Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение влияния бета-каротина на некоторые звенья иммунологического воспаления в эксперименте

На правах рукописи

Од /Усг^сл

Утешев Даниил Борисович

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ В-КАРОТИНА НА НЕКОТОРЫЕ ЗВЕНЬЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ.

14.00.25 • Фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Купавна 1999 г.

Работа выполнена во Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (директор - доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель наук РФ Л.Н.Сернов) и в Российском Государственном медицинском университете (ректор - академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.Н.Ярыгин).

Научные консультанты: доктор медицинских наук В.Л. Ковалева чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Г.И.Сторожаков

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор И.С.Гущин доктор медицинских наук, профессор А.С. Кинзирский доктор медицинских наук, профессор А.Г. Муляр

диссертационного совета (Д 098.01.02) при Всероссийском научном центре по безопасности биологически активных веществ (ВНЦ БАВ) по адресу: Московская область, Купавна, ул Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНЦ БАВ.

Ведущая организация: НИИ Фармакологии РАМН

Защита состоится «..»

1999 г. в_часов на заседании

Автореферат разослан «...»

1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Доктор биологических наук

Т.Н. Робакидзе

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время общепризнанной является точка зрения на иммунное воспаление, как на главный компонент патогенеза многих заболеваний, таких как бронхиальная астма, аллергические поражения кожи и др. (Гущин И.С., 1998; Ovary Z, 1994; Spinozzi F. et al„ 1998). В связи с этим, перед современной иммунофармакологией встает проблема создания новых и безопасных иммуномодуляторов, пригодных для коррекции иммунологического воспаления (Чучалин А.Г.,1998; Гущин И.С., 1997).

С начала 80-х годов усилился интерес фармакологов к предшественнику витамина А - ß-каротину (Сергеев A.B. и др., 1993). Первоначально, ß-каротин был открыт и широко изучен как вещество, обладающее антиоксидантной активностью, и его биологические эффекты долгое время связывали именно с этим (Gerster Н., 1993). Препарат интенсивно изучался как средство для профилактики атеросклероза, опухолевых и других заболеваний. В начале 1990-х годов, было показано, что действие ß-каротина на клеточном уровне реализуется через его метаболиты - витамин А (ретинол) и ретиноевую кислоту (Bissonetti R.P. et al., 1993), и

*

интерес исследователей был практически полностью переключен на изучение фармакологической активности метаболитов ß-каротина.

Было установлено, что ретиноевая кислота обладает противовоспалительным действием (Reichert U., Fesus L., 1994). На культуре Т-лимфоцитов человека и экспериментальных животных было продемонстрировано, что ретиноевая кислота оказывает выраженное антипролиферативное действие и вызывает гибель клеток по механизму апоптоза (Szondy Z et al. 1997). Имеются данные, что ретиноевая кислота способна предотвращать развитие эмфиземы легких у крыс (Massaro С. et al., 1997). Однако, в отличие от своего предшественника, этот метаболит ß-каротина оказался чрезвычайно токсичным - в немногочисленных клинических исследованиях ретиноевой кислоты было описано немало случаев возникновения так называемого синдрома «ретиноевой кислоты» (Pfahl М„ 1996).

В экспериментах in vitro и in vivo была продемонстрирована способность ß-каротина дозо-зависимым образом влиять на антителогенез, образование IL-2, фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов как у иммунизированных, так и неиммунизированных животных (Буюклинская О.В.,1992). Кроме того, крайне важными представляются полученные в последние годы результаты фундаментальных исследований регуляторных функций ретиноевой кислоты. Установлено, что ретиноевая кислота играет роль транскрипционного фактора и регулирует экспрессию генов, ответственных за осуществление иммунных реакций (Pfahl М., 1996).

Эти данные позволяют по-новому оценить биологическую активность ß-каротина и предположить наличие у него нового, ранее не описанного противовоспалительного действия, не связанного с про-витаминной и антиоксидантной активностью. Нами было высказано предположение, что только при местном способе применения, будет осуществляться противовоспалительная активность ß-каротина.

Цель исследования: экспериментальное изучение влияния ß-каротина на различные звенья иммунологического воспаления для создания теоретических основ его применения в терапии аллергических заболеваний.

Задачи исследования:

• исследование влияния ß-каротина на реакции гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) in vitro и in vivo

• исследование влияния ß-каротина на реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) in vivo

• исследование противовоспалительной активности ß-каротина при локализации воспалительного процесса в ткани легкого (на модели экспериментального бронхоальвеолита)

• исследование противовоспалительной активности ß-каротина in vivo при локализации воспалительного процесса в коже

• исследование содержания lg G-i в крови экспериментальных животных при ингаляционном введении В-каротина

• исследование содержания В-каротина и каротиноидов в крови экспериментальных животных при ингаляционном пути введения

• исследование влияния В-каротина на апоптоз и пролиферацию лимфоцитов человека in vitro.

• исследование in vitro влияния В-каротина на агрегацию тромбоцитов человека in vitro

• исследование влияния В-каротина на показатели функции внешнего дыхания при ингаляционном пути введения на добровольцах.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что В-каротин in vitro эффективно подавляет реакции ГНТ на модели анафилактической контрактуры гладкомышечного препарата трахеи. Активность препарата на данной модели превосходит аналогичный показатель у препарата сравнения - кромогликата натрия. В-каротин при ингаляционном введении in vivo оказывает выраженный протективный эффект на развитие реакций ГНТ на модели анафилактического бронхоспазма у предварительно сенсибилизированных морских свинок. По эффективности антианафилактического действия В-каротин не уступает, а ряде случаев и превосходит кромогликат натрия. Одним из возможных механизмов действия препарата, является снижение содержания иммуноглобулина G! в крови. Впервые было установлено, что при ингаляционном способе введения В-каротина не происходит увеличение концентрации препарата и каротиноидов в крови животных, и кроме того не возникает местных побочных эффектов.

Изучение В-каротина на модели экспериментального гранулематозного воспаления легких впервые показало, что препарат обладает противовоспалительным действием, уменьшая распространенность альвеолита и эмфиземы в легких, снижая цитоз и процентное содержание нейтрофилов в бронхоальвеолярном смыве (БАС).

Впервые было установлено противоаллергическое действие В-каротина при местном воздействии на моделях аллергических реакции немедленного и замедленного типа.

В экспериментах по изучению влияния R-каротина in vitro на агрегацию тромбоцитов было впервые показано, что препарат обладает выраженным антиагрегантным действием.

При изучении влияния В-каротина на эффекторные клетки аллергического воспаления - мононуклеарные лейкоциты периферической крови человека in vitro, было впервые показано, что препарат обладает более выраженным антипролиферативным действием, чем глюкокортикоиды. Также было установлено, что препарат усиливает гибель этих клеток по механизму программированной клеточной гибели.

Впервые было показано, что при ингаляционном введении В-каротина происходит достоверное увеличение потоковой скорости выдоха у здоровых добровольцах.

Практическая значимость.

