Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Изучение влияния тиоктовой кислоты на течение адъювантного артрита

На правах рукописи

ИМАНАЕВА АЛЬФИЯ ЯХЪЯЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ТИОКТОВОИ КИСЛОТЫ НА ТЕЧЕНИЕ АДЪЮВАНТНОГО АРТРИТА

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 О МАЙ 2013

005060358

Казань-2013

005060358

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Залялютдинова Луиза Наильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фундаментальной и клинической фармакологии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Минобрнауки России Зиганшина Лилия Евгеньевна

доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая

академия» Минздрава России Юшкова Татьяна Александровна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится_июня 2013 г. в _часов на заседании

диссертационного совета Д208.034.03 при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России по адресу 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России по адресу 420012, Казань, Бутлерова, 49Б

Автореферат разослан «20» мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских науг

доцент

Хасанова Гулынат Рашатовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ревматоидный артрит (РА) - аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся развитием хронического эрозивного артрита, синовита и системным воспалительным поражением внутренних органов (Лила A.M., 2006; Calder P.C., 2008; Kahlenberg J.M. et al., 2011). Значительный прогресс в лечении PA был достигнут благодаря внедрению современных флоголитических препаратов. Однако их высокая эффективность нередко сопровождается развитием нежелательных побочных эффектов, в частности, гастротоксичности, острой почечной или печеночной недостаточности и др. (Лила A.M., 2006; Kahlenberg J.M. et al., 2011; Roux C.H. et al., 2006). В связи с этим актуальным представляется поиск новых высокоэффективных, малотоксичных при длительном применении и доступных для населения противовоспалительных препаратов.

Одним из основных патобиохимических процессов, выступающих в роли триггера в дебюте РА и отвечающих за поддержание патологического процесса, является образование свободных радикалов, запускающих воспалительные реакции в суставах и в целом организме при генерализации процесса (Canter Р.Н. et al., 2007; Harman D. 2006). Поэтому одним из перспективных источников новых антиревматоидных антифлогистиков являются препараты, обладающие антиоксидантными свойствами. В экспериментальных исследованиях на культурах клеток, на моделированном артрите или в клинике у пациентов с РА показана эффективность витаминов А, С, Е; селена, фуллерена С60 и др. (Rosenbaum С.С. et al., 2010; Canter Р.Н. et al., 2007). Однако, несмотря на значительно меньший риск развития побочных эффектов при применении антиоксидантов по сравнению с применением нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), они, как правило, уступают НПВС по силе противовоспалительного действия (Peretz A. et al., 1992; Canter Р.Н. et al., 2007; Edmonds S.E. et al., 1997). Кроме

того, в систематическом обзоре 20 рандомизированных клинических исследований, посвященных изучению влияния витаминов А, С, Е и селена на течение ревматоидного артрита и остеоартроза, только витамин Е был признан перспективным для дальнейших исследований с более активным применением плацебо-контроля (Canter Р.Н. et al., 2007)

Ранее нами было показано, что тиоктовая кислота, обладающая антиоксидантными свойствами, проявляет противовоспалительную активность, сопоставимую с эталонными НПВС, при пероральном и местном применении (Залялютдинова JI.H. и др., 2004; Зверев P.P. и др., 2007). Она применяется в комплексной терапии патологий печени, диабетической полинейропатии и некоторых других заболеваний. В систематических обзорах Кокрейновской базы данных эффективность тиоктовой кислоты в лечении патологий не доказана и говорится о необходимости дальнейших исследований в этой области (Klugman A. Et al., 2008; Mirza N., 2009; Pfeffer G. Et al., 2012). При ревматоидном артрите действие тиоктовой кислоты не изучалось, что делает настоящее исследование актуальным.

Цель работы. Оценка влияния тиоктовой кислоты при пероральном и местном применении на течение адъювантного артрита (АА) крыс. Задачи исследования.

1. Изучить зависимость противовоспалительного действия тиоктовой кислоты от дозы на модели адъювантного артрита крыс.

2. Оценить влияние тиоктовой кислоты при пероральном и местном применении на выраженность адъювант-индуцированного отека и гипертермии лап крыс и на патоморфологические изменения в них.

3. Изучить влияние тиоктовой кислоты на состав периферической крови, сывороточную концентрацию С-реактивного белка, фактора некроза опухоли (ФНО)-альфа, интерлейкина (Ил) -1 бета и Ил-6 при адъювантном артрите.

