Автореферат и диссертация по медицине (14.00.41) на тему:Клеточная трансплантация при лечении хронической сердечной недостаточности

На правах рукописи

ООЗ1Т023Э

ТЕМНОВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

КЛЕТОЧНАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14 00 41 Трансплантология и искусственные органы 14 00 16 Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 9 [/; П

Москва- 2008

003170239

Работа выполнена в ФГУ «Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии» Научные консультанты: Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Шумаков Валерий Иванович

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна Официальные оппоненты Член-корр РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Кирпатовский Игорь Дмитриевич Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Мороз Борис Борисович Доктор медицинских наук, профессор Мазаев Владимир Павлович Ведущее учреждение

ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» Росздрава

Защита диссертации состоится «_»_2008 года в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 208 055 01 при ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов» Росмедтехнологии по адресу 123182, Москва, ул Щукинская, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологии»

Автореферат разослан «_»_2008 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 208 055 01

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

Актуальность работы.

Современная статистика заболеваемости населения показывает, что хроническая сердечная недостаточность (ХСН), возникающая чаще всего в результате острого инфаркта миокарда, остается одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, причем в XXI столетии прогнозируется дальнейший рост численности таких больных [Hunt et al 2005]

По данным американской ассоциации кардиологов в 2005 г в США насчитывалось около 5 млн человек с ХСН, тогда как по прогнозам к 2050г количество таких больных возрастет до 16 млн человек [Robbins, 1998]. В России исследование «Эпоха» показало, что клинические признаки ХСН имеют более 8,2 млн человек [Беленков Ю Н и др 2003]

В настоящее время для профилактики и лечения сердечной недостаточности используются 3 группы методов [Kirklin, Young , 2002], которые обеспечивают.

1- профилактику тромбозов и торможение развития атеросклероза путем применения диеты, медикаментозной терапии и пропаганды здорового образа жизни,

2- ограничение зоны повреждения и сохранения функциональной активности работоспособной зоны миокарда путем медикаментозной терапии (ан-тиаггреганты, p-блокаторы, ингибиторы ангиотензин превращающего фермента (АПФ)) и оперативного лечения (баллонная коронарная ангиопластика, операция аортокоронарного шунтирования),

3- замену несостоятельности сократительной функции сердца путем трансплантации сердца или имплантации искусственных аналогов левого желудочка

Однако перечисленные методы не могут в полной мере снизить рост заболеваемости и обеспечить адекватную социальную адаптацию этих больных

В связи с этим в последние годы получило развитие новое направление регенерационной терапии, направленное на стимуляцию регенерации миокарда путем возмещения дефицита функционально-активной ткани и/или стимуляции ее компенсаторной гипертрофии, а также стимуляции ан-гиогенеза с помощью современных клеточных технологий

Трансплантация в миокард мышечных клеток - фетальных кардио-миоцитов [Sakai et al 1999, Ю JI. Шевченко 1999], скелетных миобластов [Atkins et al 1999, Taylor et al 1998; Remecke et al. 2000], а также гладко-мышечных клеток [Yoo et al. 2000, Li et al. 1996] не подтвердила заместительного механизма регенерационного действия этих клеток, но позволила выдвинуть концепцию биорегуляторного воздействия пептидов, продуцируемых трансплантированными клетками

Именно поэтому предметом пристального изучения стали возможности восстановительной регенерации миокарда с помощью доступных и легитимных аутологичных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (ККМ)

В настоящее время эти клетки, преимущественно клетки гемопоэти-ческой фракции ККМ, используются для лечения острой [Straer et al 20012003; Schachmger et al. 2004, Assmus et al 2003] и хронической [Perm et al 2004, Patel et al. 2004, Lian Ru 2006] сердечной недостаточности

Улучшение насосной функции сердца после терапии аутологичными мононуьслеарными ККМ авторы связывают преимущественно с обновленной продукцией в организме больных проангиогенных и ангиапоптических ци-токинов [Kmnaird et al, 2004, Dimmeler et al., 2004; Kocher et al, 2001], с регуляцией воспаления и иммунной модуляцией [Dewald et al, 2005, Thum et al, 2005], с улучшением внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов и повышением их устойчивости к апоптозу [Minatoguchi et al., 2004; Trial et al, 2004, Chazaud et al., 2003], а также с их влиянием на пролиферацию кар-диомиобластов [Anversa, 2004].

Между тем, наряду с позитивной оценкой применения ККМ у больных с ХСН в последние годы появились исследования, которые отрицают возможность улучшения сократительной функции левого желудочка у таких больных при использовании аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга

Отсутствие позитивного эффекта от применения аутологичных ККМ авторы этих исследований связывают с изменением состава и свойств стволовых и прогениторных ККМ больных под влиянием различных тяжелых сопутствующих заболеваний [Rota et al., 2006, Award et al, 2006, Rauscher et al., 2003; Karra et al., 2005, Messma, 2006, Lehrke et al, 2006, Gma et al., 2006, Sata, 2006, Epstein et al, 2004].

Создается впечатление, что в практике лечения ХСН разные исследователи применяют ККМ с разными и даже противоположными свойствами

Для выяснения причин отсутствия у отдельных категорий больных позитивного эффекта от введения мононуклеарных (МНК) ККМ, мы предположили, что при ХСН как хроническом заболевании [Гольдберг Е Д и др 2006] на фоне системного воспаления [Шевченко О.П. и др 2005], и сопутствующего вторичного иммунодефицита различной степени выраженности [Ермакова Л П, 2001], а также хронической гипоксии у больных формируется функциональная недостаточность самих гемопоэтических и иммуноре-гуляторных клеток КМ, которую необходимо диагностировать и корригировать до использования клеток КМ (мононуклеарной фракции клеток) в качестве терапевтического средства. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать методы диагностики и коррекции функциональной активности клеток костного мозга для обеспечения стабильного позитивного эффекта клеточной трансплантации на сократительную функцию сердца и качество жизни больных с хронической сердечной недостаточностью

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи

1 Изучить возможность применения мононуклеарных клеток (МНК) ауто-логичного костного мозга в качестве эффективного вспомогательного метода коррекции сократительной функции миокарда и повышения качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью; выявить факторы, препятствующие реализации этих эффектов

2 Выявить нарушения функционального состояния МНК костного мозга и установить их взаимосвязь с дисфункцией клеток иммунной системы периферической крови, развивающейся у больных ХСН.

3 Разработать метод индивидуальной оценки резервов функциональной устойчивости клеток иммунной системы периферической крови больных ХСН и предложить тест для прогнозирования клинической эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга

4 Разработать и применить метод индивидуального подбора иммунномо-дуляторов для восстановления функциональной активности иммунной системы больных ХСН (клеток костного мозга и периферической крови), обеспечивающей реализацию позитивного клинического эффекта трансплантации ККМ

5 Показать возможность оптимизации клинического эффекта трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН путем 2-х этапного восстановления иммунобиорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией за счет осуществления медикаментозной коррекции иммунного статуса больных m vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при их культивировании

6 Установить клиническую эффективность трансплантации аутологичных клеток костного мозга у больных с терминальной стадией хронической сердечной недостаточности

7 Изучить влияние интраоперационной интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга на частоту и тяжесть развития послеоперационных иммунозависимых осложнений

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Научное исследование было проведено в рамках государственного контракта № 02 435 11 3019 от «02»сентября 2005г «Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы», а также выполнено по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120 0 800279)

Впервые показано, что у больных с ХСН, нуждающихся в хирургической коррекции сократительной функции миокарда, состояние иммунной системы характеризуется не только вариабельными формами апоптотиче-ского иммунодефицита, но также снижением функциональной активности мононуклеарной фракции клеток костного мозга, что предопределяет отсутствие клинического эффекта от применения клеток костного мозга

Установлено, что способность мононуклеарных клеток костного мозга к колониеобразованизо находится в прямой зависимости от содержания С025 и в обратной зависимости от содержания СБ95 лимфоцитов в периферической крови

На основании сопоставления интенсивности продукции активных форм кислорода (АФК) нативными лейкоцитами крови без и при добавлении ингибитора цАМФ-фосфодиэстеразы был предложен критерий, так называемый индекс стимуляции (ИС), для прогнозирования адаптационных резервов иммунной системы и оценки пригодности клеток костного мозга для целей клеточной терапии. Установлено, что у здоровых людей численное значение ИС больше 1 0, при выраженной патологии ИС становится меньше 1.0 Было предложено использовать индекс стимуляции для оценки степени тяжести иммунодефицита в организме, а также для подбора имму-нокорректоров и контроля эффективности проводимой иммунокорриги-рующей терапии Новизна указанных разработок подтверждена положительными решениями о выдаче 5 патентов (положительные решения от 7.05 2007,29 08 2007,28 09 2007,03 08 2007,03 12 2007)

Установлено, что при значении ИС<0 6 и необходимости выполнения хирургической операции у больных возникает опасность возникновения тяжелых иммунозависимых осложнений в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до развития полиорганной недостаточности

Показано, что наиболее выраженная коррекция сократительной функции миокарда и улучшение качества жизни больных при использовании клеточной терапии достигается путем сочетанного предварительного применения индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии m vivo и культивирования выделенных клеток в питательных средах ex vivo перед введением их в миокард При сочетанном применении этих процедур создаются оптимальные условия для восстановления биорегуляторной функции клеток костного мозга и клеток периферической крови, что создает условия для полной реализации регенерационных эффектов иммунной системы, как важнейшей интегративной системы регуляции гомеостаза.

Культивирование клеток костного мозга без предшествующей имму-нокоррекции позволяет повысить их функциональную активность, что сопровождается изменением фенотипического состава клеток и продукцией цитокинов в культуральную среду Однако регуляторные эффекты таких клеток после трансплантации являются недостаточными особенно у больных с выраженным иммунодефицитом

Однократный курс иммунокоррекции без последующей трансплантации клеток, также не позволяет добиться выраженной и пролонгированной коррекции функции миокарда у больных ХСН.

Интраоперационное использование аутологичных ККМ как после культивирования, так и после культивирования в сочетании с иммунокор-рекцией оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, что проявляется снижением иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, таких как гнойно-септические осложнения и полиорганная недостаточность даже при наличии инфекционно-септического анамнеза.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Создана медицинская технология лечения больных ХСН с помощью МНК аутологичного костного мозга Технология предусматривает контроль степени иммунной дизрегуляции в организме больных, предварительное проведение иммунокоррекции индивидуально подобранными препаратами ю vivo и последующее культивирование клеток костного мозга ex vivo Такая технология предварительной подготовки ККМ позволяет повысить сократительные свойства миокарда (увеличение фракции изгнания (ФИ) и снижение конечного диастолического и конечного систолического объемов (КДО и КСО), а также улучшить качество жизни больных ХСН (индекс MLHFQ) и повысить их физическую активность (индекс DASI).

Предложен метод оценки степени иммунной дизрегуляции, основывающийся на определении активности лейкоцитарной суспензии в модельном хемшпоминесцентном тесте, отражающем состояние суммарных адаптационных резервов организма у больных с ИБС и ХСН Этот показатель назван индексом стимуляции, величина его коррелирует с уровнем иммунодефицита и поэтому может использоваться для быстрой диагностики иммунной дизрегуляции Этот показатель использован также для индивидуального подбора иммунокорректоров и контроля эффективности терапии иммуномодуляторами Установлено, что при ИС<0 6 у больного прогнозируется выраженный иммунодефицит, сопровождающийся опасностью развития инфекционных осложнений и отсутствием эффекта от клеточной терапии. Именно таким больным должна заблаговременно проводится курсовая иммунокорригирующая терапия

При проведении у больного полного комплекса подготовки иммунной системы и клеток костного мозга эффективность клеточной терапии достоверно повышается и сохраняется в течение 6 месяцев Безопасность клеточной терапии позволяет рекомендовать повторные курсы клеточной терапии

у больных ХСН для восстановления и поддержания сократительной функции миокарда

Интраоперационное введение клеток костного мозга снижает летальность кардиохирургических больных и частоту развития иммунозависимых послеоперационных осложнений, а также способствует гладкому течению госпитального периода

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1. Предварительная коррекция иммунной дизрегуляции в организме и последующее культивирование in vitro клеток костного мозга достоверно повышает сократительную функцию миокарда и улучшают качество жизни больных с хронической сердечной недостаточностью при трансплантации аутологкчных клеток костного мозга

2 Интракоронарное введение клеток костного мозга больным в терминальной стадии сердечной недостаточности может служить «биологическим мостом» к трансплантации сердца

3. Использование индекса стимуляции позволяет оценивать адаптационные резервы организма и может быть использован для индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов.

