Автореферат и диссертация по медицине (14.00.08) на тему:Изучение воздействия N-ацетил карнозина и D-пантетина на ультрафиолет-индуцированную катаракту в эксперименте

На правах рукописи

Сосновская Ольга Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ N-АЦЕТИЛ КАРНОЗИНА И D-ПАНТЕТИНА НА УЛЬТРАФИОЛЕТ- ИНДУЦИРОВАННУЮ КАТАРАКТУ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.00.08 - глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2008

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН

Научные руководители кандидат медицинских наук

Шеремет Наталия Леонидовна

кандидат биологических наук Муранов Константин Олегович

Официальные оппоненты. доктор медицинских наук, профессор

Шелудченко Вячеслав Михайлович

доктор биологических наук, профессор Чеснокова Наталья Борисовна

Ведущая организация Российский Университет Дружбы

Народов

Защита состоится « 19 » мая 2008 г в 14— часов на заседании диссертационного совета Д 001 040 01 при Государственном учреждении научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН по адресу 119021, г Москва, ул Россолимо, д 11А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Автореферат разослан « 16 » апреля 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Макашова Н.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В структуре слепоты и слабовидения возрастная катаракта занимает одно из ведущих мест в мире (Либман Е С, Шахова Е В , 2000, Lundstrom М, 2002, Фокин,В П, 2005, Либман Е С, Шахова Е В , 2006) Так, удельный вес катаракты в структуре глазной заболеваемости в мире по данным ВОЗ составляет 42 % В России распространенность катаракты по критерию обращаемости составляет 1201,5 на 100 тыс населения, а абсолютное число людей, страдающих данным заболеванием превышает 1,7 млн (Малюгин Б Э, 2006) В то же время, возрастная катаракта приобретает все большее социальное значение благодаря отмечаемым в последние годы сдвигам дермографических показателей в сторону постарения населения

В настоящее время нет эффективного медикаментозного лечения возрастной катаракты, поэтому основными способами лечения являются хирургические вмешательства (Фокин В П, 2005) В России ежегодно выполняется 180 тыс операций по поводу катаракты, но это охватывает лишь десятую часть от общего количества больных (Малюгин Б Э, 2006) В то же время, хирургическое лечение не является патогенетически обоснованным, в отличие от медикаментозного Несомненно, что знание этапов патогенеза развития возрастной катаракты явилось бы основой для эффективной медикаментозной терапии Однако патофизиологические процессы начала этого заболевания еще далеко не полностью установлены Поэтому в исследовании этиологии катаракты уже многие годы заняты не только представители медицинской науки, но и исследователи в области молекулярной биологии, биохимии и биофизики (Корсакова Н И, 2004) Существенным достижением является сформулированная в последние годы свободнорадикальная теории катарактогенеза Подтверждением ее справедливости является факт того, что в офтальмологической практике успешно применяют препараты, обладающие антиоксидантными (АО)

свойствами (Багиров Н А, 2000, Spector А, 1985, Orlian Н et al, 1999, Gritz D С, 2001, Zone L, Marcovic M , 2001, Полунин Г С , 2001, Майчук Ю Ф , Ларина Л А, 2003) В то же время, катаракта - это многофакторное и многостадийное заболевание, поэтому существует возможность воздействия и на другие этапы процесса катарактогенеза Например, на стадию образования водонерастворимых белковых агрегатов, образование которых признано одной из ключевых стадий развития помутнений в хрусталике (Harrington V et al, 2004, Jung W T et al, 1996, Ahrend M et al, 1998, Paunksnis A et al, 2000, Позняк H И, Барковский E В , 1997)

Действительно оказалось, что усиление шаперон-подобных свойств а-кристаллина, то есть его способности предупреждать агрегацию поврежденных белков, лежит в основе механизма антикатарактального действия тетрапептида D-пантетина Как известно, это соединение эффективно тормозит развитие экспериментальных катаракт (радиационной, селенитовой, галактозной, стрептозотоциновой и др) (Clark JI, Huang Q , 2001, Harding J J, 2001)

Последние исследования показали, что N-ацетил карнозин, обладающий антикатарактальным действием (Babizhayev М.А et al, 2004), способен тормозить ультрафиолет-индуцированную агрегацию pL-кристаллина m vitro как молекулярный шаперон (Муранов КО. и соавт, 2008) Более того, смесь этих пептидов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) in vitro более эффективно тормозит процесс агрегации кристаллинов под воздействием ультрафиолетового излучения (УФ), чем каждый из них в отдельности (Soustov L V et al, 2003, Соустов Л В и соавт, 2008)

Полученные результаты дали основания для разработки новой комбинации антикатарактальных препаратов, действующей по шаперон-подобному механизму

Условия формирования помутнений хрусталиков in vitro полностью не могут повторить условия развития катаракты в живом организме, поэтому,

чтобы дать окончательный ответ об эффективности предложенной комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина), необходимо изучение ее антикатарактальных свойств m vivo

Для постановки такого эксперимента необходима легко воспроизводимая и адекватная модель возрастной катаракты По данным литературы, катаракта, индуцированная низкими дозами ультрафиолетового облучения (УФО) приближена к возрастной Действительно, под влиянием УФ и видимого света в хрусталике происходят процессы фотоокисления и агрегации водорастворимых белков, что является одним из основных этапов патогенеза возрастной катаракты (Hamngton V et al, 2004, Jung W T et al, 1996, Azzam N, Dovrat A, 2004, Knvandin А V et al, 1989, Nai-Teng Yu et al, 2004)

Таким образом, актуальность изучения воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте несомненна

Цель исследования

Изучение воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте на крысах

Задачи исследования

1 Разработать легко воспроизводимую пролонгированную экспериментальную модель УФ-индуцированной катаракты,

2 Разработать шкалу субъективной оценки степени прозрачности хрусталика крысы вида Wistar для этой модели,

3 Изучить особенности клинической картины УФ-индуцированной катаракты на разных этапах ее формирования;

4 Изучить влияние УФ на передний и задний отрезок глаза,

5 Исследовать эффективность применения различных доз комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на развитие УФ-индуцированной катаракты на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования,

6 Определить эффективность применения различных способов введения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина)

Научная новизна исследования

1 Разработана пролонгированная модель УФ-индуцированной катаракты, что открывает перспективы для контролирования ближайших и отдаленных результатов медикаментозного воздействия на развитие возрастной катаракты у крыс,

2 Изучены этапы формирования УФ-индуцированной катаракты в различных слоях хрусталика в эксперименте на крысах,

3 Впервые в условиях m vivo произведено исследование действия комбинации препаратов нового класса (N-ацетил карнозина и D-пантетина) - шаперон-подобных соединений на модели УФ-индуцированной катаракты и доказана антикатарактальная эффективность комбинации препаратов, как препаратов нового поколения,

4 Впервые, на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования определен наиболее эффективный способ введения комбинации препаратов, содержащей N-ацетил карнозин и D-пантетин

Полученные данные в эксперименте на крысах, касающиеся антикатарактальной эффективности комбинации N-ацетил карнозина и D-пантетина при УФ-индуцированной катаракте, дают теоретическое обоснование для клинического изучения антикатарактальных свойств комбинации этих препаратов при возрастной катаракте

Практическая значимость работы

1 Доказана возможность клинического изучения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина),

2 Представленные в работе данные об антикатарактальном действии комбинации препаратов обосновывают перспективность поиска эффективных комбинаций аналогов этих соединений, обладающих более выраженной шаперон-подобной антикатарактальной активностью

Основные положения, выносимые на защиту

1 Клинико-морфологическая картина, установленная на модели УФ-индуцированной катаракты, достоверно отражает степень патологических нарушений, происходящих в хрусталике, и может использоваться для контроля эффективности медикаментозной терапии возрастной катаракты,

