Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение влияния блокаторов H2-гистаминовых рецепторов на изофермент CYP3A4 цитохрома P-450

На правах рукописи

ЧАУКИНА Светлана Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЛОКАТОРОВ Н2-ГИСТАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ИЗОФЕРМЕНТ СУРЗА4 ЦИТОХРОМА Р-450

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 О МАП :0!0

Москва-2010

004604667

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени

И.М.Сеченова

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Кукес Владимир Григорьевич доктор фармацевтических наук, профессор Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук

Чистяков Виктор Владимирович

доктор фармацевтических наук, профессор

Берлянд Александр Семенович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.

Защита диссертации состоится «24» мая 2010 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

" С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке ММА имени И.М. Сеченова Росздрава, по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49

Автореферат разослан « м _» 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09,

доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы.

В медицинской практике часто используют несколько лекарственных средств (ЛС) одновременно. При этом они могут взаимодействовать между собой на фармацевтическом, фармакокинетическом и фармакодинамическом уровнях, изменяя выраженность, продолжительность и характер основного эффекта, а также усиливая или ослабляя побочные и токсические явления [Кукес В.Г. и соавт., 2007].

Одним из клинически значимых видов фармакокинетического взаимодействия является взаимодействие на уровне метаболизма ЛС, в том числе их влияние на цитохром Р-450. Являясь индукторами или ингибиторами определенных изофермен-тов цитохрома Р-450 ЛС способны изменять фармакокинетику ЛС-субстрата данного изофермента, что приводит к изменению его метаболизма, а следовательно эффективности и безопасности [Кукес В.Г., 2004]. Данное свойство особенно важно для ЛС, часто применяющихся в домашних условиях без постоянного врачебного надзора. Так в России болезни ЖКТ занимают одно из ведущих мест по распространению. Из них, значительная часть приходится на рефлюкс - эзофагит. Реальная частота заболевания рефлюкс - эзофагита выше, чем показывает официальная статистика, так как люди страдающие данным заболеванием, к сожалению часто, самостоятельно выбирают медикаментозное лечение до обращения к врачу. По данным «Фармэксперт» (с января по сентябрь 2009 года) в розничных продажах препаратов для лечения заболеваний, связанных с нарушением кислотопродукции, доля блока-торов I Ь-гистаминовых рецепторов составила 24,2%. В тоже время параллельно часто принимаются другие препараты (сердечно-сосудистые, антикоагулянты и другие), что может привести к развитию нежелательных явлений. Поэтому для таких препаратов крайне важна наиболее полная информация в инструкции по применению, в том числе по возможному взаимодействию ЛС.

При изучении фармакокинетического взаимодействия также необходимо помнить, что одно и тоже ЛС в разных дозах, создавая разные уровни концентрации в крови, может иметь разную степень влияния на изоферменты цитохрома Р-450.

Для проведения любого фармакокинетического исследования в первую очередь необходимы воспроизводимые, чувствительные методики количественного определения ЛС в биологических жидкостях, в том числе в плазме крови.

Все выше изложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось фармакокинетическое изучение влияния лекарственных средств - блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов (фамотидина, рани-тидина и циметидина) на активность изофермента СУРЗА4 цитохрома Р-450. Задачи исследования.

1. Предложить простые, воспроизводимые и точные методики количественного определения фамотидина, ранитидина и циметидина в плазме крови методом ВЭЖХ и провести их валидацию.

2. Определить уровень концентраций и фармакокинетические параметры фамотидина, ранитидина и циметидина после однократного перорального приема в терапевтической дозе.

3. Изучить влияние блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов на активность изофермента СУРЗА4 с помощью МЕвХ - теста.

4. Оценить степень изменения активности СУРЗА4 на фоне курсового приема фамотидина, ранитидина и циметидина с помощью МЕОХ - теста.

5. Провести сравнительный статистический анализ степени влияния фамотидина, ранитидина и циметидина на активность изофермента СУРЗА4 цитохрома Р-450.

Научная новизна.

Показано, что фамотидин, ранитидин и циметидин оказывают ингибирующее влияние на изофермент цитохрома Р450 СУРЗА4 при курсовом приеме в терапевтических дозах.

Установлено, что наиболее сильным ингибитором является циметидин. Ранитидин оказывает-замстное ингибирующее влияние, а фамотидин оказывает незначительное влияние на изофермент СУРЗА4. Практическая значимость. На основании результатов изучения хроматографического поведения фамотидина, ранитидина и циметидина предложены воспроизводимые, доступные ВЭЖХ методики их количественного определения в плазме крови.

Установлено, что прием блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов (фамотидина, ранитидина и циметидина) вызывает ингибирование СУРЗА4, что необходимо учитывать при назначении указанных препаратов в составе комплексной терапии.