4 Интрамиокардиальное введение клеток костного мозга во время операции аортокоронарного шунтирования достоверно снижает частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений и летальность у больных с хронической сердечной недостаточностью РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Основные выводы и рекомендации используются в практической и научной работе- отделения коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии, лаборатории трансплантологии и консервации тканей ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им.акад С.М Федорова Росмедтехнологии», ФГУ «НКЦ оториноларингологии Росздрава», ЛОР-отделения ГКБ № 67

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены- на IX, X, XI, XII Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2003, 2004, 2005, 2006 годы соответственно), на конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва 2002); на VIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004, на V Ежегодной конференции «Сердечная недостаточность» (Москва, декабрь 2004), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004), на П-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, апрель 2004), на IX и X Всероссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2002, 2003), Ежегодных Всероссийских и международных научных конференциях «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва май 2006, май 2007), на II и III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002, ноябрь 2005), на четвертой межд конф "Лечение кардиомиопатий", (Москва, 27-28 мая 2005г), на XIII сессии общего собрания РАМН (Москва, 17-20 Февраля 2004г), на 1 межд конф "Альтернативные методы реваскуляризации миокарда", (Москва, 5 апреля 2004г ), на 13th World congress of Heart Disease , International academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, В С, Canada, July 2831, 2007 Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии 5 февраля 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 работ, из них 22 в центральных рецензируемых журналах. 13 работ в материалах всероссийских и 1 в материалах зарубежной конференций Получены положительные решения по 5 патентам

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация содержит 7 глав и состоит из введения, обзора литературы (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 4 глав собственных исследований (главы III, IV, V, VI) с одновременным обсуждением полученных результатов, а также развернутого заключения (глава VII), выводов и практических рекомендаций.

Диссертация имеет библиографический указатель, который содержит 292 источников, включающих в себя 145 отечественных и 147 зарубежных источников. Работа изложена на 240 страницах машинописного текста, содержит 46 таблиц и 34 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика клинического материала и использованных методов исследования у больных с хронической сердечной недостаточностью.

Для решения поставленных задач нами с 2002 по 2007 гг проводились исследования по нескольким направлениям, сгруппированным в таблице 1.

Первоначально у 154 больных с ИБС и ХСН различной степени тяжести было проведено развернутое исследование иммунного статуса и сопоставление его показателей с фенотипическими и функциональными характеристиками мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга.

У 250 кардиохирургических больных на лейкоцитарной взвеси, была разработана методика и тесты, позволяющие оценивать адаптационные резервы организма и тем самым прогнозировать эффективность применения аутологичных клеток костного мозга для лечения ХСН

У 107 больных с ИБС и ХСН с помощью предложенного теста был разработан и применен метод индивидуального подбора иммунокорректо-ров, что обеспечивало повышение функциональной иммунорегуляторной активности всех клеток иммунной системы, в том числе и клеток костного мозга (КМ)

Таблица 1. Общий объем исследований, проведенных для повышения эффективности терапии больных с ХСН аутологичными ККМ

Серия исследования Группа исследования Больные с АКШ или протезированием клапанов сердца Больные с ко-ронарографией или ангиопластикой Всего

1 Изучение иммунного статуса кардио-хирургических больных и сопоставление показателей с характеристиками МНК КМ 95 59 154

2 Разработка методики и тестов для прогнозирования резервов индивидуальной устойчивости организма к стрессорному воздействию 250 0 250

3 Отработка метода индивидуального подбора иммунокор-ректоров 107 0 107

4 «Пилотные исследования» влияния ККМ у больных ХСН Ведение ККМ интракоро-нарно - 4 8

Введение ККМ интрамио-кардиально 4 -

5 Применение МНК у больных ХСН Применение культивированных МНК интракоро-нарно 42 71

Применение культивированных МНК интрамиокар-диально 29

Применение иммунокор-рекции и культивированных МНК интракоронарно 17 77

Применение иммунокор-рекции и культивированных МНК интрамиокарди-ально 60

Больные с АКШ без ККМ (контроль) 50 - 50

Больные с АКШ без ККМ (с иммунокоррекцией) 15 - 15

6 Влияния ККМ на частоту развития им-мунозависимых п/о осложнений Больные АКШ +ККМ 50 - 50

Больные с АКШ без ККМ (контроль) 475 475

Всего исследований 1257

Оценка клинической эффективности лечения больных ИБС с ХСН с помощью мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного КМ была проведена у 148 больных, у 89 (29+60) из этих больных проводили интрамиокарди-альную трансплантацию МНК КМ во время операции аортокоронарного шунтирования (АКШ) без и с проведением иммунокоррекции Контролем служили 50 больных с АКШ без ККМ У 15 больных с АКШ (без трансплантации ККМ) изучено влияние предварительной (1 курс) иммунокоррекции на сократительную функцию миокарда

У 59 (42+17) больных проводили динамическое наблюдение за восстановлением функции миокарда после интракоронарного введения МНК

8 больных вошли в так называемую группу «пилотных исследований», которые положили начало работе по применению ККМ у больных ИБС с ХСН в клинике (у 4 больных были проведены интракоронарные инфузии и у 4 больных МНК вводили интрамиокардиально) и позволили установить безопасность метода клеточной терапии, а также расширить его изучение в клинике.

Отдельный раздел работы был посвящен оценке влияния трансплантации МНК на частоту развития иммунозависимых послеоперационных осложнений у больных, перенесших операцию АКШ (50 больных)

Контролем этой группы исследований служили 475 больных с АКШ без трансплантации МНК

В целом результаты проведенной работы основываются на анализе результатов клинического и лабораторного исследования 869 кардиохирурш-ческих больных, у которых было проведено 1257 исследований

Поиск путей оптимизации терапии аутологичными ККМ был выполнен у 156 больных исходные параметры клинического кардиологического статуса которых достоверно не отличались от аналогичных параметров в контрольных группах (без терапии ККМ)

Методы клинического обследования карднохирургических больных.

Обследование больных проводилось по утвержденному протоколу, включающему перечень общеклинических и специальных методов исследования Методы оценки кардиологического статуса больных включали: электрокардиографические, эхокардиографические, доплер-эхокардиогра-фические исследования; зондирование правых и левых отделов сердца; ко-ронарографию; рентгеноконтрастную вентрикулографию; радиоизотопные исследования сердца и внутрисердечные исследования, которые выполнялись по специальной программе, включающей ретроградную катетеризацию правых и левых отделов сердца с регистрацией кривых внутриполостного давления

Функциональный класс стенокардии оценивали по классификации Канадской ассоциации кардиологов [Захаров В.Н, 2001], функциональный класс хронической сердечной недостаточности - по Международной (Нью-Йоркской) классификации кардиологов [Ольбинская Л.И, Сизова ЖМ, 2001].

Физическую активность и качество жизни больных оценивали по-6-минутному тесту, индексу физической активности (The Duke Activity Status Index-индекс DASI) в баллах и показателю качества жизни больных ХСН (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire - MLHFQ) в баллах. Иммунологическое обследование больных (крови и костного мозга) проводили с использованием стандартных тестов, рекомендованных ВОЗ, в соответствии с разработанной схемой иммунологического обследования, адекватной для диагностики типа и степени вторичной иммунной недостаточности [Новиков Д К 1996; Фрейдлин И С 1986, Пинегин Б В., Ярилин В А, 2001]

Контроль частоты возникновения послеоперационных иммунозависн-мых осложнений у больных, включал оценку следующих показателей Общую летальность (ЛЕТ), частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений (ПИО), летальность, ассоциированную с инфекцией

(ЛАИ), тяжесть инфекции (ТИ), которая рассчитывалась, как отношение количества больных, умерших от инфекции, к общему числу больных с инфекционными осложнениями; развитие полиорганной недостаточности (ПОН)

Индивидуальный подбор иммуномодуляторов для кардиохирургических больных осуществляли с помощью метода люминолзависимой хемилюми-несценции (XJI) лейкоцитарной суспензии m vitro [Владимиров Ю.А, Шер-стнев М.П 1989] при инкубации ее с иммуномодуляторами

Для проведения иммунокоррекции были использованы препараты по стандартным схемам, рекомендованным в аннотациях к препаратам: Полиоксидоннй, ООО «Иммафарма» (Москва), по 6 мг в\м 1 раз в день в течение 10 дней, Имунофан, Hi 111 «Бионокс» (Москва), по 1 мл 0, 005% р-р в/м, 1 раз в день в течение 10 дней; Циклоферон, ООО «НТФФ Полисан» (Санкт-Петербург), по 2 мл (250 мг) в/м 1 раз в день 10 дней, Реаферон, ЗАО «Вектор-Медика» (Россия), по 1 млн ME в/м 1 раз в два дня 10 дней; Т-активин ОАО «БИОМЕД» (Россия), по 4-5 мкг/кг (0,04- 0,05 мл/кг) 1 раз в день подкожно 1 раз в день 5-7 дней, Тимоген, «НПО Микроген» (Россия), по 100 мкг в/м 1 раз в день в течение 10 дней.

Технология получения, подготовки и применения аутологичных клеток КМ для трансплантации.

Технологический процесс включал: получение костномозговой взвеси клеток из подвздошной кости под местной анестезией в условиях операционной; выделение и культивирование клеток костного мозга (ККМ) в асептических условиях в ламинарном боксе с использованием чашек Петри и посевом клеток в концентрации 2,5-3*10б кл/мл сроком на 5-7 суток; подготовку взвеси аутологичных ККМ для трансплантации больному

Трансплантацию МНК в миокард осуществляли строго по показаниям с учетом регламентированных абсолютных и относительных противопоказаний

Обработка материала и статистический анализ проводился с помощью программы обработки данных "Статистка 6 О" (США, 2002г ), средствами которой выполнялось также графическое представление данных Все расчеты выполнялись автоматически на компьютере с процессором Pentium 4 в среде Windows ^ Professional., с использованием функции статистического анализа базы данных программы "Статистика 6,0" (США, 2002)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Особенности показателей иммунного статуса у больных ХСН. У всех больных ХСН (п=154), которые поступили на лечение, в том числе с применением ККМ, было проведено полное обследование крови на иммунный статус, результаты которого представлены в таблицах 2, 3 и рис 1

Таблица 2. Характеристика популяционного состава лимфоцитов у больных

ХСН

Иммунологические показатели, % Здоровые доноры, п=25 Больные ХСН, (п=154) Группа больных ХСН

<N N >N

Лейкоциты, кл/мкл 6646±451 6830±552 3614±210* 6749±254 9215±422*

(15%) (61%) (24%)

Лимфоциты 32,5±4,8 25,1±4,2 15,3±2,7* 30,5±4,4 44,6+4,8*

(62%) (7%) (31%)

Т-лимф (CD3+) 67,5±4,6 57,9±6,6 42,2±4,5* 65,2±3,5 79,6±4,7*

(58%) (8%) (34%)

Т-хел (CD4*) 43,1±3,7 35,9±4,8 27,7±4,4* 42,5±2,5 55,5±4,6*

(68%) (14%) (18%)

Т-цит. (CD8+) 25,1+3,6 20,3±4,8 13,5±4,2* 27,1 ±4,8 39,6±4,3*

(68%) (10%) (22%)

NK-кл (CD164) 13,9+1,6 17,5±3,5 6,7±2,7* 13,5±2,0 26,6±5,0*

(20%) (42%) (38%)

В-лим (CD20+) 10,1±1,5 6,7±3,5 6,1±2,0* 10,2+1,2 14,2±2,2*

(84%) (10%) (6%)

Обозначения: * - достоверное различие по сравнению с группой здоровых доноров крови (р<0,05), в скобках указан % больных, включенных в группу, от общего числа больных ХСН, ^ - сниженное значение исследуемого показателя, >Ы - повышенное значение исследуемого показателя; N - нормальное значение исследуемого показателя.

Таблица 3. Показатели функциональной активности Т-клеток крови у боль-

ных с ХСН.

Иммунологи- Здоровые Больные Группа больных ХСН

ческие пока- доноры, ХСН,

затели, % п=25 (п=154), I

N Ж

НЬА 1Ж+ кл. Ц,5±3,5 13,5±3,3 5,2±3,2* 13,1±2,0 26,914,4*

(19%) (65%) (16%)

11.2-11 (С025+) 3,2+1,6 2,9+1,1 1,3±0,4* 3,8+1,0 8,1±2,2*

(60%) (25%) (15%)

СВ7Г 3,0±0,5 3,7±0,2 1,4+0,7* 3,5±0,8 8,8+3,2*

(25%) (60%) (15%)

СИ 95т 13Д±3,1 17,5±2,2 7,2±2,7* 13,9±3,3 25,3±3,9*

(17%) (40%) (43%)

Обозначения: см. таблицу 2.

Распределив всех больных в группы, различающиеся между собой по степени отклонения исследуемых показателей от нормы, нами были выделены те варианты отклонения показателей популяционного состава лимфоцитов и функциональной активности Т-лимфоцитов, которые были наиболее типичны для больных ХСН, поступивших на (рис. 1).

Рис. 1. Распределение больных ХСН по группам (в %) в зависимости от численных значений показателей клеточного звена иммунитета. Белая часть столбиков - больные со сниженным значениями показателей; черная часть столбиков - больные с повышенными значениями показателей; серая часть столбиков - больные с нормальным значением показателей.