Выявленное в эксперименте антианафилактическое, противовоспалительное и антиаллергическое действие В-каротина, позволяет рекомендовать его к дальнейшему изучению в качестве потенциального лекарственного средства для лечения легочной патологии, имеющей в основе развития иммунологическое воспаление и сопровождающейся развитием бронхообструктивного синдрома (бронхиальной астмы, хронических обструктивных заболеваний легких, пневомикозов и т.д.).

Выявленное в эксперименте антиаллергическое и противовоспалительное местное действие мази В-каротина позволяет рекомендовать его дальнейшее изучение в качестве лекарственного средства для лечения аллергодерматозов.

Выявленное в эксперименте антиагрегантное действие В-каротина позволяет рекомендовать продолжить дальнейшее изучение его в качестве дезагрегантного препарата.

Внедрение в практику.

На основании экспериментальных данных разработано новое ингаляционное противоастматическое средство (имеется патент на изобретение №2132679 от 10.07.1999). Имеется патент на изобретение №2132183 от 27.06.1999 на мазь для лечения воспалительных и аллергических заболеваний кожи.

Предложен способ лечения хронических неспецифических болезней легких ингаляцией масляного раствора В-каротина в клинике, предложение внедрено в практику работы МСЧ № 1 «АМО-ЗИЛ».

Результаты работы внедрены в учебный процесс в разделе «Болезни органов дыхания» на кафедре госпитальной терапии № 2 лечебного факультета РГМУ.

Работа выполнена в ВНЦ БАВ, Старая Купавна (директор -д.м.н., проф., засл. деятель науки РФ Сернов Л.Н.) и на кафедре госпитальной терапии № 2 РГМУ (зав. кафедрой - чл.-корр. РАМН, д.м.н.,проф. Сторожаков Г.И.).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждались на VI Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999), на 6 Конгрессе Европейского Общества Аллергологов и Клинических Иммунологов (Брюссель, 1999), на II Всероссийском съезде иммунологов (Сочи, 1999).

Публикация результатов исследования. Материалы диссертации отражены в 20 публикациях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, изложена на 189 страницах машинописного текста, иллюстрирована 37 рисунками и 6 таблицами. Библиографический указатель содержит 76 отечественных и 175 зарубежных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Животные. В эксперименте использовали самцов морских свинок массой 350-400 г, белых неинбредных крыс - самцов массой 250-300 г и белых мышей линии (C57BI х СВА) F1(3\ массой 25-30 г полученных из питомника «Столбовая». Все животные содержались в условиях вивария ВНЦ БАВ при температуре 21-22'С, 12 часовом режиме освещения и свободном доступе к корму и воде. В каждой экспериментальной группе было от 10 до 20 животных.

Доноры. В эксперименте использовали кровь от клинически здоровых доноров в возрасте 25-45 лет обоего пола отделений переливания крови МСЧ № 1 «AMO ЗИЛ» и Гематологического центра РАМН.

Добровольцы. В исследование по изучению влияния ингаляционного введения ft-каротина были включены 10 добровольцев (3 мужчин и 7 женщин) из числа медицинского персонала МСЧ № 1 «AMO-ЗИЛ» (средний возраст - 28,5+7,5) и 31 школьник ЭКСД и П г.Москвы в возрасте 13-15 лет.

Используемые лекарственные соединения: /3 - каротин для ингаляционного введения готовили путем смешивания 2,5 мг химически чистой субстанции (i-каротина с 4,9975 г лактозы. Полученный после смешивания состав вводили с помощью дозирующего порошкового ингалятора, являющегося лабораторным аналогом «Циклохалера». Кромогликат натрия для ингаляционного введения - использовали коммерческий препарат «Интал», производства фармацевтической фирмы «Orion»,Финляндия, вводимый с помощью дозирующего порошкового ингалятора. Для изучения локального действия И-каротина смешивали химически чистую субстанцию IS-каротина и фармацевтического носителя. В качестве носителя была использована смесь, содержащая в 1 мл носителя- 0,1 мл воды, 0,7 мл 8 % метилцеллюлозы, 0,2 мл пропиленгликоля. После получения нужной консистенции В-каротин в виде 5 % мази наносили на конечности животных стеклянной палочкой.

В исследовании по изучению влияния ингаляционного введения I.l-каротина добровольцем и в экспериментах на

мононуклеарах периферической крови и тромбоцитах человека использовали коммерческий препарат «Ветарон», производства фирмы («Валетек», Россия) - 0,05 % раствор ß-каротина в масле.

В экспериментах в качестве препаратов сравнения использовали химически чистые субстанции следующих препаратов: сальбутамола, будесонида и теофиллина.

Так же в работе применяли следующие мази: 0,05 % мазь ретиноевой кислоты («Аэрол», фирмы Хоффман-ля Рош), 10 % мазь индометацина (производство фирмы «Фармахим») и 0,1 % мазь поликортолона (производство фирмы «Польфа»),

Методы исследования.

Исследование антианафилактических, противовоспалительных и противоаллергических свойств ß-каротина проводили с использованием следующих основных экспериментальных моделей и методов:

1 Изучение антианафилактической активности ß-каротина на экспериментальных моделях ГНТ in vitro и in vivo:

1.1. Модель гистамин-индуцированной контрактуры гладкомышечного препарата трахеи (ГПТ) морской свинки по Blattner et al (1980).

1.2. Модель анафилактической контрактуры ГПТ активно-сенсибилизированной морской свинки по Koda et al. (1970) (реакция Шульца-Дейла).

1.3. Модель антиген-индуцированного бронхоспазма по Konzett-Rossler (1940) у активно сенсибилизированных овальбумином (OA) морских свинок по Per Andersson (1980) с использованием аппарата искусственного дыхания и датчика бронхоспазма (Ugo Basile).

2. Изучение противоаллергической активности ß-каротина.

2.1. Модель реакции пассивной кожной анафилаксии у крыс по Goose J et Blair А.М (1969).

2.2. Модель реакции ГЗТ к эритроцитам барана у мышей по Lagrange (1976).

3. Изучение противовоспалительной активности ß-каро-тина на моделях воспаления in vivo:

3.1. Модель бронхоальвеолита у крыс, вызванного аэрозольным введением сефадекса А-25 (Kovaleva V.L., и др., 1995).

3.2. Модель индуцированного полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) отека лапок у крыс по Ezeamuzie a. Umezurike (1989) с измерением величины отека с помощью плетизмометра (Ugo Basile).

3.3. Модель каррагенин-индуцированного отека лапок у крыс rio Winter et al. (1962) с измерением величины отека с помощью плетизмометра (Ugo Basile).

4. Изучение влияния ß-каротина in vivo на содержание lpG1 в крови у морских свинок.

4.1. Методика определения lgG1 с помощью радиальной иммунодиффузии по Манчини (Хаитов P.M.,1995).

5. Изучение концентрации ß-каротина и его метаболитов в крови при ингаляционном пути введения.

5.1. Методика определения ß-каротина и его метаболитов в крови с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Якушкина Л.М.,1992).

6. Исследование фармакологический активности ß-каротина на культурах клеток крови человека.