Методики количественного определения фамотидина, ранитидина и цимети-дина в плазме крови с помощью ВЭЖХ внедрены и используются в Филиале «Клиническая фармакология» НЦ БМТ РАМН при проведении фармакокинетических исследований лекарственных средств, а также внедрены в работу Отдела клинико-фармакологической экспертизы лекарственных средств Института клинической фармакологии ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Росздравнадзора.

Апробация диссертации.

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2008 г.); Второй Научно-практической конференции с международным участием «Достижения клинической фармакологии в России» (Москва, 2009 г.); VI научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009 г.). Апробация работы проведена на научно - практической конференции кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова 08 февраля 2009 г.

Публикации.

По результатам проведенных исследований опубликовано 7 печатных работ, в том числе три в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы из 136 наименований (31 отечественной и 105 зарубежной литературы). Работа иллюстрирована 37 рисунками и 28 таблицами. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Условия количественного определения фамотидина, ранитидина и циметидина в плазме крови методом ВЭЖХ.

2. Результаты динамики концентрации и фармакокинетических параметров фамо-тидина, ранитидина и циметидина после однократного перрорального приема в терапевтической дозе.

3. Результаты влияния фамотидина, ранитидина и циметидина на активность изо-фермента цитохрома Р-450 CYP3A4.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Оборудование, материалы и методы исследования

Анализ фамотидина, ранитидина и циметидина в плазме крови проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с СФ-УФ детектором. Для этого использовали:

1. оборудование и материалы:

- жидкостные хроматографы «Waters» и «Shimadzu»;

- хроматографические колонки (Zorbax ODS 150x4.6мм; Диасорб 130—С16 150x4 мм, 7 мкм; Nukleosil С18 250x4.6 мм, 5 мкм);

- центрифуга высокоскоростная;

- аппарат для встряхивания "vortex";

- pH - метр;

- роторный испаритель с вакуумным насосом;

- лабораторная посуда и вспомогательные материалы (мембранные фильтры, микрошприцы, автоматические пипетки со сменными наконечниками и др.).

2. реактивы - этилацетат, ацетонитрил, дихлорметан, натрия гидрокарбонат, кальция

карбонат, калия дигидрофосфат, метанол, триэтиламин, фосфорная кислота и др.

Все реактивы были соответствующего качества: «для ВЭЖХ», «хч», «чда».

Для проведения MEGX - теста использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флюориметрическим детектором. Для этого использовали:

1. оборудование и материалы:

- жидкостной хроматограф «Shimadzu»;

- хроматографическая колонка Ultrasphere ODS, Beckman, 4.6 х 250 мм, 5 мкм;

- центрифуга высокоскоростная;

- аппарат для встряхивания "vortex";

- холодильник бытовой;

- водяная баня;

- рН-метр;

- роторный испаритель с вакуумным насосом;

- лабораторная посуда и вспомогательные материалы (микрошприцы, автоматические пипетки со сменными наконечниками и др.).

2. реактивы - субстанция MEGX (синтезирована ЦХЛС - ВНИХФИ с содержанием активного вещества 99%), субстанция MPGX, борная кислота, 2 М натрия гидроксид, NBD-F (4-фтор-7-нитробензофуразан) (Sigma), фосфатный буфер (рН 5,0), ацетонитрил, тетрагидрофуран, дихлорметан, этанол, натрия тетраборат, хлористоводородная кислота. Все реактивы были соответствующего качества: «для ВЭЖХ», «хч», «чда».

Условия анализа:

- подвижная фаза: 0,05 М фосфатный буфер (рН 5,0): ацетонитрил : тетрагидрофуран в соотношении 590:370:40;

- скорость потока подвижной фазы 1,5 мл/мин;

- температура термостата 47 °С;

- длина волны экстинкции - 340 нм; длина волны эмиссии - 520 нм.

Экстракция. К 1 мл плазмы добавляли 0,5 мл раствора MEGX (0,01 мг/мл) и 0,3 мл внутреннего стандарта MPGX (0,2 мкг/мл), перемешивали на vortex. Затем добавляли 0,6 мл боратного буфера (рН 9,5), 30 секунд перемешивали на vortex, добавляли 2 мл дихлорметана, 1 минуту экстрагировали при помощи vortex, далее пробы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут. Органический слой отбирали в чистые пластиковые пробирки с коническим дном и упаривали на роторном испарителе под вакуумом при 38°С.

Дериватизация. К сухому экстракту прибавляли 0,1 мл насыщенного раствора тетрабората натрия в этаноле, добавляли 0,01 мл свежеприготовленного раствора NBD-F (10 мг/мл в-смеси этанол - ацетонитрил (3:1), встряхивали на vortex 5 секунд и нагревали при 60 °С 10 минут. Затем пробу охлаждали и добавляли 0,006 мл 25% хлористоводородной кислоты, центрифугировали при 10000 об/мин в течение 3 минут. Аликвоту 50 мкл вводили в колонку хроматографа.