2 Длительное введение смеси ди- и тетрапептидов в экспериментально-терапевтических дозах (по 25, 150 мг/кг внутрибрюшинно и 5 % раствора инстилляционно каждого из пептидов) оказывает тормозящее действие на развитие УФ-индуцированной катаракты,

3 Наиболее выраженный антикатарактальный эффект комбинации препаратов по результатам клинико-морфологических и биохимических методов исследования выявлен при инсталляционном пути введения,

4 Комбинация пептидных препаратов в виде инсталляций и внутрибрюшшшых инъекций оказывает выраженное протекторное действие на роговицу

Внедрение результатов работы в практику

На базе ГУ НИИ глазных болезней РАМН продолжаются исследования

комбинации пептидных препаратов с целью внедрения ее в клиническую

практику

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены

• на Конференции молодых ученых (Клинические и экспериментальные исследования в офтальмологии) - М, 2005,

• на II Всероссийской научной конференции молодых ученых (Актуальные проблемы офтальмологии) - М, 2007,

• на Юбилейной научно-практической конференции (Федоровские чтения) - М, 2007,

• на Научно-практической конференции (Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры) - М, 2007 Результаты работы доложены на заседании проблемной комиссии

«Терапевтической офтальмологии и офтальмофармакологии» ГУ НИИ ГБ РАМН от 21 марта 2008 г

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, среди них в центральной рецензируемой печати - 5 статей, подано 2 заявки на выдачу патентов на изобретения получено положительное решение по заявке № 2007118210 от 16 05 2007, приоритетная справка № 2007144339 от 3 12 2007

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы

Работа иллюстрирована 6 таблицами и 34 рисунками Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 70 отечественных и 147 зарубежных авторов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Общая характеристика материала исследования.

Эксперимент проведен на 33 крысах самцах вида Wistar (66 глаз) в возрасте от 20 до 23 дней с массой тела 39-41 гр Срок наблюдения составил 10 месяцев (43 недели) К концу исследования масса тела животных достигала 400-450 г

Экспериментальные животные находились в стандартных условиях содержания в виварии ММА им Сеченова на типовых рационах летнего и зимнего периода для лабораторных крыс Животных выводили из эксперимента через 10 месяцев методом передозировки хлороформного наркоза согласно «Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Visual Research» (www arvo org)

В работе применяли растворы D-пантетина (C22H42N4O8S2, мол масса (FW) - 554,72), производитель «Sigma-Aldnch» (USA) и растворы N-ацетил карнозина (ChHi6N404, FW - 268), полученного путем ацетилирования L-карнозина (C9H14N4O3, FW - 226) с замещением р-аланила на остаток 2,3-диаминопропионовой кислоты, любезно предоставленный С Л Стволинским (ГУ Научный центр неврологии РАМН), рН растворов - 7,0

Все животные были разделены случайным образом на 5 групп (Табл 1) Первую группу составили животные, которым инициировали формирование УФ-индуцированной катаракты, но не вводили комбинацию препаратов,

Вторую (контрольную) группу составили 7 крыс, которые не подвергались воздействию УФ и не получали комбинацию препаратов,

В третьей группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде инсталляций в оба глаза 5 % раствора каждого пептида,

В четвертой группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе 25 мг/кг ПТ и 25 мг/кг NAC,

В пятой группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию пептидных препаратов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе по 150 мг/кг каждого из пептидов

Таблица 1.

Распределение животных по группам в зависимости

от способа введения комбинации препаратов и УФО _

№ группы 1 2 3 4 5

количество животных/глаз 8/16 7/14 6/12 6/12 6/12

ультрафиолетовое облучение + - + + +

УФО+инстилляции 5%

раствора NAC и ПТ +

УФО+внутрибрюшинно по 25 мг/кг NAC и ПТ - - - +

УФО+внутрибрюшинно по 150 мг/кг NAC и ПТ - - - - г

Инсталляции и внутрибрюшинные инъекции проводили однократно каждый день в течение всего периода наблюдения (10 месяцев) В те дни, когда животных облучали, комбинация препаратов вводилась за 45 минут до облучения

Была разработана модель УФ-индуцированной катаракты В условиях максимального мидриаза (1% раствор атропина сульфата) животных подвергали облучению светом двух ультрафиолетовых кварцевых облучателей ОУФК-01 «Солнышко» (Х=280-400 нм) в течение 16 мин через день в течение 10 месяцев

Средняя мощность облучения на полу клетки контролировалась с помощью спектрорадиометра Аргус-04 (ВНИИОФИ, Россия) и составляла в среднем 4,7±0,23 Вт/м2

Методы исследования Методы клинических исследований в эксперименте

Субъективная клиническая оценка Биомикроскопию проводили на щелевой лампе 8Г-75 (Ор1оп. ФРГ) при угле наклона осветителя 45° и открытии диафрагмы 0,1 мм.

Оценку развития катаракты осуществляли при помощи метода экспертных оценок: три исследователя независимо друг от друга оценивали интенсивность помутнения хрусталика по цифровым фотографиям с использованием разработанной нами шести-бальной шкалы (от 0 до 5 баллов) (Рис. 1, Табл. 2).

Г -'п я ' '' Щ ши 9 ж §Ш '.1>: Н К "'•-•Л!'

^ВЁц^ '-ДЯ ; Н А - ■ (" I ' ШШтШ0Щш гШ

Рис. 1. Шкала бальной оценки помутнений хрусталика, использованная для анализа данных методом экспертных оценок. На рисунке, соответствующем 5 баллам, обозначены зоны, выделяемые для графического анализа: 1— передняя капсула, 1-2 - передние кортикальные слои, 2-3 - передние ядерные слои, 3-4 - средние ядерные слои, 4-5 - задние ядерные слои, 5-6 - задние кортикальные слои.

Таблица 2.

Критерии оценки динамики развития катаракты методом экспертных оценок

балл Описание

0 прозрачные кортикальные и ядерные структуры хрусталика

1 незначительное уплотнение под передней капсулой хрусталика, сохранение оптической прозрачности кортикальных слоев и ядра

2 слабовыраженное диффузное помутнение в ядре, появление зернистости в передних и задних кортикальных слоях, незначительное уплотнение под передней капсулой хрусталика,

3 умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре, однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика в оптическом срезе

4 более выраженное помутнение в области ядра с развитием слоистоподобного помутнения и тенденцией к слиянию, незначительное увеличение однородного помутнения в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика в оптическом срезе

5 однородное облакоподобное помутнение ядра средней степени выраженности, менее выраженное однородное помутнение в передних и задних кортикальных слоях, незначительное увеличение плотности передней капсулы хрусталика в оптическом срезе

Оценка проводилась по всему массиву фотографий слепым методом В случае расхождения оценок (два мнения против одного) — выбирали оценку большинства В случае полного расхождения принимали серединную оценку В качестве окончательной оценки повреждения глаз животного принимали сумму баллов левого и правого глаз

Объективная клиническая оценка Инструментальную оценку степени помутнения в различных слоях хрусталика осуществляли с помощью микроденситометрии цифровых изображений биомикроскопических оптических срезов хрусталиков при помощи специализированной компьютерной программы для анализа офтальмологических цифровых изображений (Макаров И А, 2003, Полунин Г С , Гуров А Н, Касимов А К, 1993)

Методы гистологического исследования

Хрусталики фиксировали в 2 % растворе глютаральдегида в течение суток Затем проводили обезвоживание ткани по батарее спиртов восходящей концентрации и заливали в эпон-аралдит Полутонкие срезы толщиной 1-1,5 мкм готовили на ультрамикротоме («ЬКВ», Швеция) Полученные срезы окрашивали полихромным красителем (метиленовый синий + фуксин) Готовые препараты исследовали методом световой микроскопии Светооптическое и морфометрическое исследование препаратов проводили на «Фотомикроскопе III» («Оргоп», Германия)

Гистологические исследования выполнены на базе патогистологической лаборатории ГУ НИИ глазных болезней РАМН*