Было установлено, что у преобладающего большинства больных ХСН выявляется: снижение (или тенденция к снижению) общего числа Т-клеток (CD34) в периферической крови (у 58% больных) на фоне относительной (%) и абсолютной (хЮ9) лимфопении; снижение числа Т-хелперов (CD4") (у 68% больных) и цитотоксической фракции СВ8+-клеток (у 68% больных); повышение фракции NK-клеток (CD164) у 38% больных; снижение В-лимфоцитов (CD20+) у 84% больных

У 16% больных с прогрессирующей формой ХСН отмечается повышение количества активированных Т-клеток (HLA DR+), а также клеток, экспрессирующих рецептор к ИЛ-2 (CD25+ioi) и CD71+, но у значительного числа обследованных пациентов, т е у 19%, 60% и 25% соответственно выявлено снижение этих показателей ниже принятой нормы; установлено также повышение готовности Т-клеток к активационному апоптозу более чем у 43% (СБ95+'клетки с экспрессией FAS-R) Среди показателей гуморального звена свыше 50% больных имели повышенный уровень ЦИК в крови, более 80% кардиологических больных имели сниженные значения фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса.

Результаты проведенных исследований крови позволили заключить, что больные ХСН имеют признаки общего вариабельного иммунодефицита по клеточному звену со снижением фагоцитарной активности нейтрофилов Полагая, что выявленные изменения иммунного статуса должны найти отражение в изменении популяционного состава ККМ этих больных, нами было проведено сравнительное исследование миелограммы больных и здоровых доноров костного мозга Было установлено, что миелограммы этих двух сравниваемых групп достоверно не различались В тоже время при фе-нотипической характеристике свежевыделенных МНК КМ больных было установлено снижение CD25 клеток по сравнению со здоровыми донорами КМ Кроме того, была установлена сильная прямая корреляционная зависимость между количеством CD25 клеток в крови и числом колониеобразую-щих единиц МНК КМ после их культивирования (г=0,72), а также сильная

обратная корреляционная зависимость между количеством CD95 клеток крови и числом колониеобразующих единиц МНК КМ этих больных (г=-0,59).

Результаты приведенного исследования позволили предположить, что у больных ИБС с резкой дисфункцией иммунной системы и сопутствующим снижением функциональной активности ККМ - эффект от терапевтического применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга будет снижен или отсутствовать

Полученные результаты позволили нам также заключить, что.

- для прогнозирования результатов терапии аутологичных МНК у больных ХСН должен быть разработан и использован информативный метод, основывающийся на предварительной индивидуальной оценке общих адаптационных резервов организма по состоянию биологической реактивности клеток иммунной системы,

- под контролем разработанного биологического теста должен быть разработан метод повышения адаптационных резервов организма, в том числе иммунной системы и костного мозга, что позволит повысить биологические регуляторные возможности аутологичных клеток КМ для эффективной терапии ХСН

Разработка метода прогнозирования адаптационных резервов и индивидуальной устойчивости организма к стрессорному воздействию у больных с ХСН.

Описание выполнения способа прогнозирования адаптационных резервов.

В качестве клеточной модели использовали лейкоциты крови (Ж), устойчивость которых к стрессорному повреждению оценивали m vitro в хемшпоминесцентном тесте Критерием устойчивости служил индекс стимуляции (ИС) ядросодержащих клеток под действием ингибитора ц-АМФ

фосфодиэстеразы (иФДЭ) (10-карбоксиметил-9-акриданон*), способствующего повышению уровня ц-АМФ в клетке [Romer et al 1986].

Для определения ИС использовали две кюветы - контрольную и опытную, куда вносили по 40*103 Ж В опытную кювету дополнительно вносили 1 мкл раствора иФДЭ (12,5% р-р). В контрольную ячейку вносили 1 мкл раствора Хэнкса Обе кюветы инкубировали в термостате в течение 60 мин при 37°С, после чего проводили запись кривых хемилюминесцентной реакции (XJIP) клеток в контрольной и опытной кюветах с использованием хе-милюминометра «Хемилюм 12» (Россия) в комплексе с компьютером IBM-PC при температуре счетной камеры 37°С, в течение 15 мин, после добавления активатора образования активных форм кислорода - РМА (форбол-12-миристат-13-ацетат)

Суммарную продукцию (S) активных форм кислорода (АФК) ядросо-держащими клетками вычисляли как площадь под кривой ХЛР отдельно в контрольной и опытной пробах. Затем, рассчитывали ИС, как отношение площади ХЛР в опытной и контрольной пробах (MC=S„an)0HroP /8контрол1,), для нивелирования индивидуальных отклонений в продукции АФК у разных больных (рис 2)

Для выявления связи тяжести нарушения кинетических характеристик кривых ХЛР Ж с уровнем адаптационных резервов организма нами проводилась также количественная оценка состояния иммунного статуса

АФК (у «■) 1500

АФК <уе)

1500 в ; / ••ч -"5ц- • [

1000 ' г t t

• 1 * > t i

500 » 1 )

• « /\Ь Нхгкбхтор J ! 1

1000

500

О 2

4 6 8 10 12 14 16 мин

1 1)1 (lilt

i III 1 i 1 1 1 1

? «у* Jf Jill /1 » » » 1 /»till s ' ' : ! Контроль , м.мм. . п и!

4 6 8 10 12 14 16 мин

Рис 2. Запись кривых ХЛР для расчета индекса стимуляции_

М0-карбоксиметнл-9-акриданон входит в состав препаратов «Неовир», «Циклофе-рон».

Опенка индивидуальной устойчивости больных к стрессу - проводилась на Ж 250 больных, которым выполнялись реконструктивные операции на сердце (аортокоронарное шунтирование, протезирование клапанов сердца) Контролем служили исследования устойчивости Ж 25 клинически здоровых доноров

Проведенное исследование показало, что XJIP Ж на инкубацию с ингибитором ФДЭ у здоровых доноров и у больных с тяжелыми хроническими заболеваниями сердца имеет достоверные количественные и качественные различия. Добавление к клеткам ингибитора у здоровых доноров повышало продукцию АФК, тогда как у больных с тяжелой хронической патологией сердца наоборот снижало ее по сравнению с контролем Нарастание тяжести клинического состояния больных приводило к практически полному инги-бированию продукции АФК при добавлении ингибитора

Было отмечено, что больные, у которых в послеоперационном периоде развились послеоперационные осложнения имели в предоперационном периоде резко сниженный ИС, который колебался от 0,01 до 0,6 Выбрав за реперную точку ИС=0 6 и разбив всех оперированных больных по группам в зависимости от исходного значения ИС, мы отметили, что при ИС>0,6 процесс выздоровления больных шел достоверно быстрее, опасность развития осложнений (инфекционно- септические, органные дисфункции) была достоверно ниже, чем у больных с исходном значением ИС <0,6

Было отмечено также (таблица 4), что у больных с ИС <0 6 после перенесенной операции достоверно снижается уровень лимфоцитов, преимущественно СД4+ лимфоцитов, относящихся к Т- клеточной популяции.

Сопоставление результатов клинического наблюдения и лабораторных исследований позволяет придти к заключению, что степень исходного снижения ИС и других показателей XJIP прогнозирует не только опасность развития и тяжести иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, но и степень дисфункции иммунной системы.

Таблица 4 Показатели хемилюминесцентиой реакции и клеточного звена иммунной системы у кардиохирургических больных до и на 7 сутки в зависимости от значений ИС в предоперационном периоде._

Показатель Здоровые доноры (п=25) Кардиохирургические больные

ИС<0 6 (п=104) ИС>0 6 (п=14б)

До операции После операции До операции После операции

йОО^/уе) 352,1±55,2 277,1 ±15,9 151,1±33,2* 333,0±Н,Г 240,2±30,3*+

ИС 2,50±0,31 0,5710,04 0,0810,02* 0,86±0,08+ 0,44±0,10*+

Лейк. кл/мкл 6646±451 6850±854 10750±450* 6920±655 9840±955*

Лимф,% 32,5±4,8 20,3123 14,4±2,6* 27,1±2,1+ 25,4±3,3+

Т-кл, СВЗ,% 67,5±4,6 56,2±3,1 44,5±1,1* 63,3±23+ 58,2±2,9+

Т-хел ,СВ4,% 43,1±3,7 35,1+4,2 30,0±1,1 41,3 ±2,7 37,3±3,2+

Т-цит, СБ8,% 25,1+3,6 22,2±3,5 14,1±3,1* 20,3±2Д 21,1±2,1+

В-лим, С020,% 10,1+1,5 6,4±1,1 6,3±2,1 6,9+1,7 6,5±2,2

Ж-кл.СШб, % 13,9±1,6 15,1±2,2 13,1±1,4 18,9±2,0 16,1±1,3+

СВ7Г, % 3,0±0,5 3,8±1,4 7,2±2,3* 3,112,3 6,4±1,1*

*- достоверно, по сравнению с исходным уровнем (р<0,05) + - достоверно, по сравнению с группой ИС<0,6 (р<0,05)

Рассматривая ИС в качестве показателя адаптивных резервов устойчивости организма мы полагали, что подбор иммуномодуляторов и контроль медикаментозно регулируемого восстановления сниженных адаптационных резервов организма с помощью иммунокорректоров также должен осуществляться путем динамического измерения ИС

Пути восстановления биорегуляторной активности клеток аутологич-ного костного мозга у больных ХСН.

Оценка эффективности иммунокоррекции в организме при индивидуальном подборе иммуномодуляторов методом хемилюминесценции.

В исследование были включены пациенты, у которых была выполнена кардиологическая операция (АКШ или протезирование клапанов сердца) и которые нуждались в проведении иммунокоррекции (на основании анализа

результатов клинического и лабораторного обследования больных) Все больные были разделены на две группы

В 1-ю - основную группу - были включены пациенты, получавшие курсовую терапию подобранным иммуномодулятором (ИМ), который в ХЛ-тесте был определен, как предпочтительный препарат (п=53) для иммунокоррек-ции

Препаратом выбора считали иммуномодулятор, индекс стимуляции лейкоцитов которым был больше 1,1.

Во П-ю группу - сравнения были включены пациенты, также получавшие курсовую терапию ИМ, который назначался произвольно при выявлении отклонений в иммунограмме без специального подбора (п=54).

Результаты изменения лейкоцитарной формулы и показателей клеточного звена иммунитета, наступающие при индивидуально подобранной и произвольно назначенной иммунокоррекции, представлены в таблице 5 и таблице 6

Таблица 5 Динамика показателей лейкоцитарной формулы крови у больных при проведении иммунокоррекции на основе индивидуального подбора и произвольного назначения иммуномодулятора (ИМ)_

Показатель, % Здоровые доноры (контрольная группа) (п=25) Индивидуальный подбор ИМ (группа I) (п=53) Произвольное назначение ИМ (группа II) (п=54)

Исходные значения Через 14 дней после начала лечения Исходные значения Через 14 дней после начала лечения

Лимфоциты 32,5±6,8 16,7±2,2* 30,0±2,0+ 17,3±1,6* 24,2±1,9+

Нейтр (с/я) 60,5 ±1,6 61,0±2,8 62,3±2,6 60,5±2,3 59,3±1,9

Нейтр (п/я) 4,5±1,1 11,1±0,7* 6,1±1,3+ 12,2±2,5* 9,0±1,4*

Моноциты 2,9±0,5 7,3±1,7* 2,6±0,5+ 7,3±0,6* 4,6±0,8+

Базофилы 0,4±0,1 0,2±0,1 0,2±0,1 0,4±0,2 0,4±0Д

Эозинофилы 2,9±0,4 3,2±0,5 2,1±0,6 3,2±0,6 3,8±0,б

* - достоверное различие со здоровыми донорами (р<0,05)

+ - достоверное различие с исходным уровнем (р<0,05)

Из таблиц видно, что предварительный индивидуальный подбор ИМ in vitro способствовал развитию у больных достоверно более благоприятных изменений ряда исследуемых показателей, в лейкоцитарной формуле наступало достоверное снижение палочкоядерных нейтрофилов, в иммуно-грамме - повышение уровня лимфоцитов, Т-лимфоцитов и их основных субпопуляций, В-лимфоцитов Уменьшались признаки воспалительной реакции (снижение HLA-DR) и нормализовался уровень CD25 лимфоцитов При этом нормализация клеточного звена проходила с нарастанием проли-феративной способности лимфоидных клеток (CD71+).