В указанных условиях время выхода пика MEGX составляло 8.2 мин, время выхода пика внутреннего стандарта MPGX -12.3 мин. Предел обнаружения составлял 2 нг/мл.

Хроматографические характеристики и параметры пригодности системы представлены в таблице 1.

Таблица 1

Параметры пригодности системы (MEGX - тест)

Соединение tR,MHH N ВЭТТ R к'

MEGX 8,2 4139 0,06 4,32 0,5

MPGX 12,3 5238 0,047

Количественное определение MEGX в образцах проводили методом внутреннего стандарта по соотношению площадей пиков MEGX/MPGX. Точность измерения в диапазоне концентраций 10 - 100 нг/мл составляла 6,5%, воспроизводимость 3,6.

Схема фармакокинетического исследования

Фармакокинетическое исследование начинали в 8-00 утра. Пациентов с диагнозом «рефлюкс - эзофагит» разделили на 4 группы по 12 человек. У всех пациентов производили отбор исходной пробы крови через одноразовый кубитальный катетер. Затем пациенты I, II, III групп принимали per os один из препаратов - блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов: I группа - фамотидин в дозе 40 мг («Квамател», фирмы «Гедеон Рихтер», Венгрия); II группа - ранитидин в дозе 300 мг («Зантак», фирмы «Глаксо-Вэллком Оперэйшенс Лтд.», Великобритания); III группа - циметидин в дозе 400 мг («Циметидин», фирмы «Балканфарма-Дупница АД», Болгария). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови: для фамотидина через 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6 и 12 часов после приема препарата; для ранитидина через 0.25, 0.5, 0.75, 1,1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 часов после приема; для циметидина через 0.5, 1, 1.5, 2, 3,4, 6 и 8 часов после приема.

Пробы крови для определения концентраций препаратов отбирали в гепари-низированные пробирки, образцы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Плазму переносили в пластиковые пробирки, замораживали и хранили до анализа при температуре -35°С. Определение концентрации препаратов в плазме крови проводили методом ВЭЖХ.

Далее пациентам всех групп на 1, 3, 5 и 7 день курсового лечения проводили MEGX - тест.

MEGX - тест проводили путем внутривенного введения 2% раствора лидо-каина в дозе 1 мг/кг. Время введения составляло 1-2 мин.

Перед каждым введением лидокаина производили отбор крови ("исход"). На 30 минуте с момента инъекции выполнялся повторный отбор крови из вены, отличной от места введения лидокаина. Через 40 минут пробы крови центрифугировали (10 минут при 3000 об/мин). Образовавшуюся сыворотку отбирали по 1,5 мл и переносили в пластиковые пробирки. Далее замораживали и хранили образцы до проведения количественного анализа при температуре не выше -20 °С. Концентрацию метаболита лидокаина (MEGX) определяли методом ВЭЖХ.

Все пациенты удовлетворительно перенесли и благополучно закончили исследование.

Обработка полученных результатов

Для оценки предложенных методик количественного определения фамотидина, ранитидина и циметидина рассчитывали метрологические характеристики по 10 параллельным измерениям.

Результаты антропометрических характеристик испытуемых представлены в виде Mean+SD.

Фармакокинетические параметры рассчитывали с помощью программы Ki-netica™2000 модельно-независимым методом. Рассчитывались следующие параметры: максимальная концентрация Стах, нг/мл; время ее достижения Ттах, час; площадь под фармакокинетаческой кривой — в пределах длительности наблюдений (AUCo-t) рассчитывали методом трапеций, нг*ч/мл; отношение Cmax/AUCo-t по индивидуальным значениям (характеристика скорости всасывания).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью программы «Systat w5». Рассчитывали следующие статистические параметры: среднее арифметическое значение (Mean), стандартное отклонение среднего результата (SD), стандартная ошибка (SE), коэффициент вариации (CV), минимальное значение из выборки (min), максимальное значение из выборки (max). Оценку достоверности различий между парными и независимыми выборками проводили с использованием t-теста с помощью программы EXCEL. Различия считались достоверными при р<0,05.

Количественное определение фамотидина, ранитидина и циметидина в плазме крови методом ВЭЖХ

При выборе оптимальных условий разделения препаратов и соэкстрактивных веществ был проанализирован ряд условий хроматографирования, такие как подвижная фаза, неподвижная фаза, выбор детектора и аналитической длины.

Изолирование блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов проводили методом жидкофазной экстракции. Степень извлечения определяли на контрольных образцах крови, содержащих заведомо известное количество вещества по сравнению со стандартным раствором.