4. Оценить эффективность комбинированного перорального применения тиоктовой кислоты с диклофенаком натрия на модели адъювантного артрита крыс.

Научная новизна работы. В представленной работе впервые доказана противовоспалительная активность тиоктовой кислоты при АА. Выявлена способность тиоктовой кислоты при пероральном и местном применении в виде геля уменьшать объем суставов, их температуру и улучшать их патоморфологическую структуру при АА. Доказано, что курсовое пероральное применение тиоктовой кислоты приводит к уменьшению лейкоцитоза, СОЭ, концентрации С-реактивного белка и ключевых провоспалительных цитокинов, в частности, ФНО-альфа, Ил-1 бета и Ил-6 у крыс с АА. Впервые установлена возможность комбинированного перорального применения тиоктовой кислоты с диклофенаком натрия на модели АА.

Научно-практическая значимость и внедрение результатов работы. Полученные в ходе исследований результаты являются обоснованием целесообразности клинического изучения эффективности тиоктовой кислоты у пациентов с ревматоидным артритом, в том числе в комбинации с диклофенаком натрия. По результатам исследования подана заявка на изобретение «Композиция для наружного применения, обладающая противовоспалительной, анальгетической, антиревматоидной и антибактериальной активностью и способ ее получения» (регистрационный № 2011144062 от 31.10.2011 г. (Анисимов А.Н, и др., 2011). Результаты исследований используются в учебном процессе ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России.

Положения, выносимые на защиту.

1. Тиоктовая кислота при пероральном введении, в том числе в комбинации с диклофенаком натрия, уменьшает выраженность отека и гипертермии суставов, а также гематологических и морфологических проявлений АА.

2. При местном применении 1% гель тиоктовой кислоты обладает выраженной противовоспалительной активностью на модели АА.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 81-й Всероссийской студенческой научной конференции, посвященной

150-летию В.М. Бехтерева (г. Казань, 2007 г.), Российской конференции, посвященной 75-летию И.А. Студенцовой «Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ» (г. Казань, 2008 г.), конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2010 г.), международной конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (г. Казань, 2010 г.), ежегодной научно-практической конференции «Инновации РАН» (г. Казань, 2010 г.), П международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (г. Казань, 2011 г.), 2-й международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011 г.), Ш Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в XXI веке» (г. Казань, 2011 г.), V Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (г.Троицк, 2012 г.), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012 г.).

Публикации материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе две в периодических изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации. Общий объем публикаций составляет 2,7 условных печатных листов, в том числе авторский вклад - 1,3.

Личный вклад автора. Приведенные в работе данные получены лично автором или при личном участии автора во всех этапах работы: определение цели и задач, построение плана работы, выбор методов, постановка экспериментов, статистическая обработка полученных результатов, написание публикаций по теме исследования. Выводы и положения, выносимые на защиту, сформулированы лично автором.

Достоверность полученных данных. Достоверность полученных данных подкреплена проведением достаточного объема исследований с использованием оптимального числа животных и применением адекватных

методик оценки эффективности и методов статистической обработки. Достоверность межгрупповых различий оценивалась с помощью ^критерия Стьюдента, Т-критерия Уилкоксона и и-критерия Манна-Уитни. Критерием достоверности различий явилось значение Р<0,05.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов исследования (2 глава), изложения собственных результатов (3, 4 главы), обсуждения результатов (5 глава), выводов и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 43 рисунками. Список использованных источников и литературы включает 252 источника, в том числе 49 отечественных и 203 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились: отечественная субстанция липоевой (МНН - тиоктовой) кислоты (ФСП 420035029200 и 420035029205, ОАО «Марбиофарм», Россия) и разработанный нами совместно с ОАО «Татхимфармпрепараты» на основе этой субстанции 1% гель липоевой (тиоктовой) кислоты. Субстанция диклофенака натрия, использованная в экспериментах, была произведена в НИОПИК ГНЦ (Россия), официнальный 1% гель диклофенака натрия - в ОАО «Синтез», г. Курган (регистрационный номер ЛСР-000076). Конфликт интересов отсутствует.

Протокол данного исследования был представлен на экспертизу и одобрен Локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета.

Эксперименты по исследованию противовоспалительных свойств тиоктовой кислоты при пероральном и местном применении проводили на 363 нелинейных крысах массой 200-250г с адъювантным артритом согласно методическим указаниям по изучению новых нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) (Шварц Г.Я., 2000).