Таблица 6. Динамика показателей клеточного звена иммунитета у кардиологических больных при курсовом проведении иммунокоррекции на основе индивидуального подбора (основная группа) и произвольного назначения

Показатель, % Здоровые доноры (контроль) (п=25) Индивидуальный подбор ИМ (группа I) (п=53) Произвольное назначение ИМ (группа II) (п=54)

Исходные значения Через 14 дней после начала лечения Исходные значения Через 14 дней после начала лечения

Лейк, кл/мкл б646±451 10218±675* 8705±675*+ 10358±567* 7850±555*+

Лимфоциты,% 32,5±6,8 16,7±2,2* 30,0±2,0Х+ 17,3±1,6* 24,2±1,9*+

Т-лим (CD3) 67,5±4,6 50,2±4,3* 69,8±2,5Х+ 49,5±4,1* 58,4±4,4+

Т-хел (CD4) 43,9±3,7 34,4±3,1* 45,5±1,4Х+ 33,4±3,4* 40,1±3,1

Т-цит (CD8) 25,1±3,6 16,1±2,5* 25,7±2,0Х+ 17,0±2,2* 18,7±1,2*

В-лим (CD20) 10,1±1,5 6,9±1,9 8,6±0,9х 6,1±2,0* 6,3±1,1*

NK-кл (CD 16) 13,9±1,6 13,8±1,4 16,5±2,0 11,7±2,9 19,5±2,9*+

HLA-DR 11,5±3,5 13,0±1,1 15,7±1,7 16,8±2,5 17,6±2,1*

CD25-bji 3,2±1,6 2,0±0,1 6,6±0,9*+х 1,9±1,1 2,8±1,2

CD71 3,0±0,5 6,6±1,7* 11,0±2,8*+ 3,1±1,2 8,7±2,0*+

CD 95 13,1±3,1 15,0±2,8 8,3±2,9Х+ 17,2±2,7 16,9±3,3

* - достоверное различие по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05), х - достоверное различие с группой сравнения (р<0,05); + - достоверное различие по сравнению с исходным уровнем (р<0,05),

Таким образом, проведенное исследование показало, что индивидуальный подбор иммунокорректоров больным ХСН существенно и достовер-

но повышает иммунорегуляторные свойства клеток крови этих больных по сравнению с произвольным назначением иммунокорригирующих препаратов.

Повышение функциональной активности клеток костного мозга при проведении иммунокоррекции.

Используя для оценки адекватности иммунокоррекции разработанный нами показатель - индекс стимуляции (ИС) в хемилюминесцентном тесте мы сопоставили содержание клеток СБ25+, С095+ и количество колоние-формирующих единиц (КОЕ) в свежевыделенных МНК костного мозга у больных с ИС <1.0 и больных, у которых ИС стал >1.0, через 14 суток после иммунокоррекции (рис 3).

го 1

18 16 14 12-, 10

2

Рис. 3 Влияние значений ИС лейкоцитарной взвеси периферической крови на взаимозависимые показатели функциональной активности МНК костного мозга (колониеобразующие единицы) у больных ХСН с ИС <1 (черный столбик); восстановление ИС>1 (черно-белый столбик); здоровые доноры (белый столбик).

Результаты измерения содержания CD25 и CD95 в крови, а также число колониеформирующих единиц в мононукяеарной фракции КМ подтвердили, что медикаментозная иммунокоррекция является эффективным способом повышения функциональной активности ККМ.

Культивирование мононуклеарных клеток костного мозга in vitro -дополнительный способ повышения их функциональной активности.

Проведенные исследования позволили установить, что культивирование МНК KM in vitro всегда изменяет фенотипический состав клеток (рис.4) и этот факт мы стали рассматривать как доказательство изменения функциональных характеристик клеток в процессе культивирования.

Вместе с тем мы отметили, что характер и выраженность возникающих изменений у разных больных различна и коррелирует с исходным значением ИС Ж крови этих больных и клиническим эффектом после их применения.

А в

%

% 80 —------------! ; 70 -------------,

7

Рис. 4 Фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного мозга двух больных до и после культивирования. Темные столбики - после культивирования; Светлые столбики - до культивирования. А- клинический эффект на применения ККМ - был отчетливо выражен (ЙС>1.0); В- клинический эффект на применения ККМ отсутствовал (слабо выражен) (ИС<1.0).

Так у больного с тяжелой ХСН (рис. 4Б) клинический эффект на применение аутологичных культивированных клеток был слабо выраженным и этот эффект соответствовал ИС <1.0. У другого больного, также с ХСН (рис. 4 А), ККМ отреагировали на культивирование резким увеличением практически всех популяций клеток, а после применения этих клеток у больного был получен отчетливо выраженный позитивный клинический эффект (ИС его лейкоцитов был > 1.0).

6 s

4 3

У больного с позитивной клинической реакцией на введение ККМ, наступали не только отчетливые количественные изменения в популяционном составе клеток, но и резко увеличивалось в культуральной среде содержание ТвР-р и С-СвБ. У больного с отсутствием выраженной позитивной реакции на введение аутологичных ККМ - накопление цитокинов в культуральной среде было незначительным также как невыраженными были изменения в фенотипическом составе клеток после культивирования (рис. 5).

Рис. 5. Интенсивность накопления цитокинов в культуральной среде (за 5 суток культивирования) мононуклеарными клетками костного мозга, оказывающих различный клинический эффект при их аутологичном применении. Светлые столбики- позитивный клинический результат (ИС >1.0); черные столбики - клинический эффект отсутствовал, ИС <1.0.

Результаты проведенного исследования позволили нам признать пригодность хемилюминесцентного метода и процедуры культивирования клеток для прогнозирования функциональных (адаптационных) резервов иммунной системы больных (в том числе МНК КМ), а также возможность повышения этих резервов с помощью медикаментозной иммунокоррекции в организме больного и в меньшей степени путем предварительного культивирования МНК KM in vitro.

Влияние культивированных мононутеарных клеток аутологичного костного мозга на показатели сократительной функции сердца и качество жизни больных ХСН (I этап исследования).

Интракоронарное введение культивированных клеток костного мозга в миокард.

Анализ результатов интракоронарного применения ККМ без хирургической коррекции был выполнен в двух группах больных ХСН В 1-ю группу были включены больные, внесенные в лист ожидания трансплантации сердца (и=13), т е имели терминальную стадию поражения миокарда. Среди них было 3 больных с ишемической кардиомиопатией (ИКМП) и 10 больных с дилатационной кардиомиопатией (ДКМП) Этим больным интракоро-нарно вводили 150-500* 10б МНК аутологичного КМ однократно (п=11) или многократно (п=2) (3-4 раза) в тех же дозах

Во вторую группу было включено 29 больных с ИКМП, причем у 25 из них был поставлен диагноз ИБС с постинфарктным кардиосклерозом и ХСН (ФК П-1У по ЫУНА); у 4 больных - ИБС с рефрактерной стенокардией (ФК П-Р/ по КУНА) Эти больные получали интракоронарно ту же дозу клеток, что и в I группе, но всегда однократно.

Как в первой, так и во второй группе больных проводилась традиционно используемая медикаментозная терапия миокарда, без его хирургической реваскуляризации

В 1-й группе уже через 2 месяца после введения ККМ отчетливо позитивно менялись клиническое состояние, качество жизни и индекс физической активности больных (таблица 7)

Однако, позитивная динамика указанных показателей сохранялась не более 2-3 мес, после чего требовались повторные интракоронарные инфу-зии клеток, которые позволили 2 больным с ДКМП в течение 2 лет дождаться трансплантации донорского сердца

Таблица 7 Изменение показателей клинического состояния больных, ожидающих пересадку сердца до и через 2 мес после интракоронарной трансплантации аутологичных МНК костного мозга, л=13__

Показатель До введения МНК КМ М±м Через 2 мес после введения МНК КМ М±м Значение р (по критерию Манна-Уитни)

Индекс физической активности БАБ!,баллы 21,7±6,1 38,2±7,6 0,002

Качество жизни, МШРС), баллы 76,2±12,4 46±11,4 0,0025

Проба с 6-минутной ходьбой, м 150±76 315±52 0,03

Примечание: индекс ОА81 - более высокие показатели соответствуют более высокой физической активности. Индекс МЮТС) - более высокие показатели соответствуют менее высокому качеству жизни.

Во II группе больных влияние клеточной терапии на показатечи функции сердца оценивали через 6 месяцев после трансплантации, причем первоначально при оценке результатов клеточной терапии не учитывались исходные индивидуальные характеристики больного и прежде всего исходный ИС лейкоцитов крови, отражающий функциональную активность используемых ККМ В результате при такой оценке достоверного улучшения показателей функции миокарда нами не было обнаружено.

Проведя корреляционный анализ между показателями насосной функции сердца - фракцией изгнания (ФИ), конечным диастолическим и систолическим объемами (КДО и КСО) через 6 месяцев после трансплантации с одной стороны и исходной функциональной активностью клеток костного мозга (Индекс стимуляции), возрастом больного, длительностью СН, количеством вводимых клеток, показателями Т- клеточного звена иммунной системы, показателями функциональной активности лимфоцитов периферической крови с другой стороны - нами было выявлено существование сильной корреляционной связи в следующих 6 парах (таблица 8)

Таблица 8. Факторы, влияющие на ремоделирование ЛЖ у больных с ИБС

Корреляционные пары Бреагтап Я р-1еуе1

Длительность СН - ДКСО ЛЖ 6 мес 0,73 0,04

Длительность СН - ДФИ ЛЖ бмес -0,40 0,049

Индекс стимуляции - ДКДО ЛЖ 6 мес -0,78 0,0005

Индекс стимуляции - ДКСО ЛЖ 6 мес -0,59 0,008

Индекс стимуляции - ДОА81 мес 0,45 0,04

Индекс стимуляции - ДУО ЛЖ 6 мес 0,58 0,01

Примечание: Д - дельта изменения показателя, %, рассчитывалась по Ребровой О Ю (2002)

Установив значимость ИС в реализации терапевтического эффекта введенных МНК на миокард мы для выявления результатов клеточной терапии разделили всех этих больных на две подгруппы1 с ИС <1 и ИС>1 (таблица 9)

Таблица 9. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес после интракоронарно-го введения культивированных клеток костного мозга в зависимости от зна-

Параметры, % Больные ИБС

Исходный ИС<1 Исходный И01 р Манна-Уитни

(«=И) («=18)

ДКДОЛЖ 1,2±4,1 -9,1±5,1 0,049

ДФИЛЖ 7,1 ±4,9 10,2±8,7 0,12

ДКСОЛЖ 3,9±8,08 -15,0±7,3 0,049

ДУОЛЖ 4,6±1,1 10,5±2,2 0,01

Д Индекс ОАБ! 44,3±11,1 68,5±9,9 0,04

Обозиачения: КСО - конечно-систолический объем; КДО ЛЖ - конечно-диастолический объем, УО - ударный объем; ФИ ЛЖ - фракция изгнания левого желудочка; ВАБ1 - индекс физической активности, Д - дельта изменений, рассчитывалась по Ребровой О Ю (2002)

В результате нам удалось подтвердить, что высокие исходные значения ИС играют определяющую роль в развитии позитивных эффектов клеточной терапии миокарда при ХСН В тоже время позитивное влияние клеточной терапии на показатели общего клинического состояния больных не зависело от исходных значений их ИС (таблица 10)

Таблица 10. Динамика клинического состояния больных ИКМП, через 6 мес после изолированного интракоронарного введения клеток костного мозга, п=29_

Показатели До введения! МНК КМ Через 6 мес. после введение МНК КМ Р = Мапп-Whitney

Тест с нагрузкой, METS. 5,0±1,5 8,0±1,5 0 047

DASI, баллы 27,7±10,2 44,2±6,1 0002

MLHFQ, баллы 68±11,4 25±15,2 0 0025

Частота ангинозных приступов в неделю 7,13±3,1 2,15±1,4 0 0001

6-и минутная проба, метры 212±75 350±72 0 03

Примечание. METS - метаболический эквивалент, один МЕТ равен количеству кислорода, которое в среднем потребляет сидящий человек DASI - индекс физической активности Индекс MLHFQ - Миннесотский опросник качества жизни больных ХСН,

Интрамиокардиальное введение культивированных клеток костного мозга в миокард при операции аортокоронарного шунтирования (АКШ)

В настоящий раздел исследования были включены больные ишемиче-ской ХСН, которые поступили в клинику для плановой операции АКШ

Больные были разделены на 2 группы 1-ю группу (контрольную) было включено 50 больных, которым выполнялась АКШ по стандартному плану Во 2-ю группу клеточной терапии (АКШ+ККМ) было включено 29 больных, которым во время операции АКШ интрамиокардиально вводили аутологичные, предварительно культивированные МНК в количестве 200*106 клеток в 5 мл физиологического раствора.

Через 6 месяцев после операции в обеих группах больных было проведено сравнительное изучение изменения наиболее информативных показателей функции миокарда и показателей общеклинического состояния (таблица 11)

Таблица 11. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес после интрамиокар-диального введения культивированных клеток костного мозга во время опе-

Параметры, % Больные ИБС

АКШ (и=50) АКШ+ККМ (и=29) р Манна-Уитни

АКДОЛЖ -3,9+2,1 -7,5+2,6 0,65

ДФИЛЖ 9,1+2,9 18,2+10,7 0,02

ДКСОЛЖ -10,2+8,08 -12,6+1,26 0,51

ДУОЛЖ 7,05+6,9 6,7+4,2 0,2

Д Индекс БАБ! 8,3+1,9 18,6+3,1 0,04

Обозначения: см таблицу 9

Оказалось, что в группе АКШ+ККМ достоверно позитивно изменялись только два показателя ФИ ЛЖ и индекс ВАБ1 Прирост ФИ ЛЖ через 6 мес в группе АКШ+ККМ составил 18,2% вместо 9,1% в контроле (р=0 021), а индекс ПА81 18,6% и 8,3% (р=0 04) соответственно в исследуемой и контрольной группах

Корреляционный анализ между гемодинамическими параметрами насосной функции сердца (КДО, КСО) в группе АКШ+ККМ через 6 месяцев после операции с одной стороны и функциональной активностью клеток КМ (индекс стимуляции), возрастом больных, длительностью СН и другими показателями с другой - позволил установить существование сильной корреляционной связи в парах, включающих значения ЙС (таблица. 12)

Таблица 12. Факторы, влияющие на ремоделирование ЛЖ у больных ИБС через 6 месяцев после интрамиокардиального введения ККМ при операции АКШ+ККМ (по результатам ЭхоКГ)__

Корреляционная пара Бреагтап И. р-1еуе!