Условия экстрагирования:

1. для фамотидина: к 1 мл плазмы добавляли 1 мл насыщенного раствора №НСОз/К2СОз (1:1) и экстрагировали 3 мл этилацетата при активном встряхивании в течение 15 минут. По окончании встряхивания пробу центрифугировали. После центрифугирования органический слой отбирали и упаривали досуха под током азота. Остаток после упаривания растворяли в 100 мкл элюента, из которых 50 мкл (объем петли инжектора) вводили в хроматографическую колонку. Степень извлечения фамотидина из плазмы крови составляла 60%;

2. для ранитидина: к 1 мл плазмы добавляли 250 мкл 0,1 М натрия гидроксида, встряхивали на vortex 10 секунд, добавляли 5 мл дихлорметана и экстрагировали 15 минут на шейкере. Затем пробы центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. После центрифугирования органический слой отбирали и упаривали под вакуумом. К сухому остатку добавляли 150 мкл подвижной фазы и аликвоту 100 мкл вводили в колонку хроматографа. Степень извлечения ранитидина из плазмы крови составляла 78%;

3. для циметидина: к 250 мкл плазмы добавляли 20 мкл 2,5 М натрия гидроксида и 100 мкл насыщенного раствора калия карбоната, встряхивали на vortex 1 мин. Далее добавляли 1 мл этилацетата и снова встряхивали на vortex 1,5 мин. Затем пробу центрифугировали при 9500 об/мин. После центрифугирования органический слой извлекали и упаривали досуха под вакуумом при 37 °С. К сухому остатку добавляли 500 мкл воды и аликвоту 50 мкл вводили в колонку хроматографа. Степень извлечения циметидина из плазмы крови составляла 86%.

Количественный анализ фамотидина проводили на хроматографической системе «Waters». Хроматографическая колонка «Zorbax ODS», 150x4.6 мм. Подвижная фаза метанол : вода с добавлением на 1 л воды 1 мл триэтиламина и фосфорной кислоты до рН=3.5, в соотношении 10:90. Подвижную фазу перед использованием дегазировали под вакуумом. Скорость потока элюента составляла 1,0 мл/мин. Детектирование СФ-УФ при длине волны 267 им. Время выхода пика фамотидина из хроматографической колонки - 5.2 мин. Предел обнаружения - 5 нг/мл.

- 5 мВ

I

S 10 мим

Рисунок 1. Хроматограмма фамотидина в плазме крови.

Концентрацию фамотидина в плазме крови рассчитывали с помощью метода абсолютной калибровки. Калибровочная зависимость в диапазоне концентраций 20 - 200 нг/мл носила линейный характер (рисунок 2).

КЮ.Ю1

. istmio1

с 50110'

0 40 м 120 160 200 240

Концентрация фаыатидхна

Рисунок 2. Калибровочный график.

Для оценки точности и воспроизводимости методики были рассчитаны метрологические характеристики, по результатам 10 параллельных измерений трех концентраций раствора фамотидина 40, 80, 120 нг/мл (таблица 2).

Количественный анализ ранитидина проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Shimadzu». Хроматографическая колонка «Диасорб 130-С16», 150x4 мм (7 мкм). Подвижная фаза ацетонитрил : 0,1 М дигидрофосфат калия (рН

4,3) в соотношении 10:90. Подвижную фазу перед использованием дегазировали под вакуумом. Скорость потока составляла 1,0 мл/мин. Детектирование СФ-УФ при длине волны 320 нм. Время выхода пика ранитидина из хроматографической колонки - 6.9 мин. Предел обнаружения -10 нг/мл.

Рисунок 3. Хроматограмма ранитидина в плазме крови.

Концентрацию ранитидина в плазме крови рассчитывали с помощью метода абсолютной калибровки. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 50 - 1000 нг/мл (рисунок 4).

eooxio5

500x10s

6

s «0*10"

г

| ЗООкЮ»

i

I 200И01

С

100*10» 0

0 «О 200 300 400 МО 600

Концентрация ранитидина, нг/мл

Рисунок 4. Калибровочный график.

Для оценки точности и воспроизводимости методики были рассчитаны метрологические характеристики, по результатам 10 параллельных измерений трех концентраций раствора ранитидина 50, 100, 150 нг/мл (таблица 2).

Количественный анализ циметидина проводился с помощью хроматографической системы «Waters». Хроматографическая колонка «Nukleosil С18», 250x4.6 мм (5 мкм). Подвижная фаза ацстонитрил : 0,01 М фосфатный буфер (рН=6,2), содержащий 2,5 г/л гептансульфоновой кислоты в соотношении 25:75. Скорость потока составляла 0,9 мл/мин. Детектирование СФ-УФ при длине волны 228 нм. Время выхода пика циметидина из хроматографической колонки - 6.3 мин. Предел обнаружения -15 нг/мл.

Рисунок 5. Хромата грамма циметидина в плазме крови.

Концентрацию циметидина в плазме крови рассчитывали с помощью метода абсолютной калибровки. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 50 - 1000 нг/мл (рисунок 6).