6.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ), меченных [3Н]-тимидином по Oldham K.G. (1977).

6.2. Метод проточной цитометрии для изучения апоптоза МНПК человека (Trauth B.C., Keesey J., 1997).

6.3. Метод определения функциональной активности тромбоцитов по G.G.V.Born (1962).

7. Исследование влияния ингаляционного введения ß-каротина на показатели функции внешнего дыхания (потоковую скорость выдоха) у добровольцев.

7.1. Метод ингаляционного введения маслянных форм лекарственных веществ с помощью ингалятора «Clima-Maske» (Германия).

7.2. Метод мониторирования потоковой скорости выдоха с помощью минипикфлоуметра фирмы «Astra», Швеция.

1С so препаратов, используемых в эксперименте, определяли графически по методу Вилкокксона (Беленький М.Л.,1959). Для более точной оценки эффективности ß-каротина и референтного препарата применялся способ, оценивающий не только абсолютную величину бронхоспазма, но и его длительность и характер -площадь под кривой бронхоспазма - (S/t), рассчитываемой по формуле:

п

S/t = 1/2 X h х (bn., + bn);

1

где h - единица времени = 1 мин; п - время бронхоспазма 1,2, 3 и т.д. мин.); b - величина бронхоспазма (мм) в данную мин.

Статистические методы. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью методов вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (программа EXEL для Windows'95).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение антианафилактической активности ß-каротина in vitro и in vivo.

Перед тем как исследовать влияние ß-каротина in vitro на анафилактическую контрактуру, нами было исследовано влияние ß-каротина на контрактуру ГПТ морской свинки, вызванную гистамином - одним из важнейших медиаторов аллергических реакций. В качестве препаратов сравнения были использованы: теофиллин и сальбутамол. Результаты исследования показали, что теофиллин и сальбутамол вызывали дозо-зависимое расслабление контрактуры гладких мышц трахеи, в то время как ß-каротин не оказывал влияния на величину спазма ГПТ морской свинки, вызванной гистамином. Однако, ß-каротин оказывал дозо-зависимое расслабляющее действие на анафилактический спазм ГПТ морской

свинки, предварительно иммунизированной ОА и гидроокисью аллюминия. 1С50 спазмолитического действия Р-каротина оказалась равной 4х10"7М (табл. 1).

Табл. 1. Влияние различных концентраций Р-каротина на величину анафилактического спазма ГПТ морской свинки, предварительно сенсибилизированной ОА и гидроокисью аллюминия (реакция Шульца-Дейла) (М+т) (п=20).

Концентрация В-каротина Величина контрактуры изолированной трахеи (% от контроля)

10~9М 85,0+11,7

Ю^М 70,0+6,3 *

10~7М 45,5+10,6*

Ю^М 46,8+11,5 *

10"5М 34,0+9,8 *

Ю^М 21,0+7,3 *

Примечания: * - р<0,05 относительно контроля. За 100% принята величина анафилактического спазма ГПТ морской свинки, вызванного добавлением 10 мкг/мл ОА (контроль).п - количество

животных.

По эффективности действия на модели ОА-индуцированного спазма ГПТ морской свинки, предварительно иммунизированной ОА и гидроокисью аллюминия, В-каротин превосходил препараты сравнения - кромогликат натрия и теофиллин. У теофиллина 1С50 составила - 8х10"6М, в то время как у кромогликата натрия - 1С50 была значительно меньше (ИО^М) (рис. 1).

_ 70

►—бета-каротин ► — кромогликат натрия теофиллин

концентрация веществ (М).

Рис.1. Влияние бета-каротина и препаратов сравнения на ОА-индуцированную контрактуру

ГПТ морской свинки in vitro (M+m).

Антианафилактические свойства В-каротина in vivo исследовали на классической модели антиген-индуцированного бронхоспазма у активно сенсибилизированных ОА и гидроокисью аллюминия морских свинок. Бронхоспастическую реакцию вызывали введением разрешающей дозы ОА через 2 недели после начала иммунизации. Полученные данные свидетельствуют о выраженной антианафилактической активности li-каротина in vivo, при использовании разрешающих доз ОА - 150, 200 и 300 мкг/кг (рис. 2). Наибольшей эффективностью обладал В-каротин в дозе 500 мкг/вдох при курсовом введении. Ингаляция p-каротина за 1 час до введения разрешающей дозы ОА эффективно тормозила развитие анафилактического бронхоспазма только при использовании разрешающей дозы 150 и 200 мкг/кг ОА. Эффективность р-каротина подавлять анафилактический бронхоспазм оказалась сопоставимой с действием эталонного препарата - кромогликата натрия. Таким образом, в опытах in vivo были получены данные о том, что курсовое ингаляционное введение Р-каротина, а так же введение препарата за 1 час до введения ОА, оказалось эффективным в подавлении развития анафилактического бронхоспазма у морских свинок. Анализ результатов под кривой бронхоспазма свидетельствует, что В-каротин значительным образом уменьшал величину площади под кривой бронхоспазма во всех

экспериментальных группах животных. Препарат сравнения -кромогликат натрия также эффективно уменьшал величину площади под кривой бронхоспазма. Однако, при комплексной оценке бронхолитической активности В-каротина (быстрота развития и длительность эффекта), оцениваемой по величине под кривой бронхоспазма, было показано, что В-каротин обладал более выраженными бронходилятирующими свойствами, чем кромогликат натрия при использовании ОА в дозе 200 мкг/кг (р<0,05) (рис. 3).

Рис.2. Торможение анафилактического бронхоспазма у предварительно сенсибилизированных морских свинок, индуцированного ОА, под влиянием различных доз

бета-каротина в % (М+т).

25

□ контроль п=10 Пищал 50 мш'вдох; п-10

□ интзл 500 мкг/вдох; п-10

□ й-кзротин 50 мкг'вдох, п=10 Н5-кэротин 500 мкг/вдох,п=Ю

Примечание: * - р<0,05 относительно контроля п -количество животных

Рис.3. Влияние бета-каротина и интала в различных дозах на величину площади под кривой бронхослазма (БД) у морских свинок , индуцированную 200 мкг/кг ОА в мм2 (М+т).

Изучение противоаллергической активности И-каротина.

Изучение противоаллергической активности И-каротина на модели реакции пассивной кожной анафилаксии (ПКА) у крыс (Феномен Овери).

В работе использовали два разведения сыворотки, содержащей гомоцитотропные антитела (1дЕ и 1д6) 1:64 и 1:128, которые вводили для сенсибилизации крыс. Результаты исследования местной противоаллергической активности В-каротина, наносимого в виде мази на область инъекции, продемонстрировали выраженную фармакологическую активность препарата. Было установлено, что наиболее выраженный эффект В-каротина (почти полное торможение образования воспалительного пятна - на 97,2+2,5 % относительно нелеченного контроля) наблюдался при использовании в качестве индуктора воспаления сыворотки, содержащей гомоцитотропные АТ в разведении 1:64 (р<0,01). В этом случае В-каротин даже превосходил по эффективности индометацин, вызывавший торможение реакции ПКА на 73,4+1,6 % (р<0,05). При использовании более низкого титра антител эффект В-каротина снижался до 39,6+2,8 % (р<0,05), в то время как индометацин был эффективен на 93,0+2,1 % (р<0,01). При использовании ретиноевой кислоты наблюдалось торможение реакции ПКА, вызванной введением сыворотки, содержащей гомоцитотропные АТ в разведении 1:64 и 1:128, соответственно на 45,3+1,9 % и 35,8+2,1 % относительно нелеченного контроля (р<0,05).