ИС-ДКДОЛЖ -0 63 0.005

ИС-ДКСОЛЖ -0 62 0 007

ИС- Д ФИ ЛЖ 0 74 0.001

Длит ХСН-ДКСОЛЖ 0.73 0.043

Разделив всех больных группы АКШ+ККМ на две подгруппы в зависимости от значения ИС (с исходным ИС >1 (п=10) и с ИС<1 (и=19)), мы подтвердили наши предположения о том, что именно от исходного функ-

ционального состояния ККМ зависит эффект их клинического применения у больных ХСН (таблица 13)

Таблица 13.3начения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес после операции АКШ с интрамиокардиальным введением культивированных клеток костного мозга в зависимости от исходного функционального состояния МНК КМ

Параметры, % Больные ИБС

Исходный ИС<1 Исходный р Манна-

(»=19) ИС>1 (и=10) Уитни

ДКДОЛЖ -5,0+2,1 -11,8+2,6 0,006

ДФИЛЖ 13,8+1,8 25,2+5,3 0,0017

АКСОЛЖ -7,6+3,1 -20,4+5,4 0,049

ДУОЛЖ 6,2+1,3 7,7+4,2 0,71

А Индекс DASI 16,3+2,4 22,4+1,3 0,04

Обозначения: см таблицу 9

Оптимизация биорегуляторной активности мононуклеарпых ККМ путем предварительной иммунокоррекции in vivo (индивидуально подобранными иммуномодуляторами) и культивирования ex vivo в питательных средах (II этап исследования).

Для оптимизации биорегуляторной активности МНК КМ у всех больных ХСН (п=60) в предоперационном периоде (до выполнения АКШ) был изучен исходный иммунный статус, установлены значения ИС и проведена иммунокоррекция с целью подготовки больных к операции с позитивным результатом применения клеточной терапии

Характеристика показателей иммунного статуса больных ХСН до и после иммунокоррекции.

Разделив всех больных (п=(60+29), которым планировалась операция АКШ в сочетании с клеточной терапией на подгруппы в зависимости от исходного значения ИС (ИС<1 и ИС>1), мы выявили скрытые ранее различия в усредненной карте показателей иммунной системы этих больных (таблица 14)

Таблица 14 Исходные показатели иммунограммы кардиохирургических больных (29 больных I этапа исследования и 60 больных II этапа исследования) в зависимости от индекса стимуляции их МНК клеток крови_

Показатель Здоровые доноры («=25) Кардиохирургические больные

Общая группа («=89) Группа с ИС>1 0 (и=34) Группа с ИС <1 0 («=55)

Лейкоциты, кл/мкл 6646±451 6893±354 6820±245 6890±145

Лимфоциты, % 32,5+4,8 22,7±3,1* 30,0±3,6 18,1±1,1*+

Т-лимф (СБЗ+)% 67,5±4,6 57,1±5,5* 67,1+6,6 53,5±3,1*+

Т-хел (С04+)% 43,9±3,7 36,5±4,5 43,3+5,4 32,4±3,5*+

Т-цит. (СБ8+) % 25,1±3,б 20,6+2,3 25,2±3,5 18,0±4,9

В-лимф (СЭ20+) % 10,1±1,5 8,2±2,1 9,1±1,1 6,9+1,0*

№С-кл (СО 16+), % 13,9±1,6 16,8±3,1 18,7±3,2 15,0±1,4

Н1А-Ш1,% 11,5+3,5 15,5±1,1 20,1+2,7* 13,1+2,2

1Ь2-Я+-кл, % 3,2±1,6 2,8±0,9 4,0±2,1 1,8±1,0

С071+ 3,0±0,5 3,4±1,2 4,510,5* 2,5+0,1+

СБ 95+ 13,1±3,1 17,2±2,2 12,8±1,2 22,4±1,2*+

"•-достоверно по сравнению со здоровыми донорами (р<0,05), +-достоверно по сравнению с показателями больных с ИС >1 0( р<0,05),

Таблица 15 Изменение иммунологических показателей у больных с ИС<1 0 группы после курса иммунокорригирующей терапии (и=36)_

Иммунологические Здоровые до- Больные с ИС <1 до и по-

показатели, % норы сле иммунокоррекции

(«=25) («=36)

До Через 14 дней

Лейкоциты, кл/мкл 6646±451 6790±130 7750±210

Лимфоциты 32,5+4,8 19,4±1,1* 30,0±2,0Х

Т-лимфоциты (СБЗ+) 67,5±4,6 54,5±2,1* 69,8±2,5Х

Т-хелперы (С04+) 43,9+3,7 33,0±2,1* 45,5±2,4Х

Т-цит. (СБ8+) 25,1±3,6 19,7±1,2* 25,7±2,0Х

В-лимфоциты (СБ20+) 10,1±1,5 7,0±2,2 8,6±0,9

Ж-клетки (СБ 16+) 13,9±1,6 15,5±1,9 16,5±2,0

НЬД-БЯ 11,5±3,5 13,5±1,1 15,7±1,7

1Ь2-Б!.+-кл (СБ25+) 3,2±1,6 1,7±0,9 3,3±0,1х

СБ71+ 3,0±0,5 2,5±0,4 11,0±2,8*х

СБ95+ 13,1±3,1 21,8±2,1* 15,1±1,1х

^-достоверно по сравнению с группой здоровых доноров (р<0,05), ■"-достоверное по сравнению с исходным уровнем (до иммунокоррекции) 0X0,05),

Оказалось, что из 60 больных у 36 изначально (еще до забора клеток костного мозга) ИС был <1 Однако, у этих больных после курса иммунотерапии одним из подобранных иммунокорректоров, уже на 10-14-е сутки происходило достоверно благоприятное изменение большинства изученных нами показателей, причем часть показателей достигала значений, присущих значениям здоровых доноров (таблица 15)

Влияние предварительной иммунокоррекции на результаты операции аортокороварного шунтирования.

В работе была также проанализирована эффективность предварительной иммунокоррекции на сократительную функцию миокарда у больных с операцией аортокоронарного шунтирования У 15 больных в предоперационном периоде была проведена иммунокорригирующая терапия индивидуально подобранными препаратами с целью профилактики иммунозависи-мых инфекционных осложнений В контрольной группе иммунокоррекция не проводилась Сопоставление результатов состояния сократительной функции миокарда в исследуемых группах больных показало, что через 6 месяцев однократный курс иммунокоррекции не вызывает значимого улучшения показателей сократительной функции миокарда (таблица 16)

Таблица 16. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес. после однократного курса индивидуально подобранной иммунотерапии в предоперационном периоде__

Параметры, % Больные ХСН

АКШ(«=50) АКШ + иммунокоррекция (и=15) р Манна-Уитни

ДКДОЛЖ -3,9+2,1 -4,7+3,3 0,71

ДФИЛЖ 9,1+2,9 11,1+7,8 0,31

ДКСОЛЖ -10,2+8,08 -9,3+3,8 0,5

ДУОЛЖ 7,05+6,9 7,1+5,3 0,67

Д Индекс БАв! 8,3+1,9 14,4+4,2 0,1

Влияние предварительной комплексной активации МНК КМ на результаты интрамиокардиальной трансплантации этих клеток больным

хсн.

Интрамиокардиальное применение ККМ, во время операции АКШ (АКШ+ККМ), которые были предварительно 2-х этапно активированы (т vivo с помощью иммунокорректоров и ex vivo путем культивирования), позволило достоверно улучшить значения показателей функционального состояния миокарда и качество жизни больных ХСН через 6 месяцев после операции по сравнению с аналогичной группой больных, в которой ККМ были только культивированы (без предварительной иммунокоррекции) (таблица 17)

Полученные результаты показывают, что активация функционального состояния мононуклеарных ККМ, комплексно и последовательно сначала in vivo, под контролем ИС, а затем ex vivo на этапе культивирования позволяет добиться повышения эффективности трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН, что выразилось достоверно положительным изменением КСО, КДО и ФИ ЛЖ в сравнении с контрольной группой - активация ККМ только ex vivo

Таблица 17. Значения параметров сократительной функции сердца и индекса физической активности у больных ХСН через 6 мес после операции АКШ+ККМ, при использовании культивированных клеток (контрольная группа) и при использовании клеток, подвергнутых активационной терапии

Параметры, % Больные ИБС

АКШ+ККМ (контрольная группа -культивированные ККМ I этап исследования) (я=29) АКШ+ККМ (основная группа- иммунокоррек-ция + культивирование ККМ II этап исследования) (л=60) р Манна-Уитни

Д КДО ЛЖ, -7,5+2,6 -16,21+4,6 0,001

ДФИЛЖ, 18,2+10,7 28,2+5,4 0,02

ДКСОЛЖ, -12,6+1,26 -21,5+4,4 0,044

ДУОЛЖ, 6,7+4,2 20,7+14,3 0,01

А Индекс DASI 18,6+1,1 20,3+1,1 0,052

Влияние предварительной комплексной активации МНК КМ на результаты интракоронарной трансплантации этих клеток больным

хсн.

Проведенная нами иммунокоррекция у больных ХСН (п=17) перед забором клеток костного мозга и последующее культивирование ККМ привело к достоверному улучшению результатов ремоделирования сердца по сравнению с контролем (таблица 18) при введении клеток интракоронарно

Проведение активации мононуклеарных ККМ, последовательно m vivo и ex vivo позволило повысить эффективность трансплантации аутоло-гичных ККМ у больных ХСН, что выразилось более значимым положительным изменениям КСО, КДО, ФИ ЛЖ по сравнению с контрольной группой

Таблица 18. Показатели внутрисердечной гемодинамики и сократительной функции миокарда у больных через 6 мес. после интракоронарной трансплантации МНК, при использовании культивированных клеток (контрольная группа) и при использовании клеток, подвергнутых активационной те-

Параметры, % Больные ИБС

Контрольная группа (контрольная группа - культивированные ККМ I этап исследования) (и=29) Опытная группа (иммунокоррекция + культивирование ККМ II этап исследования) (и=17) Р Манна- Уитни

ДКДОЛЖ -5,2±5,3 -12,5+4,6 0,0006

А ФИ ЛЖ 8,9±2,8 31,2+10,7 0,02

ДКСОЛЖ -7,7±4,3 -26,8+21,26 0,049

ДУОЛЖ 8,2±3,2 9,9+14,2 0,12

А Индекс DASI 62,3±15,1 64,1+33,1 0,44

Обозначения: см. таблицу 9

Влияние мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга на развитие иммунозависимых осложнений у больных после операции АКШ

Анализ частоты развития послеоперационных осложнений показал, что в группе АКШ+ККМ развитие полиорганной недостаточности полностью нивелировалось, а количество инфекционных осложнений становилось достоверно ниже, чем в контрольной группе (таблица 19)

Этот факт является особенно примечательным, если учесть, что сравниваемые группы больных (АКШ и АКШ+ККМ), достоверно не различались между собой ни по возрасту, ни по длительности искусственного кровообращения и искусственной вентиляции легких, но достоверно различались по наличию очагов хронической инфекции в организме, выявленных до операции Очаги хронической инфекции в контрольной группе (АКШ) исходно были выявлены у 27% больных, тогда как в группе (АКШ +ККМ) - у 54%, т е. встречались в два раза чаще, и эта разница была статистически достоверной (р<0,05)

Полагая, что активация микрофлоры в очагах хронической инфекции, в условиях операционного стресса может являться одной из основных причин развития иммунозависимых осложнений, была проанализирована частота развития послеоперационных инфекционных осложнений в каждой группе больных, в зависимости от наличия или отсутствия очагов хронической инфекции в организме в предоперационном периоде

Анализ показал (таблица 19), что общее снижение иммунозависимых осложнений в основной группе происходило как за счет снижения таких осложнений в подгруппе больных без очагов хронической инфекции в организме (тяжесть инфекционного поражения больных), так и особенно в подгруппе больных исходно имеющих очаги хронической инфекции.

Таблица 19. Частота развития послеоперационных осложнений у больных после аортокоронарного шунтирования (АКШ) и у больных с АКШ в сочетании с интрамиокардиальным введением клеток костного мозга (АКШ+ККМ) за 2004-2006гг.