у=981 х-6548,2 > ¿=0.9501 /

* у/^

/

/

О 100 200 300 МО 500 000

Концентрация цимвпщина, нг/мл

Рисунок 6. Калибровочный график.

Для оценки точности и воспроизводимости методики были рассчитаны метрологические характеристики по результатам 10 параллельных измерений трех концентраций раствора циметидина 50, 100, 150 нг/мл (таблица 2).

В таблице 2 представлены метрологические характеристики метода анализа для фамотидина, ранитидина и циметидина.

Таблица 2

Метрологические характеристики метода анализа (t95%9)=2.26_

Препарат И, нг/мл X Si S Дх е%

Фамотидин 40 40.4 16.9 4.1 2.9 7.2

80 80.5 65.7 8.1 5.8 7.0

120 120.4 148.3 12.1 8.7 6.8

Ранитидин 50 50.0 27.3 5.2 3.7 7.4

100 100.1 101.2 10.1 7.2 7.2

150 150.4 216.7 14.7 10.5 7.0

Циметидин 50 50.0 28.9 5.4 3.8 7.6

100 100.3 105.4 10.3 7.3 7.3

150 150.3 228.8 ' 15.1 10.8 7.2

Полученные метрологические характеристики показывают, что методики определения концентраций фамотидина, ранитидина и циметидина в плазме крови по точности и воспроизводимости могут быть использованы для количественного определения при проведении фармакокинетических исследований.

Хроматографические характеристики и параметры пригодности системы фамотидина, ранитидина и циметидина представлены в таблице 3.

Таблица 3

Параметры пригодности системы фамотидина, ранитидина и циметидина

лс tR,MHH S/N RSD% As N

фамотидин 5,2 3 2,5 1,5 4500

ранитидин 6,9 3 2,5 0,95 6300

циметидин 6,3 3 2,5 1,25 5600

Результаты фармакокинетического исследования

В таблице 4 представлена динамика концентрации фамотидина (нг/мл) в плазме крови испытуемых после приема препарата Квамател. Фармакокинетические параметры фамотидина после однократного перорального применения в терапевтической дозе представлены в таблице 5.

Таблица 4

Динамика концентрации фамотидина (нг/мл) в плазме крови после приема препарата

Квамател

Статис-тическии параметр Время отбора проб, час

0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 12

Mean 14,8 35,9 64,9 80,6 100,9 73,3 51,4 31,4 15,4

SD 7,2 5,6 17,9 10,6 14,6 9,2 14,7 11,4 6,9

SE 3,0 2,6 6,3 3,7 6,1 4,3 5,8 4,4 2,8

CV 49 16 28 13 14 13 29 36 45

min 9,2 22,1 46,0 65,0 79,1 57,0 26,1 18,1 6,2

шах 30,5 42,0 92,3 95,5 129,9 88,0 70,3 48,0 28,7

На рисунке 7 приведен усредненный график динамики концентрации фамотидина при приеме препарата Квамател.

о 1 1 3 4 5 6 г 8 в 10 11 12 13 Вре*4я после приема препарата, час

Рисунок 7. Усредненный график динамики концентрации фамотидина.

Таблица 5

Фармакокинетические параметры фамотидина

после однократного перорального применения

Статисти- Стах Ттах АиСо.12 Стах/

ческий параметр нг/мл час нг*ч/мл АиСо-п

Меап 100,9 2,0 478,1 0,215

6,1 0,0 34,6 0,010

БЕ 0,5 0,0 2,9 0,001

СУ 14 0 19 17

тт 79,1 2,0 338,8 0,167

тах 129,9 2,0 611,3 0,286

Как видно из таблицы 5, максимальные концентрации фамотидина регистрировались спустя 2 часа с момента приема препарата и составляли - 100,9±6,1 нг/мл, площадь под кривой 478,1±34,6 нг*ч/мл. Отношения Стах/АиСо.12 Для лекарственного средства 0,215±0,010. Отмечен умеренный разброс индивидуальных значений фармакокинетических параметров фамотидина (СУ от 14 до 19).

В таблице 6 представлена усредненная динамика концентрации ранитидина (нг/мл) в плазме крови испытуемых при приеме препарата Зантак. Фармакокинетические параметры ранитидина после однократного перорального применения в терапевтической дозе представлены в таблице 7.

Таблица 6

Динамика концентрации ранитидина (нг/мл) в плазме крови после приема препарата

Зантак

Статистический параметр Время отбора проб, час

0,25 0,5 0,75 1 1,5 2 3 4 6 8 12

Mean 150,2 394,1 561,6 700,2 768,1 887,4 886,8 691,1 427,2 261,8 121,9

SD 62,5 123,4 117,7 146,5 236,2 290,8 111,7 177,8 117,2 84,1 52,6

SE 5,2 10,3 9,8 12,2 19,7 24,2 9,3 14,8 9,8 7,0 4,4

CV 42 31 21 21 31 33 13 26 27 32 43

min 62 187 335 464 380 393 629 420 167 101 44

max 238 598 736 899 1131 1385 973 1115 567 414 223

На рисунке 8 приведен усредненный график динамики концентрации ранитидина при приеме препарата Зантак.