Воспалительную реакцию моделировали путем субплантарного введения в правую заднюю лапу крыс 0,1мл полного адъюванта Фрейнда (ПАФ, Sigma). Исследуемые вещества (суспензия тиоктовой кислоты в диапазоне доз от 1/1000 до 1/10 средней смертельной дозы (ЛД50) (1-110 мг/кг) в крахмальной слизи, водный раствор диклофенака натрия в дозе 8мг/кг и комбинация его с тиоктовой кислотой в дозе 11мг/кг) вводили внутрижелудочно с помощью зонда ежедневно однократно с 12-го дня эксперимента в течение 14 дней. При исследовании наружных лекарственных форм препараты наносили на обе задние лапы (в количестве 0,1мл на лапу) в те же дни однократно, осторожно втирали в течение 30 секунд и покрывали защитной повязкой из пластыря с марлей. Выраженность воспалительной реакции оценивали на 0, 3, 6, 10, 15, 20,25-й дни эксперимента в динамике. В качестве критериев оценки эффективности исследуемых веществ использовали следующие методы:

1. Онкометрический метод - определение объема лап по количеству вытесненной из сосуда жидкости.

2. Инфракрасная (ИК)-термография лап при комнатной температуре с помощью компьютерного тепловизора ИРТИС-2000 С (г. Москва, сертификат об утверждении типа средств измерений №29469 от 2.11,2007г.) в динамике.

3. Развернутый анализ крови в динамике с подсчетом количества эритроцитов, ретикулоцитов, лейкоцитов с лейкоформулой, тромбоцитов, определением уровня гемоглобина и скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Определение проводили по стандартным методикам.

4. Высокочувствительный С-реактивный белок определяли в динамике в сыворотке крови, согласно инструкции к набору реактивов для иммуноферментного анализа (Cusabio, КНР) с использованием планшетного иммуноферментного анализатора Sirius S (Seac, Италия).

5. Уровни цитокинов ФНО-альфа, Ил-1 бета и Ил-6 определяли в динамике с помощью иммуноферментного анализа согласно инструкции к реактивам

(Invitrogen, США) с использованием планшетного иммуноферментного анализатора Sirius S (Seac, Италия). 6. Патоморфологическое исследование голеностопных суставов крыс проводили на 25-е сутки эксперимента. Изготовление гистологических препаратов проводили по методике, разработанной для костных тканей (Коржевский Д.Э., 2005; Пахт A.B., 2008). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизону. Микроскопическое изучение объектов осуществляли с использованием микроскопа Axioscop «Цейс». Морфометрическое исследование проводили при помощи морфометрической сетки случайного шага (Автандилов Г.Г., 1990; Стефанов С.Б., 1974). Морфологический раздел работы консультирован заведующим кафедрой патологической анатомии КГМУ д.м.н., профессором Д.Э. Цыплаковым.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 для Windows с вычислением средней арифметической, ошибки средней, t-критерия Стьюдента, Т-критерия Уилкоксона, U-критерия Манна-Уитни. Критерием достоверности различий явилось значение р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния тиоктовой кислоты при пероральном введении в различных дозах на выраженность адъювант-индуцированного отека лап проводили в шести сериях экспериментов. Согласно ранее полученным нами данным, средняя смертельная доза субстанции тиоктовой кислоты при внутрижелудочном введении составляет 1110±83 мг/кг массы крыс обоих полов (Залялютдинова Л.Н. и др., 2004, Зверева Е.Ю., 2006).

При моделировании адъювантного артрита крыс в контрольной группе животных отек правой лапы начинал формироваться на третий день после введения адъюванта и сохранялся до конца эксперимента (прирост объема

правой лапы по сравнению с исходным к концу эксперимента составил 1,30±0,145мл и был принят за 100% первичной воспалительной реакции). Воспаление контрапатеральной задней лапы начинало достоверно проявляться на 10-й день эксперимента и достигало максимума к концу эксперимента (на 25-й день прирост объема левой лапы составил 0,81±0,102мл и был принят за 100% вторичной иммунологической реакции).

Результаты оценки влияния перорального применения тиоктовой кислоты в дозах 1, 5.5, 11, ПОмг/кг, диклофенака натрия в дозе 8мг/кг и комбинации тиоктовой кислоты в дозе 11мг/кг с диклофенаком натрия в дозе 8мг/кг на адъювант-индуцированный отек представлены на рисунках 1 и 2.

■ Контроль

нДиклофенак натрия

и Тиоктовая кислота 1 мг/кг

нТиоктовая кислота 5,5мг/кг

яТиоктовая кислота 11мг/кг

НТиоктовая кислота 110мг/кг

нТиоктовая кислота 11 мг/кг + диклофенак натрия 8мг/кг

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой, получавшей диклофенак натрия

Рис. 1. Влияние тиоктовой кислоты в дозах 1, 5.5, 11, 110мг/кг, диклофенака натрия в дозе 8мг/кг и его комбинации с тиоктовой кислотой в дозе 11 мг/кг при пероральном применении на первичную воспалительную реакцию на 25-е сутки эксперимента, в % по отношению к контролю.

Как видно из рисунков 1 и 2, тиоктовая кислота в диапазоне доз от 5.5 до 110 мг/кг подавляла адъювант-индуцированную первичную воспалительную реакцию на 60-69%, вторичную иммунологическую реакцию - на 69-78%. Наилучший эффект тиоктовая кислота проявляла в дозе 11мг/кг. Отсутствие дозозависимого эффекта характерно для препаратов метаболического типа действия (Гацура В.В., 1977). Комбинированное

применение тиоктовой кислоты с диклофенаком натрия уменьшало отек правой лапы на 82%, левой лапы - на 77% у крыс с адъювантным артритом.

* ** * **

¡1 Ж

ЕЕЕЕ Ш

■ Контроль

■ Диклофенак натрия

0 Тиоктовая кислота 1мг/кг В Тиоктовая кислота 5,5мг/кг

■ Тиоктовая кислота 11мг/кг

ЕЗ Тиоктовая кислота 110мг/кг

и Тиоктовая кислота 11 мг/кг + диклофенак натрия 8мг/кг

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой, получавшей диклофенак натрия

Рис. 2. Влияние тиоктовой кислоты в дозах 1, 5.5, 11, 110мг/кг, диклофенака натрия в дозе 8мг/кг и его комбинации с тиоктовой кислотой в дозе 11мг/кг при пероральном применении на вторичную иммунологическую реакцию на 25-е сутки эксперимента, в % по отношению к контролю.

Развитие адъювант-индуцированной гипертермии правой лапы начиналось на третий день после введения адъюванта и сохранялось до конца эксперимента. Температура контралатеральной лапы, свидетельствующая о генерализации воспалительного процесса, начинала достоверно повышаться на 10-й день. У крыс с моделированным артритом температура правой лапы к концу эксперимента составила 34,0±0,49°С, левой лапы в те же сроки -33,4±0,32°С.

На рисунке 3 приведены примеры ИК-термограмм голеностопных суставов крыс на третьи и 10-е сутки после введения ПАФ. Влияние курса терапии исследуемыми препаратами на выраженность адъювант-индуцированной гипертермии лап представлено на рисунке 4.

На третий день после введения адъюванта отмечается повышение температуры правой лапы в среднем на 4,8±0,63 °С, а на 10-й день эксперимента - левой лапы на 4,2±0,51°С.

Рис. 3. А - типичная ИК-термограмма лап крыс на третий день; Б - на 10-й день после введения ПАФ.

*

■

1 — .. . . § хш

□ Интактные

■ Контроль

■ Диклофенак натрия, 8мг/кг

1 Тиоктовая кислота,

11мг/кг И Тиоктовая кислота + диклофенак натрия

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Рис. 4. Влияние перорального введения тиоктовой кислоты, диклофенака натрия и их комбинации в тех же дозах на температуру правой (А) и левой (Б) задних лап крыс с адъювантным артритом на 25-й день эксперимента, в °С

Как видно из рисунка 4, курсовое применение диклофенака натрия в дозе 8мг/кг снизило среднюю температуру в правой задней конечности на 2,1±0,43 °С, в левой - на 1,9±0,26 °С по сравнению с контрольной группой. Курсовое применение тиоктовой кислоты в дозе 11мг/кг привело к снижению

температуры правой лапы на 3,2±0,37 °С, левой лапы на 3,1±0,45 °С, что достоверно превосходило эффективность диклофенака натрия. Температура лап крыс, получавших комбинированную терапию, статистически не отличалась от таковой у здоровых животных.