% (кол-во чел) Группа АКШ (п=479) Группа АКШ+ККМ (п=50)

Исходно с хроническими очагами инфекции (п=131/27%) Исходно без хронических очагов инфекции (п=348/73%) Исходно с хроническими очагами инфекции (п=27/54%) Исходно без хронических очагов инфекции (п=23/46%)

ЛЕТ 10(13) 7(23) 0(0)* 0(0)

ПИО 20(26) 15(54) 4(1)* 9(2)

ЛАИ 7(9) 4(15) 0(0) 0(0)

ТИ 34(9) 28(15) 0(0)* 0(0)*

ПОН 10(13) 7(25) 0(0)* 0(0)

Обозначения. *- достоверно по сравнению с группой АКШ (р<0 05)

У исследуемых больных дополнительно осуществляемая трансплантация ККМ достоверно снижала уровень летальности, частоту послеоперационных осложнений, тяжесть инфекции и частоту развития полиорганной недостаточности

ВЫВОДЫ

1 Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга является эффективным вспомогательным методом восстановления сократительной функции миокарда и улучшения качества жизни больных с хронической сердечной недостаточностью, но только при использовании клеток костного мозга с высокой иммунобиорегуляторной активностью Фактором, препятствующим реализации терапевтического эффекта ККМ у больных служит сниженный уровень иммунобиорегуляторной активности аутологичных ККМ, который обусловлен дизрегуляцией иммунной системы у этих больных

2 У больных с хронической сердечной недостаточностью часто развивается вариабельный иммунодефицит с выраженными нарушениями в крови Т-клеточного звена иммунной системы (снижение СБ25, повышение СБ95), степень проявления которых коррелирует со снижением колониеобра-зующей активности клеток костного мозга

3 Для восстановления колониеобразующей и биорегуляторной активности ККМ еще до стадии их применения должна проводится диагностика функциональных резервов иммунной системы и коррекция вторичного иммунодефицита у больных ХСН.

4 Для индивидуальной оценки функциональных резервов иммунной системы больных ХСН разработан тест - индекс стимуляции, вычисление которого основано на измерении продукции АФК нативными Ж крови больных без и при добавлении к ним ингибитора цАМФ-фосфодиэстеразы.

5 Численные значения индекса стимуляции служат количественной мерой неспецифической устойчивости организма больного к стрессорному воздействию. ИС > 1 прогнозирует адекватную адаптационную реакцию организма, ИС < 1 - снижение адаптационных резервов и опасность развития осложнений в послеоперационном периоде

6 Для повышения функциональной активности клеток костного мозга и клеток иммунной системы периферической крови, а также для обеспече-

ния клинической эффективности клеточной трансплантации у больных с хронической сердечной недостаточностью необходимо предварительно в организме больного проводить иммунокорригирующую терапию медикаментозными препаратами, выбор которых осуществляется на основании разработанного метода индивидуального подбора иммуномодуляторов

7. Культивирование ККМ в обогащенных питательных средах in vitro, также способствует восстановлению их функциональной активности, однако, процедура культивирования является лишь вспомогательным способом повышения функциональной активности ККМ до трансплантации.

8 Проведение двух этапного восстановления иммунобиорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией путем сочетанного применения контролируемой медикаментозной иммунокоррекции in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при культивировании позволяет оптимизировать иммунобиорегуляторную подготовку клеточного материала к трансплантации, а также добиться достоверного улучшения насосной функции сердца и качества жизни у больных ХСН, предварительная иммунокоррекция не может заменить эффект трансплантации МНК в миокард у больных ХСН.

9. Трансплантация клеток костного мозга у больных с терминальной стадией сердечной недостаточности, ожидающих пересадку сердца, в течение 2-3 месяцев улучшает качество жизни Клеточная терапия для данной категории больных служит «биологическим мостом» к трансплантации сердца и должна повторяться каждые 2-3 месяца, что позволяет больному дождаться трансплантации донорского сердца

10. Интрамиокардиальная трансплантация мононуклеарной фракция клеток аутологичного костного мозга во время операции АКШ достоверно снижает частоту развития инфекционно-септических осложнений и связанную с этим летальность, а также препятствует развитию полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Для улучшения показателей насосной функции сердца и качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью показано интрако-ронарное и/или интрамиокардиальное введение аутологичных клеток костного мозга с высокой биорегуляторной активностью

2 Для контроля уровня биорегуляторной активности аутологичного ККМ и прогнозирования клинической эффективности их трансплантации у больных ХСН необходимо наряду с определением иммунного статуса оценивать резервы функциональной активности клеток иммунной системы, используя предложенный нами показатель - индекс стимуляции (ИС)

3.Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют прогнозировать сниженную биорегуляторную активность ККМ и отсутствие или слабо выраженный терапевтический эффект от трансплантации таких клеток у больных ХСН

4 Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют также прогнозировать высокий риск развития послеоперационных инфекционных осложнений При ИС<0,6 и необходимости выполнения хирургической операции возникает опасность развития тяжелых иммунозависимых осложнений в п/операционном периоде в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до полиорганной недостаточности

5 При снижении значения ИС для обеспечения выраженного терапевтического эффекта трансплантации аутологичного ККМ необходимо заблаговременно проводить иммунокорригирующую терапию индивидуально подобранными препаратами

6 Для индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов необходимо использовать метод, основанный на хемилюминесцентной реакции лейкоцитов крови больных

7 Для оптимизации иммунобиорегуляторной активности аутологичных ККМ и обеспечения выраженного позитивного результата после их трансплантации следует применять 2-х этапную подготовку ККМ - контролируемую иммунокоррекцию индивидуально подобранными препаратами т

vivo и проводить последующее культивирование ККМ в питательных средах в течение 5-7 суток ш vitro. Иммунокоррекция не может заменить трансплантацию культивированных МНК КМ

8 Для улучшения качества жизни и снижения темпа прогрессирования сердечной недостаточности у больных с дилатационной и ишемической кар-диомиопатией, в том числе у пациентов, включенных в "лист ожидания" на трансплантацию сердца, показано интракоронарное и/или интрамио-кардиальное введение специально подготовленных аутологичных клеток костного мозга У таких больных, однако, улучшение клинического состояния после терапии аутологичными ККМ ограничивается 2-3 месяцами и требует повторных введений культивированных клеток

9 Для снижения частоты возникновения инфекционных иммунозависимых осложнений после операции аортокоронарного шунтирования следует проводить интраоперационное введение аутологичных клеток костного мозга

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Темнов А. А., Хубутия МIII, Сускова В С и др //Использование хемилюми-

несценции для подбора иммунокорректоров у кардиологических больных со вторичными иммунодефицитами перед операцией // Сборник тезисов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство»// Москва, 2002, стр 448-449

2 Подвальнюк В В , Хубутия М Ш, Сускова В С, Темнов А.А. и др

//Иммунный статус как интегральный показатель адаптационных резервов организма у кардиологических больных // Сборник тезисов конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» // Москва, 2002, стр 224-226

3 Хубутия М Ш, Подвальнюк В В , Темнов А.А. и др // Комплексный подход к

оценке адаптационных резервов организма у кардиохирургаческих больных в дооперационном периоде // Ж «Вестник трансплантологии и искусственных органов», 2002, №3, стр 34

4 Хубутия М Ш, Сускова В С., Подвальнюк В В, Темнов А.А. и др

//Применение имунофана, полиоксидония и спленопида у кардиохирургаческих больных при подготовке к операции // Сборник тезисов X Российского национального конгресса «Человек и лекарство» //Москва, 2003, стр 555

5 Хубутия М Ш, Сускова В С, Подвальнюк В В, Темнов А.А.

//Хемшпоминесцентный анализ клеток крови для прогноза развития послеоперационных осложнений у кардиологических больных И IX Всероссийский съезд сердечно-сосудистых хирургов Тезисы докладов // Москва, 2003, том 4, №11, стр. 278

6 Хубутия М Ш, Сускова В С, Подвальнюк В В , Темнов А.А., Емец В И,

Ермакова Л П Индивидуальный подбор иммунокорректоров у кардиохирургаческих больных для профилактики инфекционных осложнений в послеоперационном периоде // Ж «Медицинская иммунология» // 2003, том 5, №3-4, стр 409-410

7 Онищенко Н А, Крашенинников М Е, Расулов М Ф., Темнов А.А , Потапов

И.В , Берсенев А В., Зайденов В А и др. // Применение стволовых и прогени-торных клеток костного мозга для регуляции восстановительных процессов в поврежденных органах. // Сборник тезисов 2-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина», Москва 22-24 апреля 2004, стр 298

8 Артамонов С Д, Темнов А.А, Никольская А О, Тарабарко Н В и др //Влияние трансплантации аутогенных гемопоэтических клеток костного мозга на течение диабетической нефропатии у больных с хронической почечной недостаточностью в терминальной стадии ХПН // Сборник тезисов Третий российский конгресс по патофизиологии. Москва, 9-12 ноября, 2004, стр 219

9. Сускова B.C., Оншценко Н.А, Емец В И, Темнов А.А. и др. // Иммунофено-типическая и цитокиновая характеристика клеточных трансплантатов аутоло-

гичного костного мозга у кардиохирургических больных // Сборник тезисов Третий российский конгресс по патофизиологии Москва, 9-12 ноября, 2004, стр238

10 Сускова В.С, Онищенко Н А, Емец В.И, Ермакова В.И., Сусков С И, Теинов А.А, Казаков Э Н, Гуреев С.В // Анализ иммунофенотипических и ци-токиновых параметров клеточных трансплантатов аутологичного костного мозга у кардиохирургических больных // Ж. «Медицинская иммунология», 2004, N3, т 5 (6) стр.439

11 Шумаков В.И, Казаков Э Н, Гуреев С В., Онищенко Н А., Остроумов Е Н, Темное A.A., Тюняева И.Ю., Крашенинников М Е .Васильев К Н, Сухачев А А, Хубутия МШ., Ильинский И.М. //Аортокоронарное шунтирование и трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга в лечении ишемической сердечной недостаточности // Сборник тезисов общероссийский съезд • У ежегодная конференция общества специалистов по сердечной недостаточности «Сердечная недостаточность 2004», Москва 7-9 декабря 2004 г стр 43

12 Шумаков В И, Казаков Э Н, Гуреев С В, Онищенко Н А., Темное A.A., Тюняева И.Ю, Васильев К Н., Остроумов Е Н., Сухачев A.A., Арзуманов В С, Хубутия А Ш., Ильинский И М., Миронков А.Б //Комплексная оценка результатов трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиохирургических больных с сердечной недостаточностью // Ж. «Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН», Том 5 №11, ноябрь 2004г. стр. 328

П.Остроумов Е Н, Крашенинников М.Е, Гуреев С В , Темнов A.A., Сухачев А А, Ермоленко А Е, Онищенко Н А. // Визуализация распределения в миокарде аутологичных стволовых клеток костного мозга при их интракоронар-ном и интрамиокардиальном введении // Ж «Вестник трансплантология и искусственных органов» -2004 -№1 -С 26-29

И.Шумаков В И, Казаков Э Н, Гуреев С.В., Онищенко Н.А, Темнов A.A. и др Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для восстановления функции поврежденного миокарда// 1-я международная конференция "Альтернативные методы реваскуляризации миокарда" Москва, Научный центр ССХ им. А Н.Бакулева, 5 апреля 2004.

15 Шумаков В И., Онищенко Н.А, Темнов A.A., Казаков ЭН., Гуреев СВ, Шевченко О П, Сускова ВС., Сухачев А А, Хубутия М.Ш, Крашенинников М Е, Тюняева И.Ю , Васильев К Н, Остроумов Е Н // Связь функциональной активности стволовых клеток костного мозга с ремоделированием левого желудочка при их трансплантации кардиохирургическим больным// Ж «Бюллетень НЦССХ им А Н Бакулева РАМН», Том 5 №11, ноябрь 2004г. стр 328

16 Сускова В. С , Оншценко Н.А, Шальнев Б И, Емец В И., Ермакова JI П., Сусков С.М, Темнов A.A., Гуреев С В //Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга у кардиологических больных: иммунофено-

типическая и цитокиновая характеристика аутотрансплантатов // Ж «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №3,2005 стр 42

17 0нищенко НА, Поздняков ОМ, Темнов А.А., Остроумов ЕН, Сускова В С , Гуреев С В , Казаков Э Н. // Транспозиция стволовых и прогениторных клеток аутологичного костного мозга как способ коррекции патогенетических нарушений при острой и хронической сердечной недостаточностью // Ж «Бюллетень НЦССХ им А Н Бакулева РАМН», Том 6 №5, ноябрь 2005г стр 295.

18 Шумаков ВИ, Гуреев С.В, Казаков Э.Н Онищенко НА, Сухачев А А, Васильев К Н, Темнов АЛ., Остроумов Е.Н //Трансплантация аутологич-ных стволовых клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности // Ж «Бюллетень НЦССХ им А Н Бакулева РАМН», Том 6 №5, ноябрь 2005г. стр 296.

19 Шумаков В И, Казаков Э Н., Гуреев С.В , Онищенко Н А, Остроумов Е Н, Темнов А.А, Шевченко О П, Васильев К.Н, Сухачев А А , Хубутия М Ш Трансплантация аутологических клеток костного мозга как биологический мост к трансплантации сердца \\ Ж «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №3,2005, стр 10

20 Шумаков В И., С В Гуреев, Онищенко Н.А., Темнов А.А, Васильев К Н, Сухачев А А //Факторы, влияющие на эффективность трансплантации ауто-логичных стволовых клеток костного мозга больным хронической сердечной недостаточности // Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» 24-25 мая 2006г. Стр 81-82

21 Темнов А. А., Никольская АО, Габриелян НИ, Савостьянова О А, С В.Гуреев, Онищенко Н А, Васильев К.Н, Сухачев А А // Использование аутологичных клеток костного мозга для профилактики и лечения иммуноза-висимых осложнений у кардиохирургических больных // Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» 24-25 мая 2006г Стр 83-84

22 Шумаков В И., Темнов А.А, Никольская А.О, Габриелян Н И, Савостьянова О А, С В Гуреев, Онищенко Н.А //Трансплантация аутологичных клеток костного мозга снижает частоту осложнений у больных после операции аорто-коронарного шунтирования. // Ж. «Бюллетень НЦССХ им АН Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр 48

23 Темнов А.А., Никольская А.О.,Артамонов С.Д, Новиков В К, Башкина Л В , Онищенко НА// Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга восстанавливает взаимосвязь иммунного статуса, соматического состояния и качества жизни больных с хроническими заболеваниями внутренних органов // Ж «Бюллетень НЦССХ им.А Н Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр 167

24Шумаков В.И, Темнов А.А., С.ВГуреев, Оншценко Н.А, Васильев КН, Сухачев А А // Состояние иммунного гомеостаза, как фактор ремоделирова-ния левого желудочка у больных с хронической сердечной недостаточностью при проведении клеточной терапии. // Ж «Бюллетень НЦССХ им А.Н Бакулева РАМН», Том 7, №3 Май-Июнь Москва, 14-16 мая 2006, стр.177

25 Антониев В.Ф, Матела И И, Темнов А.А., Нажмудинов ИИ// Повышение эффективности иммунокоррекции методом индивидуального подбора иммунологических препаратов у больных папилломой гортани //Материалы XVII съезда оторинолагингологов России, г. Нижний Новгород 7-9 июня 2006 г. с 365.

26 Шумаков В И, Оншценко Н А., Гуреев С.В., Темнов А.А., Остроумов Е Н, Васильев К Н., Сухачев А.А, Никольская А.0, Шумаков Д В // Клеточная трансплантация // Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №4,2006, стр. 94-102.

27 Шумаков В.И, Оншценко Н А., Гуреев С В., Темнов А.А. Глава «Клеточная трансплантология» в «Руководство по трансплантологии» под редакцией В И Шумакова 2006, стр.431-457

28 Никольская А О, Артамонов С Д., Темнов А.А., Шахов Н Л, Новиков В.К, Башкина Д В //Взаимосвязь соматического состояния и качества жизни больных сахарным диабетом 1-го типа при трансплантации мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга // Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», 2006, №1, с. 51-52

29 Шумаков В И, Остроумов Е.Н., Губенок Т.В., Темнов А.А., Гуреев С.В, Оншценко Н.А., Сускова В С, Аврамова Н Н., Казаков Э Н // Результаты ин-тракоронарного введения аутологичных клеток костного мозга при диастоли-ческой сердечной недостаточности // Ж «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №5(37), 2007, стр 3-10.

30 Матела И И., Антониев Т.В, Темнов А.А., Темнова В В // Индивидуальный подбор иммунокорректоров у больных папилломатозом гортани методом хе-милюминисценции И «Российский медицинский журнал», 2,2007, стр 36-39

31 VI Shumakov, S V. Gureev, А.А. Temnov, NA. Onishenko, // BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS ACTIVATED CONSECUTIVELY IN VIVO AND EX VIVO IMPROVE MYOCARDIAL FUNCTION IN ISCHEMIC HEART FAILURE H 13th World congress on Heart Disease , international academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, B.C, Canada, July 28-31, 2007 Institute of Transplantology and Artificial Organs, Moscow, Russia

32 Темнов A.A., Никольская A.O., Башкина Л В , Гуреев С.В., Онищенко Н А, Сухачев А А, Васильев К Н. // Предварительная иммунокоррекция и культивирование клеток костного мозга повышают функциональную активность и изменяют фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного мозга у больных с хронической патологией // Ежегодная Всероссийская и

международная научная конференция «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении»; Москва 30-31мая 2007 стр 109-110

33 Темнов А.А., Гуреев С В., Онищенко Н А, Шумаков В.И.// Контролируемая иммунокоррекция больного и последующая активирование мононуклеранных клеток костного мозга, улучшает функцию миокарда при хронической ише-мической сердечной недостаточности // Ж «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия » т 2, №1,2007, стр 65-73

34 Темнов А.А., Габриэлян Н И, Никольская А О, Савостьянова О А, Сускова B.C., Онищенко Н А., Гуреев С В., Васильев К Н., Сухачев А А., Сибякина А А. //Транспозиция культивированных клеток аутологичного костного мозга способствует профилактике и лечению иммунозависимых осложнений у кар-диохирургических больных // Ж. «Патологическая физиология и экспериментальная терапия», №2,2007, стр 7-9

35 Темнов А.А., Онищенко Н.А // Контроль продукции активных форм кислорода лейкоцитами позволяет прогнозировать устойчивость организма к стрес-сорному повреждению // Ж «Патологическая физиология и экспериментальная терапия», №2 2007 стр 9-11

36 Темнов А.А., С В Гуреев, Н А Онищенко, В.И Шумаков // Улучшение ремо-делирования и функции миокарда при хирургическом лечение хронической сердечной недостаточности путем двухэтапного повышения иммунорегуля-торных резервов клеток аутологичного костного мозга и их интрамиокарди-ального применения // Ж «Вестник РАМН», 2008, №1, стр.3-9

37 Темнов А.А. Значение взаимосвязи функционального состояния клеток костного мозга и показателей клеточного звена иммунитета у больных с хронической сердечной недостаточностью при проведении терапии аутологич-ными клетками костного мозга // Ж «Вестник трансплантологии и искусственных органов», №1(39), 2008, стр 37-39

Патенты:

1 «Способ лечения хронических заболеваний (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты), биотрансплантат (варианты)» Per номер №2006103865 Положительное решение от 03 08.2007

2 «Способ профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардио-хирургических больных в послеоперационном периоде». Per номер № 2006136463 Положительное решение от 03 12.2007

3 «Способ лечения больных с хронической сердечной недостаточностью» Per номер № 2006136466 Положительное решение от 28 09 2007

4 «Способ прогнозирования устойчивости организма к стрессорному воздействию» Per номер № 2006139185 Положительное решение от 29 08 2007

5.«Способ индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов у больных папилломатозом гортани» Per номер № 2006114325 Положительное решение от 7 05 2007

Заказ №571. Объем 2 п л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул Палиха-2а, тел. 250-92-06 тууу.рсЫа!^ ги

Современная статистика заболеваемости населения показывает, что хроническая сердечная недостаточность (ХСН), возникающая чаще всего в результате острого инфаркта миокарда, остается одной из главных проблем здравоохранения всех экономически развитых стран мира, причем в XXI столетии прогнозируется дальнейший рост численности таких больных (Hunt et al. 2005).

По данным американской ассоциации кардиологов в 2005 г. в США насчитывалось около 5 млн. человек с ХСН, тогда как по прогнозам к 2050г количество таких больных возрастет до 16 млн. человек (Robbins, 1998). В России исследование «Эпоха» показало, что клинические признаки ХСН имеют более 8,2 млн. человек (Беленков Ю.Н. и др 2003).

В настоящее время для профилактики и лечения сердечной недостаточности используются 3 группы методов (Kirklin, Young , 2002), которые обеспечивают:

1- профилактику тромбозов и торможение развития атеросклероза путем применения диеты, медикаментозной терапии и пропаганды здорового образа жизни;

2- ограничение зоны повреждения и сохранения функциональной активности работоспособной зоны миокарда путем медикаментозной терапии (ан-тиаггреганты, [З-блокаторы, ингибиторы ангиотензин превращающего фермента (АПФ)) и оперативного лечения (баллонная коронарная ангиопластика, операция аортокоронарного шунтирования);

3- замену несостоятельности сократительной функции сердца путем трансплантации сердца или имплантации искусственных аналогов левого желудочка.

Однако перечисленные методы не могут в полной мере снизить рост заболеваемости и обеспечить адекватную социальную адаптацию этих больных.

В связи с этим в последние годы получило развитие новое направление регенерационной терапии, направленное на стимуляцию регенерации миокарда путем возмещения дефицита функционально-активной ткани и/или стимуляции ее компенсаторной гипертрофии, а также стимуляции ангиогенеза с помощью современных клеточных технологий.

Трансплантация в миокард мышечных клеток — фетальных кардио-миоцитов (Sakai et al. 1999; Ю.Л. Шевченко 1999), скелетных миобластов (Atkins et al. 1999; Taylor et al. 1998; Reinecke et al. 2000), а также гладко-мышечных клеток (Yoo et al. 2000, Li et al. 1996) не подтвердила заместительного механизма регенерационного действия этих клеток, но позволила выдвинуть концепцию биорегуляторного воздействия пептидов, продуцируемых трансплантированными клетками.

Именно поэтому предметом пристального изучения стали возможности восстановительной регенерации миокарда с помощью доступных и легитимных аутологичных стволовых и прогениторных клеток костного мозга (ЬСКМ).

В настоящее время эти клетки, преимущественно клетки гемопоэти-ческой фракции ККМ, используются для лечения острой (Straer et al. 20012003; Schachinger et al. 2004; Assmus et al. 2003) и хронической (Perin et al. 2004; Patel et al. 2004; Lian Ru 2006) сердечной недостаточности.

Улучшение насосной функции сердца после терапии аутологичными мононуклеарными ККМ авторы связывают преимущественно с обновленной продукцией в организме больных проангиогенных и антиапоптиче-ских цитокинов (Kinnaird et al., 2004; Dimmeler et al., 2004; Kocher et al., 2001), с регуляцией воспаления и иммунной модуляцией (Dewald et al., 2005; Thum et al., 2005), с улучшением внутриклеточной регенерации кар-диомиоцитов и повышением их устойчивости к апоптозу (Minatoguchi et al., 2004; Trial et al., 2004; Chazaud et al., 2003), а также с их влиянием на пролиферацию кардиомиобластов (Anversa, 2004).

Между тем, наряду с позитивной оценкой применения ККМ у больных с ХСН в последние годы появились исследования, которые отрицают возможность улучшения сократительной функции левого желудочка у таких больных при использовании аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга.

Отсутствие позитивного эффекта от применения аутологичных ККМ авторы этих исследований связывают с изменением состава и свойств стволовых и прогениторных ККМ больных под влиянием различных тяжелых сопутствующих заболеваний (Rota et al., 2006; Award et al., 2006; Rauscher et al., 2003; Karra et al., 2005; Messina, 2006; Lehrke et al., 2006; Gina et al., 2006; Sata, 2006; Epstein et al., 2004).

Создается впечатление, что в практике лечения ХСН разные исследователи применяют ККМ с разными и даже противоположными свойствами.

Для выяснения причин отсутствия у отдельных категорий больных позитивного эффекта от введения мононуклеарных (МНК) ККМ, мы предположили, что при ХСН как хроническом заболевании (Гольдберг Е.Д. и др. 2006) на фоне системного воспаления (Шевченко О.П. и др. 2005), и сопутствующего вторичного иммунодефицита различной степени выраженности (Ермакова Л.П., 2001), а также хронической гипоксии у больных формируется функциональная недостаточность самих гемопо-этических и иммунорегуляторных клеток КМ, которую необходимо диагностировать и корригировать до использования клеток КМ (мононуклеар-ной фракции клеток) в качестве терапевтического средства. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать методы диагностики и коррекции функциональной активности клеток костного мозга для обеспечения стабильного позитивного эффекта клеточной трансплантации на сократительную функцию сердца и качество жизни больных с хронической сердечной недостаточностью.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить возможность применения мононуклеарных клеток (МНК) ау-тологичного костного мозга в качестве эффективного вспомогательного метода коррекции сократительной функции миокарда и повышения качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью; выявить факторы, препятствующие реализации этих эффектов.

2. Выявить нарушения функционального состояния МНК костного мозга и установить их взаимосвязь с дисфункцией клеток иммунной системы периферической крови, развивающейся у больных ХСН.

3. Разработать метод индивидуальной оценки резервов функциональной устойчивости клеток иммунной системы периферической крови больных ХСН и предложить тест для прогнозирования клинической эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга.

4. Разработать и применить метод индивидуального подбора иммунномо-дуляторов для восстановления функциональной активности иммунной системы больных ХСН (клеток костного мозга и периферической крови), обеспечивающей реализацию позитивного клинического эффекта трансплантации ККМ.

5. Показать возможность оптимизации клинического эффекта трансплантации аутологичных ККМ у больных ХСН путем 2-х этапного восстановления иммунобиорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией: за счет осуществления медикаментозной коррекции иммунного статуса больных in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при их культивировании.

6. Установить клиническую эффективность трансплантации аутологичных клеток костного мозга у больных с терминальной стадией хронической сердечной недостаточности. и

7. Изучить влияние интраоперационной интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга на частоту и тяжесть развития послеоперационных иммунозависимых осложнений. НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Научное исследование было проведено в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02»сентября 2005г «Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы», а также выполнено по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0 800279).