Методы биохимических исследований в эксперименте

Выделение основных белков хрусталика проводили по модифицированной нами методике Чиоу (СЬюи 8 Н ег а1., 1979) Фракцию водорастворимых белков отделяли от водонерастворимых центрифугированием Концентрацию белка определяли по методу

Автор выражает глубокую благодарность ведущему научному сотруднику ГУ НИИ глазных болезней РАМН к м н А А Федорову за помощь в выполнении фрагмента работы и обсуждении результатов морфологического исследования

микробиурета (Дарбре А, 1989) с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина

Анализ водорастворимых белков с помощью гель-фильтрации проводили на колонке 2,5 х 90 см, гель - TSK HW-55 Fine, (Toyoperl, Япония) (Chiou S Н et al, 1979) Для количественной оценки содержания белков во фракциях использовали высоту соответствующих пиков Анализ водонерастворимых белков проводили методом хроматографии на колонке Biosep-SEC S4000 (Phenomenex, США) (Simpanya М F et al, 2005)

Полипептидный состав фракций исследовали с помощью электрофореза в 12,5 % ПААГ по методу Леммли (Laemmli UK, 1970) В случае анализа водонерастворимых белков проводили специальную отмывку от гуанидин хлорида

Биохимические исследования проводили на базе Института биохимической физики им Н М Эмануэля Российской академии наук

Методика статистического анализа

Статистический анализ результатов проводили с использованием непараметрических статистик (U-тест Манна и Уитни и R коэффициент ранговой корреляции Спирмана) В тексте на рисунках и таблицах данные

приведены в виде ¡Л ,~~х~— среднее исследуемых показателей, jn - 95% доверительный интервал

Критические значения критериев определяли при уровне значимости а=0,05 Различия рассматривали как статистически достоверные при Р<0,05

Обработка результатов исследования производили с использованием прикладного пакета статистических программ Statictica 6 0 (Statsoft, USA)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Результаты клинических исследований в эксперименте

Клиническое течение УФ-индуиированной катаракты Биомикроскопическое исследование хрусталиков (метод экспертных оценок) позволило выявить динамику формирования помутнения хрусталиков у животных исследуемых групп в ходе эксперимента и описать клиническую картину формирования УФ-индуцированной и возрастной катаракт

В облучаемой группе оптическая прозрачность кортикальных слоев и ядра хрусталика сохранялась до полутора месяцев, затем развивалось слабовыраженное диффузное помутнение в ядре и появлялась зернистость в передних и задних кортикальных слоях Далее под воздействием ультрафиолетового облучения помутнения в ядре прогрессировали быстрее, чем в коре К концу эксперимента (через 10 месяцев) в облучаемой группе наблюдали формирование средней степени выраженности однородного облакоподобного помутнения хрусталика, более интенсивного в ядерных слоях (катаракта 5 баллов), в то время как в контрольной группе хрусталик в значительно большей степени сохранял свою прозрачность (катаракта 2-3 балла) Зрелая катаракта при этом способе моделирования катаракты не формировалась (рис 2)

Скорость развития и величина помутнения хрусталика в контрольной группе была меньше, чем в облучаемой группе Через полтора месяца после начала эксперимента в контрольной группе определяли помутнения хрусталиков только в виде незначительного уплотнения наружного кортикального слоя под передней капсулой К концу эксперимента обнаруживалось лишь умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре и однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях хрусталика

Несмотря на разную скорость развития помутнения в облучаемой и контрольной группах, отмечена определенная схожесть клинической картины развития катаракты в этих группах Это может свидетельствовать о родстве механизмов катарактогенеза при УФ-индуцированной и возрастной катаракте у вида крыс \Vistar

При исследовании хрусталиков у животных облучаемой группы посредством микроденситометрии выявлено, что оптическая плотность всех слоев хрусталика у животных облучаемой группы значительно увеличивается в первые три месяца от начала облучения, после чего темпы этого прироста несколько снижаются Следует отметить, что показатель оптической плотности передней капсулы хрусталика за все время эксперимента практически не меняется, как в облучаемой, так и в контрольной группе Офтальмоскопически этот процесс проявляется в виде уплотнения капсулы Наиболее выраженное увеличение показателя оптической плотности к концу эксперимента отмечено в ядерных слоях

В передних и задних кортикальных слоях хрусталика нарастание помутнений проходило практически одинаково, но более медленными темпами, чем в ядре

В контрольной группе в течение всего периода наблюдения диагностировано небольшое равномерное увеличение показателя оптической плотности во всех слоях, что может являться свидетельством естественного процесса развития возрастных изменений хрусталика у животного этого вида

Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным метода экспертных оиенок Хрусталики животных в группах, получавших комбинацию препаратов на фоне УФО согласно данным биомикроскопического исследования (метод

экспертных оценок), также как хрусталики облучаемой и контрольной групп, до начала эксперимента были прозрачны во всех слоях

В группах животных, получавших комбинацию препаратов на фоне УФО, как в виде инсталляций, так и виде внутрибрюшинных инъекций, скорость нарастания помутнений в хрусталиках была значительно медленнее, чем в облучаемой группе (рис 2) Различие между группами облученных животных и облученных животных, получавших комбинацию препаратов, было достоверно, начиная с 82 дня эксперимента, в дальнейшем достоверность различия существенно возрастала К концу эксперимента на 313 день более выраженный антикатарактальный эффект комбинации препаратов был получен в 3-ей группе, то есть эффективность инсталляций комбинации пептидов была выше, чем внутрибрюшинных инъекций При последнем наблюдении катаракта в этой группе соответствовала 2-3 баллам В 4-ой группе в конце эксперимента катаракта оценена в 3 балла, в 5-ой группе - в 3-4 балла

> ...

i Jí —V ' '' """JL X

/f

s'k

'¿А ——•---УФ облучение + NAC и D пантетин no 150 мг

•""•" —УФ облучение + NAC и D-лантетин, капли

— -▼— — УФ облучение

.......................... Контроль

-Z -1-I-—I-J-

О 100 200 300

Облучение УФ светом, дни

Рис. 2. Влияние комбинации препаратов на развитие УФ-индуцированной катаракты у крыс (метод экспертных оценок) Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95 % доверительного интервала

Результаты применения комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты по данным микроденситометрического анализа Данные микроденситометрического анализа позволили объективизировать результаты биомикроскопического исследования

График прироста показателя оптической плотности в кортикальных слоях и ядре хрусталика в 3-ей группе (облучение и инсталляции комбинации препаратов) практически полностью повторяет кривую 2-й группы (контрольной), с вероятностью большей 95 % животные 3-ей и 2-ой групп могут быть отнесены к одной группе (рис 3) В 4-ой и 5-ой группах (облучение и введение по 25 мг/кг и по 150 мг/кг пептидов внутрибрюшинно соответственно) величины показателя оптической плотности хрусталика в динамике несколько превышали соответствующие значения в контрольной группе Различие показателя оптической плотности между группами облученных животных и облученных животных, получавших комбинацию препаратов в инсталляциях и внутрибрюшинно, было достоверным, начиная с 30 дня эксперимента

Сравнивая группы животных, получавших комбинацию препаратов различными способами, следует отметить, что, в кортикальных слоях, начиная со 104 дня, инсталляции комбинации препаратов действуют эффективнее, чем инъекции в дозе по 25 мг/кг каждого из пептидов, а на 313 день эффективнее, чем в дозе по 150 мг/кг D-пантетина и N-ацетил карнозина В ядерных слоях инсталляции комбинации препаратов действуют эффективнее, чем инъекции в дозах по 25 мг/кг и по 150 мг/кг каждого из пептидов, начиная со 104 дня Нарастание помутнений в передних и задних кортикальных слоях, а также во всех слоях ядра хрусталика проходило практически одинаково

220 -j-

200 - T

т

180- ,, ^ — 1

ш o T T ^

I 1 160" т -Uf T

II «o- T t I ............

i - /ШЙ^М

100 ■ j ЯО^х^ | X т--^ облучение

Л | у........Контроль

80- X •---Уф облучение + NAC и D-пэктегии по 150 мг

О**"**» УФ облучение +NAC и D-патегии по 25 мг

Я--УФ облучение + NAC и О-пантотии капли

60 -1-,-1-,-г-1-1-1-

0 S0 100 150 200 250 300 3»

Облучение УФ светом, дни

Рис. 3. Влияние комбинации препаратов на помутнение в средних ядерных слоях хрусталика в оптических единицах (метод микроденситометрии) Данные представлены в виде среднего значения по группе с указанием 95 % доверительного интервала (Графики, характеризующие кортикальные слои хрусталика, не приводятся в целях экономии места)

Результаты гистологического исследования в эксперименте

По данным морфологического исследования незначительное нарушение прозрачности хрусталиков в контрольной группе, по всей видимости, обусловлено пространственными и структурными изменениями хрусталиковых волокон, появлением участков межволоконного отека с локальной вакуолизацией Основные изменения были локализованы в ядре и передних субкапсулярных кортикальных слоях хрусталика

В облучаемой группе нарушение прозрачности хрусталика в результате длительного воздействия ультрафиолетового излучения мы связываем с развитием выраженных структурных нарушений, которые проявляются в виде ослабления межволоконных связей, фрагментации части волокон и межклеточного отека практически во всех отделах хрусталика

Патоморфологическая картина хрусталиков и в облучаемой, и в контрольной группе соответствовала изменениям, характерным для возрастной катаракты человека

Полученные данные морфологического исследования групп крыс, получавших комбинацию препаратов на фоне облучения, позволили установить результат воздействия комбинации пептидов, на хрусталик экспериментальных животных Так, в группе облученных крыс, получавших комбинацию препаратов в виде инсталляций, отмечена сохранность передней капсулы, кортикальных слоев хрусталика по глубине, в отличие от облученных крыс, но не получавших комбинацию препаратов Незначительный отек ядра при этом не сопровождался фрагментацией хрусталиковых волокон Однако, намного более лучшие гистологические результаты получены в группе крыс, получавших комбинацию препаратов внутрибрюшинно по 150 мг/кг каждого из пептидов, в которой полностью сохранилась вся архитектоника вещества хрусталика по всей толще и практически повторяла результаты контрольной группы

Таким образом, данные патоморфологического исследования хрусталиков крыс, получавших комбинацию препаратов в виде инсталляций или внутрибрюшинных инъекций на фоне ультрафиолетового облучения, свидетельствуют о протекторной функции комбинации препаратов на ткани хрусталика в условиях УФ-индуцированной модели катаракты у крыс Наибольшая антикатарактальная активность установлена при инъекционном способе введения пептидов в дозе по 150 мг/кг каждого из пептидов

По данным морфологического исследования у животных всех исследуемых групп животных на гистологической картине сетчатки, радужки, цилиарного тела, склеры и конъюнктивы патологических изменений выявлено не было

Основываясь на результатах гистологического исследования, мы делаем вывод о наличии у комбинации препаратов корнеопротективных

свойств Перед началом работы мы не ставили перед собой цели всесторонне исследовать влияние комбинации препаратов на роговицу, и наши выводы носят сугубо предварительный характер, требуя дополнительных экспериментальных исследований

Результаты биохимических исследований в эксперименте

Известно, что помутнение хрусталика, в особенности на начальных стадиях развития катаракты, сопровождается накоплением в клетках нерастворимых белковых агрегатов Поэтому, мы вправе были ожидать, что облучение УФО вызовет повышенное накопление в клетках хрусталика нерастворимых белковых агрегатов по сравнению с контролем, а применение комбинации NAC и ПТ снизит количество таких агрегатов При этом следует подчеркнуть, что снижение количества агрегатов при действии комбинации пептидов может явиться лишь косвенным указанием на то, что молекулярный механизм действия связан с шаперон-подобной активностью комбинации препаратов В образовании водонерастворимых агрегатов в клетках хрусталика участвуют растворимые белки цитоплазмы, наружных и внутренних мембран, белки цитоскелета Поэтому было также необходимо исследовать и полипептидный состав водорастворимой и водонерастворимой фракции хрусталиков животных соответствующих экспериментальных групп с целью определения конкретных участников процесса агрегации

Исследование состава водорастворимой фракции хрусталика показало, что белковый состав по данным как гель-фильтрации, так и электрофореза в различных экспериментальных группах идентичен в пределах ошибки измерения Исследование состава водонерастворимой фракции хрусталика показало следующее

Количество водонерастворимых белков под действием УФО существенно возрастает, тогда, как применение комбинации препаратов в

любых исследованных дозах на фоне УФО снижает количество водонерастворимого белка до уровня контроля

При разделении с помощью гель-проникающей хроматографии водонерастворимых белков, растворенных в мощном детергенте -гуанидинхлориде, получено, что в образцах всех исследуемых групп животных присутствуют три основные фракции - фракция-1 (высокомолекулярная, вес > 1000 кДа), фракция-2 с молекулярным весом в пределах 100-200 кДа и фракция-3 с молекулярным весом около 40 кДа При этом пики этих фракций в значительной степени уширены, что свидетельствует о том, что каждая фракция представляет собой набор белков в достаточно широком диапазоне молекулярных масс

Сравнение хроматограмм образцов разных экспериментальных групп позволило выявить следующее Содержание белков во фракции-1 и фракции-2 в группе, получавшей УФО, увеличено, фракции-3 - уменьшено по сравнению с контрольной группой Применение комбинации препаратов снижает содержание как фракции-1, так и фракции-2 При этом молекулярный вес белков фракции-2 несколько снижается Обнаружены некоторые различия в результатах применения инсталляций и инъекций комбинации препаратов при действии инсталляций смещение молекулярного веса фракции-2 несколько выше, чем при действии инъекций Но этот эффект незначителен

Исследование полипептидного состава водонерастворимых белков методом электрофореза не выявило существенных различий между группами

Таким образом, можно сделать вывод о том, что применение комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты приводит к уменьшению количества водонерастворимых белковых агрегатов в хрусталике Это является косвенным указанием на то, что комбинация

препаратов может действовать по шаперон-подобному механизму Однако исследование молекулярного механизма требует специальных исследований

Анализ результатов проведенного комплексного исследования (клиническими, гистологическими и биохимическими методами) позволяет заключить, что испытуемая комбинация препаратов (D-пантетина и N-ацетил карнозина) обладает выраженной антикатарактальной активностью по отношению к УФ-индуцированной катаракте у крысы, приближенной к естественным условиям формирования возрастной катаракты Комбинация препаратов, действуя по новому шаперон-подобному механизму, выполняет протективную функцию при применении, как в виде инсталляций, так и в виде внутрибрюшинных инъекций Полученные данные позволяют рекомендовать разработку лекарственной формы комбинации препаратов и дальнейшее клиническое испытание

Выводы

1 Впервые разработана пролонгированная модель УФ-индуцированной катаракты у крыс, особенности клинико-морфологической картины которой сопоставимы с возрастными изменениями хрусталиков у этого вида экспериментальных животных

2 Разработана шкала бальной оценки помутнений хрусталика с помощью метода экспертных оценок, которая с высоким коэффициентом корреляции (коэффициент ранговой корреляции Спирмана R=0,74) связана с объективными методами оценки прозрачности хрусталика

3 Показано, что применение комбинации пептидных препаратов (N-ацетил-карнозина и D-пантетина) в соотношении 1 1 в виде инсталляций в глаза и внутрибрюшинных инъекций позволяет существенно и с высокой степенью достоверности (Р < 0,0001, U-тест Манна и Уитни) замедлить процессы формирования УФ-индуцированной катаракты in vivo