Развернутый анализ крови крыс с адъювантным артритом показал, что введение ПАФ уже на третий день вызывало достоверное повышение СОЭ и лейкоцитоз, которые усиливались к 10-му дню и сохранялись до конца эксперимента: к 25-му дню у крыс с адъювантным артритом СОЭ достигла 26±2,6 мм/ч; число лейкоцитов возросло более, чем в 2,5 раза по сравнению с исходным. При этом в лейкоформуле увеличились доли нейтрофилов (с 24 до 44%) и моноцитов (с 2 до 11%) и, соответственно, уменьшилась доля лимфоцитов (с 73 до 44%).

Курсовое применение диклофенака натрия, тиоктовой кислоты и их комбинации приводило к уменьшению адъювант-индуцированных гематологических сдвигов (рисунки 5, 6).

А Б

вТиоктовая кислота 11мг/кг

И Тиоктовая кислота + диклофенак ...........натрия.........................................

□ Интактные ■ Контроль

В Диклофенак натрия 8 мг/кг

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Рис. 5. Влияние курсового применения диклофенака натрия, тиоктовой кислоты и их комбинации на СОЭ (А) и лейкоцитоз (Б) крови при АА.

Интактные Контроль Диклофенак Тиоктовая Тиоктовая натрия кислота кислота +

диклофенак натрия

* - Р < 0,05 по сравнению с контролем

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Рис. 6. Влияние курсового применения диклофенака натрия в дозе 8мг/кг, тиоктовой кислоты в дозе 11 мг/кг и их комбинации на число нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов крови при АА на 25-й день.

Как видно из рисунков 5 и 6, применение диклофенака натрия приводило к достоверному снижению СОЭ почти в два раза, но не влияло на выраженность лейкоцитоза. При этом в лейкоформуле отмечалось достоверное снижение доли (до 7%) и абсолютного числа (до 0,7±0,10 -109/л) моноцитов. На фоне курсового применения тиоктовой кислоты СОЭ была достоверно ниже, чем в группе диклофенака натрия, но не достигала показателей здоровых животных. Комбинированное применение препаратов приводило к нормализации СОЭ, числа лейкоцитов и лейкоформулы.

После введения крысам ПАФ уровень С-реактивного белка резко возрастал уже на третий день, после чего темп роста замедлялся, и к 25-му дню концентрация СРБ достигала в контрольной группе 720±22 нг/мл. При этом отмечался достоверный рост концентрации цитокинов. Начиная с 10-го дня эксперимента отмечалось повышение сывороточной концентрации ФНО-альфа и Ил-1 бета, а к концу эксперимента их уровни возросли по сравнению с исходными более, чем в три и четыре раза соответственно. Увеличение концентрации Ил-6 вдвое по сравнению с исходным уровнем отмечалось на 25-й день опыта.

Таблица 1

Влияние курсового перорального применения диклофенака натрия, тиоктовой кислоты и их комбинации на уровень ФНО-альфа, Ил-1 бета и Ил-6 в сыворотке крови крыс с АА на 25-й день, пг/мл

Интактные Контроль Диклофенак натрия 8мг/кг Тиоктовая кислота 11мг/кг Тиоктовая кислота + диклофенак натрия

ФНО- альфа 14,8±3,91 54,3±9,26 51,2±7,46 26,9±5,18 * ** 23,5±5,02 * **

Ил-1 бета 30,4±7,35 125,3±27,94 116,5±28,52 64,6± 16,48 * ** 70,1±19,70 * **

Ил-6 7,9±0,86 17,8±3,61 18,1±2,92 11,5±2,01 * ** 10,9±1,46 * **

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Применение диклофенака натрия привело к достоверному снижению уровня СРБ до 497±24 нг/мл, но не влияло на концентрацию провоспалительных цитокинов (таблица 1). Курсовое применение тиоктовой кислоты способствовало нормализации концентрации СРБ (средний уровень в группе тиоктовой кислоты составлял 371±16 нг/мл), снижению уровня ФНО-альфа на 69%, Ил-1 бета на 64% и Ил-6 на 64% по сравнению с показателями нелеченых животных. В сыворотке крови крыс, получавших курсовую комбинированную терапию обоими препаратами, отмечалась нормализация концентрации СРБ (358±35 нг/мл на 25-й день эксперимента), достоверное снижение содержания ФНО-альфа на 78%, Ил-1 бета на 58% и Ил-6 на 70% по сравнению в показателями контрольной группы.

Патоморфологическое исследование голеностопных суставов показало, что в контрольной группе регистрировалась выраженная воспалительная реакция, захватывающая как сам сустав, так и периартикулярные ткани.

>

ШрР

• - , - С,»/. ? " * . •

.-■ .у

Рис. 7. Состояние суставного хряща в контрольной группе (А) и группе животных, леченных тиоктовой кислотой в дозе 11мг/кг (Б) к концу эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином, х 200.

А. Дефекты хрящевой выстилки: чередование зон деструкции и пролиферации хряща с оголением участков подлежащей кости. Б. Разрастание соединительной ткани, трансформация ее в хрящ и образование новых костных балок.

ж»

иш

п ■ ' М**, мтщш

-'*■'Г' Щ

VI

Шк ..... ^ АV.....Л."* >*! ж Ш 1шШа «

И Р

>" --М • . М

Рис. 8. Патоморфологические изменения синовиальной оболочки в контрольной группе (А) и группе крыс, леченных тиоктовой кислотой в дозе 11мг/кг, к концу эксперимента (Б). Окраска гематоксилином и эозином, х 200.

А. Тотальная лимфогистиоцитарная инфильтрация синовиальной оболочки в контрольной группе.

Б. Умеренный отек синовиальной оболочки.

Как видно из рисунков 7 и 8, применение тиоктовой кислоты в случаях деструкции кости в результате воспалительной реакции сопровождалось

восстановлением костной ткани. В единичных случаях в синовиальной оболочке сохранялись явления умеренного отека синовиальной оболочки.

Пероральное курсовое применение комбинации обоих препаратов приводило к уменьшению или отсутствию воспаления как в суставе, так и в периартикулярных тканях.

Морфометрический анализ подтвердил более высокую эффективность терапии адъювантного артрита комбинацией тиоктовой кислоты и диклофенака натрия. Так, в данной группе наблюдений статистически достоверно по сравнению с контролем уменьшалась площадь как пораженной хрящевой выстилки, так и синовиальной оболочки соответственно с 26,29±0,83 до 4,94±0,63% (р<0,05) и с 21,85±1,00 до 5,31±0,33% (р<0,05).

В связи с тем, что в клинике для лечения ревматоидного артрита применяют НПВП не только системно, но и местно, нами проведено изучение влияния на течение адъювантного артрита 1% геля тиоктовой кислоты в сравнении с 1% гелем диклофенака натрия. Установлено, что при однократном нанесении на кожу практически полное высвобождение тиоктовой кислоты из геля происходит в течение суток (Зверева Е.Ю., 2006). В связи с этим и для геля диклофенака натрия была выбрана аналогичная схема применения.

Влияние гелей тиоктовой кислоты и диклофенака натрия на отек лап крыс с моделированным артритом представлено на рисунке 9.

Как видно из рисунка 9, нанесение геля диклофенака натрия не влияло на выраженность первичной воспалительной реакции, но достоверно уменьшало вторичную иммунологическую реакцию на 28%. Вероятно, недостаточная эффективность 1% геля диклофенака натрия в данной серии экспериментов была связана с тем, что, согласно инструкции, рекомендованная кратность его нанесения составляет 2-3 раза в сутки. Применение геля тиоктовой кислоты снижало первичную реакцию на 60%, вторичную реакцию - на 57%.

120 100 80 ^ 60 40 20 0

■ Контроль

И 1 % гель диклофенака натрия

И 1 % гель тиоктовой кислоты

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Рис. 9. Влияние 1% гелей тиоктовой кислоты и диклофенака натрия на первичную воспалительную (А) и вторичную иммунологическую (Б) реакцию лап на 25-е сутки после введение адъюванта, в процентах по отношению к контролю

А Б

□ Интактные ■ Контроль

н 1% гель диклофенака натрия И 1% гель тиоктовой кислоты

* - Р < 0,05 по сравнению с контрольной группой

** - Р < 0,05 по сравнению с группой диклофенака натрия

Рис. 10. Влияние 1% гелей тиоктовой кислоты и диклофенака натрия на гипертермию правой (А) и левой (Б) лап крыс с моделированным артритом на 25-е сутки после введения ПАФ.

Местное нанесение диклофенака натрия не привело к достоверному снижению температуры правой лапы, средняя температура левой лапы достоверно снижалась на 1,2±0,34 °С по сравнению с контрольной группой. Применение геля тиоктовой кислоты привело к достоверному снижению температуры в правой лапе на 2,9±0,61 °С, в левой - на 3,0±0,48 °С (рис. 10).

Курсовое местное применение тиоктовой кислоты устраняло кожные проявления адъювантного артрита, лишь в единичных случаях в дерме сохранялись небольшие лимфогистиоцитарные инфильтраты. Подлежащая костная ткань была представлена компактной костью с наличием небольших грубоволокнистых фрагментов балочного строения. Синовиальная оболочка в целом имела нормальное гистологическое строение.

Таким образом, нами показано, что тиоктовая кислота при пероральном применении в виде монотерапии и в комбинации с диклофенаком натрия, а также при местном применении в виде 1% геля уменьшает адъювант-индуцированные воспалительные изменения в суставах, что подтверждается результатами ИК-термографии и патоморфологического анализа. Курсовое пероральное введение тиоктовой кислоты, в том числе в комбинаций с диклофенаком натрия, уменьшает степень воспалительных изменений в крови крыс с адъювантным артритом.

ВЫВОДЫ

1. Тиоктовая кислота при курсовом пероральном введении в дозах, соответствующих 1/200, 1/100 и 1/10 ЛД50, оказывает выраженное противовоспалительное действие на модели адъювантного артрита крыс. Наиболее эффективной является доза, соответствующая 1/100 ЛД50 (11мг/кг).

2. Курсовое применение тиоктовой кислоты в дозе 11мг/кг и 1% геля тиоктовой кислоты уменьшает отек и гипертермию лап, разрастание синовиальной ткани и явления остеопороза, восстанавливает структуру хряща и устраняет кожные проявления адъювантного артрита.

3.Тиоктовая кислота в дозе 11мг/кг при курсовом пероральном введении крысам с адъювантным артритом уменьшает СОЭ, лейкоцитоз, нейтрофилез, моноцитоз крови, а также уровень СРБ и содержание провоспалительных цитокинов ФНО-альфа, Ил-1 бета и Ил-6 в сыворотке крови.

4. Комбинированное применение тиоктовой кислоты с диклофенаком натрия устраняло гипертермию суставов и гематологические изменения, а также восстанавливало морфологическую структуру суставов у крыс с моделированным артритом.

Практические рекомендации.

1. Рекомендуется изучение тиоктовой кислоты, в том числе в комбинации с диклофенаком натрия, у пациентов с ревматоидным артритом.

2. Следует провести клиническую апробацию 1% геля тиоктовой кислоты у пациентов с ревматоидным артритом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Залялютдинова Л.Н. Сравнительная оценка противовоспалительной активности кислоты липоевой и диклофенака натрия / Л.Н. Залялютдинова, Н.М. Насыбуллина, Е.Ю. Захматова, Р.Р. Зверев, А.Я. Фатгахова [и др.] // Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы: тез. докл. П междунар. конф. (Минск, 2-3 апреля 2004 г.). -Минск, 2004. С. 168-169.

2. Фатгахова А.Я. Изучение противовоспалительных и жаропонижающих свойств липоевой кислоты // 81-я Всерос. студ. науч. конф., посвященная 150-летию В.М. Бехтерева: тез. докл. (Казань, 10-12 апреля 2007 г.). -Казань, 2007. С. 85.

3. Зверев P.P. Новые свойства тиоктовой кислоты [Электронный ресурс] / Р.Р. Зверев, А.Я. Фатгахова [и др]. // Фармакология - практическому здравоохранению: материалы Ш съезда фармакологов России (Санкт-Петербург, 23-27 сентября 2007 г.). Психофармакология и биологическая наркология. 2007. URL: http://psychopharmacology.ru/index.php/PPBN/article/viewArticle/570 (дата обращения: 4.04.2013).

4. Залялютдинова Л.Н. Влияние липоевой кислоты на течение адьювантного артрита // Л.Н. Залялютдинова, А.Я. Фатгахова // Фармакология и токсикология фосфорорганических соединений и других биологически активных веществ, выпуск 4: мат. Рос. конф., поев. 75-летию профессора И.А. Студенцовой (Казань, 2008 г.). - Казань, 2008. С. 32.

5. Залялютдинова Л.Н. Эффективность универсального антиоксиданта -липоевой кислоты при лечении адьювантного артрита у белых крыс / Л.Н. Залялютдинова, А.Я. Фаттахова [и др.] // Современные проблемы ветеринарной фармакологии и токсикологии: материалы второго съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 9-12 июля 2009 г.).-Казань, 2009. С. 98-101.

6. Сабирова А.Я. Эффективность местного применения липоевой кислоты на модели адьювантного артрита у крыс // Молодые ученые в медицине: материалы Всерос. конф. (Казань, 2-3 апреля 2010 г.). - Казань, 2010. С. 238-239.

