герпеса в спинномозговой жидкости по сравнению с детьми с отрицательными результатами исследования. Формирование детского церебрального паралича в раннем возрасте чаще отмечалось у тех детей, у которых в неонатальном периоде в спинномозговой жидкости обнаруживали прямые маркеры ЦМВ и/или ВПГ, по сравнению с детьми без таковых (45,5% противк 4,5%, соответственно; р<0,01 (ТКФ)).

5. Показатели врожденного иммунитета у новорожденных детей, имеющих прямые маркеры цитомегаловируса и/или вируса простого герпеса в спинномозговой жидкости и/или в крови, характеризуются сниженными уровнями продукции интерферона-а, интерферона-у, интсрлейкина-1 Р по сравнению с детьми без прямых маркеров герпесвирусных инфекций (р<0,05), что свидетельствует о снижении у них противовирусного иммунитета.

6. Включение препарата рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®) в состав комплексной терапии недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода и наличием внутриутробных инфекций оказывает модулирующее влияние на величину индуцированной продукции ИФН-а и ИФН-у лейкоцитами недоношенных детей, статистически значимо снижает показатель летальности и частоту возникновения осложнений (тяжелых форм ретинопатии недоношенных и бронхолегочной дисплазии).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Распространенность вирусов простого герпеса и цитомегалии у новорожденных детей в отделениях реанимации и взаимосвязь наличия маркеров герпесвирусов в биологических средах детей с развитием тяжелых, инвалидизирующих патологических состояний свидетельствуют о необходимости проведения диагностики ЦМВ и ВПГ методом ПЦР и быстрым культуральным методом в качестве скрининговой процедуры при поступлении детей в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. Учитывая низкую степень согласия между методами ПЦР и БКМ, необходимо дополнительное исследование прямых маркеров ЦМВ и ВПГ быстрым культуральным методом в случае отрицательного результата ПЦР при подозрении на вирусную этиологию внутриутробной инфекции.

2. Снижение продукции эндогенных интерферонов у недоношенных детей, находящихся в критическом состоянии в отделении реанимации, при наличии прямых маркеров герпесвирусов в крови, спинномозговой жидкости и других локусах, является обоснованием для назначения заместительной терапии препаратом рекомбинантного интерферона-а2Ь человека (Виферон®) и позволяет улучшить результаты базисной терапии.