Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Кардиопротективные эффекты комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот при ишемии миокарда

111111

003052745

На правах рукописи

БРЮШИНИНА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

КАРДИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ КОМПЛЕКСА АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВОЙ И ЯНТАРНОЙ КИСЛОТ ПРИ ИШЕМИИ

МИОКАРДА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2007

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Хазанов Вениамин Абрамович

Плотников Марк Борисович Маслов Леонид Николаевич

Ведущее учреждение: ГУ НИИ фармакологии РАМН, г. Москва.

Защита состоится «_»_2007 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН.

Автореферат разослан 2007 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^

кандидат биологических наук — Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ишемическая (коронарная) болезнь сердца (ИБС), развивающаяся вследствие атеросклероза коронарных артерий, является ведущей причиной инвалидизации и смертности трудоспособного населения во всем мире [Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2000]. Согласно эпидемиологическим данным, в Российской Федерации лидирующее положение по показателям нетрудоспособности населения принадлежит заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Из их числа первые ранговые места занимают ИБС и артериальная гипертензия [Белоусов Д.Ю., Медников О.И., 2003].

В настоящее время накоплено достаточно данных, указывающих на то, что в патогенезе ИБС отчетливо прослеживается деэнергизация из-за формирования тканевой гипоксии [Кондрашова М.Н, Григоренко Е.В., Хазанов В.А. и др., 1987; Лукьянова Л.Д., 1997]. Возникающие при этом нарушения клеточного энергетического метаболизма преимущественно связаны с митохондриальными дисфункциями. [Гацура В.В., 1993; Лукьянчук В.Д., Савченкова Л.В., 1998; Коган А.Х., 1999; Коркина О.В., Хаткевич АН, 2001; Кондрашова М.Н., 2002; Хазанов В.А., 2002, 2003]. Нарушения энергетического обмена приводят к дестабилизации функциональной активности систем жизнеобеспечения организма, запускается каскад патологических реакций, включая генерацию активных форм кислорода, приводящих к повреждению митохондрий и других структур клетки [Владимиров Ю.А., 1991; Гацура В.В., 1993; Скулачев В.П., 1994; Барсель В.А., Щедрина И.С., 1998; Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000; Хазанов В.А., 2003].

Современная схема лечения ИБС включает прием антианпшальных, ангаишемических, гиполипидемических, метаболических и антитр омботических препаратов [Метелица В.И., 1999; Глезер М.Г., Сыркин А.Л., 2000; Фомина И., Георгадзе 3., 2001]. Имеются доказательства того, что применение антитромботических препаратов уменьшает риск развития сердечно-сосудистых осложнений и улучшает прогноз течения заболевания у больных ИБС [Покровская Т.Н., Столярова О.Л., 1982; Gibbons R.J., Abrams J., Chattel ее К., 2003]. В терапии и профилактике тромботических осложнений при ИБС успешно применяют антитромбоксанг ацетилсалициловую кислоту (АСК) [Красильников С.А., 1993; Насонов Е.Л., Лебедева О.В., 1996]. При этом известно, что сами салицилаты в терапевтических дозах оказывают негативное влияние на систему энергопродукции. Помимо создания ксенобиотической нагрузки, они прямо влияют на энергетический обмен, ингибируя различные метаболические пути [Хазанов В.А., 2004; Gutknecht J., 1990]. Вместе с тем пациенты с заболеванием сердечно-сосудистой системы ишемического генеза вынуждены длительно, практически пожизненно, принимать салицилаты, несмотря на опасность развития митохондриальных осложнений.

Эти данные, а так же сведения о развитии нарушений клеточного энергетического метаболизма при ИБС, предполагают возможность использования в качестве фармакологических корректоров ИБС средств, влияющих на выработку энергии в ишемизированном миокарде и предотвращающих энергетический дисбаланс. Это возможно, в частности, при

использовании янтарной кислоты (ЯК), являющейся субстратом энергетического обмена

В последнее время в клинической практике успешно применяются препараты - регуляторы энергетического обмена, созданные на основе не только ЯК, но и других естественных метаболитов митохондрий. Они способны оказывать оптимизирующее и активизирующее, в пределах физиологической нормы, действие на энергетические процессы митохондрий [Хазанов В.А., 1996, 2002, 2003, 2004]. Применение регуляторов энергетического обмена (РЭО) позволяет унифицировать ответную реакцию митохондрий (MX) на фармакологическое воздействие и стабилизировать эффект на уровне всего организма [Хазанов В.А., 1992,2000,2004].

В ранее проведенных исследованиях выявлена способность ЯК, снижать токсичность и повышать эффективность АСК. Таким образом, создание комплексного препарата на основе АСК и ЯК помимо снижения негативных свойств АСК даст возможность влиять на энергетику шпемизированной ткани сердца Вместе с тем, известно, что изменение энергетического статуса организма может повлиять на фармакокииетику лекарственного средства, а тем самым и на фармакологические свойства препарата, а это может привести не только к изменению условий его дозирования, но и основных свойств [Циш А.Ю., 2004; Белоусов Ю.Б., Гуревич К.Г., 2005; Гурто Р.В., 2005; Benet L.Z., Kroetz D.L., Sheiner L.B., 1996; Hans-Georg Eichler, M Muller., 1998; James W. Lohr, Gail IL, Willsky A., 1998; Hutzier J.M., Tracy S.T., 2001;]. Однако в литературе отсутствуют данные о влиянии Ж на фармакокииетику АСК. Приведенные сведения указывают на актуальность разработки комбинированного препарата на основе АСК и ЯК для профилактики и лечения ИБС.

Цель работы. Изучить противоишемические свойства, острую токсичность и фармакокинетику комбинированного препарата янтарной и ацетилсалициловой кислот.

Задачи исследования.

1. Разработать методику хроматографического определения янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. Оценить фармакокинетику янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови кроликов и влияние янтарной кислоты на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты

3. Исследовать острую токсичность комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот.

4. Оценить влияние янтарной и ацетилсалициловой кислот на энергетический обмен митохондрий сердца интакгаых крыс.

5. Изучить противоишемическое действие комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот по электрокардиографическим показателям и энергетическому обмену миокарда крыс.

Научная новизна.

■ Впервые исследовано влияние янтарной кислоты на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты. Установлено, что янтарная кислота в терапевтических дозах не влияет на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты.

■ Получены новые данные относительно влияния ацетилсалициловой кислоты на энергетический обмен, в частности на функциональное состояние МХ миокарда

■ Установлено противоишемическое действие смеси ацетилсалициловой и янтарной кислот, проявляющееся в нормализации электрической активности миокарда и энергетического обмена.

Практическая значимость.

1. Разработан хроматографический метод определения янтарной кислоты и комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. Обоснована целесообразность применения комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот в качестве средства комплексной терапии при ишемии миокарда.

3. Установлено, что янтарная кислота снижает негативное влияние ацетилсалициловой кислоты на энергетический метаболизм.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговой научной конференции ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на IV Российском симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2005), на V Российском симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2006).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях и материалах конференций, из них одна в журнале, рекомендованном перечнем ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 22 таблицами. Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 80 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 84 белых беспородных крысах обоего пола массой 250300 г, 48 мышах-самцах массой 20-30 г и 10 кроликах-самцах массой 2,5-3 кг. Животные получены из питомника научно-исследовательской лаборатории экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). До эксперимента животных содержали в стандартных условиях в пластиковых клетках по 15-20 мышей и по 10 крыс, а также в специально оборудованных клетках по 1 кролику, при (22±2) °С и 12-часовом цикле день/ночь, при свободном доступе к воде и без ограничения в

приеме пищи. Животных умерщвляли декашггацией в отдельном помещении, избегая стрессирования остальных животных Все эксперименты проводили в осенне-зимний период, когда наблюдаются умеренные скорости дыхания MX, а их функциональное состояние характеризуется стабильностью [Хазанов В.А., 1993].

При оценке острой токсичности исследуемые препараты (АСК, Ж и смесь АСК и Ж) вводили мышам и крысам однократно, внутрижелудочно в увеличивающихся дозах в ввде суспензии на 1% слизи картофельного крахмала Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней.

Для оценки функционального состояния системы энергопродукции митохондрий сердца крыс, животные получали препараты АСК в дозе 250 и 125 мг/кг и ЯК в дозе 50 мг/кг (отдельно и совместно), однократно внутрижелудочно в виде взвеси в 1% крахмальной слизи в течение 7 дней, последнее введение за сутки до эксперимента. Оценку функционального состояния системы энергопродукции митохондрий сердца крыс проводили после курсового введения препаратов, интактаым животным, а так же на фоне моделирования острой ишемии миокарда.