7. Сабирова А.Я. Вопрос защиты экспериментальных животных в Российском законодательстве / А.Я. Сабирова. Л.В. Исмагилова // Молодые ученые в медицине: материалы Всерос. конф. (Казань, 2-3 апреля 2010 г.). - Казань, 2010. С. 62-63.

8. Сабирова А.Я. Антиоксидант подавляет аутоиммунное воспаление, вызванное введением адъюванта Фрейнда / А.Я. Сабирова [и др.] // Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли: материалы междунар. конф. (Казань, 17-18 мая 2010 г.). -Казань, 2010. С. 243-246.

9. Сабирова А.Я. Разработка нового патогенетического подхода к лечению ревматоидного артрита / А.Я. Сабирова [и др.] // Инновации РАН 2010:

материалы ежегодной науч.-практ. конф. (Казань, 2010 г.). - Казань, 2010. С. 84-87.

Ю.Сабирова А.Я. Сравнительная эффективность антиоксиданта и диклофенака натрия в лечении адьювантного артрита крыс / А.Я. Сабирова [и др.1 // Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли: материалы П междунар. науч.-практ. конф. (Казань, 2011 г.). - Казань, 2011. С. 36-39.

И.Сабирова А.Я. Антиоксидантная терапия адъювант-индуцирванного артрита / А.Я. Сабирова [и др.] // Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина: материалы 2-й междунар. школы (Московская область, 19-24 сентября 2011 г.). -Москва, 2011.С. 95-96.

12.Сабирова А.Я. Изучение антиревматоидного и антисеборейного действия мягких наружных лекарственных форм с антиоксидантом / А.Я. Сабирова [и др.] // Здоровье человека в XXI веке: материалы Ш Рос. науч.-практ. конф. (Казань, 21 -22 апреля 2011 г.). - Казань, 2011. С. 292-295.

13.Залялютдинова J1.H. Экспериментальная оценка эффективности липоевой кислоты на моделях острого и хронического воспаления при пероральном и местном применении /J1.H. Залялютдинова, А.Я. Сабирова [и др.] // Инновации в современной фармакологии: материалы IV съезда фармакологов России (Казань, 18-21 сентября 2012 года). - Казань, 2012. С.68.

14.3алялютдинова Л.Н. Изучение антиревматоидной активности липоевой кислоты методом инфракрасной термографии / Л.Н. Залялютдинова, А.Я. Сабирова [и др.] // Медицинская физика и инновации в медицине: сб. тез. V Троицкой конф. (Троицк, 4-8 июня 2012 г.). - Троицк, 2012. Т. 1. С. 6264.

15.Сабирова А .Я. Оценка влияния экспериментальной терапии НПВС и антиоксидантом на содержание лейкоцитов периферической крови крыс с адъювантным артритом / А.Я. Сабирова. Д.А. Насыбуллина // Молодые ученые в медицине: материалы ХУЛ Всерос. науч.-практ. конф. (Казань, 23-24 апреля 2012 г.). - Казань, 2012. С. 94.

16.Иманаева А.Я., Залялютдинова Л.Н. Патогенетическое обоснование применения антиоксидантов в лечении ревматоидного артрита [Электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования. 2013. №2. URL: www.science-education.nl/108-9036 (дата обращения: 06.05.2013).

17.Иманаева А.Я., Залялютдинова Л.Н., Цыплаков Д.Э. Изучение противовоспалительной активности липоевой кислоты на модели адъювант-индуцированного артрита крыс // Фундаментальные исследования. 2013. №6 (часть 3). С. 596-600.

18.Иманаева А.Я., Залялютдинова Л.Н. Изучение влияния тиокговой кислоты на состояние периферической крови крыс с адъювантным артритом // Врач-аспирант. 2013. - В печати.

Список сокращений

АА - адъювантный артрит

ИК - инфракрасный

Ил - интерлейкин

ЛД50 - средняя смертельная доза

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

НПВС - нестероидные противовоспалительные средства

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

РА - ревматоидный артрит

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

СРБ - С-реактивный белок

ФНО-альфа - фактор некроза опухоли альфа

Подписано в печать 20.05.2013г. Формат 60x84Чц. Печатных листов 1. Бумага офсетная, тираж 100. Заказ К-50. Отпечатано в

г. Казань, ул. Муштари, 11, тел. 259-56-48. E-mail: meddok2005@mail.ru