I

О 1 2 3 4 8 в 7 < в 10 11 12 13 Вр»мя поел« приема прел арен, час

Рисунок 8. Усредненный график динамики концентрации ранитидина.

Таблица 7

Фармакокинетические параметры ранитидина после однократного

перорального приема

Статистический Cmax Tmax AUCo.,2 Cmax/

паратметр нг/мл час нг*ч/мл AUCo.,2

Mean 1023,9 2,5 6140,1 0,171

SD 156,8 0,8 1035,5 0,040

SE 13,1 0,1 86,3 0,003

CV 15 32 17 23

min 832 1 4576 0,121

max 1385 4 7809 0,278

Как видно из таблицы 7, максимальные концентрации ранитидина регистрировались спустя 2,5 часа с момента приема препарата и составляли - 1023,9±156,8 нг/мл. Площадь под кривой составляла 6140,1±1035,5 нг*ч/мл, отношения Стах/АиСо-п 0,171±0,040.

В таблице 8 представлена усредненная динамика концентрации циметидина (нг/мл) в плазме крови испытуемых при приеме препарата Циметидин. Фармакоки-нетические параметры циметидина после однократного перорального применения в терапевтической дозе представлены в таблице 9.

Таблица 8

Динамика концентрации циметидина (нг/мл) в плазме крови после приема препарата

Циметидин

Статистический параметр Время отбора проб, час

0,5 1 1,5 2 3 4 6 8

Меап 450,3 1030,1 1109,3 1120,1 810 5403 330,2 210,3

БО 157 427,8 420,9 450,8 238,9 370,4 66,2 64,8

БЕ 13,1 35,6 35,1 37,6 19,9 30,9 5,5 5,4

СУ 35 42 38 40 29 69 20 31

гшп 263 442 576 557 384 271 244 131

тах 843 1687 1768 1812 1153 1630 443 343

На рисунке 9 приведен усредненный график динамики концентрации циметидина после однократного перорального приема.

i

х 1000

^ воо £

Ь ш |

400 200 О

Рисунок 9. Усредненный трафик динамики концентрации циметидина.

Таблица 9

Фармакокинетические параметры циметидина после однократного перорального приема

Статистический Cmax Tmax AUCO-8 Cmax/

параметр нг/мл нг*ч/мл AUCO-8

час

Меап 1190,0 1,6 5461,2 0,214

SD 428,2 0,4 959,3 0,056

SE 35,7 0,0 79,9 0,005

CV 36 26 18 26

min 576 1 4081 0,121

max 1811 2 6692 0,305

Как видно из таблицы 9, максимальные концентрации регистрировались спустя 1,6 часа с момента приема препарата и составляли - 1190,0±428,2 нг/мл. Площадь всасывания составляла 5461,2±959,3 нг*ч/мл, отношение Cmax/AUCVs 0,214±0,056.

В таблице 10 приведены усредненные значения концентрации MEGX у пациентов на фоне приема фамотидина, ранитидина и циметидина, а также в контрольной группе, нг/мл.

Средние значения концентраций метаболита лидокаина в плазме крови на 1, 3, 5 и 7 дни исследования в I группе составляли 81,6±16,8 нг/мл, 77,9±18,7 нг/мл, 75,6±18,4 нг/мл и 75,5+18,5 нг/мл, соответственно. Проведенный статистический анализ с помощью t-теста не выявил достоверного различия между средними значениями концентраций метаболита лидокаина у пациентов I группы на 3 (р=0,62), на 5 (р=0,41) и на 7 (р=0,41) дни исследования по отношению к 1 дню исследования. Таким образом, полученные данные fie отражали выраженное понижение концентрации метаболита лидокаина в плазме крови у пациентов I группы.

Проведенный статистический анализ I и IV групп с помощью t - теста не выявил достоверного различия между средними значениями концентраций метаболита лидокаина на 1 (р=0,73), 3 (р=0,51), 5 (р=0,38) и на 7 (р=0,42) дни исследования в сравнении с 1 днем. Данный факт свидетельствует о практически отсутствующем ингибирующем влиянии 7-дневного приема фамотидина на метаболическую активность CYP3A4.

На рисунке 10 показана усредненная динамика концентраций MEGX в I группе (фамотидин) и в IV группе (контроль).

