Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинические и внутриклеточные маркеры наследственной и приобретенной патологии у детей в экологически неблагоприятных регионах

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

, г : л д ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР 1 " ПЕДИАТРИИ И ДЕТСКОЙ ХИРУРГИИ

1 о м ет

на правах рукописи

УДК: 616 - 053. 2:577. 4 (574.54): 577. 21: 612 - 086

САМУРАТОВА РАУШАН БИНОЫОВНА

КЛИНИЧЕСКИЕ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ НАСЛЕДСТВЕННОЙ И ПРИОБРЕТЕННОЙ ПАТОЛОГИИ У ДЕТЕЙ В ЭКОЛОГИЧЕСКИ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ РЕГИОНАХ

14.00.09 - Педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г.АЛМАТЫ . 1996г.

Работа выполнена на кафедре педиатрии N 3 (заведующий к; Щедрой педиатрии 3.X.Мажитова) Алматинского медицинского ин< титута (ректор - профессор Т.А.Муминов)

Научные руководители: доктор медицинских наук.

академик АПМ. профессор З.Х.Мажитова доктор биологических наук, профессор В.С.Толмачев Официальные оппоненты: доктор медицинских наук.

академик АПМ, профессор А.К. Машкеев доктор биологаческих наук, профессор А. Б. Бигалиев Ведущая организация: Казахский институт усовершенствовг

ния врачей МЗ РК

Защита диссертации состоится "_м _ 1996г. в _

часов на заседании специализированного совета ДР 09.15.01 щ Научном центре педиатрии и детской хирургии МЗ РК.

(Адрес: 480090. г.Алматы, проспект Алъ-Фараби, 146)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке центра.

Автореферат разослан "21" мая 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета.

доктор медицинских наук. СНС_______ Ш. Н. Хусаиновг

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В стране сложилась деблагоприятная , а з ряде регионов кризисная экологическая обстановка.Наиболее опасные троявления экологического кризиса - региональное техногенное опустынивание. деградация почв, истощение и загрязнение водных ресур-;ов. загрязнение атмосферы,обезлесение . необратимое сокращение би-)логического разнообразия и разрушение генетического фонда живой фироды, активизация угрожающих жизни стихийных природных явлений и ¡ромышленных катастроф,накопление опасных и токсичных отходов (При-фалье. Семипалатинский полигон. Прикаспий. Байконур и др.)

По предварительным данным неблагоприятные факторы окружающей :реды оказывают отрицательное влияние на состояние здоровья населе-шя. особенно женщин и детей (С.В.Алексеев. И.М.Воронцов 1993, ).Е. Еельтищев 1991.1996).

Нарастает экологическая угроза здоровью детей, увеличивается юля врожденных пороков развития, отмечается повсеместный рост он-:ологических заболеваний, перинатальной смертности, наследственных юлезней и уменьшения продолжительности кизни, что является косвен-:ым показателем накопления мутационного груза в популяциях, как от-дленного последствия действия отрицательных факторов окружающей реды на организм человека (Н.П.Бочков 1992, A.J. Мс Mlciiael 1991).

Взаимодействие детского организма с окружающей средой определяется его высокой восприимчивостью. Самым специфическим феноменом заимоотношения среда - ребенок, даже при минимально небдагоприят-ых воздействиях, является патология развития. При значимых влияни-х токсического характера нарушения развития могут быть клинически вными. т.е. представлять собой аномалии или дасплазии.

Одной из основных причин деградации здоровья детей в Приаралье ожет быть воздействие химических токсических веществ окружающей реды на организм ребенка. Однако, до настоящего времени эта проб-ема остается практически неизученной.

Общее представление о наследственной и приобретенной патологии детей в экологически неблагополучных регионах не соответствует ребованиям комплексного подхода к анализу генетических изменений труктурно-функциональных .свойств хроматина на субклеточном и моле-

¿Ь и ЛЗМСПСПИЛМЛ О 1СЛПии 414,-

л., хроматина лимфоцитов и электрофореграммы белка сыворотки крови, которые являются необходимым вторым уровнем изучения изменений : генетическом аппарате клеток.

Исследования этих процессов может иметь существенное теорети ческое и практическое значение для разработки новых критериев ] оценке состояния здоровья детей и формирования групп риска наследс твенной и приобретенной патологии у детей в экологически неблагопо лучных регионах.

Системный подход при анализе изменений наследственного аппара та клеток у детей, проживающих в очагах с высоким содержанием хими ческих токсических веществ в компонентах окружающей среды, являете перспективным направлением для прогноза состояния здоровья и орга низации лечебной и реабилитационной помощи регионам экологическог кризиса.

Неблагоприятное экологическое состояние усугубляет здоровь народа . поэтому экологическая безопасность является одним из стра тегически фундаментальных компонентов национальной безопасности важнейшим аспектом защиты интересов и приоритетов страны (Концепци экологической безопасности Республики Казахстан . Алматы 1996г.) Тем более , что в Концепции экологической безопасности разработал ной на основе Конституции . законов Республики Казахстан и др.. ис ходящих из принципов Рио-де-Жанейрской Декларации по окружающе среде и развитию , приоритетов Повестки Дня ООН на 21 век . подчер кивается необходимость реабилитации населения экологически уязвимь и кризисных районов.Изучение этих вопросов определило актуальност проведенного исследования, которое связано с научно-техническс программой,включенной в государственный реестр N 0033 "Экологичен зависимые заболевания детей Приаралья, обусловленные токсически» компонентами окружающей среды."

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Оценить малые аномалии развития, исследовать го казатели цитохимических и молекулярно-биологических тестов и обо; яовать возможность их использования, как клинических и внутрикго точных маркеров наследственной и приобретенной патологии у детей экологически неблагополучных регионах.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Оценить малые аномалии развития на основании комплексного линико-генетического обследования у детей в кризисной зоне Приа->алья.