4 Установлено, что комбинация препаратов (И-ацетил-карнозина и Б-пантетина), примененная в инсталляциях оказывает более эффективное антикатарактальное действие, чем внутрибрюшинные инъекции (степень достоверности Р < 0,003, и-тест Манна и Уитни)

5 Применение комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты приводит к уменьшению количества водонерастворимых белковых агрегатов в хрусталике

6 Гистологические исследования показали, что длительное ультрафиолетовое облучение (длина волны УФ 280-400 нм, мощность облучения 4,7±0,23 Вт/м2) вызывает дегенеративные изменения всех слоев роговицы, но не оказывает отрицательного воздействия на другие структуры переднего и заднего отрезка глаза крыс вида АУ^аг, кроме хрусталика

7 Установлено, что комбинация пептидных препаратов в виде инсталляций в глаз и внутрибрюшинных инъекций оказывает выраженное протекторное действие, препятствуя отрицательному воздействию ультрафиолетового облучения на все слои роговицы

8 Показано, что комбинация препаратов (р-пантетина и Ы-ацетил-карнозина) обладает выраженной антакатарактальной активностью в эксперименте и может быть рекомендована для клинической апробации

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Денситометрический анализ прозрачности хрусталика в эксперименте на модели ультрафиолетовой катаракты / Карпова О.Е // Клинические и экспериментальные исследования в офтальмологии Материалы конференции молодых ученых - М,

2005 -С 30-32

2 Возможности консервативного лечения возрастной катаракты / Шеремет Н Л, Карпова О.Е // Новые лекарственные препараты - 2005 - № 10 - С 3-11

3 Катаракта / Полунин Г С, Шеремет Н Л , Карпова О Е // Медицинская газета -

2006 -№23 -С 8-9

4 Экспериментальная модель ультрафиолетовой катаракты / Карпова O.E., Шеремет Н Л, Полунин ГС// Актуальные проблемы офтальмологии I Всерос науч конф молодых ученых Сб науч работ -М,2006 -С 111-113

5 Разработка методов количественной оценки помутнения хрусталика при катаракте, индуцированной облучением УФ светом и радиацией / Муратов К О, Карпова О.Е , Логинова М Ю , Шеремет Н Л , Полунин Г С , Островский М А // Конференция РАН Фундаментальные науки - медицине Тез док - М, 2006 - С 146-147

6 Изучение антикатарактальной активности смеси пептидов в эксперименте in vivo // Карпова O.E., Полунин Г С, Шеремет Н Л , Макаров И А, Тимофеева А К // Актуальные проблемы офтальмологии II Всерос науч конф молодых ученых Сб науч работ - М, 2007 - С 66-68

7 Этиопатогенез и медикаментозное лечение возрастной катаракты / Полунин Г С , Шеремет Н Л, Карпова O.E. // Вестник офтальмологии -2007, №4 - С 48-51

8 Экспериментальное изучение протекторных свойств комбинированного пептидного препарата на пролонгированной модели УФ-индуцированного повреждения роговицы / Шеремет Н Л, Полунин Г С , Федоров А А, Карпова O.E., Муранов КО // Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры Научно-практическая конференция Сб науч работ - М, 2007 - Т 1 - С 371-375

9 Поиск шаперон-подобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза Сообщение первое Шаперон-подобное действие дипептида N-ацетил карнозина исследование m vitro на модели УФ-индуцированной агрегации ßL-кристаллина / Муранов К О , Тимофеева А К, Болдырев А А , Карпова О Е, Шеремет Н Л, Полунин Г С , Аветисов С Э , Островский М А // Вестник офтальмологии - 2008 - Т 124, № 2 - С 3-6

10 Поиск шапероноподобных антикатарактальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза Сообщение второе Исследование влияния шапероноподобной (защитной) активности короткоцепочечных пептидов на скорость УФ-индуцированной эксимерным лазером агрегации бета-кристаллина / Соустов Л В , Челноков Е В , Сапогова Н В , Битюрин Н М , Немов В В , Карпова O.E., Шеремет Н Л, Полунин Г С, Аветисов С Э , Островский М А // Вестник офтальмологии -2008 -Т 124, №2 - С 6-8

11 Поиск шаперон-подобных антикатаракгальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза Сообщение третье Возможности динамического наблюдения за процессами катарактогенеза на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс / Аветисов С Э , Полунин Г С, Шеремет Н Л , Муратов К О , Макаров И А , Федоров А А , Карпова О.Е , Островский М А //Вестник офтальмологии -2008 -Т 124, №2 -С 8-12

12 Поиск шаперон-подобных антикатаракгальных препаратов-антиагрегантов кристаллинов хрусталика глаза Сообщение четвертое Изучение воздействия смеси ди- и тетра-пептидов на «пролонгированной» модели ультрафиолет-индуцированной катаракты у крыс / Аветисов С Э, Полунин Г С , Шеремет Н Л, Макаров И А, Федоров А А, Карпова О Е., Муранов К О , Тимофеева А К, Соустов Л В , Челноков Б В , Битюрин Н М, Сапогова Н В , Немов В В , Болдырев А А , ОстровскийМ А //Вестникофтальмологии -2008 -Т 124, №2 - С 12-16

Заявки на изобретения

1 Способ моделирования катаракты / Аветисов С Э , Полунин Г С, Шеремет Н Л, Макаров И А, Федоров А А, Карпова O.E. // положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007118210 от 16 05 2007,

2 Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты) / Соустов Л В, Челноков Е В , Битюрин Н М, Немов В В, Аветисов С Э, Полунин Г С, Шеремет Н Л, Карпова O.E., Муранов К О, Островский М А // приоритетная справка № 2007144339 от 3 12 2007

Список сокращений

АО антиоксидант

ПААГ полиакриламидный гель УФ ультрафиолетовое излучение

УФО ультрафиолетовое облучение

Заказ № 206/03/08 Подписано в печать 31 03 2008 Тираж 100 экз Уел п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www cfr ru, e-mail info@cjr ru

В структуре слепоты и слабовидения возрастная катаракта занимает одно из ведущих мест в мире [26, 27, 63, 140]. В то же время, возрастная катаракта приобретает все большее социальное значение благодаря отмечаемым в последние годы сдвигам дермографических показателей в сторону постарения населения.

В настоящее время нет эффективного медикаментозного лечения возрастной катаракты, поэтому основными способами лечения являются хирургические вмешательства [63]. В России ежегодно выполняется 180 тыс. операций по поводу катаракты, но это охватывает лишь десятую часть от общего количества больных [35]. В то же время, хирургическое лечение не является патогенетически обоснованным, в отличие от медикаментозного. Несомненно, что знание этапов патогенеза развития возрастной катаракты явилось бы основой для эффективной медикаментозной терапии. Однако патофизиологические процессы начала этого заболевания еще далеко не полностью установлены. Поэтому в исследовании этиологии катаракты уже многие годы заняты не только представители медицинской науки, но и исследователи в области молекулярной биологии, биохимии и биофизики [24]. Существенным достижением является сформулированная в последние годы свободнорадикальная теории катарактогенеза. Подтверждением ее справедливости является факт того, что в офтальмологической практике применяют препараты, обладающие антиоксидантными (АО) свойствами [6, 29, 50, 116, 153, 187, 215]. В то же время, катаракта - это многофакторное и многостадийное заболевание, поэтому существует возможность воздействия и на другие этапы процесса катарактогенеза. Например, на стадию образования водонерастворимых белковых агрегатов, образование которых признано одной из ключевых стадий процесса развития катракты [47, 72, 120, 129, 158].

Действительно оказалось, что усиление шаперон-подобных свойств а-кристаллина, то есть его способности предупреждать агрегацию поврежденных белков, лежит в основе механизма антикатарактального действия тетрапептида D-пантетина. Как известно, это соединение эффективно тормозит развитие экспериментальных катаракт (радиационной, селенитовой, галактозной, стрептозотоциновой и др.) [101, 119].