Таким образом, на модели ПКА у крыс, В-каротин оказывал выраженный антиаллергический эффект при использовании сыворотки, содержащей гомоцитотропные АТ в двух разведениях -1:64 и 1:128. Фармакологическая активность вещества может быть связана как с блокированием взаимодействия АГ и АТ, так и с последующим торможением выброса медиаторов воспаления: гистамина, брадикинина, ацетилхолина, простагландина Е2 , серотонина и др.

Исследование противоаллергической активности ß-каротина на модели реакции ГЗТ к эритроцитам барана у мышей.

Исследуемые препараты в виде мази наносили мышам на отечную лапку на протяжении всего периода сенсибилизации в течение 5 дней. В качестве препарата сравнения использовался поликортолон. Было установлено, что в контроле величина отека лапок мышей, вызванного введением эритроцитов барана (ЭБ), составила 90,5+13,6 мг. Под влиянием полькортолона, величина отека лапки уменьшалась до 58,6+13,2 мг (р<0,05). ß-каротин также вызывал снижение массы отечной лапки до 63,2+10,8 мг (р<0,05). Было установлено, что ß-каротин эффективно подавлял выраженность реакций ГЗТ на 30,6+5,2 %. Действие поликортолона оказалось несколько сильнее - препарат вызывал 35,5+5,7 % торможение аллергической реакции.

Изучение противовоспалительной активности ß-каротина на моделях воспаления in vivo.

Изучение противовоспалительной активности ß-каротина на модели бронхоальвеолита у крыс, вызванного аэрозольным введением сефадекса А-25.

Кроме бронхолитической активности in vitro и in vivo, в исследовании противовоспалительной активности ß-каротина, представлялось принципиально важным изучить способность препарата воздействовать на иммунное воспаление в легких экспериментальных животных. Для этого была использована недавно разработанная модель бронхоальвеолита у крыс, вызванная ингаляционным введением сефадекса (Kovaleva V.L., Makarova O.V.,1995). Процессы воспаления в легких крыс исследовали на 7 сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25, так как в этот период наблюдалась максимальная выраженность воспалительного процесса. Влияние ß-каротина на воспаление в легких оценивали по результатам гистологического исследования легких; морфометрической характеристике легочной ткани; цитологическому исследованию бронхоальвеолярного смыва

(цитоз и эндопульмональная цитограмма); характеристике клеточной инфильтрации межальвеолярных перегородок. При морфологическом исследовании легких крыс во всех опытных группах наблюдений была выявлена картина острого бронхита, альвеолита и эмфиземы легких. При этом наибольшая выраженность альвеолита и эмфиземы определялась в контрольной группе крыс, подвергавшихся аэрозольному воздействию сефадекса А-25, где объемная плотность * составляла, соответственно -10,0±2,3 и 12,9+2,0 объемных процентов (об. %) (рис. 4 и 5). Бронхоальвеолярный смыв характеризовался нарастанием показателя цитоза. В эндопульмональной цитограмме преобладали макрофаги и нейтрофилы.

В группе крыс, получавших кромогликат натрия в дозе 50 мкг/вдох ежедневно, распространенность альвеолита и эмфиземы достоверно уменьшалась по сравнению с контролем. Показатели объемной плотности составили, соответственно, 2,2±0,8 и 6,4±1,1 об. %. В группе животных получавших кромогликат натрия в дозе 500 мкг/ вдох, также как и в предыдущей группе наблюдений, было выявлено достоверное снижение показателя объемной плотности альвеолита (3,4±1,0 об. %) и тенденция к уменьшению распространенности эмфиземы (7,8±3,0 об. %). В группе животных получавших (3-каротин в дозах 50 и 500 мкг/вдох, показатели объемной плотности альвеолита достоверно снижались по сравнению с контролем и составили, соответственно, 4,2±0,9 и 4,3+0,5 об. % (рис. 4). Распространенность эмфиземы в группе животных, получавших 3-каротин в дозе 50 мкг/ вдох, уменьшилась до 6,4+2,0 об. % (рис. 5). Использование В-каротина в дозе 500 мкг/вдох не влияло на выраженность эмфиземы.

Цитологическое исследование БАС у крыс на 7-е сутки после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 выявило увеличение процентного содержания нейтрофилов (рис. 6) и тенденцию к увеличению содержания лимфоцитов по сравнению с группой интактных животных. Процентное содержание нейтрофилов в БАС крыс, получавших кромогликат натрия в дозе 500 мкг/вдох, снижалось (рис. 6). Показатели цитоза в указанных группах

животных достоверно не отличались от таковых в предыдущих группах исследования. В БАС крыс, получавших Р-каротин в дозе 500 мкг/вдох в течение 7 дней определялось достоверное снижение показателей процентного содержания нейтрофилов (рис. 6). Было отмечено уменьшение показателей цитоза при использовании В-каротина в дозе 500 мкг/вдох с 0,07+0,04 млн. кпеток/мл до 0,04+0,001 млн. клеток/мл (р<0,05).Проведенное нами исследование позволило впервые выявить противовоспалительную активность В-каротина в отношении гранулематозного воспаления легких, вызванное ингаляционным введением сефадекса. Возможные механизмы действия р-каротина на данной модели (уменьшение инфильтрации стенок бронхов и межальвеолярных перегородок лимфоцитами и нейтрофилами, а также уменьшение содержания нейтрофилов в БАС) могут быть связаны, с свойствами препарата подавлять пролиферацию лимфоцитов, усиливать апоптоз нейтрофилов и угнетать высвобождения медиаторов воспаления. Таким образом, проведенное исследование показало, что Р-каротин обладает противовоспалительным действием, уменьшая распространенность альвеолита и эмфиземы в легких, снижая процентное содержание нейтрофилов и показателей цитоза в БАС при экспериментальном гранулематозном воспалении легких, вызванного сефадексом.

12 ■

10

□ сефадекс А-25,п=10

а питал 50 мкг/вдох п=10

□ интал 500 мкг/вдох.п—10

□ Х-каротин 50 (;КГ/6Д0/:Г|-10 ОЗ-каротин 500 Ыкг/вдох:п=10

Примечание:р<0,05. п-количество животных.

Рис,4. Показатели объемной плотности альвеолита (%) у крыс после аэрозольного воздействии сефадекса А-25 (контроль) и ингаляционного введения лекарственных веществ

в различных дозах (М+т).