Впервые показано, что у больных с ХСН, нуждающихся в хирургической коррекции сократительной функции миокарда, состояние иммунной системы характеризуется не только вариабельными формами апопто-тического иммунодефицита, но также снижением функциональной активности мононуклеарной фракции клеток костного мозга, что предопределяет отсутствие клинического эффекта от применения клеток костного мозга.

Установлено, что способность мононуклеарных клеток костного мозга к колониеобразованию находится в прямой зависимости от содержания CD25 и в обратной зависимости от содержания CD95 лимфоцитов в периферической крови.

На основании сопоставления интенсивности продукции активных форм кислорода (АФК) нативными лейкоцитами крови без и при добавлении ингибитора цАМФ-фосфодиэстеразы был предложен критерий, так называемый индекс стимуляции (ИС), для прогнозирования адаптационных резервов иммунной системы и оценки пригодности клеток костного мозга для целей клеточной терапии. Установлено, что у здоровых людей численное значение ИС больше 1.0, при выраженной патологии ИС становится меньше 1.0. Было предложено использовать индекс стимуляции для оценки степени тяжести иммунодефицита в организме, а также для подбора иммунокорректоров и контроля эффективности проводимой иммуно-корригирующей терапии. Новизна указанных разработок подтверждена положительными решениями о выдаче 5 патентов (положительные решения от 7.05.2007, 29.08.2007, 28.09.2007, 03.08.2007, 03.12.2007).

Установлено, что при значении ИС<0.6 и необходимости выполнения хирургической операции у больных возникает опасность возникновения тяжелых иммунозависимых осложнений в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до развития полиорганной недостаточности.

Показано, что наиболее выраженная коррекция сократительной функции миокарда и улучшение качества жизни больных при использовании клеточной терапии достигается путем сочетанного предварительного применения индивидуально подобранной иммунокорригирующей терапии in vivo и культивирования выделенных клеток в питательных средах ех vivo перед введением их в миокард. При сочетанном применении этих процедур создаются оптимальные условия для восстановления биорегуля-торной функции клеток костного мозга и клеток периферической крови, что создает условия для полной реализации регенерационных эффектов иммунной системы, как важнейшей интегративной системы регуляции го-меостаза.

Культивирование клеток костного мозга без предшествующей имму-нокоррекции позволяет повысить их функциональную активность, что сопровождается изменением фенотипического состава клеток и продукцией цитокинов в культуральную среду. Однако регуляторные эффекты таких клеток после трансплантации являются недостаточными особенно у больных с выраженным иммунодефицитом.

Однократный курс иммунокоррекции без последующей трансплантации клеток, также не позволяет добиться выраженной и пролонгированной коррекции функции миокарда у больных ХСН.

Интраоперационное использование аутологичных ККМ как после культивирования, так и после культивирования в сочетании с иммунокор-рекцией оказывает выраженное иммуномодулирующее действие, что проявляется снижением иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде, таких как гнойно-септические осложнения и полиорганная недостаточность даже при наличии инфекционно-септического анамнеза.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Создана медицинская технология лечения больных ХСН с помощью МНК аутологичного костного мозга. Технология предусматривает контроль степени иммунной дизрегуляции в организме больных, предварительное проведение иммунокоррекции индивидуально подобранными препаратами in vivo и последующее культивирование клеток костного мозга ex vivo. Такая технология предварительной подготовки ККМ позволяет повысить сократительные свойства миокарда (увеличение фракции изгнания (ФИ) и снижение конечного диастолического и конечного систолического объемов (КДО и КСО), а также улучшить качество жизни больных ХСН (индекс MLHFQ) и повысить их физическую активность (индекс DASI).

Предложен метод оценки степени иммунной дизрегуляции, основывающийся на определении активности лейкоцитарной суспензии в модельном хемилюминесцентном тесте, отражающем состояние суммарных адаптационных резервов организма у больных с ИБС и ХСН. Этот показатель назван индексом стимуляции, величина его коррелирует с уровнем иммунодефицита и поэтому может использоваться для быстрой диагностики иммунной дизрегуляции. Этот показатель использован также для индивидуального подбора иммунокорректоров и контроля эффективности терапии иммуномодуляторами. Установлено, что при ИС<0.6 у больного прогнозируется выраженный иммунодефицит, сопровождающийся опасностью развития инфекционных осложнений и отсутствием эффекта от клеточной терапии. Именно таким больным должна заблаговременно проводится курсовая иммунокорригирующая терапия.

При проведении у больного полного комплекса подготовки иммунной системы и клеток костного мозга эффективность клеточной терапии достоверно повышается и сохраняется в течение 6 месяцев. Безопасность клеточной терапии позволяет рекомендовать повторные курсы клеточной терапии у больных ХСН для восстановления и поддержания сократительной функции миокарда.

Интраоперационное введение клеток костного мозга снижает летальность кардиохирургических больных и частоту развития иммунозави-симых послеоперационных осложнений, а также способствует гладкому течению госпитального периода.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫДВИГАЕМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Предварительная коррекция иммунной дизрегуляции в организме и последующее культивирование in vitro клеток костного мозга достоверно повышает сократительную функцию миокарда и улучшают качество жизни больных с хронической сердечной недостаточностью при трансплантации аутологичных клеток костного мозга.

2. Интракоронарное введение клеток костного мозга больным в терминальной стадии сердечной недостаточности может служить «биологическим мостом» к трансплантации сердца.

3. Использование индекса стимуляции позволяет оценивать адаптационные резервы организма и может быть использован для индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов.

4. Интрамиокардиальное введение клеток костного мозга во время операции аортокоронарного шунтирования достоверно снижает частоту развития послеоперационных инфекционных осложнений и летальность у больных с хронической сердечной недостаточностью.

РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Основные выводы и рекомендации используются в практической и научной работе: отделения коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии, лаборатории трансплантологии и консервации тканей ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им.акад. С.М.Федорова Росмедтехнологии»; ФГУ «НКЦ оториноларингологии Рос-здрава»; ЛОР- отделения ГКБ № 67.

Апробация работы

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IX, X, XI, XII Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов (Москва 2003, 2004, 2005, 2006 годы соответственно); на конференции «Новые оперативные технологии (анатомические, экспериментальные и клинические аспекты)» (Москва 2002); на VIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 2004; на V Ежегодной конференции «Сердечная недостаточность» (Москва, декабрь 2004); на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004); на П-ой международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, апрель 2004); на IX и X Всероссийском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2002, 2003); Ежегодных Всероссийских и международных научных конференциях «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва май 2006, май 2007); на II и III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, октябрь 2002, ноябрь 2005); на четвертой межд. конф. "Лечение кардиомиопатий", (Москва, 27-28 мая 2005г.); на XIII сессии общего собрания РАМН (Москва, 17-20 Февраля 2004г.); на 1 межд. конф."Альтернативные методы реваскуляризации миокарда", (Москва, 5 апреля 2004г.); на 13th World congress of Heart Disease , International academy of cardiology annual scientific sessions 2007, Vancouver, B.C., Canada, July 28-31, 2007. Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологии 5 февраля 2008г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 37 работ, из них 22 в центральных рецензируемых журналах. 13 работ в материалах всероссийских и 1 в материалах зарубежной конференций. Получены положительные решения по 5 патентам.

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация содержит 7 глав и состоит из введения, обзора литературы (I глава), общей характеристики проведенных лабораторных и клинических исследований (II глава), 4 глав собственных исследований (главы III, IV, V, VI) с одновременным обсуждением полученных результатов, а также развернутого заключения (глава VII), выводов и практических рекомендаций.

выводы

1. Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга является эффективным вспомогательным методом восстановления сократительной функции миокарда и улучшения качества жизни больных с хронической сердечной недостаточностью, но только при использовании клеток костного мозга с высокой им-мунобиорегуляторной активностью. Фактором, препятствующим реализации терапевтического эффекта ККМ у больных служит сниженный уровень иммунобиорегуляторной активности аутологичных ККМ, который обусловлен дизрегуляцией иммунной системы у этих больных.

2. У больных с хронической сердечной недостаточностью часто развивается вариабельный иммунодефицит с выраженными нарушениями в крови Т- клеточного звена иммунной системы (снижение CD25, повышение CD95), степень проявления которых коррелирует со снижением колониеобразующей активности клеток костного мозга.

3. Для восстановления колониеобразующей и биорегуляторной активности ККМ еще до стадии их применения должна проводится диагностика функциональных резервов иммунной системы и коррекция вторичного иммунодефицита у больных ХСН.

4. Для индивидуальной оценки функциональных резервов иммунной системы больных ХСН разработан тест — индекс стимуляции, вычисление которого основано на измерении продукции АФК натив-ными ЛК крови больных без и при добавлении к ним ингибитора цАМФ-фосфодиэстеразы.

5. Численные значения индекса стимуляции служат количественной мерой неспецифической устойчивости организма больного к стрес-сорному воздействию. ИС > 1 прогнозирует адекватную адаптационную реакцию организма; ИС < 1 — снижение адаптационных резервов и опасность развития осложнений в послеоперационном периоде.

6. Для повышения функциональной активности клеток костного мозга и клеток иммунной системы периферической крови, а также для обеспечения клинической эффективности клеточной трансплантации у больных с хронической сердечной недостаточностью необходимо предварительно в организме больного проводить иммунокор-ригирующую терапию медикаментозными препаратами, выбор которых осуществляется на основании разработанного метода индивидуального подбора иммуномодуляторов.

7. Культивирование ККМ в обогащенных питательных средах in vitro, также способствует восстановлению их функциональной активности, однако, процедура культивирования является лишь вспомогательным способом повышения функциональной активности ККМ до трансплантации.

8. Проведение двух этапного восстановления иммунобиорегуляторной активности ККМ перед трансплантацией путем сочетанного применения контролируемой медикаментозной иммунокоррекции in vivo и последующей активации функционального состояния МНК костного мозга in vitro при культивировании позволяет оптимизировать иммунобиорегуляторную подготовку клеточного материала к трансплантации, а также добиться достоверного улучшения насосной функции сердца и качества жизни у больных ХСН; предварительная иммунокоррекция не может заменить эффект трансплантации МНК в миокард у больных ХСН.

9. Трансплантация клеток костного мозга у больных с терминальной стадией сердечной недостаточности, ожидающих пересадку сердца, в течение 2-3 месяцев улучшает качество жизни. Клеточная терапия для данной категории больных служит «биологическим мостом» к трансплантации сердца и должна повторяться каждые 2-3 месяца, что позволяет больному дождаться трансплантации донорского сердца.

10. Интрамиокардиальная трансплантация мононуклеарной фракция клеток аутологичного костного мозга во время операции АКШ достоверно снижает частоту развития инфекционно-септических осложнений и связанную с этим летальность, а также препятствует развитию полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для улучшения показателей насосной функции сердца и качества жизни у больных с хронической сердечной недостаточностью показано интракоронарное и/или интрамиокардиальное введение аутоло-гичных клеток костного мозга с высокой биорегуляторной активностью.

2. Для контроля уровня биорегуляторной активности аутологичного

ККМ и прогнозирования клинической эффективности их трансплантации у больных ХСН необходимо наряду с определением иммунного статуса оценивать резервы функциональной активности клеток иммунной системы, используя предложенный нами показатель - индекс стимуляции (ИС).

3. Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют прогнозировать сниженную биорегуляторную активность ККМ и отсутствие или слабо выраженный терапевтический эффект от трансплантации таких клеток у больных ХСН.

4. Сниженные значения ИС (ИС <1) позволяют также прогнозировать высокий риск развития послеоперационных инфекционных осложнений. При ИС<0,6 и необходимости выполнения хирургической операции возникает опасность развития тяжелых иммунозависимых осложнений в п/операционном периоде в виде инфекционно-септических и органных дисфункций вплоть до полиорганной недостаточности.

5. При снижении значения ИС для обеспечения выраженного терапевтического эффекта трансплантации аутологичного ККМ необходимо заблаговременно проводить иммунокорригирующую терапию индивидуально подобранными препаратами.

6. Для индивидуального подбора иммунокорригирующих препаратов необходимо использовать метод, основанный на хемилюминесцент-ной реакции лейкоцитов крови больных.

7. Для оптимизации иммунобиорегуляторной активности аутологичных

ККМ и обеспечения выраженного позитивного результата после их трансплантации следует применять 2-х этапную подготовку ККМ -контролируемую иммунокоррекцию индивидуально подобранными препаратами in vivo и проводить последующее культивирование ККМ в питательных средах в течение 5-7 суток in vitro. Иммунокор-рекция не может заменить трансплантацию культивированных МНК КМ.

8. Для улучшения качества жизни и снижения темпа прогрессирования сердечной недостаточности у больных с дилатационной и ишемической кардиомиопатией, в том числе у пациентов, включенных в "лист ожидания" на трансплантацию сердца, показано интракоро-нарное и/или интрамиокардиальное введение специально подготовленных аутологичных клеток костного мозга. У таких больных, однако, улучшение клинического состояния после терапии аутологич-ными ККМ ограничивается 2-3 месяцами и требует повторных введений культивированных клеток.

9. Для снижения частоты возникновения инфекционных иммунезависимых осложнений после операции аортокоронарного шунтирования следует проводить интраоперационное введение аутологичных клеток костного мозга.