Последние исследования показали, что N-ацетил карнозин, обладающий антикатарактальным действием [82], способен тормозить ультрафиолет-индуцированную агрегацию (Зь-кристаллина in vitro как молекулярный шаперон [40]. Более того, смесь этих пептидов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) in vitro более эффективно тормозит процесс агрегации кристаллинов под воздействием ультрафиолетового излучения (УФ), чем каждый из них в отдельности [59, 186].

Полученные результаты дали основания для разработки новой комбинации антикатарактальных препаратов, действующей по шаперон-подобному механизму.

Условия формирования помутнений хрусталиков in vitro полностью не могут повторить условия развития катаракты в живом организме, поэтому, чтобы дать окончательный ответ об эффективности предложенной комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина), необходимо изучение ее антикатарактальных свойств in vivo.

Для постановки такого эксперимента необходима легко воспроизводимая и адекватная модель возрастной катаракты. По данным литературы, катаракта, индуцированная низкими дозами ультрафиолетового облучения (УФО) приближена к возрастной. Действительно, под влиянием УФ и видимого света в хрусталике происходят процессы фотоокисления и агрегации водорастворимых белков, что является одним из основных этапов патогенеза возрастной катаракты [80, 120, 129, 130, 149].

Таким образом, актуальность изучения воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте несомненна.

Целью работы является изучение воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте на крысах.

Задачи исследования

1. Разработать легко воспроизводимую пролонгированную экспериментальную модель УФ-индуцированной катаракты;

2. Разработать шкалу субъективной оценки степени прозрачности хрусталика крысы вида Wistar для этой модели;

3. Изучить особенности клинической картины УФ-индуцированной катаракты на разных этапах ее формирования;

4. Изучить влияние УФ на передний и задний отрезок глаза;

5. Исследовать эффективность применения различных доз комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на развитие УФ-индуцированной катаракты на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования;

6. Определить эффективность применения различных способов введения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина).

Научная новизна работы

1. Разработана пролонгированная модель УФ-индуцированной катаракты, что открывает перспективы для контролирования ближайших и отдаленных результатов медикаментозного воздействия на развитие возрастной катаракты у крыс (положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 2007118210 от 16.05.2007 «Способ моделирования катаракты»);

2. Изучены этапы формирования УФ-индуцированной катаракты в различных слоях хрусталика в эксперименте на крысах;

-93. Впервые в условиях in vivo произведено исследование действия комбинации препаратов нового класса (N-ацетил карнозина и D-пантетина) - шаперон-подобных соединений на модели УФ-индуцированной катаракты и доказана антикатарактальная эффективность комбинации препаратов, как препаратов нового поколения (заявка на выдачу патента на изобретение «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты)» № 2007144339 от 3.12.2007); 4. Впервые, на основе клинико-морфологических и биохимических методов исследования определен наиболее эффективный способ введения комбинации препаратов, содержащей N-ацетил карнозин и D-пантетин.

Полученные данные в эксперименте на крысах, касающиеся антикатарактальной эффективности комбинации N-ацетил карнозина и D-пантетина при УФ-индуцированной катаракте, дают теоретическое обоснование для клинического изучения антикатарактальных свойств комбинации этих препаратов при возрастной катаракте.

Практическая значимость работы

1. Доказана возможность клинического изучения комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина);

2. Представленные в работе данные об антикатарактальном действии комбинации препаратов обосновывают перспективность поиска эффективных комбинаций аналогов этих соединений, обладающих более выраженной шаперон-подобной антикатарактальной активностью.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Клинико-морфологическая картина, установленная на модели УФ-индуцированной катаракты, достоверно отражает степень патологических нарушений, происходящих в хрусталике, и может использоваться для контроля эффективности медикаментозной терапии возрастной катаракты;

-102. Длительное введение смеси ди- и тетрапептидов в экспериментально-терапевтических дозах (по 25, 150 мг/кг внутрибрюшинно и 5 % раствора инстилляционно каждого из пептидов) оказывает тормозящее действие на развитие УФ-индуцированной катаракты;

3. Наиболее выраженный антикатарактальный эффект комбинации препаратов по результатам клинико-морфологических и биохимических методов исследования выявлен при инсталляционном пути введения;

4. Комбинация пептидных препаратов в виде инсталляций и внутрибрюшинных инъекций оказывает выраженное протекторное действие на роговицу.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на Конференции молодых ученых (Клинические и экспериментальные исследования в офтальмологии) — М., 2005, где доклад получил призовое место; на II Всероссийской научной конференции молодых ученых (Актуальные проблемы офтальмологии) — М., 2007, где доклад был отмечен первой премией; на Юбилейной научно-практической' конференции (Федоровские чтения) - М., 2007; на Научно-практической конференции (Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры) - М., 2007.

Апробация диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии «Терапевтическая офтальмология и офтальмофармакология» ГУ НИИ глазных болезней РАМН (Протокол № 3/1 от 21 марта 2008 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в центральной печати. Подано 2 заявки на выдачу патентов на изобретения: положительное решение о выдаче патента по заявке № 2007118210 от 16.05.2007 «Способ моделирования катаракты»; приоритетная справка № 2007144339 от 3.12.2007 «Фармацевтическая композиция для профилактики развития и лечения начальной стадии возрастной катаракты (варианты).

-11

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы.

выводы

1. Впервые разработана пролонгированная модель УФ-индуцированной катаракты у крыс, особенности клинико-морфологической картины которой сопоставимы с возрастными изменениями хрусталиков у этого вида экспериментальных животных.

2. Разработана шкала бальной оценки помутнений хрусталика с помощью метода экспертных оценок, которая с высоким коэффициентом корреляции (коэффициент ранговой корреляции Спирмана R=0,74) связана с объективными методами оценки прозрачности хрусталика.

3. Показано, что применение комбинации пептидных препаратов (N-ацетил-карнозина и D-пантетина) в соотношении 1:1 в виде инстилляций в глаза и внутрибрюшинных инъекций позволяет существенно и с высокой степенью достоверности (Р < 0,0001, U-тест Манна и Уитни) замедлить процессы формирования УФ-индуцированной катаракты in vivo.

4. Установлено, что комбинация препаратов (N-ацетил-карнозина и D-пантетина), примененная в инсталляциях оказывает более эффективное антикатарактальное действие, чем внутрибрюшинные инъекции (степень достоверности Р < 0,003, U-тест Манна и Уитни).

5. Применение комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты приводит к уменьшению количества водонерастворимых белковых агрегатов в хрусталике.

6. Гистологические исследования показали, что длительное ультрафиолетовое облучение (длина волны УФ 280-400 нм, мощность облучения 4,7±0,23 Вт/м~) вызывает дегенеративные изменения всех слоев роговицы, но не оказывает отрицательного воздействия на другие структуры переднего и заднего отрезка глаза крыс вида Wistar, кроме хрусталика.

-997. Установлено, что комбинация пептидных препаратов в виде инстилляций в глаз и внутрибрюшинных инъекций оказывает выраженное протекторное действие, препятствуя отрицательному воздействию ультрафиолетового облучения на все слои роговицы. 8. Показано, что комбинация препаратов (D-пантетина и N-ацетил-карнозина) обладает выраженной антикатарактальной активностью в эксперименте и может быть рекомендована для клинической апробации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Катаракта является наиболее частой причиной слепоты у лиц старшего возраста. Изучение особенностей патогенеза развития возрастной катаракты является основой для разработки эффективных методов лечения этого заболевания. В настоящее время патофизиологические механизмы возникновения возрастной катаракты изучены недостаточно, однако роль усиления процессов свободнорадикального окисления неоспорима. Косвенным указанием на важную роль СРО является тот факт, что в офтальмологической практике в основном используются препараты, обладающие антиоксидантными свойствами.