Эксперимента по определению концентрации АСК и Ж в плазме крови выполнены на десяти белых беспородных кроликах-самцах. Препараты для исследования фармакокинетики вводили однократно внутрижелудочно в виде взвеси в ]% крахмальной слизи: АСК в дозе 125 мг/кг, смесь АСК и Ж в дозе 125 мг/кг и 50 мг/кг соответственно. С целью определения Ж в плазме кроликов, последнюю вводили в дозе 500 мг/кг. Выбранная доза АСК соответствует максимальной разовой терапевтической дозе для человека.

У животных наркотизированных лиофилизированным тиопенгалом натрия (170 мг/кг внутрибрюпшнно) моделировали острую ишемию миокарда путем 15-минутной окклюзии левой коронарной артерии на уровне между основанием conus pulmonalis и нижним краем auricula sinistra. В течение периода ишемии и 3-х мин реперфузии регистрировали ЭКГ во П стандартном отведении [Руководство по экспер. доклин. изучению, 2000; Соленкова Н.В., Маслов JI.H., Буданкова Е.В., 2005]. Активность АСК и смесь АСК и Ж оценивали по влиянию на частоту возникновения нарушений ритма сердца и их тяжесть. Оценивали форму и амплитуду зубцов Р, R, Т (в мВ), а так же интервалы PQ, QRS, QT (в секундах).

Для оценки состояния системы энергопродукции митохондрий (MX) сердца использовали методики, разработанные под руководством проф. Кондрашовой М.Н. (в ГУ НИИ теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино) и в лаборатории молекулярной фармакологии с группой фармакокинетики под руководством проф. Хазанова В.А. (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН, Томск).

Животных наркотизировали эфиром и умерщвляли декашггацией. Затем вскрывали брюшную полость и грудную клетку и с помощью охлажденных инструментов (пинцет, ножницы, шпатель) освобождали сердце от перикарда. Средой выделения перфузировали сердце in situ, добиваясь максимального, полного освобождения органа от крови. Среда выделения содержала: з-ю-1 М

сахарозы (Sigma, США), 2-Ю"2 M трис-буфера (Serva, Швейцария), НО'2 M ЭДТА (Sigma, США), 1,2-Ю"1 M KCI (ОСЧ), 1 мг/мл бычий сывороточный альбумин (Sigma, США), температура среды - О °С, рН - 7,2. Сердце охлаждали при О °С в течение 5 мин в небольшом количестве среды выделения с целью приостановки метаболических процессов. После этого навеску сердца (около 1,0 г) измельчали в керамической ступке и помещали в стаканчик гомогенизатора с тефлоновым пестиком. Гомогенизирование ткани сердца осуществляли в среде выделения, добавленной в отношении 1:2 (тканысреда) в течение 1 мин при 1000 об/мин, совершая медленные продольные тракции пестика. Полученный гомогенат использовали в работе не более 30-40 мин в связи с ограничением времени его интактности [Кондралюва М.Н., 1991; Хазанов В.А., 1993].

Функциональное состояние системы энергопродукции митохондрий сердца оценивали полярографическим методом (полярограф LP-9, Чехия) с помощью закрытого электрода Кларка лабораторного изготовления [Кондрашова М.Н., Ананенко А.А., 1973] по поглощению кислорода в различных метаболических состояниях по Б. Чансу [Chance В., Williams G.R., 1956]. Исследование проводили в термостатируемой установке (t=26 °С) оригинальной конструкции с объемом измерительной ячейки 1,3 мл.

Среда инкубации содержала: 1,2-Ю'1 M КС1 (ОСЧ), 1-Ю"2 M Нерез-буфер (Sigma, США), 1-Ю'3 M ЭДТА (Sigma, США), 5-Ю'3 КН2Р04 (ОСЧ), 3-Ю'1 M сахароза (Sigma, США), рН - 7,2. Субстратами окисления служили ФАД-зависимый сукцинат 5-10'3 M и НАД-зависимые субстраты малат (М) и глутамах (Г) по З-Ю"3 М. С целью выявления вклада в энергопродукцию митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов эндогенной янтарной кислоты (ЭЯК) применяли конкурентный ингибитор СДГ малонат (МЛН) (2-10"3 М) и ингибитор аминотрансфераз аминооксиацетат (АОА) (5-10"4 М), все субстраты производства Sigma, США. Во всех случаях указаны конечные концентрации в полярографической ячейке.

Рассчитывали скорости потребления кислорода MX до (V4n), во время (Уз) и после (V40) цикла фосфорилирования МО M экзогенной АДФ, и время фосфорилирования АДФ (Тг). Для оценки энергетического статуса рассчитывали коэффициент стимуляции дыхания (СД=Уз/У4п), дыхательного контроля (ДК=Уз/У4о) и сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О)

Измерение концентрации салициловой кислоты в крови кроликов проводили по разработанной в лаборатории молекулярной фармакологии ГУ НИИ фармакологии ВЭЖХ методике. В крови кроликов определяли концентрацию метаболита АСК - салициловую кислоту, так как АСК под действием эстераз быстро гидролизуется (10-15 мин). Определяли концентрацию салициловой кислоты в крови животных получавших АСК, а так же в крови животных, получавших однократно смесь АСК и Ж. Кровь брали из ушной вены в количестве 500 мкл в пластиковые гепаринизированные пробирки до приема препарата и через 0,5, 1, 4, 7, 8, 9 ч. после его введения. В пробирки добавляли 0,5 мл 5% раствора NaCl, затем добавляли 2 мл диэтилового эфира, экстрагировали 10 мин. Пробы центрифугировали 10 мин при 3000 g. Органический слой количественно переносили в стеклянные пробирки для

выпаривания, и упаривали досуха под током азота при температуре 45 °С. К сухому остатку добавляли 100 мкл подвижной фазы и встряхивали на шейкере в течение 10 мин Аликвоту (50 мкл) использовали для хроматографии. Анализ проводили с ¡применением ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02»

Характеристики анализа: хроматограф «Милихром А-02» (фотометрический детектор), колонка 2x75 мм, сорбент ProntoSBL 120—5—С18 AQ, скорость потока 100 мкл/мин, длины волн детекции - 210,220,230,240, 250,260 нм. Элюент А -0,2 M LiClOr-0,005 M НСЮ4-Н2О, рН - 2,18; элюент В - ацетонитрил. Режим элюирования изо!фатический: В-30%-0-1200 мкл, t=40 °С, давление 3 МПа. Многоволновая детекция позволяет уверено идентифицировать исследуемое соединение, даже в случае плохо разделяемых пиков [Вагат G.I., Grachev М.А., 1983].

Хроматографическая характеристика приведенной методики количественного определения салициловой кислоты в плазме крови представлена в табл. 1.

Достоверность результатов количественного определения салициловой кислоты в плазме крови оценивали, рассчитывая метрологические характеристики данной методики по результатам параллельных измерений концентрации в образце модельной смеси плазмы крови.

Таблица 1.

Хроматографическая характеристика метода анализа

Параметр Значение

Время удерживания, мин 8,5-8,9

Асимметрия пика 1,22

Разрешение 3,82

Коэффициент емкости 3,54

Чувствительность метода, мкг/мл 1

С помощью разработанной в лаборатории молекулярной фармакологии ВЭЖХ методики в крови кроликов определяли концентрацию Ж. Кровь брали из ушной вены в количестве 500 мкл в пластиковые гепаринизированные пробирки до приема препарата и через 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50 мин, 1 ч, 1 ч 30 мин, 2 ч, 2 ч 30 мин после его введения. Количественное определение Ж проводили методом ВЭЖХ с предварительной дериватизацией Ж бромфенацилбромидом. В пластиковую пробирку отбирали 0,4 мл плазмы, добавляли 20 мкл Н3РО4 конц. после чего доводили pH до 5,5 раствором 5 молярного КОН. К 200 мкл подготовленной плазмы добавляли 500 мкл свежеприготовленного раствора 0,05 М бромфенацилбромида в ацетоне, получившуюся смесь термостагаровали при температуре 50 °С в течении 2 часов. После охлаждения пробирки центрифугировали и отбирали супернатанг. Аликвоту (10 мкл) использовали для хроматографического анализа.

Характеристики анализа: хроматограф «Милихром А-02» (фотометрический детектор), колонка 2x75 мм, сорбент ProntoSIL 120-5—С18 AQ, скорость потока 100 мкл/мин, длины волн детекции - 240, 260, 280 нм, температура колонки 35 °С, скорость потока 100 мкл/мин. Элюент: А - ацетонитрил-вода-0,1 М КН2Р04

(10:89:1), рН - 6,5; В - ацегошггрил-вода-0,1 М КН2Р04 (70:29:1), рН - 6,5.