14

12

10

□ сефзлекс А-25,п=И0 Оинтал 50 м к г/вдох п-10

□ питал 500 мкг'вдох.п=10

□ В-каротин 50 мк17вдох,п=10 Bß-каротин 500 мкг/вдох.п=10

Примечание " -р<0,05 п - количество животных

Рис.5. Показатели объемной плотности эмфиземы (%) в легких крыс после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 (контроль) и ингаляционного введения лекарственных веществ

в различных дозах (М^гп).

йРШРч!

Вмщж Ш л г* «

|| Ъ Г° "»

■Yi.'i fft Им

□ интзктные животные,n=10

□ сефадекс;п=10

□ питал 50 мкг/вдох;п=10

□ интал 500 мкг/вдох:п=10 ОВ-каротин 50 мкг/вдох,п=10

□ S-каротин 500 мкг/вдох;п=10

Примечание: * - р<0,05 относительно контроля (сефадекс). п-количество животных.

Рис.6. Процентное содержание нейтрофилов а БАС крыс после аэрозольного воздействия сефадекса А-25 (контроль) и при ингаляционном введении препаратов в различных дозах

(М+т).

Изучение противовоспалительной активности В-каротина на моделях ПАФ- и каррагенин индуцированного отека у крыс.

При использовании В-каротина происходило выраженное угнетение ПАФ-индуцированного отека лапы крыс на 39,9+1,7 % по сравнению с нелеченым контролем (р<0.05). При использовании метаболита В-каротина - ретиноевой кислоты была отмечена тенденция к увеличению отека, не носившая статистически значимое различие по сравнению с нелеченым контролем. Препарат сравнения - индометацин на 40,2+2,6 % подавлял ПАФ-индуцированный отек (р<0.05).

Влияние В-каротина на каррагенин-индуцированный отек лапы крыс было меньше - торможение воспаления на данной модели составило 22,9+2,2 % (р<0,05) по сравнению с нелеченым контролем. Ретиноевая кислота не оказывала влияния на данной модели воспаления. Противовоспалительное действие индометацина было более выраженно - препарат тормозил каррагениновый отек на 32,9+4,9 % (р<0.05). Результаты экспериментов впервые продемонстрировали, что В-каротин эффективно тормозил ПАФ - и каррагенин-индуцированный отек у крыс при местном воздействии. На модели ПАФ-вызванного воспаления действие В-каротина оказалось сопоставимо с эффектом эталонного препарата - индометацина. Ретиноевая кислота, на моделях острого воспаления, индуцированного ПАФ и каррагенином, не влияла на эти виды воспаления, что позволяет сделать вывод о том, что в данной ситуации действие В-каротина не реализуется через активность его метаболита. Можно предположить, что в основе фармакологической активности В-каротина лежит свойство препарата блокировать метаболизм арахидоновой кислоты, как по циклооксигеназному, так и липооксигеназному пути, а так же препятствовать активации комплемента и тормозить освобождение гистамина, 5-окситриптамина и кининов.

Изучение влияния В-каротина /л vivo на содержание ¡gG1 в крови морских свинок.

В настоящей работе нами была предпринята попытка изучить влияние В-каротина при ингаляционном введении на содержание IgGi в крови у морских свинок. Нами было установлено, что после 2 недельного ингаляционного введения 50 мкг/вдох В-каротина происходило снижение на 45 % содержания IgGi в крови у морских свинок (р<0,05). Таким образом, можно предположить, что действие (i-каротина на течение аллергических реакции немедленного типа носит опосредованный lg G! характер и его антианафилактическое действие реализуется за счет торможения образования важнейшего медиатора аллергии - иммуноглобулина Gb относящегося наряду с иммуноглобулином Е к классу гомоцитотропных антител (Гущин И.С., 1998, Tomasi Т.В., Cebra J.J., 1974).

Исследование содержания li-каротина и каротинидов в плазме крови морских свинок при курсовом ингаляционном пути

введения.

Разработка нового способа применения (i-каротина в ингаляционном виде поставило перед нами вопрос о том как реализуется его действие - локально в дыхательных путях или за счет его поступления в кровь и системного эффекта. С помощью метода ВЖЭХ было установлено, что ингаляционный способ введения не влиял на показатели концентрации препарата в системном кровотоке. В контроле содержание В-каротина в крови у морских свинок составляло 3,6+1,3 мкг/мл, у животных опытной группы, получавших на протяжении 2 недель В-каротин в дозе 50 мкг/вдох концентрация В-каротина в крови составляла 3,8±1,4 мкг/мл. Необходимо подчеркнуть, что животные контрольной и опытной группы содержались в условиях одинакового пищевого режима. Также не изменялись показатели концентраций других каротиноидов. Таким образом, можно констатировать, что при ингаляционном введении В-каротина в дозе 50 мкг/вдох (140 мкг/кг веса животного) не происходит повышение его содержания в крови и

действие препарата носит локальный, а не системный характер. Нами была отмечена хорошая переносимость препарата, случаи летальных исходов и развития побочных эффектов не наблюдались.

Исследование фармакологической активности ii-каротина на культурах клеток крови человека.

Исследование влияния Ii-каротина на реакцию бласттрансформации лимфоцитов человека, меченных [3Н]-тимидином.

Результаты эксперимента свидетельствуют, что в контроле уровень спонтанной пролиферации мононуклеаров периферической крови (МНПК) in vitro был равен 1821 ± 239 имп/мин (табл. 2). (J-каротин и другие тестируемые препараты не оказывали влияния на этот показатель. При инкубировании клеток с ФГА регистрировалось значительное усиление пролиферативного ответа МНПК человека (23511 ± 4895 имп/мин) (р<0,01) (рис. 7). Однако, при совместном инкубировании клеток с ФГА и li-каротином и будесонидом in vitro, происходило выраженное снижение пролиферативной активности МНПК - до 3912+1249 имп/мин под влиянием ii-каротина (р<0,01), и до 7180+1279 имп/мин под влиянием будесонида (р<0,01).

Анализ полученных данных показывает, что исследуемые препараты не оказывали влияние на уровень спонтанной пролиферации МНПК. Однако (3-каротин в концентрации 10"6 М и будесонид в концентрации 10"9 М оказывали выраженный ингибирующий эффект на ФГА - индуцированный пролиферативный ответ клеток.

40000

35000 -

30000

25000

20000

15000

^0000

5000

□ контроль (ФГА). п=20

□ й-каротин п=20 сзльбутамол, п=20

□ будесонид; п=20

□ теофиллин. п=20 Пкромогликат натрия, п=20

Примечание: * - р<0,01 относительно контроля п - количество проб.

Рис. 7. Влияние лекарственных средств на ФГА-индуцированную пролиферацию МНПК человека (М+т).

Табл. 2. Влияние препаратов на спонтанную и ФГА-индуцированную пролиферацию МНПК in vitro (М±т).

Препарат Спонтанная ФГА-

пролиферация индуцированная

Включение 3Н-тимидина (имп/мин).