2. Установить диагностическое значение малых аномалий развития [ля определения групп риска по реализации хронической патологии у ;етей экологически неблагополучных регионов.

3. Изучить показатели структурно-функциональной организации ■енетического аппарата лимфоцитов (ДНК . белки и электрофорез бел-:ов сыворотки крови) у обследованных детей в норме и патологии.

4. Разработать маркеры наследственной и приобретенной патоло-'ии у детей в экологически неблагополучных регионах, на основании ■чета количественной вариабельности'стигм дизэмбриогенеза и коли-;ественннх показателей цитохимических и молекулярно-биологических •естов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые в экологической педиатрии помощью современных методов изучена связь клинико-фенотипических [аркеров с изменением генетического аппарата клеток у детей прожи-;ающих в экологически неблагоприятных регионах Казахстанского Приа-йлья. Работа является новым исследованием, посвященным комплексному анализу микроаномалий развития, состояния здоровья детей и изме-ения наследственного аппарата клеток.

В результате исследования получены новые данные о тесной связи :ар с состоянием здоровья детей и изменением генетического аппарата роматина лимфоцитов у детей в кризисной зоне Приаралья. Показано, то повышение уровня стигматизации обследованных детей коррелирует о степенью тяжести установленных клинических заболеваний . При зучении интерфазного хроматина лимфоцитов у детей в кризисной зоне риаралъя (КЗП) получены новые данные об изменении в генетическом .ппарате клеток. При этом показана ассоциация диагносцируемых завоеваний с изменением свойств хроматина лимфоцитов по ряду цитохими-еских тестов. Епервые был применен комплексный подход по установ-ению взаимосвязи между состоянием здоровья детей, количеством MAP изменением структурно-функциональных свойств хроматина. Впервые пределены пороговые значения MAP, подтвержденные цитохимическими следованиями ДНП и негистоновых белков, по реализации хронической атологии у детей в экологически неблагоприятных регионах.

Комплексное изучение состояния здоровья детей путем оценки фе-нотипических и генетических маркеров позволило получить новые сведения о причинах высокой частоты встречаемости хронических патологий и ВПР.что позволило расширить представление о механизмах реализации генетической информации детского организма,' при воздействии неблагоприятных факторов окружающей среда.

Разработаны новые высокозначимые клинические и внутриклеточные маркеры оценки состояния здоровья детей и формирования групп риске наследственной и приобретенной патологии у детей в экологически неблагополучных регионах.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ работы заключается в разработке новы> высокозначимых клинических и внутриклеточных маркеров оценки состояния здоровья детей и формирования групп риска наследственной v приобретенной патологии у детей в экологически неблагополучных регионах.

В работе научно аргументирована и доказана целесообразное^ строгого учета стигм дизэмбриогенеза в практике врачей-педиатров i клиницистов другого профиля у детей, проживающих в кризисной зош Приаралья. Показано, что при обнаружении у таких детей даже 6-7 MAI высока вероятность наличия изменений интерфазного хроматина лимфоцитов, что должно определять тактику дальнейшего обследования детей. Повышение степени стигматизации указывает на необходимость углубленного клинико-лабораторного обследования данной группы дете! по выявлению хронической патологии и БПР.

Специально разработанные "медико-генетические карты по учет; малых аномалий развитая позволяет рекомендовать ее .применение пр] обследовании детей в регионах, экологического неблагополучия.

Полученные количественные оценки на основании ассоциации выявленных заболеваний с цитохимическими признаками позволяют углубит представление о сущности клинической экопатологии и наметить конк ретные пути изучения патогенеза заболеваний.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Результаты исследований малых аномали развития, цитохимических и молекулярно-биологических тестов у дете в экологически неблагоприятных регионах по выявлению наследственно и приобретенной патологии внедрены в отделение "Экология и дети Республиканской детской больницы "Аксай", в 1-ой городской детско клинической больнице г.Алматы, биохимической и цитологической лабо

.ториях института Молекулярной Биологии HAH PK, в центральной на-шо-исследовательской лаборатории , на кафедре педиатрии N 3 Алма-:нского медицинского института.

Основные положения диссертации включены в учебный курс для ■удентов педиатрических кафедр , а так ке для аспирантов и ординаров АГМИ.

Основные положения диссертации долокены на III Международной нференции по Всеобщему здоровью. Алматы 1995г.. Республиканской .учно-практической конференции "Актуальные проблемы педиатрии", маты 1995г.. на Республиканском семинаре "Актуальные проблемы пе-атрии: социально-экономические факторы в оценке состояния зцо-вья детей". Алматы 1995г., на республиканских научно-практических нференциях "Экология и дети" Алматы 1994г., на научно-практичес-:х врачебных конференциях в 1-ой ГДКБ г. Алматы.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ БШОСННЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Высокая степень стигматизации является одной из основных рактериетик для детей в экологически неблагополучных регионах. Мв-е аномалии развития являются объективными визуально - фекотипи-■скими критерия)® тяжести установленных заболеваний у детей, про-ваюших в регионах экологического неблагополучия.

2.В основе установленной клинической патологии у детей в кри-сной зоне Приаралья лежат изменения в генетическом аппарате кле-к, характеризующиеся нарушением структурно-функциональной органи-ции интерфазного хроматина лимфоцитов.

3. Уровень стигматизации по количеству MAP, изменения в гене-ческом аппарате клеток и данные спектра белкового фореза являются ними из высокозначимых клинических и внутриклеточных маркеров в енке состояния детей и формирования групп риска наследственной к иобретенной патологии у детей е экологически неблагополучных ре-онах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на _

раницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литера-ры, трех глав собственных исследований, заключения, выбодое,

актических рекомендаций. Работа иллюстрирована _ таблицами.

_ рисунками. Указатель литературы включает _ наименований

точников на русском и иностранном языках.

МАТЕРИАЛЫ й МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В основу работы положены результаты полного клиника-генетического исследования 169 детей, проживающих в экологически неблагополучном регионе, в возрасте от 2,1 до 14,5 лет. находившихся на обследовании и лечении в отделена "Экология и дети" Республиканской детской клинической больницы "Ак-саЯ". При распределении детей по половой принадлежности было выявлено примерно равное количество мальчиков - 50,9% и девочек -49,155.

Согласно модифицированной классификации Н.П.Гундобина детег группировали по возрастному составу, так как в каждом периоде происходит генетически обусловленное созревание тех структур . которые обеспечивают особенности функции , характерные для соответствующей отрезка времени (табл.1).

Из общего числа обследованных детей 18 ( 10,7%) отставали I физическом развитии, а в ряде случаев это сочеталось с задержко{ пслового созревания.

Табл.N 1

возрастной период пол

мальчики. девочки

7-И лет. 39 47.6 34 45.9

12 - 16 лет 43 52.4 40 54.1

По национальной принадлежности распределения не было, так ка] 99% обследуемых детей составило коренное население.

Проведенный комплекс клинического а лабораторно-инструмен-гального обследования 169 детей, кризисной зоны Приаралья (КЗП), позволил установить у 100% различные заболевания с полиорганным характером патологии. В группе с одним хроническим заболеванием ш доне поражения ИНС было 96 детей, что составило 50,6% от общег< числа обследованных детей,- 30.2% (51) - имели сочетанную хроническую патологию.

В структуре заболеваний детей в КЗП болезни гастродуоденэлькой 5 гепатобиллиарнсй систем занимает ведущее место и составляет 69,3% 1 84, 6% соответственно. Патология мочевыделительной системы выявле-т у 39% детей, заболевания бронхолегочной системы - 18,3% заболе-зания ЛОР-органов зарегистрированы в 83,4% случаев.зубочелкстней ;истемы - у.24,9% , тубинфицированность в 10%, эндокринная патология - у 15,9% . кардиопатии у 13% обследованных детей. Глистная ин-зазия выявлена у 6В£детей. Отдельную группу составили дети с ВПР -12,7%.

Различий по установленным заболеваниям, во всех группах обсле-юванных детей в зависимости от пола и возраста, "не было выявлено.

Обследованные дети были условно разделены для детального ана-шза состояния здоровья, основанного на количественном сочетании зыявленной патологии: в I группу вошли дети с диагнозом "практичео-си здоров" - контрольная группа детей (77) г.Алматы ; во II группу 5ыли отнесены (3,2%) дети, со спорадическими заболеваниями ; в III группу вошло 50,6% детей с одним хроническим заболеванием ; в IV группу - дети 33,5% с сочетанной хронической патологией ; в V груп-1У - дета с БПР 12,7%.

Референтную группу составили 77 практически здоровых детей в ¡озрасте от 3 до 14 лет детского сада и школы , расположенные в жологически относительно благополучных районах г.Алматы (мкр. Са-!ал).

Всем детям . методом бесповторной случайной выборки был ис-юльзован табличный метод регистрации учета малых аномалий развития ;МАР). цитохимические и молекулярно-биологические исследования проведенные в лаборатории биохимии белка института Молекулярной ¡иологии НАБ РК. (Руководитель лаборатории профессор, д. С.н. I. В. Фурсов).

Учет малых аномалий развития проводился по спектру признаков унифицированных и рекомендованных к применению на всесоюзной конфе->енции медицинских генетиков в г.Минске 1982г.

Цитохимические .методы исследования проводились в лимфоцитах [ериферической крови.Определение доступности ДНК хроматина для свя-¡ывания с основным красителем акридиновым оранжевым (АО) проводил!' ю методу, предложенному Риглером (Л^1ег, 1963), в модификации Ко-¡есникова (В. А. Колесников с соавт., 1973).

- s -

Исследование негастоновых белков в клетках проводилось по м< тоду Олферта и Гешвинда (1953) , основанном на окрашивании 0,: раствором прочного зеленого в кислой среде.

Молекулярно-биологические методы электрофоретического исслед; вания белков сыворотки крови осуществлялось по методу Лэммли (196t в щелочной среде рН 8.3-8,6 в трубках полиакриламидного геля.

При обработке полученных данных использовали математическ: методы, применяемые для медико-биологических исследований. При ан; лизе результатов фореза была использована математическая програм] обсчета статистических данных на машине "МАКИНТОШ".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. . При изучении кол] чественной и качественной характеристик MAP у детей в экологичес; неблагополучных регионах, выявлено , что средняя частота регистр: руемых стигм дизэмбриогенеза составила 10,1 + (-) 0,2 и превысила 2,5 раза средний показатель в контрольной группе . Лаборатории методами исследования (УЗЯ,ЭКГ,ЭХО) были установлены стигмы вну реннего развития: перегибы в области тела или шейки желчного пуз ря, изменение его формы , обнаружение дополнительной хорды в поло ти левого желудочка сердца и т.д.. Средняя частота определения внутренних ИАР составила 0,56 для девочек и 0,52 для мальчиков. Б ла выявлена зависимость возможности обнаружения стигм внутренне развития. Наш был высчитан средний показатель имеющий диагност ческую значимость при . выявлении у детей отстазания в физическ развитии. Он составил 12.9 . Необходимо отметить, что процент мал чиков отстающих по антропометрическим показателям, в 3 раза вы процента девочек обследуемой группы.

Качественный анализ MAP показал, что у детей с ВПР наряду остальными MAP был спектр стигм, характерных только для данной н зологии: башенный череп, ассиметрично расположенные соски, недора витие мошонки и полового члена. Достаточно редкая встречаемое этих отклонений в других группах обследуемых детей указывает на диагностическую ценность как факторов риска для выявления ВПР, г нее не распознанных или недиагносцируемых для детей в КЗП. Хараю распределения MAP для 18 детей с ВПР определил тенденцию чаете встречаемости диагностически значимый спектр: изогнутые концеЕ Фаланги пальцев - 18, сандалевидная щель - 18. плоскостопие - i аномалии прикуса - 17, окрашенные зубы - 13. широкая переносицг 12, приращенные мочки уха - И. лунки на. зубах - 11, готическое i

о - 10, плоский затылок - 10.

Наличие множественных MAP свидетельствует о высоком риске вы-вления у ребенка порока развития, что не противоречит данным лите-атуры. Уровень стигматизации 8-и MAP так же является множествен-ым, однако процент их регистрации у обследуемых детей оказался ве-ущим (58,2%), что позволило рассматривать данное количество НАР. ак отличительную черту характерную для детей, проживающих в эколо-ически неблагополучных регионах.

Качественный анализ малых аномалий выявил высокую частоту стречаемости MAP зубо-челюстной системы : аномалии прикуса у дево-эк составили - 84.4% , у мальчиков - 6555 , измененная форма неба -0% и 423Е соответственно, нарушенный рост и форма зубов девочки -Ъ% . мальчики - 82%.

Патология ЦНС также сопряжена с высокой степенью стигматиза-т. у 40% детей с внутричерепной пшертензией регистрировалось -11 MAP. Наши данные не противоречат мнению Л.0.Бадаляна, который читает,что центральная нервная система и микроаномалии развития иеют общее эктодермальное начало и соответственную взаимосвязь тя-эсти патологии с частотой MAP.

Представляет интерес регистрация отдельных NAP как маркеров тонических групп.Полученные результата исследования показали, что эличество малых аномалий коррелирует (г - 0,74-0,91) с тяжестью тонических заболеваний (табл.N2).

Так , у детей в контрольной груше у 94, В% отмечалось до 5 .MAP. з второй группе отличительной чертой явилось максимальное распре-эление детей (60%), имеющих 6-7 MAP. В третьей груше 6-7 MAP име-) Е-3 раза большее количество детей чем в четвертой группе , тогда 1к >12 MAP встречались в 3 раза чаще в четвертой чем в третьей эуппе. Для пятой группы характерно отсутствие детей с 6- 7 НАР и шый большой процент детей с более 12 MAP по сравнению со всеми стальными группами. Было обнаружено, что пороговое значение . поз-эляющее выделять детей в группу риска, по реализации хронической оологии, является наличие 6-7 MAP. Был также определен средний зрог микроаномалий развития, указывающий на возможность диагносци-эвания двух и более хронических заболеваний. Он составил 9.9 +(-) 4. '

Табл. N2

Количество нинроаномалий развития в клинических грушах обследуемых детей

НАЗВАНИЕ ГРУППЫ а КОЛИЧЕСТВО MAP(Ж)

ДО 5 6-7 8-11 12 И >

I-контрольная группа 94,8 5,2 0 0

(77 детей)

П-не имеющие хроничес-

кой патологии 40 60 0 0

(5 детей)

Ш-единичная хроничес-

кая патология 0 32,6 62,5 11,25

(80 детей)

1У-с двумя и более

хроническими патоло-

гиями 0 ■ 11.3 54,7 33,9

(53 детей)

У-ВПР 0 0 65 35

(20 детей) ■

Таким образом, степень стигматизации обследованных детей, г так же высокая диагностическая ценность количественного и качественного характера детей указывает на необходимость обязательной подсчета количества MAP у детей в экологически неблагополучных регионах.

Цитохимические исследования структурно-функциональных перестроек хроматина лимфоцитов выявили уменьшение связывания красител АО с ДНК в клетках у детей из экологически неблагополучных регионе! по сразнению с группой контроля в среднем на - 20,1% ( табл.НЗ ).

По современным представлениям в основе таких изменений-матричной активности хроматина клеток , лежит нарушение характера связ; ДНК - белок, которое сопровождается изменением способности фосфат ных групп ДНК соединяться с красителем акридиновым оранжевым (АО) : свидетельствует о понижении их активности (С.Ф.Барбашов, 1984;А.В Зеленин и др.1985)

Уменьшение связывания АО-ДНК изменятся Б одних и тех же пределах при сопоставлении с различными характеристиками , как то : визуально - фенотипические МАР ( от -16,3% до -22%) , стигмы внутрен-1его развития (от -18,4% до -20,3%), клинический спектр групп ( от -19,4% до -24,7%) ( табл. N3).

Табл. КЗ

Показатели связывания АО с ДНП лимфоцитов контрольной группы н обследованной группы детей

NN Группа Кол-во Интенсивность % ОТЛИЧИЙ Достовер-

п/п обследов. обслед. флуоресценции от конт- ность

детей детей комплекса АО-ДНК (М + т ) роля различий Р

' 1 2 3 4 5 6

I. Доноры -контроль 76 175,0 + 2,53

II. Дети без хронической патол. 5 131,8 + 2,65 - 24,7 1 -11,14 р < 0.001

[II. Дети с 1 хронической патол. 80 141.1 + 2.17 -19,4 1-9,08 р <0,001

У. Дета с 2 53 139,0 + 2,57 -20,6 1-9; 83

и более р < 0,001

хроничес.

заболев.

1. ВПР 20 136,7 + 5.53 -22,0 1=6,12 р<0. 001

Общая 158 139.8 + 1,86 -20,1 1-10,73

>бследуемая р<0,001

Достоверные изменения были выявлены при распределении детей по

половым и возрастным группам (-21.2%). Изменение связывания краси теля АО-ДНК лимфоцитов у детей, имеющих хроническую ЛОР-патологи: (83,4%) с учетом MAP и условно-клинических групп составило - 20.3% Полученные данные подтверждают имеющееся мнение, что изменена функциональной активности указывает на нарушение характера связ: ДНК с белками хроматина у детей в КЗП. Изучение изменения связыва ния АО - ДНК с лимфоцитами обнаружило статистически достоверны снижения показателя по степени нарастания клинической сочетанно патологии . включая вровденные пороки развития в сравнении с груп пой контроля (табл.ЯЗ, рис.К1).

530 нм

200

175,0

150

100

141.1

139,0

136.7

50

К А В С

Рнс.Ы 1 Связывание АО ДНП лимфоцитов в зависимости от клинической патологии обследованных детей:

где К - контрольная группа.А - одна хроническая патология, В - сочетанная хроническая патология (2 и более). С -

врожденные пороки развития (ВПР). По оси ординат: интенсивность флуоресценции ДНП клеток при 530 нм Статистически достоверные изменения связывания АО с хроматино лимфоцитов у детей в диагнозе, которых отмечалась эндокринная пато логия обнаружено уменьшение на -24%.

Детальный анализ показателей связывания АО-ДНП при распределе нии детей по возрасту и по полу одновременно показал, что изменена в хроматине лимфоцитов сохраняются по всем указанным параметрами

отличаются от контрольной группы в ранее установленных пределах (-21.3%).

Был проведен сопряженный анализ показателей зависимости количества MAP . тяжести клинической патологии и изменения связывания АО-ДНК (табл:И4). Полученные данные показали, что изменение в хроматине лимфоцитов у детей из КЗП сохраняется и по степени тяжести клинических проявлений и по количеству MAP по сравнению с контрольной группой детей г.Алматы.

Обнаружено минимальное изменение связывания АО-ДНК у детей с одной хронической патологией при регистрации 6-7 MAP (-17,1%), тогда как максимальное выявлено у детей с ВПР при 12 и более 12 MAP (-35%).

Процент изменения интенсивности связывания АО с ДНП менялся в широком диапазоне- от -10/S до -40% и ниже по отношению к контролю. Поэтому был проведен анализ количественного распределения детей в . зависимости от процентного изменения связывания (АО-ДНК) и повышения уровня стигматизации . Нами установлено, что количество MAP зависит от характера изменения связывания АО лимфоцитами . Для детей с 6-7 MAP характерно уменьшение связывания до 10% , что составилб 40% детей . При регистрации 8-11 MAP характерное изменение связывания АО - ДНП в сторону уменьшения до 3035 ( 67% детей). Дети, имеющие более 12 MAP в 40%" были установлены с изменениями связывания красителя АО от 30% и. выше. -

Примечание к табл.N4:

I - практически здоровые дети (г.Алматы); II- дети не имеющие хронической патологии;III- дети с 1-ой хронической патологией; IV -дети с сочетанной хронической патологией; V - ВПР

Был проведен анализ процентного уменьшения связывания АО - ДНП с условно-клиническими группами. Дети с одной хронической патологией с изменением связывания АО-ДНК до 20% обнаружены в 56.3%, что в 2 раза чаще, чем в группе детей с ВПР (25%). Изменение связывания красителя с хроматином (от -10% до -30%) в группе детей с сочетанной патологией отмечено в 79,3% - ото в 1,5 раза выше, чем у детей с ВПР (54%). Уменьшение связывания АО-ДНК от 30% и выше регистрировалось у 70% детей в V условно-клинической группе, причем у третьей части детей изменения составили свыше 40%.

Выявленная закономерность - повышение степени тяжести регист-

рируемых патологий зависит от повышения процента изменения связывания АО лимфоцитами крови - была подтверждена при детальном разборе клинических заболеваний с учетом MAP и результатов связывания цитохимических тестов.

Табл. N4

Изменение связывания АО с.ДНП лимфоцитов детей с учетом клинических групп и количества MAP { J 530 нм. усл.ед.)

NN Кол- Интенсивность флуоресценции комплекса

п/п во АО-ДНК (М + т)

обе.

Количество MAP

6-7 % отл. 8-11 % отл. >12 % отл

от кон ОТ кон ; от кон

I. 77 175,0+2.36

II. 5 131.8+2,85 -24,7

III. 80 145,0+7,31 -17,1 140. 6+3, 06 -19.6 141.2+8,37 -19,3

•п-14 П-60 6

IV. 53 141,7+7,01 -19,2 134,3+3,72 -23,3 145, 0+4,61 -17,1

П-6 11-29 П-18

V. 20 --- — 148.8+5.22 -15 114, 4+12,1 -35

п-13 11-7

Общая 158 138,2+3,51 -21 139,4+1.75 -20.3 139, 2+3.75 -20.5

обследов.

группа

детей

Достоверность изменений в хроматине лимфоцитов у детей в КЗП, определяемых цитохимическим тестом по связывании красителя АО лимфоцитами периферической крови, и возможность использования теста, как маркера заболеваний, обусловленных воздействием окружающей среды на детский организм, были подтверждены чувствительностью , специфичностью. и прогностичностыо используемого метода. Данные математического анализа показали, что чувствительность (это доля боль-

ных. у которых выявляется данный симптомокомплекс) выбранного метода составила 0,77, т.е.. 77% больных имеют данный симптомокомплекс. Специфичность (это частота отсутствия симптома у здоровых людей) -84%; прогностичность (вероятность заболевания при- известном результате исследования) составила 91%.

Анализ связи выявленных заболеваний и количества MAP с цитохимическим признаком указал на необходимость проведения анализа ассоциаций заболеваний с патогенетическими значимыми маркерами. Так как, установление ассоциаций позволит определить в дальнейшем факторы риска, что имеет существенное значение в профилактике болезней наследственной и приобретенной патологий у детей из экологически неблагоприятных регионов при медико-генетическом консультировании. Результаты исследования распределения показателей по тесту связывания АО с ДНП хроматина лимфоцитов у обследованных детей с учетом условно-клинических групп и в контроле показали , что пороговая граница соответствует 11% +1,3 (отн.ед.) а коэффициент ассоциаций в общей обследуемой группе равен 18,07 (р<0.001.г =0,86).

Таким образом, наблюдается значимая ассоциация цитохимического теста связывания АО с ДНК хроматина лимфоцитов во всех условно-юш-нических группах обследуемых больных, что позволяет определять вероятность развития установленных патологий как в группе первично осматриваемых детей в экологически неблагоприятных регионов, так и в группе условно здоровых детей .

Результаты анализа негистоновых белков (НГЕ) хроматина по связыванию с красителем прочным зеленым (ПЗ) у обследуемых детей в КЗП по сравнению с группой практически здоровых детей г. Алматы ( условно чистая зона) показали изменение в сторону уменьшения в равной степени при распределении детей по клиническим группам ( от -24,2% до -35.5%) и по количеству MAP (от -24.3% до - 43,8%). Уменьшение связывания ПЗ - НГБ зарегистрировано в одних а тех же 'пределах независимо от параметров зозраста (от -30,3% до -32,4%) и пола (от -30,4% и -32,4%). Показатель связывания по общей обследуемой группе составил -29,6%. Затем с помощью трех независимых клинических характеристик: визуально-фенотипические MAP, стигмы внутреннего развития, условно-клинические группы, было показано, что снижение связывания ПЗ - НГБ отмечено практически в одних и тех же пределах (от -24,3% до -а, 1%).

Полученные результаты указывают на возможность использования

признака по связыванию ПЗ с НГБ лимфоцитов в качестве дополнительного цитохимического лабораторного теста, относительная специфичность которого была установлена анализом результатов изменения связывания ПЗ - НГБ в зависимости от степени нарастания клинической патологии по сравнению с группой контроля .

Анализ изменения связывания ПЗ с НГБ по отношению к контролю в группах детей, распределенных по половому и возрастному параметрам одновременно показал, что изменение структурно-функциональных свойств хроматина остаются стабильными независимо от половой и возрастной характеристик, % отличия от контроля составил - 31,1+{-) 0.5.

Детальный анализ количественного распределения детей в зависимости от процентного изменения связывания прочного зеленого с НГБ и повышения уровня стигматизации показал, что -минимальное количество регистрируемых MAP соответствует минимальному изменению нарушения генетического аппарата клеток. Так, изменение связывания ПЗ-НГБ до 10% у детей с 6-7 MAP выявлено в 28% случаев, что в 3 и 4 раза чаще, чем у детей с 8-11 MAP и более 12 MAP соответственно. Результаты анализа количественного распределения детей в зависимости от процентного изменения связывания ПЗ с НГБ лимфоцитов и условно-клинических групп оказались непредсказуемыми . В данном случае определилась обратная тенденция . У детей с нарастанием тяжести клинических заболеваний отмечалось улучшение показателя изменения связывания красителя с НГБ лимфоцитов. Так, показатели изменения связывания ПЗ-НГБ у детей со спорадическими заболеваниями отличались от группы контроля на -35.5% , у детей с одним хроническим заболеванием на -32,3%, у детей с сочетанной хронической патологией на -32% , а уменьшение связывания в группе детей с ВПР составило только -24.2%. Возможно, обнаруженная при патологии обратная зависимость указывает , что у детей в условиях экологического неблагополучия происходит нарушение взаимодействия белков с матрицей ДНК, а так же увеличивается плотность упаковки хроматина в клетках обследуемых детей. Данное предположение определяет необходимость дальнейших поисков в этом направлении с целью выявления маркеров, возможно отдельных фракций кислых белков, отвечающих за нарушение генетического аппарата клеток у детей с различными заболеваниям!:.

Данные расчетов показали, что чувствительность выбранного метода составила о, 88 (88%) специфичность - 16% а прогностичность -

38.6л.

Расчеты коэффициента ассоциации по частоте распределения цитохимического признака в норме и патологии показали, что пороговая граница соответствует ранее установленному значению по тесту ПЗ-НГБ - 11% +(-) 1.3. А коэффициент ассоциации в общей обследуемой группе равен 25.06 (р < 0, 01, г = 0.64).

Электрофоретическое исследование физико-химических свойств белков сыворотки крови в системе полиакриламидного геля (ПААГ) было проведено для подтверждения выявленных изменений в генном аппарате клеток. Кислые белки (НГБ) и белки сыворотки крови являются разными белковыми субъединицами, но в организме человека биохимические процессы экспрессии и структуры белковых компонентов являются единой централизованной системой.

В результате полученных данных было обнаружено, что при сравнительном анализе по общим обследуемым группам у детей г.Алматы и у детей из КЗП независимо от выбранных характеристик (общие обследуемые группы, количество MAP. степень тяжести клинических заболеваний) самой стабильной корреляционной парой со средней связью яеля-ются 4 и 5 белковые субфракции. Изменения в показателях при сравнении детей , в зависимости от степени стигматизации, а так же от тяжести клинической патологии связаны с этими вариантами белка сыворотки крови ( г = 0, 84', г » 0,49 ) . Анализ корреляционных связей так же установил высокую частоту встречаемости белковых субфракций 4' . 5' , которые так же показали ряд зависимостей между количеством MAP и клиническими формами заболеваний ( г = 0,50 . г = 0,63) .

Корреляционная связь между характеристиками 4-5 была стабильной при изучении изменений белковых электрофореграмм с учетом MAP и в условно-клинических группах : в III группе - 0,49, в IV группе -0,46, в V - 0,48 (в контрольной группе г=0,51). Изменение показателя з корреляционной паре 4-5' отмечалось во всех условно- клинических группах в сторону снижения в зависимости от тяжести клинической патологии: в III группе г=0.04 , в IV группе г= 0,08. в V группе значение показателя становится отрицательным г*—о. 15. тогда как значение в контрольной группе отмечалось как слабое положительное г=0.32. Полученные данные в определенной мере указывают на нарушение полиморфизма белков сыворотки крови у детей в КЗП по сравнению с контрольной группой детей г.Алматы.

Основные отличия в элекгрофоретическом распределении белковых

полос наблюдаются на фореграммах белков сыворотки крови в 4, 4', 5,

5 > _

Таким образом, степень стигматизации в экологической педиатрш монет рассматриваться, как визуально-фенотипический маркер регистрируемы?; патологий у обследуемой группы детей , так как показанг связь МАР с заболеваниями. Наиболее выраженные изменения структурно-функциональных свойств хроматина и негистоновых белков обнаружены у детей, проживающих в КЗП и могут рассматриваться, как один и; критериев оценки состояния здоровья детей. Кроме того, количественные характеристики НАР и изменения в цитохимических маркерах с учетом индивидуальных значений позволят своевременно выявить "группу риска" по реализации хронической патологии у детей, проживающих е очагах с высокой концентрацией химических токсических веществ е компонентах окружающей среды.

ВЫВОДЫ

1. Средняя частота MAP на одного ребенка в условиях экологического неблагополучия составляет 10.1 +(-) 0,2, что по сравнению с контрольной группой детей г.Алматы выше в 2,5 раза. В кризисной зоне Приаралья дети с 5 MAP регистрируются в 1.3%. 6-7 MAP - 22.2% , 6-11 MAP - 58,2%, и более 12 MAP - 21,5% .

2. Количество микроаномалий развития коррелирует с наличие*: хронической патологии , как изолированной, так и сочетанной, включая врожденные пороки развития { г = 0.74-0,91 ).Выявленные "пороговые" критерии позволяют обосновать детей в группу риска ( при 6-7 MAP ) по реализации хронической патологии. При повышении степени стигматизации до 9.9 + (-) 0.4 определяется возможность обнаружения двух и более хронических заболеваний .

3. Повреждения генетического аппарата клеток - интерфазного хроматина лимфоцитов - у детей характеризуются достоверным уменьшением связывания акридинового оранжевого (АО) с фосфатными группами ДНК на 20,IS и прочного зеленого на 29,9X с негистоновыми белками хроматина . а также изменением физико-химических свойств белков сыворотки крови .

4. Цитохимические данные.значимые коэффициенты ассоциации цитохимических признаков с проявлениями патологии и положительные ко-

эффициенты корреляции между нарушениями структуры хроматина и тя-кестью клинических проявлений (г = 0,77 ) и количеством MAP (г = 3.75 ) у детей в кризисной зоне Приаралья определяют критерии пороговых границ. При этом,чувствительность теста по ДНК составила 77%, специфичность - 84%. прогностичность - 91%. По тесту негистоновых Зелков : чувствительность - 88%, специфичность - 76%. прогностич-10сть -88,6%.

5. Изменчивость компонентного состава белков крови у детей кризисной зоны Приаралья характеризуется тесными коррелятивными связями со степенью тяжести клинических заболеваний (г=0,60-0.67) и : количеством микроаномалий развития (г=0,69-0,84),что превышает в 2 и 3 раза показатели контрольной группы детей г.Алматы.

6. У детей кризисной зоны Приаралья выявляются достоверные корреляции клинических заболеваний по степени тяжести патологий и /ровню стигматизации по количеству MAP (г » 0,83 ) , изменения в генетическом аппарате клеток по ДНК (г - 0,86), по негистоновым 5елкам ( г - 0,64) и данных спектра белковых электрофореграмм ( г -3,67 ). что позволяет рассматривать их как одни из высокозначимых клинических и внутриклеточных маркеров в оценке состояния здоровья детей и формирования групп риска наследственной.и приобретенной патологии у детей из экологически неблагополучных регионов.

7. У детей, проживающих в кризисной зоне Приаралья. отмечаются ¡существенные изменения генетического аппарата клеток, установленные но степени стигматизации, нарушению структурно-функциональной организации хроматина клеток и негистоновых белков, а также по изменениям электрофоретического полиморфизма белков сыворотки. -

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявление и учет стигм дизэмбриогенеза у детей из экологически неблагополучных регионов должны стать обязательным компонентом клинического обследования ребенка и з значительной мере определить методические подходы к дальнейшему выяснению этиологии заболевания.

2. При обнаружении у детей , подростков 6-7 MAP рекомендуется проводить исследование крови цитохимическими тестами АО-ДНК , ПЗ-НГБ ,■ а также молекулярно-биологическими- методами для определения группы риска по реализации хронической патологии .

3. Дети , имеющие 8-11 MAP и более , являются высоковероятным контингентом обнаружения сочетанной хронической патологии и ВПР и нуждаются в углубленном клинико-лабораторном обследовании и специальном генетическом консультировании.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Клиннко-иммунологическая оценка у детей из экологически неблагоприятных районов.//Здравоохранение Казахстана. - 1994. -N1. -с.16-17 (в соавторстве с Ж.С. Абеуовой)

2. Диагностика повреждений мочевыделительной системы у детей из районов с повышенной минерализацией питьевой воды.//Новые технологии в педиатрии. Материалы конгресса педиатров России. Союз пед. России. - Москва. 19-21 апр. 1995г.-с. 58. (в-соавторстве с С.С.Сар-сенбаевой).

3.Клинико-гормональная характеристика задержки мужского пубертата б условиях экологического бедствия.//Здравоохранение Казахстана. - 1996. -N2. - с. (в соавторстве с З.Х.Мажитовой).

4.Клинические маркеры наследственной и приобретенной патологии у детей в экологически неблагоприятных регионах.//Экология и здоровье детей. - 1996.- с.27-44/

Самуратова Раушаи

Зкодсгиялыц цолайсыз аЯмак;тарда туратын балалардагм хштен ту а зэнв ууре пайда Солгал-ауру ларынщ кмииикалиц алатка£лхл1к uapitejwepi

/ 14.00.09 - Педиатрия / Камдидатты^ дассертацияныц иазиунм.

.ралдщ алатка ушыраган айтгыяда туратмн 169 баланк здрпнЯ :еД9.олардыч клеткасыидагн генетикалыц аппараттыц.еэгерхске rYCKeHi байкалды.йул Алматы кдласынщ /таза аЯмах/ бакылауда >олган 77 баласымен оадыстыра отырып ашн^талды. Ciiai ахсмалиялнк дамудын жихлхгхн кэрсетвт!»« Меднко-генетияа-тц яартаныч натижелерхнгч анализдеГен кеэде.эгсологкялня; шатка ушыраган аймагпа туратын бяяалардад бойикдаш Kiai нсмалидлыц даму саны бацылау тсбьшен салыстырганда аныа; /2,5 св/ кебейв TYcçTxHi дэлелденм отыр /р 0,001/.Буши ортава srLffi^Teri Kepceîiiiai 6ip Салага 10,1 ♦/-/ 0,2 саяьша сейдес е^ед!•

летканьщ генети^алкк; аппараттагы к^рылысынын турадты турдегх arepicin .ишфоциттердхч интерфазалмк хроыатиндогх даН-ныц юсфатты тобш циюхимиялыц зерт?еу lecifliMaH ашкргаладн. зул баланвд зинысша,жасша,ауруына т.б. нгрселерге теудж;1Э :аргш акхридин с'жгшыныц ДНП-га байланысуын 20,1 o/o,6epiK ¡асилдн^ хроматиннгц гистснды е^ес белогымен байяакысуым 29,6 о/о гэмендеух аркыя-ы бглхнедх.ЖсНе цан сарсуындаги б©лоя спектрх-(гн »лелтрофореграммасыиыц взгврух бай^алады. Гексерхлген балалардая табилган стнгматизацяякыз flapeaeeiHiq экологиялш? педиатрияда кериектх-фенсгип MapKepi рвтхнде царау й^Еаегг.Себебг Kirni аномалиялыц баск;а аугударыеИ байганы-

бар еКенх кэ^сетхлген /р= 0,83/.Хроиатиин^ ^урылысымен ¿ункцзясн Е;асиег7е?хнхч к;атты esrepicse Tvcvt /р=0,£6/,гис-гснды емес белек /р=0,о4/ пен белок cneKTipiHiî} электросоре-граиыасындагы /р=0,67/ взгерхстер Арал апат аймагннда туратык балэларда табьшган мунщ взхн баланьщ денсаулыпгн анык^тауда аерсете'гхн зор юганикалык клетк&хацлхк маркер Дел eCenieyre болады. Осынын Негхэтйдв агадогиялю; алая аймагьшда тура1™ балаларды тексерв He£e»i2rïeH туа бхткен яэнв ятрв пайда бол-бал ган ауру лары болу и -mucis вдттн теп 1?у?;уды мушехадх туадя.

Samuratova Raushan

"Clinical Intracellular Markers of Hereditary And Received Pathology in Children in Ecologically Unfavourable Regions"

(14.00.09-Pediatrics) For the Degree of the Candidate of Medical Science

Sum mar}'

The changes of cells genetic apparatus have been detected on the base of examination of 169 children,living in the crisis zone of the Aral Sea region, comparing with the control group (77 children) of Almaty city (pure zone). Truely increasing (in 2.5 times) of quantity of microabnormalities of development in children living in the region of ecological disaster .comparing with the control, group (p<0.001), has been revealed by the analysis of the results of medical-genetic charts of defining of frequency and structure of small microabnormalities of development.According this the middle frequency per one child was 10.1+(-) 0.2.

The cytochemical methods of studing of phosphate groups of DNA of interphased chromatin of lymphocytes have let to detect enough stable disorders of structure organisation in genetic apparatus of cells,which have been showed in decreasing of connecting of the such stains as acridinic orange (AO) with DNP down to -20.1% and solid green (SG) with nonhistone proteins (NHP) down to -29.6%,which have been not depended on the sex,age,diseases and so on,and also the changes of proteins spectrum of blood serum eiectrophoregrammes.

In the ecological pediatrics the degree of stigmatisation could be define as visual-phenotypical marker of registrated pathology in examinated group of the children because the connection between of microabnormalities of development with the deseases (r=0.83) has been showed.The most expressed changes of structural-functional features of chromatine (r=0.86),nonhistone proteins (r-0.64) and the data of spectrum of proteins eiectrophoregrammes (r=0.67) have been found in children living in the crisis zone of the Aral Sea region and could be detected as high significant clinical and intracellular markers in estimation of health status of the children and used for forming of the groups of hazard of hereditary and received pathology in children in ecologically unfavourable regions.