Режим элюироваиия градиентный; градиент: 0-55% В - 1000 мкл, 55-77% В -1100 мкп, 77% В - 600 мкл, 77-100% В - 500 мкл, 100% В-300 мкл. График функции калибровочной кривой имел вид С=0,0264*А2+0,03846*А, где С концентрация, А - отклик прибора.

Хроматографическая характеристика приведенной методики количественного определения Ж в плазме крови представлена в табл. 2.

Таблица 2.

Хроматографическая характеристика метода анализа

Параметры Значение

Время удерживания янтарной кислоты 16,3 мин

Ассиметрия пика 1,06

Чувствительность метода 0.1 мкг/мл

Спектральные отношения при опорной дайне волны 260 нм 240 nm 280 nm 0.446 0.149

Экспериментальный материал подвергали статистическому анализу [Лакин Г.Ф., 1973]. Использовали непараметрический метод парных сравнений по критерию Вилкоксона - Манна - Уигни при этом считали, что различия значительны, если вероятность случайности не превышала 5% (р<0,05). При расчете частоты возникновения аритмий использовали F-распределение (распределение Фишера). Фармакокинетические показатели рассчитывали модельно-независимым методом статистических моментов [Агафонов A.A., Пиотровский BJC., 1991; Сергиенко В.И., Джеллифф Р., Бондарева И.Б., 2003].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка острой токсичности комплекса ацетилсалициловой и янтарной

кислот

Исследование острой токсичности комплекса АСК и ЯК проведено на 48 беспородных белых крысах обоего пола массой 250-300 г и 48 беспородных мышах-самцах массой 20-30 г, содержащихся в стандартных условиях вивария, в сравнении с АСК. Препараты вводили однократно в форме суспензии на 1% крахмальной слизи. Наблюдения за животными проводили в течение 14 дней ежедневно, и каждый час в течение первого дня исследования.

Судя по величине ЛД50, Ж снижает токсичность АСК (коэффициент защиты для крыс составляет 1,69, для мышей -1,40), в результате чего комплекс АСК и Ж обладает меньшей острой токсичностью, чем сама АСК. ЛД50 АСК для крыс составило 1820 мг/кг, для мышей 2340 мг/кг; ЛД50 смеси АСК и Ж для крыс составило 3840 мг/кг, для мышей 4100 мг/кг. При этом известно, что сама ЯК является малотоксичным соединением: при внутрижелудочном введении, ЛД50 для крыс составляет 10000 мг/кг, для мышей 7400 мг/кг.

Таким образом, применение Ж в комплексе с АСК позволит снизить побочные эффекты АСК без снижения ее фармакологических свойств.

Анализ ЭКГ параметров на модели ишемической болезни сердца

У животных на модели острой ишемии миокарда путем 15-минутной окклюзии левой коронарной артерии в течение периода ишемии и 3-х мин реперфузии регистрировали ЭКГ во П стандартном отведении.

Исходные параметры ЭКГ у животных опытной и контрольной групп достоверно не различались и не выходили за пределы принятых для данного вида животных физиологических норм [Биленко М.В., 1989]. Начиная с 3-й мин после окклюзии коронарной артерии у крыс контрольной группы развивались выраженные изменения ЭКГ, свидетельствующие об ишемических нарушениях (табл. 3). По сравнению с контрольной группой у крыс 1-й опытной группы получавших АСК и 2-й опытной группой получавшей смесь АСК и Ж выраженные изменения ЭКГ возникали позже, начиная с 7-10 мин регистрации. При этом в группе животных получавших смесь АСК и Ж выраженные изменения зубца Т отмечались к 10-й минуте регистрации (табл. 3, 4). У контрольных животных наблюдалось повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС) на 14%, начиная с 3-й мин регистрации. Было отмечено резкое увеличение амплитуды зубца Т, что указывает на наличие зоны ишемии. При 3-х минутной реперфузии у контрольных животных амплитуда зубца Т оставалась высокой и не снижалась до уровня исходных значений. Было отмечено снижение амплитуды зубца Я уже с 3-5 мин регистрации (на 11% по сравнению с исходными данными). В ряде случаев комплекс ОИБ отсутствовал и формгфовался патологический комплекс ОТ. Наблюдаемые изменения комплекса ОШЗ отражают формирование в сердечной мышце ишемических повреждений. К 7-й мин наблюдалось увеличение комплекса С2Т, который не снижался в период реперфузии (табл. 3, 4,5) [Ольбинская Л.И., Литвицкий П.Ф., 1986].

Таблица 3.

Влияние курсового введения АСК и смеси АСК и Ж (125 мг/кг и 50 мг/кг) на показатели ЭКГ в условиях острой ишемии миокарда у крыс.

Парамет ры Исходный значения Ишемия 0,5-3 мин

Контроль АСК АСК+Ж Контроль АСК АСК+Ж

ЧСС, с-1 290±0,05 285±0,03 280±0,05 340±0,06* 290±0,05+ 280±0,04+

Р, мВ 0,09*0,03 0,09±0,03 0,09±0,03 0,09±0,03 0,09±0,03 0,09±0,03

К, мВ 0Д9±0,04 0Д9±0,04 0,31±0,03 0,31±0,05 0,30±0,06 0,32±0,02

Т,мВ 0,16±0,02 0Д7±0,03 0,16±0,02 0,19±0,02* 0,17±0,02+ 0Д6±0,02+

РО,с. 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01

(ДО!, с. 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01

ОТ, с 0Д2±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01 0,12±0,01

Примечание. Здесь и в таблицах 4, 5 * - р<0,05 по сравнению с исходными значениями + - р<0,05 по сравнению с контролем; * - р0,05 по сравнению с АСК

У животных 1-й опытной группы получавших АСК наблюдалось повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС) на 20% по сравнению с исходными значениями начиная с 7-й мин регистрации. Было отмечено незначительное

и

увеличение амплитуды зубца Т по сравнению с исходными данным, но это значение было достоверно ниже, чем в группе контрольных животных. Следует отметить, что увеличение зубца Т начиналось только с 7-й мин, что гораздо позже, чем у когарольных животных (табл. 3, 4). При 3-х минутной реперфузии у данной группы животных амплитуда зубца Т постепенно снижалась и к 3-й мин регистрации достигала исходных значений, что не было зафиксировано в контрольной группе. У часта животных наблюдалось снижение амплитуды зубца К (на 15% по сравнению с исходными данными). При этом зубец К восстанавливался на 3-й мин реперфузии (табл. 5). Присутствовал комплекс <3118, который не изменялся. Регистрировали увеличение комплекса ОТ, но по сравнению с контролем это увеличение наблюдалось позже и на 3-й мин реперфузии происходило восстановление комплекса до исходных значений (табл. 4,5).

Таблица 4.

Влияние курсового введения АСК и смеси АСК и ЯК (125 мг/кг и 50 мг/кг) на показатели ЭКГ в условиях острой ишемии миокарда у крыс.

Параметр Ы Ишемия 3-7 мин Ишемия 7—15 мин

Контроль АСК АСК+Ж Контроль АСК АСК+Ж

ЧСС, с-1 360±0,06* 300+0,03+ 305±0,02+ 430+0,06* 350+0,03*+ 320+0,02*+

Р, мВ 0,09±0,03 0,09±0,03 0,09+0,03 0,13+0,03* 0,11+0,03*+ 0,10±0,03+

Я, мВ 0,26+0,05* 0,30±0,06+ 0,32+0,02+ 0,23+0,05* 0,27+0,06*+ 0,27+0,02*+

Т, мВ 0,29+0,02* 0,20+0,02*+ 0,17+0,02+# 0,55+0,02* 0,47+0,02*+ 0,41+0,02+#

РО,с. 0,05±0,01 0,05+0,01 0,05+0,01 0,0 5+0,01 0,05±0,01 0,05±0,01

ОКБ, с. 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01 0,02±0,01

ОТ, с. 0,15±0,01* 0,12+0 01+ 0,12+0,01+ 0,17±0,01* 0,14±0,01*+ 0,14+0,01*+

Таблица 5.

Влияние курсового введения АСК и смеси АСК и Ж (125 мг/кг и 50 мг/кг) на показатели ЭКГ в условиях острой ишемии миокарда у крыс. Реперфузия.

Параметр Ы Реперфузия 0,25-1 мин Реперфузия 1-3 мин

Контроль АСК АСК+Ж Контроль АСК АСК+Ж

ЧСС, с-1 360+0,06* 300+0,03+ 305±0,02+ 360+0,06* 300+0,03+ 305+0,02+

Р, мВ 0,13+0,03* 0,11±0,03*+ 0,09+0,03™ 0,13+0,03* 0,11±0,03*+ 0,09+0,03^

И, мВ 0,23±0,05* 0,29+0,06" о.зг+о.ог*" 0,23±0,05* 0,29+0,06" 0,32+0,02'™

Т, мВ 0,55+0,02* 0,42±0,02*+ 0,38+0,02™ 0,З^ьО,02* 0,20±0,02*+ 0,16+0,02™

Р0,с. 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05±0,01 0,05+0,01 0,05+0,01

О^с. 0,02+0,01 0,02±0,01 0,02+0,01 0,02+0,01 0,02+0,01 0,02+0,01

от, с. 0,17+0,01* 0,14+0,01*" 0,12±0,01+ 0,17+0,01* 0,12+0,0Г 0,12+0,01+

У животных 2-й опытной группы получавших смесь АСК и Ж наблюдалось повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС) на 15% по сравнению с исходными значениями начиная с 10-й мин регистрации. Было отмечено незначительное увеличение амплитуды зубца Т по сравнению с исходными данными, но значение было достоверно ниже, чем в группе контрольных животных, а так же было ниже, чем в 1-й опытной группе животных получавших АСК. При 3-х минутной реперфузии у группы животных получавших смесь АСК и Ж амплитуда зубца Т быстро снижалась и к 1-й мин регистрации становилась

равной исходным значениям, что не наблюдалось в контрольной груше, а в группе с АСК это происходило позже. Было зафиксировано снижение амплитуды зубца Я, у части животных (на 10% по сравнению с исходными данными). При этом зубец Я быстро восстанавливался до исходных значений на 1-й мин реперфузии (табл. 3, 5). Регистрировали увеличение комплекса (УГ, но по сравнению с контролем и с животными 1-й опытной группы это увеличение наблюдалось позже и на 1-й мин реперфузии происходило восстановление комплекса до исходных значений.

Таким образом, у животных экспериментальных групп наблюдалось не только улучшение параметров ЭКГ по сравнению со значениями контрольных животных, но и многие показатели достигали исходных значений. Особенно отчетливо это прослеживалось во 2-й опытной группе животных, которым вводилась смесь АСК и ЯК

Анализ функционального состояния МХ сердца животных после введения

препаратов

Исследование показало, что АСК при введении экспериментальным животным в дозе 250 мг/кг (1/10 ЛД50) приводила к ингибированию дыхания МХ сердца крыс при утилизации эндогенных субстратов в метаболических состояниях до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ (У4ш У3, У4о). По сравнению с контрольной группой животных отмечалось увеличение коэффициента АДФ/О, что указывает на иншбирование как сукцинат, так и НАД-зависимых процессов энергопродукции (рис. 1).

Подобные изменения наблюдались и при утилизации экзогенных субстратов. Так, при окислении МХ миокарда 1 мМ сукцината фиксировалось уменьшение скоростей поглощения кислорода до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ при сопутствующем снижении величины ДК и мнимом увеличении коэффициента АДФ/О (рис. 1).

При окислении сукцината МХ сердца крыс, получавших АСК, увеличивалось время фосфорилирования АДФ относительно контроля. Это свидетельствует не в пользу увеличения вклада НАД-зависимых субстратов в энергопродукцию, а, наоборот, об ограничении сукцинатзависимого пути окисления субстратов и снижении энергизованносги МХ [Хазанов В.А., 1993].

При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов в МХ сердца опытных животных, получавших АСК, также наблюдалось снижение скорости фосфорилирукнцего дыхания при увеличении времени фосфорилирования АДФ по сравнению с контрольной группой. Уменьшение величины СД при сопутствующем возрастании коэффициента АДФ/О говорит о кинетическом характере энергодефицига в МХ сердца крыс, получавших АСК (рис. 1) [Хазанов В.А., 2004].

Вместе с тем, ингибиторный анализ с применением конкурентного ингибитора СДГ малоната и ингибитора аминотрансфераз - АОА показал под действием АСК увеличение вклада окисления эндогенной Ж в дыхательную активность органелл при окислении НАД-зависимых субстратов. Вероятно, процесс носит компенсаторный характер и отражает особенность метаболической

регуляции цикла Кребса в условиях измененного под влиянием АСК состояния МХ, и в частности активацию быстрого метаболического кластера [Кондрашова МЛ, 1991].

Koin-pojib

ACIC

АСК+ЯК

Рис 1. Функциональное состояние МХ сердца крыс во время фосформирования АДФ при введении АСК и смеси АСК и Ж. Субстраты окисления: ёЗ - эндогенные; еэ - сукцинат; ш -малат + глугамат; ш - манат + глугамат + маловат; ■ - малат + глутамаг + аминооксиацетат, * — различия достоверны по сравнению с показателями контрольной группы животных при р<0,05; # - различия достоверны по сравнению с показателями группы животных, получавших АСК при р<0,05.

Введение совместно с АСК ЯК в дозе 50 мг/кг способствовало устранению негативных метаболических сдвигов в МХ сердца крыс, вызванных АСК. Так, наблюдалась нормализация скоростей дыхания МХ во всех метаболических состояниях при окислении эндогенных субстратов относительно аналогичных показателей в группе животных, получавших только АСК. При этом возрастали величины СД, ДК и снижалась величина АДФ/О, что говорит о нормализации сукцинатзависимых процессов энергопродукции.

При окислении МХ сердца крыс (получавших АСК совместно с ЯК) сукцината было отмечено значительное возрастание скоростей поглощения кислорода до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ и увеличение коэффициентов СД, ДК по сравнению с таковыми показателями в группе животных, получавших АСК, что подтверждаег предположение о нормализации

сукцинахзависимого пути окисления субстратов и окислительного фосфорилирования. Снижение при этом величины АДФ/О до нормы указывает на реализацию кинетических преимуществ окисления сукцината перед НАД-зависимыми субстратами [Хазанов В.А., 1993].

Таким образом, Ж при совместном введении с АСК оказывала защитный энергопротекторный эффект, связанный с нормализацией сукцинат- и НАД-зависимого дыхания и окислительного фосфорилирования в MX сердца крыс. Сочетанное применение Ж снижало негативное влияние АСК на биоэнергетику миокарда

Влияние острой ишемии миокарда на энергетический обмен сердца

Установлено, что перевязка левой нисходящей ветви коронарной артерии у крыс сопровождалась развитием ишемии сердца, и, наряду с последующей реперфузией, приводила к значительным нарушениям процессов клеточного дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях миокарда левого желудочка.

При окислении эндогенных субстратов в митохондриях сердца крыс, перенесших острую ишемию миокарда, отмечалось снижение скоростей дыхания в метаболических состояниях 4п, 3 и 4о на 40,7% относительно показателей нормы. При этом происходило замедление процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях, что отмечалось по увеличению времени фосфорилирования АДФ на 25% относительно контроля (рис. 2). Показатели СД и ДК существенно возрастали в сравнении с контрольными значениями - на 105%, что, наряду со значительным возрастанием величины АДФ/О, вероятно, свидетельствует о преимущественном окислении НАД-зависимых субстратов и существенном ингибировании сукцинат-зависимых процессов энергопродукции.

Действительно, при окислении экзогенного сукцината митохондриями сердца крыс, подвергнутых ишемическому воздействию, также наблюдалось выраженное ингибирование скоростей дыхания до, во время и после фосфорилирования АДФ (рис. 2) относительно показателей группы контроля. Внесение АДФ в среду инкубации митохондрий миокарда, окисляющих сукцинат, сопровождалось практически двукратным замедлением времени фосфорилирования относительно нормы. Несмотря на некоторую тенденцию к увеличению ДК~и величины АДФ/О, выявленные изменения указывают на выраженное ингибирование сукцинат-зависимой энергопродукции в митохондриях миокарда ишемизированных животных и наличие кинетического энергодефицита [Хазанов В.А., 1993].

Известно, что развитие активации СДГ при экстремальных и патологических воздействиях на организм может сопровождаться компенсаторным ограничением активности СДГ [Окон Е.Б., 1979; Кондрашова М.Н., Маевский Е.А., 1978; Кондрашова М.Н., 1991]. Патологическое торможение активности СДГ выявляется на некоторых стадиях ишемии/гипоксии, и может приводить к устранению метаболического контроля дыхания митохондрий и вызывать глубокое угнетение доминирующего при

гипоксическом типе метаболизма сукцинатзависимого пути энергообеспечения [Хазанов В. А., 1993].

Внесение активатора СДГ р-оксибугирата к митохондриям миокарда, окисляющим сукцинат, не позволило восстановить нормальную активность фермента. Скорости дыхания органелл У^ Уз, У40 оставались значительно сниженными - на 28,7% относительно показателей в группе контроля, коэффициенты СД и ДК превышали показатели нормы на 49% (рис. 2). Величина времени фосфорилирования АДФ уменьшалась относительно показателя при окислении одной ЯК, однако, на 38% превышала величину в группе интактных животных. Выявленные изменения сукцинат-зависимого дыхания митохондрий миокарда крыс, перенесших ишемию, наряду с тенденцией к дополнительному увеличению коэффициентов ДК и АДФ/О, указывают на глубокое ингибирование СДГ.

Таким образом, применение активатора СДГ не выявило активации СДГ при ишемии, что, вероятно, свидетельствует о развившемся вследствие глубокого ингибирования фермента падении мембранного потенциала митохондрий, нарушении способности органелл поддерживать кальциевый гомеостаз, накоплении свободных жирных кислот [Хазанов В.А., 1993].

При окислении в митохондриях миокарда ишемгоированных крыс смеси НАД-зависимых субстратов наблюдалось как уменьшение скоростей контролируемого дыхания У4ш У4о на 56,5%, гак и скорости фосфорилирования АДФ - У3, на 60%. Одновременно снижались величины СД, ДК на 30,8% относительно показателей в группе контроля, а время фосфорилирования АДФ возрастало на 15%. Замедленный цикл фосфорилирования АДФ при окислении НАД-зависимых субстратов наряду с соответствующим снижением параметров, отражающих сопряженность окислительного фосфорилирования - ДК и СД, указывают на разобщение окислительного фосфорилирования [Копдрашова М.Н., 1991; Хазанов В.А., 1993].

Применение конкурентного ингибитора СДГ малоната позволяло выявить снижение скорости окисления малата и глутамата в митохондриях миокарда крыс, перенесших ишемию, относительно соответствующих показателей в контроле до, во время и после фосфорилирования АДФ. При этом время фосфорилирования АДФ возрастало на 49%, а коэффициент АДФЮ на 21%. Отмеченные изменения указывали на угнетение чистого НАД-зависимого дыхания митохондрий крыс, перенесших ишемию миокарда, не опосредованного окислением эндогенной ЯК [Кондрашова М.Н., 1989, 1991]. По сравнению с показателем, выявленным в группе контроля, происходило снижение малонат-чувствительности дыхания органелл крыс, перенесших острую ишемию миокарда Действительно, если в контрольной группе малонат обуславливал снижение скорости фосфорилирующего дыхания при окислении НАД-зависимых субстратов на 30,5%, то в исследуемой группе - лишь на 15%. Это свидетельствует о снижении вклада быстрого метаболического кластера цикла Кребса в НАД-зависимую энергопродукцию и о снижении энергизованности органелл [Кондрашова М.Н., 1979].

При совместном окислении НАД-зависимых субстратов с ингибитором аминотрансфераз АОА происходило уменьшение скоростей дыхания митохондрий миокарда крыс в метаболических состояниях 4п, 3 и 4о на 50% и значительное возрастание времени фосфорилирования АДФ - на 120%. При этом наблюдалось разнонаправленное изменение величин ДК и АДФ/О -увеличение коэффициента ДК на 30,4% и снижение АДФ/О на 38,7% (рис.2). Соответствующие значения величин, отражающих сопряженность окислительного фосфорилирования, указывали на снижение вклада НАД-зависимого дыхания в синтез АТФ под действием ингибитора АОА. Под действием АОА также выявлено уменьшение вклада реакций переаминирования в НАД-зависимую энергопродукцию при острой ишемии миокарда.

Таким образом, в модели острой ишемии сердца и последующей реперфузии в митохондриях миокарда крыс выявлено угнетение сукцинат- и НАД-зависимого дыхания, замедление окислительного фосфорилирования, массивное торможение СДГ и ингибирование быстрого метаболического кластера митохондрий сердца

Влияние ацетилсалициловой кислоты на энергетический обмен миокарда крыс при острой ишемни сердца

В группе животных, профилактически получавших внутрь ацетилсалициловую кислоту в дозе 125 мг/кг курсом 7 дней до моделирования острой ишемии сердца, были отмечены существенные изменения митохондриальной энергопродукции в миокарде крыс по сравнению с группой животных, не получавшей препарат.

Так, при окислении митохондриями миокарда крыс эндогенных субстратов, аналогично изменениям в группе крыс, перенесших ишемию, наблюдалось значительное ингибирование скоростей дыхания до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ на 40,7% (рис. 2) относительно контроля. Время фосфорилирования АДФ несколько снижалось относительно показателей, выявленных у незащищенных препаратом животных, что, однако, не влияло на характер окислительного фосфорилирования (рис. 2). Возрастание величины СД на 20% при высоком кажущемся значении коэффициента АДФ/О указывает на сохранение доминирования окисления НАД-зависимых субстратов в энергопродукции и снижение вклада сукцинат-зависимых процессов в эпергизацшо митохондрий.

При окислении экзогенной ЯК в митохондриях сердца крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту до воздействия ишемии, наблюдались изменения биоэнергетики миокарда, подобные таковым у животных, не получавших препарат. При этом в митохондриях миокарда выявлялась тенденция к снижению скорости фосфорилирующего дыхания относительно показателя, определенного у незащищенных препаратом крыс, что может указывать на дополнительное ингибирование СДГ салицилатами. Наличие кинетического энергодефицита и ингибирование сукцинатзависимой энергопродукции в исследуемой группе крыс подтверждалось сохранением значительного

замедления времени фосфорилирования АДФ относительно контроля.

Установленные факты позволяют судить о выраженном ингибировании активности СДГ в группе крыс, перенесших ишемию миокарда и получавших ацетилсалициловую кислоту.

Использование активатора СДГ [3-оксибутирата при совместном окислении с Ж не приводило к повышению степени энергизованности органелл, что указывает на сохранение глубокого ингибирования СДГ. Так, относительно показателей нормы было отмечено ингибирование скоростей контролируемого (У4ш У4о) и фосфорилирующего дыхания (Уз) митохондрий миокарда крыс. Время фосфорилирования АДФ значительно превышало показатель, выявленный в группе интактных крыс (рис. 2). Превышение величины скорости фосфорилирующего дыхания при окислении Ж совместно с Р-оксибутиратом над соответствующим показателем при окислении Ж составило 17,5%, что сопровождалось снижением коэффициента ДК на 32% (табл. 16). Это может указывать на снижение ингибирования СДГ в группе крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту до ишемии миокарда под воздействием «сильного» активатора СДГ [Виноградов А.Д., 1979; Кондрашова М.Н., 1989; 1991]. Вместе с тем возрастал коэффициент АДФ/О, что свидетельствует об отсутствии изменений характера окислительного фосфорилирования при окислении сукцината.

При окислении в митохондриях миокарда крыс, получавших ацетилсалициловую кислоту до действия ишемии, смеси НАД-зависимых субстратов отмечалось ингибирование скоростей поглощения кислорода органеллами до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ относительно показателей контроля (рис. 2). По сравнению с параметрами, выявленными в группе животных, не получавших препарат, наблюдалось увеличение коэффициентов СД и ДК на 40,4%, что, судя по величине коэффициента АДФ/О, не влияло на характер окислительного фосфорилирования.

Внесение малоната в среду инкубации митохондрий миокарда, окисляющих НАД-зависимые субстраты, приводило к закономерному уменьшению показателей скоростей дыхания органелл во время и после цикла фосфорилирования АДФ на 22%, а также вызывало снижение коэффициента СД и увеличение показателя АДФ/О. Мнимое увеличение коэффициента АДФ/О при этом указывало на наличие ингибирования наиболее эффективного пути образования энергии в органеллах, сукцинатзависимого окисления. При этом малонат в значительно меньшей степени, чем в группе контроля, снижал скорость фосфорилирующего дыхания Уз при окислении смеси малата и глутамата (рис. 2). Следовательно, в группе животных, получавших ацетилсалициловую кислоту, сохранялось ингибирование быстрого метаболического кластера цикла Кребса, вызванное ишемией сердца

При использовании ингибитора аминотрансфераз АОА было выявлено снижение скорости дыхания митохондрий миокарда во всех метаболических состояниях и увеличение коэффициента АДФ/О относительно контроля, что, наряду со значительным увеличением времени фосфорилирования АДФ, свидетельствует о существенном ингибировании НАД-зависимой

энергопродукции. При этом отмечено значительное снижение чувствительности органелл крыс исследуемой группы к ингибитору аминотрансфераз АОА относительно показателей, выявленных в норме, что указывает на ингибирование реакций продукции эндогенной Ж.

Таким образом, на уровне митохондрий миокарда крыс, получавших салицилаты до моделирования ишемии сердца, было выявлено ингибирование сукцинат и НАД-зависимых процессов энергопродукции, быстрого метаболического кластера цикла Кребса, сохранялось замедление процесса окислительного фосфорилирования. Очевидно, что ацетилсалициловая кислота, введенная животным курсом 7 дней с профилактической целью до моделирования ишемии миокарда, не устраняет нарушений биоэнергетики сердца и не влияет на характер нарушений окислительного фосфорилирования, вызванных ишемией миокарда.

Влияние комбинации янтарной и ацетилсалициловой кислоты на энергетический обмен миокарда крыс при острой ишемии сердца

В группе животных, получавших янтарную кислоту в дозе 50 мг/кг курсом 7 дней совместно с ацетилсалициловой кислотой до моделирования ишемии миокарда, отмечалось существенное восстановление параметров биоэнергетики миокарда и тенденция к нормализации окислительного фосфорилирования по сравнению с незащищенными препаратами животными.

При окислении эндогенных субстратов было выявлено повышение скоростей контролируемого дыхания митохондрий миокарда - У4п и У^, на 20,8% (рис. 2) относительно показателей, наблюдавшихся в группе животных, подвергнутой острой ишемии сердца. При этом отмечалось уменьшение времени фосфорилирования АДФ на 26%, снижение коэффициентов СД, ДК на 15% (рис. 2). Сопутствующее данным изменениям понижение значения АДФ/О указывает на стимуляцию сукцинат-зависимых процессов энергопродукции по сравнению с группой животных, не получавших препаратов.

Действительно, при окислении сукцината наблюдалось увеличение скоростей дыхания в метаболических состояниях 4п, 3 и 4о на 15% относительно группы животных с моделью ишемии миокарда (рис. 2). Происходило уменьшение времени фосфорилирования АДФ на 33,6%, снижение коэффициентов СД, ДК на 20%. Величина АДФ/О, наоборот, повышалась на 43,5%, что свидетельствует об увеличении сопряженности окислительного фосфорилирования и повышении энергизованности органелл. Таким образом, под действием профилактического введения комбинации янтарной и ацетилсалициловой кислот происходит активация сукцинат-зависимого окисления в митохондриях миокарда крыс, подвергнутых ишемии сердца и частичное устранение ингибирования СДГ.

Эти предположения подтверждают данные, полученные при рассмотрении изменений дыхательной активности митохондрий миокарда крыс при совместном окислении органеллами сукцината с активатором СДГ оксибутиратом. Так, митохондрии миокарда крыс, получавших смесь янтарной и ацетилсалициловой кислот до моделирования ишемии сердца,

характеризовались более высокими скоростями до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ на 50,3% (рис. 2) относительно показателей в группе крыс, незащищенных препаратами. При этом отмечали снижение показателей СД, ДК до значений, выявленных в норме. Происходило восстановление времени фосфорилирования АДФ практически до значений, выявленных в норме. Одновременно с этим отмечалось уменьшение коэффициента АДФ/О относительно показателя, выявленного у ищемизированных крыс.

Рис 2. Функциональное состояние МХ сердца крыс при модели острой ишемии и ишемии на фоне введении АСК и смеси АСК а ЯК, Субстраты окисления: В - эндогенные; а - сукцииат, @ - малат + глутамат; щ - малат + глутамат + малонат, ■ - малат + глутамат + аминооксиацетат; к - р-ОБ. * - различия достоверны по сравнению С показателями контрольной группы животных при р<0,05; # - различия достоверны по сравнению с показателями группы животных, при ишемии при р<0,05.

Скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий под действием активатора СДГ р-оксибутирата возрастала на 27,8% относительно показателя, выявленного при окислении одного сукцината, одновременно с этим наблюдалось снижение величины АДФ/О на 15,7% и уменьшение времени фосфорилирования АДФ на 25%. Таким образом, введение животным янтарной кислоты совместно с ацетилсалициловой гфиводило к устранению глубокого

ингибирования СДГ, наблюдаемого в группе крыс, перенесших ишемию сердца и не получавших препараты.

Характерно, что наблюдаемое устранение ингибирования СДГ развивалось на фоне уже стимулированного сукцинат-зависимого дыхания митохондрий, и сопровождалось нормализацией процесса окислительного фосфорилирования. Это может указывать на компенсаторный характер изменений энергопродукции в миокарде крыс, получавших смесь янтарной и ацетилсалициловой кислот, в отличие от декомпенсированного характера изменений биоэнергетики миокарда в группе крыс, не защищенных препаратами.

При окислении митохондриями миокарда крыс НАД-зависимых субстратов отмечалось возрастание относительно состояния при ишемии миокарда скоростей дыхания органелл во время и после фосфорилирования АДФ, коэффициенты СД и ДК в значительной степени возрастали относительно таковых, выявленных в группе подвергнутых ишемии животных. Наблюдаемые изменения указывают на нормализацию НАД-зависимых процессов энергопродукции, стимулирование НАД-зависимого окисления в клетках. Уменьшение времени фосфорилирования АДФ относительно показателя, выявленного при ишемии миокарда, наряду с возрастанием величин СД и ДК говорит о нормализации окислительного фосфорилирования.

Применение ингибитора СДГ малоната выявляло повышение скоростей дыхания митохондрий миокарда на 60,4% относительно группы ишемизир ов анных животных, при этом наблюдалось увеличение коэффициентов СД, ДК и АДФ/О, что, при сопутствующем снижении времени фосфорилирования АДФ может свидетельствовать о восстановлении ингибированного при ишемии миокарда «чистого» окисления НАД-зависимых субстратов.

Было выявлено увеличение чувствительности органелл животных исследуемой группы к ингибитору малонату, проявляющееся в более значительном, чем при ишемии, снижении скорости фосфорилирующего дыхания митохондрий. Наблюдаемые изменения НАД-зависимого дыхания, с одной стороны, указывают на развитие доминирования быстрого метаболического кластера в энергопродукции, с другой стороны - на повышение вклада НАД-зависимых субстратов в продукцию АТФ (три пункта фосфорилирования при окислении НАД-зависимых субстратов вместо двух -при окислении сукцината).

Внесение АОА к митохондриям сердца, окисляющим НАД-зависимые субстраты, приводило к контрастированию изменений НАД-зависимой энергопродукции, вызываемых профилактическим введением смеси янтарной и ацетилсалициловой кислоты до моделирования ишемии миокарда. Так, в исследуемой группе животных отмечалось повышение скоростей дыхания митохондрий во всех метаболических состояниях относительно таковых при ишемии миокарда, а сопутствующее снижение величин СД и ДК и возрастание - АДФ/О, говорит о существенной зависимости параметров НАД-зависимого дыхания органелл от процессов переаминирования.

Следовательно, на уровне системы энергопродукции миокарда ишемизированных животных, получавших смесь янтарной и ацетилсалициловой кислот, наблюдалось развитие активации сукцинат и НАД-зависимого дыхания, восстанавление активности СДГ и происходила нормализация скорости окислительного фосфорилирования в миокарде крыс посредством поддержания активности быстрого метаболического кластера.

Сравнительный анализ фармакокинетвки ацетилсалициловой кислоты и комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот

В лаборатории молекулярной фармакологии ГУ НИИ фармакологии была разработана методика хроматографического определения салициловой кислоты, как в водно-спиртовых растворах, так и в плазме крови животных. Одним из параметров идентификации, при использовании метода хроматографии, является сравнение времен удерживания веществ с эталонными растворами. Однако этот параметр не является уникальным, в связи с этим, для повышения качества идентификации салициловой кислоты в плазме крови животных использовались спектральные характеристики данного вещества, на основании которых делались заключение о правильности идентификации. Сравнение времен удерживания и спектральных характеристик стандарта салициловой кислоты и салициловой кислоты в плазме крови животных после однократного приема АСК приведены на рис 3, 4.

После приема как АСК, так и АСК совместно с ЯК, концентрация метаболита (салициловой кислоты) достигала максимального уровня к 30-й мин и составляла 8 мкг/мл. К 9 часу после введения препаратов концентрация салициловой кислоты в крови животных падала до предельно определяемой (1 мкг/мл).

Определяли следующие фармакокинетические параметры: максимальную концентрацию (Cm«); время ее достижения (Ттах); площадь под фармакокинетической кривой (AUCo-t), отражающую количество препарата циркулировавшего в крови за период его поступления в организм и снижение концентрации до уровня минимально определяемой; как характеристику скорости всасывания обоих препаратов, рассчитывали отношение Cmm/AUCo-t. а так же определяли Mean - средние значение; Gmean - среднее геометрическое; SD - стандартное отклонение; Low - нижняя граница 90% доверительного интервала; UP - верхняя граница 90% доверительного интервала

Таблица 6.

Фармакокинетические параметры салициловой кислоты после приема комбинации АСК и ЯК

AUC, мкг* /мл Cmax МКГ/МЛ Tmax, 4 Сщах / AUC

Mean 31,06 8,81 0,7 0,29

Gmean 30,10 8,74 0,66 0,28

SD 9,76 2,26 0,23 0,07

Low 22,25 7,50 0,46 0,21

UP 37,87 11,12 0,87 0,29

Таблица 7.

Фармакокинетические параметры салициловой кислоты после приема АСК

А1ГС, кг* /мл Сщах МКГ/МЛ Ттах> Ч Сшах / АИС

Меап 32,04 8,13 0,75 0,28

Сгтеап 31,28 7,74 0,63 0,27

во 8,30 2,51 0,26 0,04

26,20 6,12 036 0,22

ир 37,88 10,15 т 0,28

Фармакокинетические параметры салициловой кислота после приема препарата АСК и смеси АСК с Ж статистически достоверно не различались. Границы оценочных доверительных интервалов для параметров АиС<м, и Сшк/АИСо^ составляли 82-115,4%, 89-131,9% и 96,6-125,8% соответственно и находятся в допустимых пределах 80-125% (для параметра АИСо-О и 75-133% (для параметров Сщ^ и С^/АиС0<). Результаты расчетов фармакокинетических параметров АСК и композиции АСК и ЯК приведены в таблице 6 и 7.

Рис 4. Хроматограмма салициловой кислоты (и ее спектр) в плазме крови кроликов после однократного приема АСК в дозе 125 мг/кг.

Усредненные фармакокинетические кривые салициловой кислоты после однократного внутрижелудочного введения АСК в дозе 125 мг/кг и смеси АСК и ЯК в дозе 125 и 50 мг/кг соответственно представлены на рис. 5. Как видно, усредненные фармакокинетические кривые практически не различаются.

Время, (час)

Рис. 5. Усредненные фармакокинетические кривые салициловой кислоты после однократного внутрижелудочного введения АСК в дозе 125 мг/кг и смеси АСК и ЯК в дозе 125 и 50 мг/кг соответственно

Анализ фармакокинетнки янтарной кислоты

В крови кроликов определяли концентрацию ЯК. Количественное определение ЯК проводилось с помощью ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02» с предварительной дериватизацией Ж бромфенацилбромидом. Хроматограмма дериватизированной Ж представлена на рис. 6.

Ж (500 мг/кг)

Анализ фармакокинетических данных показал, что янтарная кислота достигает системного кровотока, где наблюдается максимальная концентрация (Сшах - 5,41 мкг/мл) уже через 0,41 ч, которая затем быстро снижается (ГШ -0,48 ч). Янтарная кислота показала высокий клиренс (СЬ - 91,65 л/ч), что

подтверждает высокую утилизацию и выведение ее из организма. Среднее время пребывания кислоты в организме (MRT) - 0, 84 ч. Показатель абсолютной биодоступностй f Ж составил 20%. Понимание процессов утилизации янтарной кислоты и высокая потребность в ней организма, а также эффект первого прохождения, позволяют сделать предположение о быстром метаболизме препарата при достижении системного кровотока

Таким образом, Ж при совместном введении с АСК оказывает защитный энергопротекторный эффект, связанный с нормализацией сукцинат- и НАД-зависимого дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца крыс. Наличие противоишемических свойств у данной комбинации препаратов, превосходящее свойства одной АСК указывает на оправданное применение янтарной кислоты в виде композиции с ацетилсалициловой кислотой в качестве корректора энергетического обмена, для уменьшения побочных действий и повышения фармакологической активности ацетилсалициловой кислоты. Кроме того в проведенных исследованиях фармакокинетики выявлено, что Ж не влияет на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты, что позволяет увереннее прогнозировать терапевтический эффект комбинированного препарата для лечения и профилактики ИБС на основе ацетилсалициловой и янтарной кислот.

ВЫВОДЫ

1. Разработана высокочувствительная унифицированная ВЭЖХ методика количественного определения ацетилсалициловой и янтарной кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. При исследовании фармакокинетики комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови кроликов установлено, что янтарная кислота не влияет на процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения ацетилсалициловой кислоты.

3. Применение янтарной кислоты снижает токсичность ацетилсалициловой кислоты, повышая уровень выживаемости животных и увеличивая летальную дозу ацетилсалициловой кислоты в комбинации с янтарной.

4. Курсовое введение ацетилсалициловой кислоты в дозе 1/10 ЛД50 сопровождается нарушением энергетического обмена митохондрий миокарда крыс, которое характеризуется угнетением сукцинат- и НАД-зависимых путей окисления, разобщением окислительного фосфорилирования. Янтарная кислота предупреждает негативное влияние ацетилсалициловой кислоты на биоэнергетику миокарда.

5. Смесь янтарной и ацетилсалициловой кислот оказывает противоишемическое действие, проявляющееся в снижении амплитуды зубца Т, интервала QT, количества и продолжительности экстрасистол на электрокардиограмме, а так же по восстановлению активности сукцинатдегидрогеназы, скорости окислительного фосфорилирования в миокарде крыс в условиях острой ишемии посредством поддержания активности быстрого метаболического кластера митохондрий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сравнительный анализ биодоступности ацетилсалициловой кислоты и ее композиции с метаболитом цикла Кребса // Регуляторы энерг. обмена. Клин,-фармакол. аспекты. Мат. симп. на ХП Российском симпозиуме «Человек и лекарство». - Москва, 2005. - С. 134-138. (соавт. Гурто Р.В., Хазанов В.А.).

2. Влияние состояния системы энергопродукции на фармакокинетику лоратадина // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск: Изд-во Том. ун-та. - 2005. - С. 12-13. (соавт. Гурто Р.В., Овсянникова Е.Ю.).

3. Сравнительный анализ биодоступности ацетилсалициловой кислоты и ее композиции с янтарной кислотой // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии. - Томск: Изд-во Том. ун-та. - 2005. - С. 5-7. (соавт. Гурто Р.В).

4. Кардиопротекторные свойства янтарной кислоты при нарушении биоэнергетики миокарда, вызванной ацетилсалициловой кислотой // Регуляторы энерг. обмена. Клин, -фармакол. аспекты. Мат. симп. на ХШ Российском симпозиуме «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 31-36 (соавт. Гурто Р.В., Васильев К.Ю., Хазанов В.А.).

5. Взаимосвязь фармакокинетики гликлазида с состоянием системы энергопродукции // Регуляторы энерг. обмена. Клин.-фармакол. аспекты. Мат. симп. на ХШ Российском симпозиуме «Человек и лекарство». - Москва, 2006. - С. 42-48 (соавт. Гурто Р.В., Диш А.Ю., Хазанов В. А.).

6. Влияние сукцината аммония на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты // Клиническая фармакология и рациональная фармакотерапия: Мат. Первого Сибирского съезда клинических фармакологов. - Барнаул: Азбука, 2006. - С. 316-319 (соавт. Гурто Р.В., Хазанов В.А.).

7. Фармакологическая защита миокарда при патологических процессах с помощью регулятора энергетического обмена // Бюлл. экспер. биол. и мед. -2007. - Приложение 1. - С. 35-40 (соавт. Хазанов В.А., Гурто Р.В., Васильев К.Ю., Киселева A.A.).

Отпечатано в ООО «НШ1», с ТЬмсж, ул. Советски, 47, ют.: 53-14-70 Заказ M 14.02.07, праж 120 экз.

Актуальность проблемы. Ишемическая (коронарная) болезнь сердца (ИБС), развивающаяся вследствие атеросклероза коронарных артерий, является ведущей причиной инвалидизации и смертности трудоспособного населения во всем мире [Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2000]. Согласно эпидемиологическим данным, в Российской Федерации лидирующее положение по показателям нетрудоспособности населения принадлежит заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Из их числа первые ранговые места занимают ИБС и артериальная гипертензия [Белоусов Д.Ю., Медников О.И., 2003].

В настоящее время накоплено достаточно данных, указывающих на то, что в патогенезе ИБС и, в частности, стабильной стенокардии как одной из форм хронической ИБС, отчетливо прослеживается деэнергизация из-за формирования тканевой гипоксии [Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., Хазанов В.А. и др., 1987; Лукьянова Л.Д., 1997]. Возникающие при этом нарушения клеточного энергетического метаболизма преимущественно связаны с ми-тохондриальными дисфункциями. [Гацура В.В., 1993; Коган А.Х., 1999; Кондрашова М.Н., 2002; Коркина О.В., Хаткевич А.Н., 2001; Лукьянчук В.Д., Савченкова Л.В., 1998; Хазанов В.А., 2002, 2003]. Нарушения энергетического обмена приводят к дестабилизации функциональной активности систем жизнеобеспечения организма, запускается каскад патологических реакций, включая генерацию активных форм кислорода, приводящих к повреждению митохондрий и других структур клетки [Барсель В.А., Щедрина И.С. и др., 1998; Владимиров Ю.А., 1991; Гацура В.В., 1993; Ланкин В.З., Ти-хазе А.К., Беленков Ю.Н., 2000; Скулачев В.П., 1994; Хазанов В.А., 2003].

Данные медицинской статистики свидетельствуют о недостаточной эффективности современной фармакотерапии ИБС. В связи с этим требуется развитие и внедрение в широкую практику новых методов медикаментозной терапии данной патологии [Метелица В.И., 1999; Погосова Г.В., 2002; Симоненко В., Фисун А. и др., 2001; Сыркин A.JL, 2000; Чазов Е.И., 2000; Gibbons R.J., Abrams J., Chatterjee К., 2003].

Современная схема лечения ИБС включает прием антиангинальных, ан-тиишемических, гиполипидемических, метаболических и антитромботиче-ских препаратов [Глезер М.Г., Сыркин A.JL, 2000; Метелица В.И., 1999; Фомина И., Георгадзе 3., 2001]. Имеются доказательства того, что применение антитромботических препаратов уменьшает риск развития сердечнососудистых осложнений и улучшает прогноз течения заболевания у больных ИБС [Покровская Т.Н., Столярова O.JL, 1982; Gibbons R.J., Abrams J., Chatterjee К., 2003]. В терапии и профилактике тромботических осложнений при ИБС успешно применяют антикоагулянт ацетилсалициловую кислоту (АСК) [Красильников С.А., 1993; Насонов Е.Л., Лебедева О.В., 1996]. При этом известно, что сами салицилаты в терапевтических дозах оказывают негативное влияние на систему энергопродукции. Помимо создания ксенобио-тической нагрузки, они прямо влияют на энергетический обмен, ингибируя различные метаболические пути [Хазанов В.А., 2004; Gutknecht J., 1990]. Известно, что салицилаты увеличивают проницаемость мембран к иону водорода (Н4-), а это в свою очередь способствует деэнергизации митохондрий [Brooks P.M., Day R.O., 1991; Kjelden S., Kolioch R.E., Leonetti G., 2000]. Вместе с тем пациенты с заболеванием сердечно-сосудистой системы ишемиче-ского генеза вынуждены длительно, практически пожизненно, принимать салицилаты, несмотря на опасность развития митохондриальных осложнений.

Эти данные, а так же сведения о развитии нарушений клеточного энергетического метаболизма при ИБС, предполагают возможность использования в качестве фармакологических корректоров ИБС средств, влияющих на выработку энергии в ишемизированном миокарде и предотвращающих энергетический дисбаланс. Это возможно, в частности, при использовании янтарной кислоты (ЯК), являющейся как субстратом энергетического обмена, так и активатором сукцинатдегидрогеназы - фермента, регулирующего активность малочувствительного к дефициту кислорода пути образования АТФ в клетке [Шахнович P.M., 2001; Хазанов В.А., 2002; Кондрашова М.Н., 2002].

В последнее время в клинической практике успешно применяются препараты - регуляторы энергетического обмена, созданные на основе не только ЯК, но и других естественных метаболитов митохондрий. Они способны оказывать оптимизирующее и активизирующее, в пределах физиологической нормы, действие на энергетические процессы митохондрий [Хазанов В.А., 1996, 2002, 2003, 2004]. Применение регуляторов энергетического обмена (РЭО) позволяет унифицировать ответную реакцию митохондрий (MX) на фармакологическое воздействие и стабилизировать эффект на уровне всего организма [Хазанов В.А., 1992, 2000, 2004].

В ранее проведенных исследованиях нами выявлена способность ЯК, снижать токсичность и повышать эффективность АСК. Таким образом, создание комплексного препарата на основе АСК и ЯК помимо снижения негативных свойств АСК даст возможность влиять на энергетику ишемизированной ткани сердца. Вместе с тем, известно, что изменение энергетического статуса организма может повлиять на фармакокинетику лекарственного средства, а тем самым и на фармакологические свойства препарата, а это может привести не только к изменению условий его дозирования, но и основных свойств [Benet L.Z., Kroetz D.L., Sheiner L.B., 1996; Hans-Georg Eichler, M. Muller., 1998; James W. Lohr, Gail R., Willsky A., 1998; Hutzier J.M., Tracy S.T., 2001; Белоусов Ю.Б., Гуревич К.Г., 2005; Гурто Р.В., 2005; Диш А.Ю., 2004]. Однако в литературе отсутствуют данные о влиянии ЯК на фармакокинетику АСК. Приведенные сведения указывают на актуальность разработки комбинированного препарата на основе АСК и ЯК для профилактики и лечения ИБС.

Цель работы: изучить противоишемические свойства, острую токсичность и фармакокинетику комбинированного препарата янтарной и ацетилсалициловой кислот.

Задачи исследования:

1. Разработать методику хроматографического определения янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. Оценить фармакокинетику янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови кроликов и влияние янтарной кислоты на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты

3. Исследовать острую токсичность комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот.

4. Оценить влияние янтарной и ацетилсалициловой кислот на энергетический обмен митохондрий сердца интактных крыс.

5. Изучить противоишемическое действие комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот по электрокардиографическим показателям и энергетическому обмену миокарда крыс.

Научная новизна.

Впервые исследовано влияние янтарной кислоты на фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты. Установлено, что янтарная кислота в терапевтических дозах не изменяет фармакокинетику ацетилсалициловой кислоты.

Получены новые данные относительно влияния ацетилсалициловой кислоты на энергетический обмен, в частности на функциональное состояние МХ миокарда.

Установлено противоишемическое действие смеси ацетилсалициловой и янтарной кислот, проявляющееся в нормализации электрической активности миокарда и энергетического обмена.

Практическая значимость.

1. Разработан хроматографический метод определения янтарной кислоты и комплекса ацетилсалициловой и янтарной кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. Обоснована целесообразность применения комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот в качестве средства комплексной терапии при ишемии миокарда.

3. Установлено, что янтарная кислота снижает негативное влияние ацетилсалициловой кислоты на энергетический метаболизм.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговой научной конференции ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2005), на IV Российском симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2005), на V Российском симпозиуме «Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты» (Москва, 2006).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях и материалах конференций, из них одна в журнале, входящем в перечень ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 22 таблицами. Библиографический указатель содержит 238 источников, из них 80 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Разработана высокочувствительная унифицированная ВЭЖХ методика количественного определения ацетилсалициловой и янтарной кислот в плазме крови при введении препаратов в терапевтических дозах.

2. При исследовании фармакокинетики комплекса янтарной и ацетилсалициловой кислот в плазме крови кроликов установлено, что янтарная кислота не влияет на процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения ацетилсалициловой кислоты.

3. Применение янтарной кислоты снижает токсичность ацетилсалициловой кислоты, повышая уровень выживаемости животных и увеличивая летальную дозу ацетилсалициловой кислоты в комбинации с янтарной.

4. Курсовое введение ацетилсалициловой кислоты в дозе 1/10 ЛД50 сопровождается нарушением энергетического обмена митохондрий миокарда крыс, которое характеризуется угнетением сукцинат- и НАД-зависимых путей окисления, разобщением окислительного фосфорилирования. Янтарная кислота предупреждает негативное влияние ацетилсалициловой кислоты на биоэнергетику миокарда.

5. Смесь янтарной и ацетилсалициловой кислот оказывает противоишемиче-ское действие, проявляющееся в снижении амплитуды зубца Т, интервала QT, количества и продолжительности экстрасистол на электрокардиограмме, а так же по восстановлению активности сукцинатдегидрогеназы, скорости окислительного фосфорилирования в миокарде крыс в условиях острой ишемии посредством поддержания активности быстрого метаболического кластера митохондрий.

109