Контроль; п=20 1821 ±239 23511± 4895

[3-каротин 1СГ6 М; п=20 2001 ± 270 3912 ± 1249*

Сальбутамол 10"9 М; п=20 2264 ± 364 30035 ± 6092

Будесонид 10"9М;п=20 2086 ± 284 7180 ± 1279*

Теофиллин 10"5 М; п=20 15981232 26818 ± 5216

Кромогликат натрия 10"6 1947 ±325 28741 ± 5643

М; п=20

Примечание: * - р<0,01 относительно контроля; п - количество проб

Сведения об индексах стимуляции представлены в табл. 3. Средний индекс стимуляции (ИС) при стимуляции клеток ФГА составил 12,9. Под влиянием р-каротина наблюдалось более чем шестикратное снижение ИС, будесонид вызывал его снижение в 4 раза относительно положительного контроля (ФГА). Остальные из исследованных препаратов (сальбутамол, теофиллин и кромогликат натрия) в терапевтических концентрациях не оказывали влияние на пролиферацию МНПК.

Таким образом, при исследовании влияния |}-каротина на пролиферацию МНПК человека было установлено, что препарат в концентрации 10"6 М эффективно угнетает пролиферацию МНПК человека (индекс стимуляции клеток снижается более чем в 6 раз). Препарат, относящийся к группе ГКС, на данной модели оказался менее активен - будесонид, снижал ИС в 4 раза.

Табл. 3. Влияние препаратов in vitro на индексы стимуляции МНПК.

Группы ИС относительно контрольных проб при действии:

ФГА 12,9

ß-каротин 10~6 М+ФГА 2,1

Сальбутамол 10'9 М+ФГА 16,5

Будесонид 10"9 М+ФГА 3,9

Теофиллин 10'5 М+ФГА 14,7

Кромогликат 15,8

натрия 10"6 М+ФГА

Полученные результаты позволяют предположить, что противовоспалительное действие ß-каротина связано с торможением пролиферативного ответа мононуклеарных клеток -важнейшего компонента воспалительных реакций. Однако, точные механизмы антипролиферативного действия ß-каротина требуют дополнительного исследования.

Исследование влияния ß-каротина на апоптоз МНПК человека.

В настоящее время, особое внимание отводится нарушениям некоторых механизмов программированной клеточной гибели в аллергическом воспалении. Например, при атопической форме БА имеет место несостоятельность, прежде всего апоптоза эозинофилов и Т-лимфоцитов (Simon HU и соавт., 1996; 1997). Это обусловливает необходимость изучения противовоспалительных препаратов в модулировании процессов апоптоза клеток, вовлеченных в воспалительные реакции.

Результаты исследования показали, что под влиянием поликлонального активатора ФГА в контроле процент мононуклеаров периферической крови человека в состоянии апоптоза составил 41,48 ± 3,72 % (рис. 8) и 40,75 ± 5,07 % всех клеток были с диплоидным набором хромосом (рис. 9).

При инкубировании клеток, активированных ФГА, с ß-каротином регистрировалось статистически значимое увеличение процентного содержания МНПК в состоянии апоптоза до 51,69 ± 5,06 % (р<0,05) и снижение процентного содержания МНПК с диплоидным набором хромосом до 19,07 ± 2,04 % (р<0,01).

Другие препараты (будесонид, кромогликат натрия, теофиллин и сальбутамол) не оказывали влияние на апоптоз МНПК и процентное содержание клеток с диплоидным набором хромосом in vitro.

Таким образом, ß-каротин в концентрации 10"6 М существенным образом повышал процент клеток, находящихся в апоптозе и более чем в два раза снижал количество клеток с диплоидным набором хромосом.

Механизмы запуска процессов клеточной гибели мононуклеарных клеток под влиянием ß-каротина на данной модели могут быть связаны с образование его высокоактивных метаболитов: All-trans ретиноевой кислоты и 9-цис-ретиноевой кислоты и действием на Т-клеточный рецептор с последующей индукцией гена ' nur-77, синтезом Fas L и TNF (Nagy L et al., 1998).

50

Dконтроль (ФГА), П=2Э

□ S-каротин, п-20

□ сапьбутамол, п-20

□ будесонид, п-20 Итеофиллин; п-20

П кромогликат натрид, п=20

Примечание: - р<0.05 относительно контроля, п-»оличестзо проб

Рис.8. Влияние лекарственных веществ in vitro на апоптоз мононуклезров периферической

крови человека (М+т).

45

щ.. „

f®

г Л"

-.

• , *7 Г!

* 9Ш

л

□ контроль (ФГА); п-20

□ R-каротин, п-20

□ сальбутамол: п=20

□ будесонид; л=20 Птеофиллин; п-20

□ кромогликат натрия: п=20

Примечание. * -

р<0.01 относительно контроля п- количество проб

Рис.9. Влияние лекарственных веществ in vitro на частоту появления мононуклеаров периферической крови человека с диплоидным набором хромосом (М+т).

Исследование влияния ii-каротина на функциональную активность тромбоцитов.

При добавлении В-каротина в среду инкубации происходило достоверное снижение агрегации тромбоцитов, вызванное АДФ до 33,2+1,9% (р<0,05). В-каротин также ингибировал величину коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов до 35,3+1,9% (р<0,05). Таким образом, В-каротин in vitro эффективно тормозил АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов на 42% по сравнению с контролем и на 37% -агрегацию тромбоцитов, вызванную коллагеном (рис. 10).

Торможение АДФ-индуцированной агрегации

|3 7%

Торможение коллаген-индуцированной агрегации

Рис. 10. Торможение АДФ и коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов человека in vitro под влиянием В-каротина (% от контроля).

Исследование влияния ингаляционного введения В-каротина на показатели функции внешнего дыхания (потоковую скорость выдоха) у добровольцев.

При ингаляционном введении В-каротина здоровым добровольцам в течении 7 дней на аппарате для ингаляции маолянных растворов «СПта-Мавке» была отмечена хорошая переносимость препарата. При исследовании влияния ингаляционного введения В-каротина на величину потоковой скорости выдоха (ПСВ) были получены следующие результаты: показатели ПСВ до ингаляционного введения В-каротина составляли 453,1+35,1 л/мин ; после процедуры - 516,4+28,8 л/мин. Прирост объемного показателя дыхания составил 63,8+10,2 л/мин (р<0,05), что в процентном соотношении составило -14 %.

Анализ полученных результатов свидетельствует о статистически значимом увеличении показателей ПСВ после курсового ингаляционного введения В-каротина на 14 % у всех обследованных добровольцев.

В качестве дополнительного контроля на стабильность показателей функции внешнего дыхания было исследовано изменение ПСВ у 31 школьника г.Москвы в течение недели. Было отмечено отсутствие статистически значимого изменения этого показателя: 511,6+20,6 мл/мин в первый день измерения и 514,5+25,3 мл/мин на 7 день измерения.

Таким образом ингаляционное введение В-каротина в течение 7 дней здоровым лицам достоверно увеличивает показатели ПСВ. Обнаруженное свойство В-каротина в ингаляционной форме позволяет рекомендовать препарат для дальнейшего изучения в качестве потенциального ингаляционного средства.

Результаты настоящего исследования свидетельствуют, что В-каротин обладает противовоспалительным, бронходилятирующим и антиаллергическим действием на различных экспериментальных моделях (табл. 4).

Табл. 4. ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ, АНТИАНАФИЛАКТИЧЕСКОЕ И ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ В-КАРОТИНА

МОДЕЛЬ ЭФФЕКТ

1. Антиген-индуцированный спазм ГПТ морской свинки in vitro 1. Антианафилактический эффект

2. Модель анафилактического бронхоспазма in vivo 2.а)Бронходилятирующий эффект б)уменыиение содержания 1дС!

3. Модели острого воспаления, вызванные ПАФ и каррагенином 3. Антиэкссудативное действие

4. Сефадекс-индуцированный бронхоальвеолит 4. Противовоспалительное действие (торможение накопления нейтрофилов в БАС)

5. Модели аллергических реакций (ГЗТ, вызванная эритроцитами барана; ПКА) 5. Противоаллергическое действие

6. РБТЛ МНПК человека 6. Антипролиферативное действие

7. Апоптоз МНПК человека 7. Индукция алоптоза МНПК

8. Активность тромбоцитов 8. Торможение агрегации

9. Функциональная активность бронхолегочного аппарата у здоровых людей 9. Увеличение потоковой скорости выдоха

Нами было показано, что (3-каротин вызывает расслабление гладких мышц изолированного ГПТ иммунизированной морской свинки на фоне спазма, вызванного добавлением овальбумина. При этом он не оказывал эффекта на ГПТ неиммунизированного животного. При использовании гистамина и ацетилхолина в качестве индукторов бронхоспазма действие р-каротина не проявлялось. На основании полученных данных можно сделать вывод о прямом

расслабляющем действии p-каротина на ГПТ, которое развивается только в условиях предварительной сенсибилизации организма животного. За развитие релаксирующего действия В-каротина на ГПТ могут быть ответственны следующие механизмы: 1) действие В-каротина опосредуется через образование его метаболитов (например ретиноевую кислоту); 2) миорелаксирующее действие р-каротина может быть связано с торможением освобождения биологически активных веществ (например, гистамина) и иммуноглобулинов, ответственных за констрикторное действие на ГПТ (Robinson D.S et al., 1993; Schmutzler W., etal., 1997).Нами было сделано предположение, что p-каротин может оказывать не только прямое релаксирующее действие на анафилактическую контрактуру ГПТ, но и тормозить аллергическое воспаление в воздухоносных путях in vivo, протекающее по механизму реакции ГНТ. Для проверки этого предположения была проведена серия опытов, в которой исследовали влияние ингаляционного введения p-каротина на развитие анафилактического бронхоспазма у морских свинок in vivo.

При исследовании in vivo действия p-каротина на динамику анафилактического бронхоспазма у морских свинок было установлено, что курсовое ингаляционное введение p-каротина в дозе 50 и 500 мкг/вдох ежедневно в течение 2 недель эффективно тормозило развитие анафилактического бронхоспазма, вызванного введением разрешающей дозы OA. Наибольшей эффективностью обладал В-каротин в дозе 500 мкг/вдох при курсовом введении.

Эффективность В-каротина оказалась сопоставимой с эффективностью эталонного препарата - кромогликата натрия, а при использовании OA в дозе 200 мкг/кг веса животного В-каротин по своей эффективности даже превосходил референтный препарат.

Для уточнения возможных механизмов реализации указанных эффектов p-каротина было исследовано влияние препарата in vivo на освобождение lg G i в ходе реакции ГНТ. Было установлено, что под влиянием p-каротина происходило снижение содержания IgGi на 45 % в крови у животных. Таким образом, можно предполагать, что действие p-каротина на течение аллергических реакции ГНТ опосредуется через уменьшение содержания lg G,

Данное свойство В-каротина представляется крайне важным, так как в литературе имеются данные о том, что кромогликат натрия способен увеличивать выброс иммуноглобулинов этого класса («¡та1а Н. а1.,1993).

В последнее время появились сообщения о подавлении развития эмфиземы легких у новорожденных крыс под влиянием ретиноевой кислоты - естественного регулятора многих физиологических функций организма, образующейся из провитамина А - р-каротина (МаэБаго й е1 а1., 1997). Проведенное нами исследование позволило впервые выявить противовоспалительную активность В-каротина в отношении гранулематозного воспаления легких, вызванного ингаляционным введением сефадекса. Возможные механизмы действия Р-каротина на данной модели (уменьшение инфильтрации стенок бронхов и межальвеолярных перегородок лимфоцитами и нейтрофилами, а также уменьшение цитоза и содержания нейтрофилов в БАС) могут быть связаны с описанными ранее, свойствами препарата подавлять пролиферацию лимфоцитов, усиливать апоптоз нейтрофилов и угнетать высвобождения медиаторов воспаления.

На моделях острого воспаления у крыс, было впервые установлено, что В-каротин эффективно тормозил ПАФ- и каррагенин-индуцированный отек у крыс при местном воздействии. На модели ПАФ-вызванного воспаления действие В-каротина оказалось сопоставимо с эффектом эталонного препарата -индометацина. Ретиноевая кислота, на моделях острого воспаления, индуцированного ПАФ и каррагенином, не влияла на эти виды воспаления, что позволяет сделать вывод о том, что в данной ситуации действие В-каротина не реализуется через активность его метаболита.

При изучении антиаллергического действия В-каротина была описана его высокая эффективность на моделях реакции пассивной кожной анафилаксии у крыс и реакции гиперчувствительности замедленного типа, вызванной эритроцитами барана у мышей. Таким образом, В-каротин тормозит аллергические реакции, протекающие по механизмам ГНТ и ГЗТ.

При исследовании механизмов действия fi-каротина было впервые установлено, что препарат in vitro снижает пролиферативную активность лимфоцитов и повышает их программированную гибель, а также подавляет функциональную активность тромбоцитов, что может служить одним из объяснений его противовоспалительного действия.

Результаты экспериментальных исследований послужили предпосылкой для изучения действия (J-каротина на показатели функции легких у человека. Нами было установлено, что при ингаляционном введении В-каротина здоровым лицам происходит дилятация бронхов при курсовом введении. Данные результаты, во-первых, свидетельствуют о эффективности бронхорасширяющего действия В-каротина; во-вторых, - отсутствие каких-либо побочных эффектов у препарата говорит о безопасности его применения.

В заключение необходимо подчеркнуть, что проведенное нами исследование позволило впервые выявить его противовоспалительное, бронхорасширяющее и противоаллергическое действие. Также впервые выявленная высокая противоаллергическая активность 12>-каротина при местном воздействии, позволяет рассматривать возможность разработки • лекарственного препарата в виде мази.

Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать дальнейшее изучение этого вещества для лечения заболеваний легких, сопровождающихся бронхообструкцией. Следует отметить, что в настоящем исследовании был впервые использован ингаляционный путь введения p-каротина и, нами не было отмечено усиления экссудативного компонента воспаления, наблюдаемого при ингаляционном введении таких препаратов, как астмазин и теофиллин (Сладкопевцев А.С.,1998), связанного с раздражающим действием этих веществ на слизистую оболочку дыхательных путей. Также впервые выявленная, высокая противоаллергическая активность (Ь-каротина при местном воздействии, позволяет рекомендовать дальнейшее клиническое изучение мази на основе В-каротина.

ВЫВОДЫ

1. На моделях реакций гиперчувствительности немедленного типа in vitro и in vivo у предварительно иммунизированных морских свинок было обнаружено антианафилактическое действие В-каротина при местном применении.

2. На моделях реакций гиперчувствительности замедленного типа при местном использовании В-каротина было установлено его противоаллергическое действие.

3. На модели экспериментального бронхоальвеолита (i-каротин при ингаляционном введении, оказывает выраженное противовоспалительное действие, сопровождающееся уменьшением плотности альвеолита и эмфиземы, снижением цитоза и процентного содержания нейтрофилов в бронхо-легочных смывах.

4. На моделях острого воспаления, вызванного введением крысам каррагенина и полного адъюванта Фрейнда, В-каротин при местном воздействии на кожу оказывает выраженное противовоспалительное действие.

5. Возможным механизмом антианафилактического действия В-каротина in vivo является его способность уменьшать содержание в крови иммуноглобулина Gv

6. Развитие антианафилактического эффекта при ингаляционном введение В-каротина носит местный характер и не сопровождается увеличением его содержания в крови животных.

7. При ингаляционном введении В-каротина здоровым добровольцам наблюдалось увеличение показателей функциональных легочных объемов - показателя потоковой скорости выдоха.

8. Комплексная оценка полученных экспериментальных данных позволяет сделать вывод о наличии у В-каротина при местном воздействии противовоспалительной, антианафилактической и противоаллергической активности. Механизмы фармакологического эффекта В-каротина могут быть связаны с антипроли-феративной и проапоптотической активностью препарата in vitro в отношении лимфоцитов и торможением функциональной активности тромбоцитов.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ингаляционное противоастматическое средство. Патент на изобретение № 2132679 от 10.07.1999. Утешев Д.Б., Кострюков Е.Б., Утешев Б.С.. Ковалева В.Л., Сторожаков Г.И., Сергеев А.В.

2. Мазь для лечения воспалительных и аллергических заболеваний кожи. Патент на изобретение № 2132183 от 27.06.1999. Утешев Д.Б., Прокофьев П.С., Кострюков Е.Б., Утешев Б.С., Ковалева В.Л., Сторожаков Г.И., Сергеев А.В.

3. Д.Б.Утешев, А.В.Сергеев, Б.С. Утешев. Адгезивные молекулы. //Экспериментальная и клиническая фармакология.-1997.-60,-№.3.-С.83-88.

4. Д.Б.Утешев, А.В.Сергеев, Б.С.Утешев. Иммуномодулирующее действие ретиноидов. // Экспериментальная и клиническая фармакология.-1998.-61.-№.5.-С.30-33.

5. Д.Б.Утешев, А.В.Сергеев, Б.С.Утешев. Анализ иммуномо-дулирующих свойств ретиноидов. // Информационный сборник Новости науки и техники -1998.-№5.-С.1-10.

6. Д.Б.Утешев, А.В.Сергеев, Б.С. Утешев. Апоптоз: фармакологические аспекты. // Экспериментальная и клиническая фармакология.-1998.-61 .-№.4.-С.57-65.

7. Д.Б.Утешев, А. В.Сергеев, Б.С. Утешев. Строение и функции ретиноевых рецепторов. // Экспериментальная и клиническая фармакология.-1998.-61 .-№.6.-С.65-72.

8. D.B.Uteshev, A.V.Sergeev, B.S.Uteshev. Analysis of immuno-modulating propereties of retinoids. // Russian Journal of lmmunotogy.-1998.-3.-Vol.3-4.-P.223-237

9. Д.Б.Утешев, А. В.Сергеев, Б.С. Утешев, М.Я. Шашкина, Г.И. Сторожаков. Перспективы применения IJ-каротина как имму-нотропного препарата. // Иммунология, - 1999г. - №4. - М. 17-19

10. D. Uteshev, V. Kovaleva, В. Uteshev, G.Storagjakov. Influence of some drugs used in treatment of bronchial asthma on proliferation of human mononuclear cells in vitro. // Allergy. -1999. -Vol.54.-N.4. -P.562.

11. Д.Б.Утешев, В.Л.Ковалева, П.С.Прокофьев, Г.И. Сторожаков. Влияние противоастматических препаратов на пролиферацию

мононуклеарных клеток человека in vitro. // Экспериментальная и клиническая фармакология.-1999.-62.-№.2.-С.32-37.

12. Д.Б.Утешев, А.А.Карабиненко, А.В.Сергеев, М.Я.Шашкина, Г.И.Сторожаков. Особенности применения В-каротина в клинической медицине. // В мире лекарств. -1999. -№.4- С.35-37

13. Д.Б.Утешев, Е.Б.Кострюков, А.А.Карабиненко, В.Л.Ковалева, Г.И.Сторожаков Антиастматическое действие В-каротина в эксперименте . //Аллергия, астма и клиническая иммунология. -1999.-№2.-С.1-9.

14. Д.Б.Утешев, А.А.Карабиненко, П.С.Прокофьев, Г.И.Сторожаков. Влияние противоастматических препаратов на пролиферацию и апоптоз периферических мононуклеаров человека in vitro. //Пульмонология.-1999.-Т.9.-№2.-С.2г>-2</

15. Д.Б.Утешев, В.Л.Ковалева, Г.И.Сторожаков. Влияние антиастматических препаратов на пролиферацию и апоптоз периферических мононуклеаров человека.. Тезисы докладов VI Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 1999. -С.72.

16. Е.Б.Кострюков, Д.Б.Утешев, В.Л.Ковалева. Антиаллергическая активность В-каротина. Тезисы докладов VI Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 1999. -С.41.

17. Д.Б.Утешев, Г.Н. Петрухин, С.А. Калугин, В.А. Макаров. Влияние В-каротина на агрегацию тромбоцитов in vitro. Тезисы докладов VI Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 1999. -С.72.

18. П.С.Прокофьев, Д.Б. Утешев, В.Л. Ковалева. Антиаллергическая и противовоспалительная активность мази В-каротина. Тезисы докладов VI Национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 1999. -С.61.

19. Д.Б.Утешев,А.А.Карабиненко, В.Л.Ковалева. Противовоспалительное, антианафилактическое и противоаллергическое действие В-каротина при местном применении. // Russian Journal of lmmunotogy.-1999.- Vol.4.- Suppl.1. - P. 118

20. Д.Б.Утешев, Г.И. Сторожаков, А. В.Сергеев, Б.С. Утешев. Ретиноевая кислота как возможный регулятор апоптоза в иммуной системе. // Иммунология. - 1999г. - №5. - М. - С. 12-14