Таблица 10

Усредненные значения концентрации МЕйХ у пациентов на фоне приема блокато-ров Н2-гистаминовых рецепторов и в контрольной группе, нг/мл

Препарат Статистический MEGX

параметр 1 день 3 день 5 день 7 день

Фамотидин Mean 81,6 77,9 75,6 75,5

(I группа) SD 16,8 18,7 18,4 18,5

SE 1,4 1,6 1,5 1,5

cv 21 24 24 25

min 58,3 50,2 48,8 49,5

max 98,2 96,7 94,8 93,3

Ранитидин Mean 84,1 56,8 32,4 29,3

(II группа) SD 13,7 16,5 6,7 8,2

SE 1,1 1,4 0,6 0,7

CV 16 29 21 28

min 59,0 28,8 19,7 13,4

max 96,3 78,7 41,3 38,2

Циметидин Mean 83,8 10,3 5,1 4,6

(III группа) SD 11,5 1,9 1,5 1,4

SE 1,0 0,2 0,1 0,1

CV 14 19 29 29

min 59,7 7,1 2,3 2,0

max 95,3 13,4 8,1 7,3

Контроль Mean 83,8 82,6 81,9 81,2

(IV группа) SD 16,0 15,8 15,8 15,6

SE 1,3 1,3 1,3 1,3

CV 19 19 19 19

min 57,8 57,4 56,6 56,4

max 97,0 96,4 95,7 95,6

У О 100 80

S

грация нг/мл 60 40 —♦—фамотидин контроль

£ ъ 20

1 3 дни 5 7

Рисунок 10. Усредненная динамика концентраций MEGX в I группе

(фамотидин) и в IV группе (контроль).

Средние значения концентраций метаболита лидокаина в плазме крови на 1, 3, 5 и 7 дни исследования во II группе составляли 84,1+13,7 нг/мл, 56,8±16,5 нг/мл, 32,4+6,7 нг/мл и 29,3±8,2 нг/мл, соответственно.

Проведенный статистический анализ с помощью t-теста выявил достоверное различие между средними значениями концентраций метаболита лидокаина у пациентов II группы на 3 день исследования (р=0,0002). Из представленных данных, видно, что на 5 день исследования концентрация MEGX достоверно снижалась (р=6,31x10"") по отношению к 1 дню исследования. На 7 день исследования (р=4,77х10"") концентрация достоверно максимально снизилась по отношению к 1 дню исследования.

Проведенный попарный статистический анализ с помощью t - теста не вы- явил достоверное различие между средними значениями концентраций метаболита лидокаина у пациентов II и IV групп на 1 день исследования (р=0,97). Дальнейший статистический анализ выявил достоверное различие между усредненными значениями концентрации метаболита лидокаина у пациентов II и IV групп на 3 (р=0,0007), 5 (р= 1,32x10"9) и на 7 (р=8,07х10"10) дни исследования. Данный факт свидетельствует о выраженном ингибирующем влиянии 7-дневного приема ранитидина на метаболическую активность CYP3А4. На рисунке 11 показана усредненная динамика концентраций MEGX во II группе (ранитидин) и в IV группе (контроль).

X о 100 л

х 80

грация нг/мл 60 1 40 - —ранитидин контроль

« X 20

3 Дни 5 7

Рисунок 11. Усредненная динамика концентраций MEGX во II группе

(ранитидин) и в IV группе (контроль).

Средние значения концентраций метаболита лидокаина в плазме крови на 1,3, 5 и 7 дни исследования в III группе составляли 83,8±11,5 нг/мл, 10,3+1,9 нг/мл, 5,1±1,5 нг/мл и 4,6±1,4 нг/мл, соответственно.

Проведенный статистический анализ с помощью t-теста выявил выраженное достоверное различие между средними значениями концентраций метаболита лидокаина у пациентов III группы на 3 день исследования (р=2,03х10'16) по отношению к 1 дню исследования. На 5 (р=4,25х10"п) и на 7 (р=3,61х10"п) дни исследования концентрация метаболита лидокаина продолжала достоверно снижаться по отношению к 1 дню.

Проведенный статистический анализ III и IV групп с помощью t - теста не выявил достоверного различия между усредненными значениями концентрации метаболита лидокаина у пациентов III и IV групп на 1 день исследования (р=0,99). Дальнейший статистический анализ выявил достоверное различие между усредненными значениями концентрации метаболита лидокаина у пациентов III и IV групп на 3 (р=1,82х10"13), на 5 (р=5,57х10'14) и на 7 (р=4,04х10'14) дни исследования по отношению к 1 дню исследования между III и IV группами. Данный факт свидетельствует о сильно выраженном ингибирующем влиянии 7-дневного приема циметидина на метаболическую активность CYP3A4. На рисунке 12 показана усредненная динамика концентраций MEGX в III группе (циметидин) и в IV группе (контроль).

Средние значения концентраций MEGX в плазме крови на 1, 3, 5 и 7 день исследования в IV группе (контрольной) составляли 83,8+16,0 нг/мл, 82,6+15,8 нг/мл, 81,9±15,8 нг/мл и 81,2115,6 нг/мл, соответственно. Статистический анализ с помо-

щью Ответа показал, что в IV группе испытуемых не было выявлено достоверной разницы в концентрациях МЕОХ в плазме крови (р>0,05) на протяжении всего исследования.