Результаты многочисленных исследований, проведенных в последнее десятилетие, свидетельствуют о возможности оказания терапевтического воздействия на другие этапы катарактогенеза, в частности, замедлить процесс агрегации водорастворимых белков хрусталика. Как известно, неспецифическая агрегация белков цитоплазмы клеток хрусталика — ключевая стадия процесса помутнения хрусталика.

Усиление шаперон-подобных свойств а-кристаллина, то есть способности этого белка предупреждать агрегацию поврежденных белковых молекул, лежит в основе механизма антикатарактального действия пептида D-пантетина. Пептид N-ацетил карнозин, в отличие от D-пантетина, непосредственно сам обладает шаперон-подобными свойствами и способен защищать хрусталик от помутнения. При этом было доказано in vitro, что смесь этих пептидов (N-ацетил карнозин и D-пантетин) более эффективно тормозит процесс агрегации кристаллинов под воздействием ультрафиолетового облучения, чем каждый из них в отдельности. Такое усиление антиагрегаторных свойств смеси препаратов, вероятно, результат того, что N-ацетил карнозин и D-пантетин влияют на процесс агрегации белков посредством разных молекулярных механизмов.

Процесс агрегации кристаллинов in vitro при действии ультрафиолетового излучения отражает лишь одну, хотя и ключевую стадию возникновения помутнения хрусталика. Поэтому, для проверки гипотезы о том, что смесь пептидов, обладающих шаперон-подобной активностью, может эффективно тормозить процесс агрегации кристаллинов, необходимо изучение его антикатарактальных протекторных свойств в условиях in vivo.

Для изучения механизмов действия антикатарактальных препаратов требуется легко воспроизводимая и адекватная модель возрастной катаракты. Ультрафиолетовое излучение В-спектра (280-315 нм) индуцирует процессы фотоокисления и агрегации водорастворимых белков хрусталика с образованием водонерастворимых белковых комплексов.

Окисление и агрегация кристаллинов является одним из основных этапов патогенеза возрастной катаракты. Другие виды экспериментальных возрастных катаракт (крысы линии OXIS, мыши линии Эймори и т.д.) сопряжены с различными нарушениями на генетическом уровне и не являются оптимальными для нашего исследования.

Целью работы явилось изучение воздействия комбинации препаратов (N-ацетил карнозина и D-пантетина) на УФ-индуцированную катаракту в эксперименте in vivo.

В процессе работы было обследовано 33 крысы самца вида Wistar (66 глаз) в возрасте от 20 до 23 дней с массой тела 39-41 гр. Срок наблюдения составил 10 месяцев (43 недели). К концу исследования масса тела животных достигала 400-450 г.

Была разработана модель УФ-индуцированной катаракты. В условиях максимального мидриаза (1% раствор атропина сульфата) животных подвергали облучению светом двух ультрафиолетовых кварцевых облучателей ОУФК-01 «Солнышко» (А=280-400 нм) в течение 16 мин через день в течение 10 месяцев. Средняя мощность облучения на полу клетки составила в диапазоне А и В ультрафиолетового излучения 4,7±0,23 Вт/м2.

Первую группу составили 8 животных, которым инициировали формирование УФ-индуцированной катаракты, но не вводили комбинацию препаратов; вторую (контрольную) группу составили 7 крыс, которые не подвергались воздействию УФ и не получали пептиды; в 3-й группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде инстилляций в оба глаза 5 % раствора каждого из пептидов; в 4-й группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе 25 мг/кг D-пантетина и 25 мг/кг N-ацетил карнозина; в 5-й группе (6 животных, 12 глаз) облучаемые животные получали комбинацию препаратов в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе по 150 мг/кг каждого из пептидов.

Инстилляции и внутрибрюшинные инъекции проводили однократно каждый день в течение всего периода наблюдения (10 месяцев). В те дни, когда животных облучали, комбинация препаратов вводилась за 45 минут до облучения.

Субъективную оценку динамики развития катаракты проводили при помощи метода экспертных оценок цифровых фотографий хрусталика с использованием собственной шести-бальной шкалы (от 0 до 5 баллов). Объективную инструментальную оценку степени помутнения хрусталика осуществляли с помощью микроденситометрии биомикроскопических оптических срезов хрусталиков при помощи специализированной компьютерной программы для анализа цифровых изображений. Необходимо отметить высокий уровень корреляции данных, полученных обоими методами — методом экспертных оценок и микроденситометрии оптических срезов.

Животных выводили из эксперимента через 10 месяцев, после чего проводили изучение изолированных хрусталиков гистологическими и биохимическими методами. Гистологическое исследование хрусталиков разных экспериментальных групп проводили на полутонких срезах. Биохимические исследования включали оценку состояния водорастворимых и водонерастворимых белков хрусталика посредством гель-проникающей хроматографии и электрофореза в ПААГ.

Биомикроскопическое исследование хрусталиков (метод экспертных оценок) позволило выявить динамику формирования помутнения хрусталиков у животных исследуемых групп в ходе эксперимента и описать клиническую картину формирования УФ-индуцированной и возрастной катаракт.

В облучаемой группе оптическая прозрачность кортикальных слоев и ядра хрусталика сохранялась до полутора месяцев, затем развивалось слабовыраженное диффузное помутнение в ядре и появлялась зернистость в передних и задних кортикальных слоях. Далее под воздействием ультрафиолетового облучения помутнения в ядре прогрессировали быстрее, чем в коре. К концу эксперимента (через 10 месяцев) в облучаемой группе наблюдали формирование средней степени выраженности однородного облакоподобного помутнения хрусталика, более интенсивного в ядерных слоях (катаракта 5 баллов), в то время как в контрольной группе хрусталик в значительно большей степени сохранял свою прозрачность (катаракта 2-3 балла). Зрелая катаракта при этом способе моделирования катаракты не формировалась.

Скорость развития и величина помутнения хрусталика в контрольной группе была меньше, чем в облучаемой группе. Через полтора месяца после начала эксперимента в контрольной группе определяли помутнения хрусталиков только в виде незначительного уплотнения наружного кортикального слоя под передней капсулой. К концу эксперимента обнаруживалось лишь умеренно выраженное диффузное помутнение в ядре и однородное слабовыраженное помутнение в передних и задних кортикальных слоях хрусталика.

Несмотря на разную скорость развития помутнения в облучаемой и контрольной группах, отмечена определенная схожесть клинической картины развития катаракты в этих группах. Это может свидетельствовать о родстве механизмов катарактогенеза при УФ-индуцированной и возрастной катаракте у вида крыс Wistar.

При исследовании хрусталиков у животных облучаемой группы посредством микроденситометрии выявлено, что оптическая плотность всех слоев хрусталика у животных облучаемой группы значительно увеличивается в первые три месяца от начала облучения, после чего темпы этого прироста несколько снижаются. Следует отметить, что показатель оптической плотности передней капсулы хрусталика за все время эксперимента практически не меняется, как в облучаемой, так и в контрольной группе. Офтальмоскопически этот процесс проявляется в виде уплотнения капсулы. Наиболее выраженное увеличение показателя оптической плотности к концу эксперимента отмечено в ядерных слоях.

В передних и задних кортикальных слоях хрусталика нарастание помутнений проходило практически одинаково, но более медленными темпами, чем в ядре.

В контрольной группе в течение всего периода наблюдения диагностировано небольшое равномерное увеличение показателя оптической плотности во всех слоях, что может являться свидетельством естественного процесса развития возрастных изменений хрусталика у животного этого вида.

В группах животных, получавших комбинацию препаратов на фоне УФО, как в виде инстилляций, так и виде внутрибрюшинных инъекций, скорость нарастания помутнений в хрусталиках была значительно медленнее, чем в облучаемой группе. Различие между группами облученных животных и облученных животных, получавших комбинацию препаратов, было достоверно, начиная с 82 дня эксперимента, в дальнейшем достоверность различия существенно возрастала. К концу эксперимента на 313 день более выраженный антикатарактальный эффект комбинации препаратов был получен в 3-ей группе, то есть эффективность инстилляций пептидов была выше, чем внутрибрюшинных инъекций.

График прироста показателя оптической плотности в кортикальных слоях и ядре хрусталика в 3-ей группе (облучение и инсталляции комбинации препаратов) практически полностью повторяет кривую 2-й группы (контрольной), с вероятностью большей 95 % животные 3-ей и 2-ой групп могут быть отнесены к одной группе. В 4-ой и 5-ой группах (облучение и введение по 25 мг/кг и по 150 мг/кг пептидов внутрибрюшинно соответственно) величины показателя оптической плотности хрусталика в динамике несколько превышали соответствующие значения в контрольной группе. Различие показателя оптической плотности между группами облученных животных и облученных животных, получавших комбинацию препаратов в инсталляциях и внутрибрюшинно, было достоверным, начиная с 30 дня эксперимента.

Сравнивая группы животных, получавших комбинацию препаратов различными способами, следует отметить, что, в кортикальных слоях, начиная со 104 дня, инсталляции комбинации препаратов действуют эффективнее, чем инъекции в дозе по 25 мг/кг каждого из пептидов, а на 313 день эффективнее, чем в дозе по 150 мг/кг D-пантетина и N-ацетил карнозина. В ядерных слоях инстилляции комбинации препаратов действуют эффективнее, чем инъекции в дозах по 25 мг/кг и по 150 мг/кг каждого из пептидов, начиная со 104 дня. Нарастание помутнений в передних и задних кортикальных слоях, а также во всех слоях ядра хрусталика проходило практически одинаково.

По данным морфологического исследования незначительное нарушение прозрачности хрусталиков в контрольной группе, по всей видимости, обусловлено пространственными и структурными изменениями хрусталиковых волокон, появлением участков межволоконного отека с локальной вакуолизацией. Основные изменения были локализованы в ядре и передних субкапсулярных кортикальных слоях хрусталика.

В облучаемой группе нарушение прозрачности хрусталика в результате длительного воздействия ультрафиолетового излучения мы связываем с развитием выраженных структурных нарушений, которые проявляются в виде ослабления межволоконных связей, фрагментации части волокон и межклеточного отека практически во всех отделах хрусталика.

Патоморфологическая картина хрусталиков и в облучаемой, и в контрольной группе соответствовала изменениям, характерным для возрастной катаракты человека.

Полученные данные морфологического исследования групп крыс, получавших комбинацию пептидных препаратов на фоне облучения, позволили установить результат воздействия комбинации препаратов на хрусталик экспериментальных животных. Так, в группе облученных крыс, получавших комбинацию препаратов в виде инстилляций, отмечена сохранность передней капсулы, кортикальных слоев хрусталика по глубине, в отличие от облученных крыс, но не получавших пептидные препараты. Незначительный отек ядра при этом не сопровождался фрагментацией хрусталиковых волокон. Однако, намного более лучшие гистологические результаты получены в группе крыс, получавших комбинацию препаратов внутрибрюшинно по 150 мг/кг каждого из пептидов, в которой полностью сохранилась вся архитектоника вещества хрусталика по всей толще и практически повторяла результаты контрольной группы.

Таким образом, данные патоморфологического исследования хрусталиков крыс, получавших комбинацию препаратов в виде инстилляций или внутрибрюшинных инъекций на фоне ультрафиолетового облучения, свидетельствуют о протекторной функции комбинации препаратов на ткани хрусталика в условиях УФ-индуцированной модели катаракты у крыс. Наибольшая антикатарактальная активность установлена при инъекционном способе введения пептидов в дозе по 150 мг/кг каждого из пептидов.

По данным морфологического исследования у животных всех исследуемых групп животных в сетчатке, радужке, цилиарном теле, склере и конъюнктивы патологических изменений выявлено не было.

Основываясь на результатах гистологического исследования, мы делаем вывод о наличии у комбинации препаратов корнеопротективных свойств. Перед началом работы мы не ставили перед собой цели всесторонне исследовать влияние комбинации препаратов на роговицу, и наши выводы носят сугубо предварительный характер, требуя дополнительных экспериментальных исследований.

Известно, что помутнение хрусталика, в особенности на начальных стадиях развития катаракты, сопровождается накоплением в клетках нерастворимых белковых агрегатов. Поэтому, мы вправе были ожидать, что облучение УФО вызовет повышенное накопление в клетках хрусталика нерастворимых белковых агрегатов по сравнению с контролем, а применение комбинации препаратов NAC и ПТ снизит количество таких агрегатов. При этом следует подчеркнуть, что снижение количества агрегатов при действии комбинации NAC и ПТ может явиться лишь косвенным указанием на то, что молекулярный механизм действия связан с шаперон-подобной активностью комбинации препаратов. В образовании водонерастворимых агрегатов в клетках хрусталика участвуют растворимые белки цитоплазмы, наружных и внутренних мембран, белки цитоскелета. Поэтому было также необходимо исследовать и полипептидный состав водорастворимой и водонерастворимой фракции хрусталиков животных соответствующих экспериментальных групп с целью определения конкретных участников процесса агрегации.

Исследование состава водорастворимой фракции хрусталика показало, что белковый состав по данным как гель-фильтрации, так и электрофореза в различных экспериментальных группах идентичен в пределах ошибки измерения. Исследование состава водонерастворимой фракции хрусталика показало следующее.

Количество водонерастворимых белков под действием УФО существенно возрастает, тогда, как применение комбинации препаратов в любых исследованных дозах на фоне УФО снижает количество водонерастворимого белка до уровня контрольной группы.

При разделении с помощью гель-проникающей хроматографии водонерастворимых белков, растворенных в мощном детергенте -гуанидинхлориде, получено, что в образцах всех исследуемых групп животных присутствуют три основные фракции - фракция-1 (высокомолекулярная фракция, вес > 1 ООО кДа), фракция-2 с молекулярным весом в пределах 100-200 кДа и фракция-3 с молекулярным весом около 40 кДа. При этом пики этих фракций в значительной степени уширены, что свидетельствует о том, что каждая фракция представляет собой набор белков в достаточно широком диапазоне молекулярных масс.

Сравнение хроматограмм образцов разных экспериментальных групп позволило выявить следующее. Содержание белков во фракции-1 и фракции-2 в группе облученных крыс увеличено, а во фракции-3 -уменьшено по сравнению с контрольной группой. Применение комбинации препаратов снижает содержание как фракции-1, так и фракции-2. При этом молекулярный вес белков фракции-2 несколько снижается. Обнаружены некоторые различия в результатах применения инстилляций и инъекций комбинации препаратов: при действии инстилляций смещение молекулярного веса фракции-2 несколько выше, чем при действии инъекций. Но этот эффект незначителен.

Исследование полипептидного состава водонерастворимых белков методом электрофореза не выявило существенных различий между группами.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что применение комбинации препаратов на модели УФ-индуцированной катаракты приводит к уменьшению количества водонерастворимых белковых агрегатов в хрусталике. Это является косвенным указанием на то, что комбинация пептидных препаратов может действовать по шаперон-подобному механизму. Однако исследование молекулярного механизма требует специальных исследований.

Анализ результатов проведенного комплексного исследования (клиническими, гистологическими и биохимическими методами) позволяет заключить, что испытуемая комбинация препаратов (D-пантетина и N-ацетил карнозина) обладает выраженной антикатарактальной активностью по отношению к УФ-индуцированной катаракте у крысы, приближенной к естественным условиям формирования возрастной катаракты. Комбинация препаратов, действуя по новому шаперон-подобному механизму, выполняет протективную функцию при применении, как в виде инсталляций, так и в виде внутрибрюшинных инъекций. Полученные данные позволяют рекомендовать разработку лекарственной формы комбинации препаратов и дальнейшее клиническое испытание.