Степень изменения ингибирующего влияния блокаторов Н2-гистаминовых рецепторов на активность СУРЗА4 была рассчитана с помощью Д%. На рисунке 13 показано незначительное увеличение Д% концентрации МЕвХ у пациентов I группы на 3 (4,5Д%), на 5 - 7,4Д% и на 7 - 7,5Д% дни исследования. Увеличение Д% концентрации МЕвХ у пациентов II группы на 3 день исследования составило 32,5Д%, на 5 - 61,5Д% и на 7 день исследования - 65,1Д% по отношению к 1 дню исследования. Увеличение Д% концентрации МЕОХ у пациентов III группы на 3 день исследования составило 87,7Д%, на 5 день исследования - 93,9Д% и на 7 день исследования - 94,5Д%.

—циметпдин -е—■ контроль

Рисунок 12. Усредненная динамика концентраций MEGX в III группе (циметидин) и в IV группе (контроль).

□ фамотадин

□ рашятвдин

□ циметадин

□ контроль

Рисунок 13. Изменение дельта процентов концентраций МЕОХ в четырех группах в течение 7 дней исследования в сравнении с 1 днем.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Подобраны доступные методики количественного определения фамотидина, ра-нитидина и циметидина в плазме крови с помощью ВЭЖХ с СФ-УФ детектированием. Предложенные условия хроматографирования позволяют достоверно с необходимой чувствительностью (для фамотидина - 5 нг/мл, для ранитидина - 10 нг/мл, для циметидина - 15 нг/мл) проводить фармакокинетические исследования данных препаратов.

2. Определена динамика концентрации фамотидина, ранитидина и циметидина после однократного перорального приема в терапевтической дозе: фамотидин 40 мг, ранитидин 300 мг, циметидин 400 мг (Стах для фамотидина составила 100,9±6,1 нг/мл, для ранитидина - 1023,0±156,8 нг/мл, для циметидина - 1190,0±428,2 нг/мл, Ттах составило 2, 2,5 и 1,6 часа, соответственно).

3. Изучено влияние блокаторов Нг-гистаминовых рецепторов на активность изо-фермента СУРЗА4 с помощью \1EGX - теста. Показано значимое ингибируюшее действие ранитидина и циметидина на активность СУРЗА4, а также минимальное действие фамотидина.

4. Получено, что под влиянием фамотидина активность СУРЗА4 снижается на 7,5Д%, ранитидина - 65,1Д%, циметидина - 94,5Д%.

5. При сравнительном статистическом анализе полученных результатов установлено, что степень ингибирования препаратами блокаторами Нг-гистаминовых рецепторов среди изучаемых препаратов распределяется следующим образом - цимети-дин>ранитидин>фамотидин. Данную закономерность необходимо учитывать при назначении указанных препаратов в составе комплексной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чаукина C.B. Клинико-фармакологические аспекты метаболизма лекарственных средств под действием изофермента цитохрома Р-450 CYP2D6. //Трудный пациент.-2007.-№14. - Том №5 - С. 31 -33.

2. Чаукина C.B. Особенности метаболизма лекарственных средств под действием изофермента цитохрома Р-450. //Фармация. - 2008. - №3. - С. 47 - 48.

3. Чаукина C.B., Савченко А.Ю., Раменская Г.В. Влияние CYP2D6 на метаболизм Р-адреноблокаторов. //Материалы XV Рос. нац. конф. "Человек и лекарство". - Москва. - 2008. - С. 726.

4. Чаукина C.B., Савченко А.Ю. Изучение метаболизма метопролола методом ВЭЖХ. //Материалы XV Рос. нац. конф. "Человек и лекарство". - Москва. - 2008. -С. 726.

5. Чаукина C.B., Савченко А.Ю., Раменская Г.В. Изучение влияния Н2-гистаминовых блокаторов на активность CYP3A4, с использованием MEGX - теста. //Клиническая фармакология и терапия (дополнительный). - Москва. - 2009. -№6. -С. 29-30.

6. Чаукина C.B., Савченко А.Ю., Раменская Г.В. Методика определения фамоти-дина методом ВЭЖХ. //VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». - Москва. - 2009. - С. 239 - 240.

7. Чаукина C.B., Савченко А.Ю., Раменская Г.В. Влияние Нг-гистаминовых блокаторов на активность CYP3A4. //Фармация. - 2009. - №7. - С. 9 - 11.

ЧАУКИНА Светлана Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЛОКАТОРОВ Н2-ГИСТАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ИЗОФЕРМЕНТ СУРЗА4 ЦИТОХРОМА Р-450

14.04.02. - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2010

Усл.п.л. - 1.5 Заказ №01541 Тираж: ЮОэкз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru