Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Фармакология и механизм антиканцерогенного действия каротиноидов

На правах рукописи

р ~ п п

15 :.:д:1 т

Коростелев Сергеи Анатольевич

ФАРМАКОЛОГИЯ И МЕХАНИЗМ АНТИКАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ КАРОТИНОИДОВ

14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2002

Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им Н.Н.Блохнна Российской Академии медицинских наук

Научные консультанты:

-действительный член РАЕН, академик РМТА и РБА,. заслуженный деятель науки и техники РФ, доктор медицинских наук, профессор АЛО.Барышников -доктор медицинских наук, профессор А.В.Сергеев -доктор медицинских наук, профессор А.Б.Сыркин |

Официальные оппоненты:

-доктор медицинских наук, профессор Э.А.Рудзит - академик МАИ, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Р.Д.Сейфулла -доктор медицинских наук, профессор А.Г.Муляр

Ведущая организация:

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится ' «__»_2002г. на

заседании диссертационного совета Д002.252.01 при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН по адресу: 117977, Москва, Ленинский проспект, дом 38, корпус б-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН

Автореферат разослан «___»__2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор биологических наук Л.А.Радкевич

V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из путей профилактики злокачественных новообразований является использование средств, способных препятствовать возникновению и развитию

опухолевого процесса. Однако, арсенал таких средств, используемых в настоящее время, ограничен. С одной стороны, это связано с недостаточно изученными причинами и механизмом возникновения и развития опухоли, что препятствует созданию средств направленного действия и, с другой стороны, с тем, что серьезное внимание к проблеме профилактики злокачественных новообразований проявилось только в последние десятилетия, что является незначительным сроком по сравнению со столетиями изучения способов и средств лечения опухолей.

Среди относительно небольшого числа веществ, антиканцерогенный эффект которых в той или иной степени можно считать экспериментально доказанным, выделяется группа сильно ненасыщенных углеводородных соединений тетратерпенового ряда, объединяемая под общим названием «каротиноиды».

Информация, свидетельствующая о защитном действии каротиноидов в отношении онкогенеза, получена главным образом из двух источников - из эпидемиологических исследований и лабораторных экспериментов. Эпидемиологические доказательства противоракового эффекта получены при сравнении питания онкологических больных и здоровых людей. Имеются данные относительно рака легких, толстой кишки, желудка, мочевого пузыря, пищевода, молочной железы, шейки матки, простаты. Доказано, что низкое содержание в пищевом рационе ретинола и бета-каротина ассоциируется с 1,5-2 кратным повышением риска последующего заболевания раком легкого, а пищевой рацион, содержащий каротиноиды, приводит к снижению частоты рака пищевода и желудка. Выявлено, что при относительно высокой концентрации бета-каротина в сыворотке крови общая заболеваемость различными злокачественными опухолями (рак толстой кишки, мочевого пузыря, простаты, шейки матки, кожи, цнс и др.) в среднем почти в 2 раза ниже, чем у лиц с низким содержанием провитамина А (Шуш Л-Б., 1982; Б^итига Т., 2000). Имеется достаточное количество сведений об эффективности применения бета-каротина в лечении предраковых заболеваний.

Четкое профилактическое действие каротиноидов продемонстрировано на моделях экспериментального

канцерогенеза, вызванного физическими или химическими факторами. Так, установлено, что бета-каротин задерживает проявление и ограничивает частоту возникновения опухолей, индуцированных аппликацией ДМБА или ультрафиолетовым облучением (Агшпе М.А., 1991). В других опытах проявляли подобную активность кантаксантин и фитоен.

В то же время не всегда ясно, в какой степени антиканцерогенный эффект определяется собственными свойствами каротиноидов, и когда это зависит от продуктов их метаболизма, в частности, витамина А, антиканцерогенный эффект которого также можно считать доказанным.

С другой стороны, в ряду каротиноидов достаточно много веществ, для которых, так или иначе, показаны антиканцерогенные свойства. Несмотря на то, что наиболее изученным в этом отношении является бета-каротин, нет оснований считать его наиболее эффективным антиканцерогенным веществом этого ряда.

Так, из 600 известных каротиноидов, приблизительно 50 обладают, в той или иной степени, А-витаминной активностью. Ряд каротиноидов, особенно такие широкораспространенные, как ликопин, лютеин, зеаксантин, неоксантин, кантаксантин, и виолоксантин, которые не являются предшественниками витамина А, были обнаружены в крови, жировой ткани, печени человека и в других тканях и органах, что несомненно указывает на их активное биологическое действие.

Для четкого понимания возможности использования каротиноидов в качестве средств профилактики опухолей важное значение имеет изучение механизмов химиопрофилактического действия каротиноидов.

Предполагается, что в основе защитного эффекта бета-каротина и некоторых других каротиноидов лежит их способность служить ловушкой синглетного кислорода. По ряду наблюдений, например, кантаксантин обладает более выраженным антиоксидантным эффектом, чем хорошо изученный бета-каротин. Способность каротиноидов нейтрализовывать синглетный кислород в модельной системе понижается в следующем ряду: ликопин, альфа-каротин, астаксантин, кантаксантин, гамма-каротин, бета-каротин, зеаксантин, лютеин. Однако в организме подобное соотношение антирадикальных свойств каротиноидов может быть иным. Это может быть связано с различиями в фармакокинетике и метаболизме этих соединений. Подробное сравнительное изучение их биологических эффектов не

проводилось. Антиоксиданты способствуют нейтрализации свободных радикалов, образующихся под действием, например, ионизирующего окисления, избыточного накопления липидных перекисей или обусловленных образованием из канцерогенов высокореакционоспособных электрофильных метаболитов, что, в свою очередь, снижает степень их взаимодействия с нуклеофильными центрами клеточных мишеней, в первую очередь с ДНК. Это, в свою очередь, снижает вероятность их повреждения. В то же время не существует прямой зависимости между антиоксидантными свойствами каких-либо веществ и степенью влияния их на уровень перекисного окисления липидов или защитным действием в отношении ДНК в клетке. Возможны и другие, нежели антирадикальный, механизмы защитного действия каротиноидов. Так, эти вещества способны проявлять защитный эффект при воздействии канцерогенов, обладающих отличным от свободнорадикального механизмом канцерогенного эффекта. Так, например, имеются данные о защитном эффекте бета-каротина при экспериментальном канцерогенезе вызванном Н-метил-Ы-нитро-М-нитрозогуанидином (МННГ), молекулярный механизм канцерогенного действия которого связан, в первую очередь, с метилированием пуриновых оснований ДНК (Окихигги Д., 1992). Таким образом, механизм защитного эффекта бета-каротина в данном случае может быть связан со стимуляцией другой защитной системы организма - иммунной. Известно, что каротиноиды стимулируют функции натуральных киллеров, цитолитических Т-лимфоцитов и макрофагов. А эти иммунокомпетентные клетки и продуцируемые ими иммуномедиаторы определяют эффективность

иммунобиологического надзора.

Другим важным компонентом в антиканцерогенном действии каротиноидов является их способность снижать число хромосомных мутаций вызванных целым рядом мутагенов.

Однако неясно, в какой степени эти эффекты опосредуют антиканцерогенные свойства каротиноидов. В то же время, нельзя не учитывать, что ряд каротиноидов обладает опосредованным действием, а именно: через продукт своего метаболизма - витамин А, важной функцией которого является контроль процессов пролиферации и дифференцировки тканей, осуществляемый, по-видимому, путем экспрессии соответствующих генов. Поэтому, в изучении механизма действия каротиноидов важное место занимает изучение фармакокинетики и метаболизма этих веществ.

Таким образом, одним из подходов в решении проблемы создания химиопрофилактических лекарственных средств является

поиск наиболее эффективных соединений в ряду каротиноидов, изучение механизма их антиканцерогенного эффекта, выбор оптимальных доз и способов применения, создание и изучение лекарственных форм, разработка показаний и рекомендаций к их использованию.

Цель н задачи исследования. Цель исследования состояла в изучении механизма антиканцерогенного действия ряда каротиноидов (бета-каротина, кантаксантина, ликопина),

различающихся по метаболизму и антиоксидантной активности, а также природного каротин-токоферолового комплекса; сравнительном изучении их влияния на системы, опосредующие защитные функции организма в отношении канцерогенеза (антиоксидантную, иммунную, репаративную); определение оптимальных доз и режимов их использования для профилактики опухолевых заболеваний, а также возможности включения каротинсодержахцих препаратов в курс экспериментальной химиотерапии канцерогенеза.

Основные задачи исследования состояли в следующем:

1.Изучить фармакокинетику каротиноидов у экспериментальных животных и человека, определить оптимальные дозы и режимы их применения в экспериментальных моделях и в клинической практике.

2.0ценить протекторные свойств каротиноидов в отношении канцерогенеза на стадии инициации опухолевого процесса по способности снижать уровень генетических повреждений, индуцированных канцерогенными факторами (облучение, химический канцерогенез), и их влияние на процессы репарации ДНК поврежденных клеток.

2.Разработать модель определения антимутагенной активности каротиноидов на уровне целостного организма на основе теста по учету индуцированных хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и провести сравнительное изучение антимутагенных свойств каротиноидов на данной модели.

3.Исследовать влияние каротиноидов на мутагенную активность прямых и непрямых мутагенов в различных модификациях теста Эймса.

4.Изучить способность каротиноидов стимулировать основные звенья иммунной системы, участвующие в противоопухолевой защите в норме и на моделях иммунодепрессии, вызванной различными химическими и физическими факторами и у животных с опухолями, индуцированными канцерогенами.

5.0пределить влияние каротиноидов на показатели гуморального и клеточного иммунитета при первичном иммунном ответе здорового организма и при иммунодефицитных состояниях.

б.Определить влияние каротиноидов на продукцию интерлейкина-2 здорового организма и при индуцированной иммунодепрессии.

7.Определить влияние каротиноидов на пролиферативную активность лимфоцитов.

8.Изучить влияние каротиноидов на состояние противоопухолевого иммунитета и развитие опухолей у приматов на модели опухолей желудка, индуцированных М-этил-1Ч-нитро-Ы-нитрозогуанидин (ЭННГ).

9.0пределить иммунологический и антиоксидантный статус больных раком толстой кишки и изучить влияние на него предоперационного гамма-облучения, проведенного на фоне иммунокоррекции бета-каротином.

Научная новнзна работы. Полученные данные расширяют представления о механизмах антиканцерогенных свойств каротиноидов, позволяют выявить наиболее эффективные соединения этого ряда, определить показания к использованию вновь разрабатываемых лекарственных препаратов на основе каротиноидов, обосновать дозы и схемы их применения, разработать новые подходы к химиопрофилактике опухолей. Результаты исследования свидетельствуют о роли иммуномодулирующих, антимутагенных, антиоксидантных свойств каротиноидов в механизме их антиканцерогенного эффекта. Впервые проведено комплексное фармакокинетическое исследование различных доз каротиноидов у животных и человека. Показана зависимость между их содержанием и уровнем активности противоопухолевых систем организма.

Впервые в иммунологических системах изучена и охарактеризована активность природного каротин-токоферолового комплекса. Изучены зависимости эффектов каротин-токоферолового комплекса от дозы и времени введения в норме и при иммунодефицитных состояниях. Научную новизну представляют данные о стимулирующем эффекте каротин-токоферолового комплекса на гемопоэз и об его антимутагенном эффекте.

Получены новые данные о стимуляции каротиноидами эффекторных популяций лимфоцитов на фоне дозозависимого снижения Т-клеточной супрессии на модели активации клеточного иммунитета.

В результате исследований антимутагенных свойств каротиноидов впервые установлено наличие антимутагенного

эффекта синтетического бета-каротина в тесте 8а1топе1Ымикросомы с 2-ацетил-амино-флуореном. Впервые исследовано влияние синтетического бета-каротина на генотоксичность прямых мутагенов в различных модификациях теста Эймса.

Впервые проведено изучение иммунологического и антиоксидантного статуса больных раком толстой кишки, а также их изменение при проведении курса дистанционной гамма-терапии и назначении бета-каротина. После курса иммунокоррекции у больных отмечена стимуляция функциональной активности лимфоцитов на фоне снижения эндогенной супрессии; уменьшение концентрации малонового диальдегида в плазме крови и увеличение активности каталазы.

Практическая значимость. Работа выполнена в рамках программы ГКНТ 02.03.03 «Разработать препараты обладающие антиканцерогенным действием» и включает экспериментальный и клинический материал по изучению факторов, влияющих на химический канцерогенез, и поиску антиканцерогенных соединений. В работе показано защитное действие каротиноидов в отношении канцерогенеза, индуцированного различными канцерогенами.

Выявленные свойства каротиноидов позволяют включать их в схемы иммунокоррекции при различных видах патологии. Данные клинических исследований являются обоснованием для рекомендаций по применению бета-каротина в период предоперационного гамма-облучения онкологических больных, а также в группах населения с высоким риском развития злокачественных новообразований.

Полученные данные, характеризующие антимутагенную и иммуномодулирующую _ активность нового отечественного препарата - синтетического бета-каротина, использованы при составлении нормативной документации, представляемой в Фармакологический комитет при МЗ РФ.

На основе полученных данных по антимутагенной активности природных комплексных препаратов разработаны рекомендации по применению их как потенциальных средств активной профилактики опухолей и для снятия осложнений противоопухолевой химиотерапии.

Выявленные в работе закономерности позволяют создать рациональные схемы иммунокоррекции при различных видах патологии с использованием каротинсодержащих препаратов. Обоснована возможность использования каротиноидов в качестве средства, активирующего противоопухолевый надзор в организме.

Внедрение полученных результатов. Полученные данные о специфической активности и безопасности каротиноидов явились основой для регистрации препарата «БЕТА-КАРОТИН, желатиновые капсулы 5 мг» и «БЕТА-КАРОТИН, драже 5 мг», разрешенных фармакологическим комитетом для клинического применения.

Результаты исследования доложены на I конференции НИИ ЭДиТО ВОНЦ «Терапия, диагностика и профилактика опухолей в эксперименте» (г.Москва, 1990г.), Всесоюзной конференции «Клиническая витаминология» (г.Москва, 1991г.), Всесоюзной конференции «Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов» (г.Киев, 1991г.), симпозиуме «Каротиноиды в онкологии» (г.Москва, 1992г.), XI научной конференции «Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (г.Челябинск, 1992г.), I Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 1992г.), IV конференции «Биоантиоксидант» (г.Москва, 1992г.), II Int. Cancer Chemoprevent Conf. (Berlin, Germ., 1993), XYI Int. Cancer Congress (New Delhi, India, 1994), Международном симпозиуме «Экология человека: проблемы и сост. проф. питания» (г.Москва, 1994г.), И Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 1995г.), I European congress of pharmacology (Milan, Italt, June 16-19 1995), I Съезде онкологов стран СНГ (г.Москва, 1996г.), 9-th NCI - EORTC Symposium on new drugs in cancer therapy (Amsterdam, 1996), IV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 1997г.), 8-th Internetiorial Congress on Anti - Cancer Treatment (France, Paris, 3-6 febr. 1998), V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г.Москва, 21-25 апреля 1998г.), IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: 21 век» (г.С.-Петербург, 22-24 мая 2000г.).

По результатам экспериментальных и клинических данных поданы заявки на изобретение и получен 1 патент.

Данные о специфической активности лекарственных препаратов предполагается использовать для проведения клинических испытаний и определения показаний к использованию новых химиопрофилактических лекарственных препаратов на основе каротиноидов.

Объем н структура диссертации. Работа изложена на 364 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация иллюстрирована 37 рисунками и содержит 39 таблиц. В

диссертации использованы материалы работ 46 отечественных и 278 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Препараты. Бета-каротин (GioHse) и его окисленная форма кантаксантин (С40Н56О2) синтезированы в НПО «Витамины», ликопин (изомер бета-каротина) получен от фирмы «РОШ», каротин-токофероловый комплекс получен путем углекислотной экстракции из плодов шиповника в ВНИИХТЛС, г.Харьков (содержит бета-каротин -160мг%, альфа-каротин 18 мг%, кантаксантин 27 мг%, ликопин 76 мг%, другие каротиноиды 59 мг% токоферол 85 мг%, а также высшие спирты, стероиды, стерины, жирные кислоты). Лекарственный препарат - «Бета-каротин, желатиновые капсулы, 5 мг №100» производство АО «Белмедпрепараты»

Животные. Исследования выполняли на взрослых мышах-самцах линии СБА, С57В16, СЗН, весом 18-22 г., полученных из питомников «Крюково», «Столбовая», белых беспородных крысах со средней массой 180-220 г., беспородных собаках массой 10-12 кг, 60-дневных поросятах весом 13,5 кг, обезьянах Macaca fascicularis.

Онкологические больные н здоровые доноры. В группы предоперационной иммунокоррекции включены 43 больных раком толстой кишки (РТК), которые находились на лечении в отделении проктологии ОНЦ РАМН (зав. отделением - профессор В.И. Кныш) в период с 1991 по 1994годы. Из них вторая стадия процесса была у 3, третья - у 31, четвертая - у 9 больных. Из исследований исключались пациенты с сопутствующими заболеваниями. В предоперационном периоде все они прошли курс дистанционной гамма-терапии в суммарной очаговой дозе 25 Грей. Для сравнения был изучен иммунный статус у 11 практически здоровых лиц (доноров). Объектами исследования служили сыворотка крови, плазма крови, лимфоциты периферической крови пациентов. Наблюдение проводили в динамике, сравнивая показатели до и после курса иммунокоррекции.

Группа доноров (контроль) состояла из 11 человек, не имеющих каких-либо хронических заболеваний, из которых 5 женщин и 6 мужчин, в возрасте от 27 до 50 лет.

Хроматографнческие исследования. Определение концентрации каротиноидов проводили на жидкостном хроматографе «Spectra physics-8000». Условия хроматографии: режим изократический; состав подвижной фазы - 85% ацетонитрил:

изопропанол (93,5:6,5); скорость потока 2 мл/мин; использовали колонку 3X250 мм заполненную Separes С с диаметром частиц 5 мкм. Для идентификации каротиноидов использовали стандартные растворы в хлороформе; количественное определение проводили по калибровочному графику.

Цитогенетнческин тест. В основе метода лежит регистрация хромосомных аберраций (ХА) в клетках костного мозга мышей на стадии метафазы. Этот метод использован нами для определения антимутагенной активности препаратов в опытах с животными. В качестве индуктора ХА нами был отобран циклофосфан (Цф).

Метод учета генных мутаций в тесте Эймса. Использовали тестерные штаммы бактерий Salmonella typhimurium ТА-98 и ТА-100, (НИИ «Общей генетики», г. Москва):__

Штамм Мутация Тип мутации Другие дефекты R фактор (pKm 101)

ТА-98 his D3052 Сдвиг рамки считывания rfa, uvr, bio' +

ТА-100 his G 46 Замена пар оснований rfa, uvr', bio" +

В тесте, кроме классических чашечного и преинкубационного вариантов, использовали суспензионную модификацию. В этом случае исследуемое соединение добавлялось в культурапьную среду. Использовали прямые мутагены - тиофосфамид (ТЭФ) и диамино-диоксо-диокси-тетрагидро-диазо-пирен (ДДДТДП) и непрямые мутагены - 2-ацетил-амино-флуорен (2-ААФ) и бенз(а)пирен (БП), для последних индукторами активации микросомальных ферментов были использованы фенобарбитал и совол соответственно.

Получение лнмфндпых клеток. Для приготовления суспензий спленоцитов мыши использовали гомогенизаторы Поттера. Выделенные клетки культевировали в среде 11РМ1-1640, содержащей 10% ТЭС, 1% 200 тМ Ь-глютамина. Т-клетки получали нанесением 2,5-5х107 клеток селезенки на колонну с нейлоновой ватой с последующей 30-минутной инкубацией при 37°С. Затем не прикрепившиеся клетки элюировали экспериментальной средой. Для получения фракции лимфоцитов, обогащенных макрофагами, прикрепившиеся к пластику клетки после 45-минутной инкубации (37°С) в обработанных эмбриональной телячьей сывороткой чашках Петри удаляли 0,25% раствором трипсина и собирали открепившиеся клетки.

Периферическую венозную кровь обследуемых пациентов получали в утренние часы в стерильных условиях. Количество лейкоцитов и относительное содержание лимфоцитов определяли

на аппарате «Hemalog» (Technicon corp., USA). Мононуклеарные клетки из периферической крови человека выделяли в градиенте плотности фикол-верографина (плотность 1,077 г/см2).

Определение числа антителообразующих клеток.

Содержание антителообразующих клеток (АОК) исследовали методом безгелевого варианта локального гемолиза. Суть метода заключается в том, что лимфоидные клетки животного, иммунизированного эритроцитами барана (ЭБ) помещают в узкую, образованной двумя предметными стеклами, камере в смеси с использованным антигентм и комплементом. При этом АОК клетки синтезируют антитела, которые диффундируют в окружающую среду и вызывают лизис таких эритроцитов и вокруг каждой такой клетки возникает зона гемолиза, свободная от эритроцитов.

Определение продукции интерлейкнна-2. Определение продукции интерлейкина-2 (ИЛ-2) проводили с помощью метода, основанного на способности этого цитокина усиливать пролифирацию лимфобластов. Метод включает следующие этапы: получение ИЛ-2, получение лимфобластов, тестирование ИЛ-2 на лимфобластах по уровню включения 3Н-тимидина, который зависел от концентрации ИЛ-2 в супернатанте. Показателем количества ИЛ-2 был индекс стимуляции.

Постановка реакции бластгрансформацнн лимфоцитов.

Спленоциты выделяли с помощю стеклянного гомогенизатора в асептических условиях. Клеточную суспензию дважды отмывали средой 199 при 200q (10 минут). Осажденные клетки помещали в среду 1640 со всеми добавками и ресуспендировали. Клеточную суспензию разводили до плотности 106 клеток/мл. Затем в ячейки 96-лунояной микропанели'вносили по 100 мг/мл стрептомицина, 2 мМ 1-глутамина. Индукцию бласттрансформации осуществляли с помощью ФГА в концентрации 10 мкг/мл. Культивирование клеток проводили при 37°С в присутствие 5% С02 в течение 72 часов. В последние 4 часа инкубации добавляли 3Н-тимидин в концентрации 1 мкКи/мл. По окончании культивирования клетки осаждали на фильтрах, которые после высушивания вносили во флаконы с толуоловым сцинтиллятором и регистрировали включение изотопа на счетчике.

Определение активности цитолнтнческнх Т-лнмФоцнтов.

Для оценки активности специфических цитолитических Т-лимфоцитов использовали модель однонаправленной смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). Суть метода заключается в следующем. Спленоциты, используемые в качестве стимулирующих, инактивируются гамма облучением. В качестве реагирующих клеток применяли аллогенные лимфоциты. При

совместном культивировании этих лимфоидных клеток развивается иммунная реакция, сопровождающаяся генерированием специфических цитолитических Т-лимфоцитов, направленных против клеток, несущих антигенные детерминанты, соответствующие тем, которые присутствуют в клетках, используемых в качестве стимуляторов. Специфическую цитолитическую активность образовавшихся Т-лимфоцитов определяли по выходу радиоактивного изотопа из соответствующих клеток-мишений при их совместном культивировании.

Определение активности перитонеальиых макрофагов.

Измерение хемилюминесценции, амплифицированной люминолом проводили на приборе CL-3603. Суспензии спленоцитов в соотношении 1:1:1 смешивали с 20 мкМ раствором люминола на натрий - фосфатном буфере (рН=7,0) и средой RPMI-1640. Измеряли спонтанную хемилюминесценцию или хемилюминисценцию, индуцируемую фагоцитозом зимозана в концентрации 5х107-1х108 частиц/мл. Клетки Candida albicans предварительно убивали прогреванием в течение 60 мин при 90°С и опсонизировали сывороткой крупного рогатого скота.

При исследовании собственно фагоцитарной активности макрофагов в качестве тест-микроба использовали культуру золотистого стафилококка (штамм Жаев). После его инкубации с образцами перитонеальных макрофагов микроскопически определяли фагоцитарное число - процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарный индекс - среднее число микробов захваченное 1 фагоцитом. Определение завершенности фагоцитоза производили методом, основанным на изменении цвета микробов, захваченных фагоцитами, на окрашенных препаратах при гибели вследствии внутриклеточных факторов.

Цитотокснческнй тест. Для определения цитотоксической активности спленоцитов мыши и мононуклеаров человека 0,5-4х106 клеток-мишеней инкубировали в среде, содержащей 50-200 мкКи Na5lCrO.), в течение 1 часа при 37°С, трижды отмывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640. В лунки 96-луночных пластин вносили 10 меченых клеток-мишеней и 5x105 эффекторных лимфоцитов, инкубировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% бычьей сыворотки, в объеме 0,2 мл в течение 18 часов при 37°С и 5% СОг в 96-луночных конических пластинах (Linbro, USA). Каждый вариант повторяли трижды. При работе с клетками человека начальную концентрацию мононуклеаров дважды уменьшали в 2 раза. Для этого суспензию лейкоцитов разводили культуральной средой. По окончании инкубации

половину супернатанта переносили в пластиковые ампулы для определения радиоактивности.

Определение субпопуляцнй нммунокомпетеитных клеток.

Количественную оценку субппопуляций

иммунокомпетентных клеток проводили методом иммунофлюоресценции с использованием специфических моноклональных антител. Для постановки реакции иммунофлюресценции к 20 мкл моноклональных антител (МКА) добавляли не менее 0,5x106 мононуклеаров и инкубировали 30 мин. при 4°С в круглодонных 96-луночных пластинах.

Затем после двухкратного отмывания клетки обрабатывали 20 мкл Fab фрагментов, полученных из люминесцирующей кроличьей сыворотки против Ig мышей и снова инкубировали 30 мин. при 4°С, после чего трижды отмытые клетки фиксировали 1% раствором формальдегида и определяли относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные антигены на цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, USA). В работе использованы МКА серии ИКО, полученные профессором А.Ю.Барышниковым в лаборатории клинической радиоиммунологии ОНЦ РАМН.

Исследование процессов перекнсного окислення лнпидов.

Исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по концентрации малонового диальдегида (МДА) в плазме крови, для характеристики состояния антиоксидантной системы исследовали активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы. Содержание МДА в плазме крови оценивали методом, основанным на образовании триметинового комплекса с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для этого к 0,3 мл сыворотки добавляли 3 мл 1% ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% ТБК и инкубировали при 100°С в течение 1 часа. После охлаждения добавляли 4 мл бутанола, тщательно перемешивали и центрифугировали 10 мин. при 3000 об/мин. Содержание МДА рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинции МДА и разведения плазмы крови.

Активность СОД в эритроцитах определяли спектрофотометрически методом в системе «ксантин-ксантиноксидаза». Используя 50 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,8) в соотношении 1:9, готовили гемолизаты эритроцитов. Гем осаждали с помощью последовательного добавления этанола и хлороформа. После 10-минутного центрифугирования при 6000 об/мин. супернатант использовали для определения СОД в эритроцитах, которое производилось при длине волны 560 нм. В инкубационную смесь, содержащую lxlO"4 М ксантина, lxlO"4

ЭДТА, 0,05 М Na2C03,2,5х10'3 М нитросинего тетразолия в 50мМ натрий - калий - фосфатном буфере (рН=7,8), вносили ксантиноксидазу (3,3х10"9 М) для измерения скорости прямой реакции. Для измерения скорости обратной реакции в инкубационную смесь с ксантиноксидазой вносили гемолизаты эритроцитов в таком количестве, чтобы процент торможения прямой реакции находился в пределах 25-50 %.

Активность каталазы эритроцитов определяли спектрофотометрическим методом. Для этого эритроциты гемолизировали в холодной дистиллированной воде в соотношении 1:9. Образовавшийся после центрифугирования супернатант использовали для определения каталазы по уменьшению концентрации перекиси водорода. В кювету вносили 3 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН=7,4) и добавляли 5-10 мкл 30% Н7О2 (значение экстинции при этом должно находится в пределах 0,50,7) и затем добавляли такое количество гемолизата, чтобы уменьшение экстинции Н2О2 за одну минуту находилось в пределах 0,05-0,15. Измерение экстинции проводили при 240 нм.

Статистический анализ. Все сведения о больных раком толстого кишечника и здоровых лицах контрольной группы были внесены в базу данных PARADOX 3 (фирма BORLAND INTERNATIONAL) в соответствии с разработанным нами кодификатором.

При обработке результатов вычисляли значение средней величины и стандартную ошибку показателя средней. Для оценки степени достоверности полученных различий в сравниваемых группах при равномерном частотном распределении цифровых значений пользовались критерием Стьюдента, а при неравномерном - U-критерием Вилкоксона-У айта.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Бнодоступность каротиноидов.

В связи с тем, что имеются существенные видовые различия в метаболизме каротиноидов, представлялось целесообразным изучение их биодоступности для выбора адекватной экспериментальной модели, определения оптимальных доз и режимов применения.

Однократное пероральное введение бета-каротина в дозе 30 мг/кг не приводило к определяемому изменению содержания бета-каротина в сыворотке крови мышей. Незначительное увеличение этого каротиноида наблюдалось в дозе 100 мг/кг. И только доза 300 мг/кг вызывала существенное повышение концентрации бета-каротина в сыворотке крови мышей. Каротин-токофероловый комплекс при введении его из расчета 30 мг/кг чистого бета-каротина вызывал повышение его сывороточного уровня до 21,4 мкг/100 мл, а введение дозы 100 мг/кг приводила к такому же повышению уровня бета-каротина в сыворотке как 300 мг/кг его синтетического аналога, при этом его повышенное содержание в сыворотке сохранялось дольше. Более высокая усвояемость и скорость всасывания бета-каротина из природного КТК вероятно связана как с его физико-химическим состоянием, так и с входящими в состав КТК иными компонентами, влияющими на всасывание в ЖКТ (рисунок 1).

Курсовое введение бета-каротина (в течение 11 дней) вызывало повышение его сывороточного уровня при его введении в дозах выше 0,1 мг/кг начиная с 4-6 дня его применения. Как и в случае однократного использования, бета-каротин в составе КТК обладал существенно лучшей биодоступностью и выраженное повышение его сывороточного уровня наблюдалось уже в минимальной дозе (рисунок 2).

Кантаксантин и ликопин обладали несколько лучшей всасываемостью, так уже минимальные исследуемые дозы приводили к некоторому повышению сывороточного уровня этих каротиноидов. Более высокие дозы приводили к пропорциональному увеличению их концентрации. Курсовое введение этих препаратов в дозах 0,1-10,0 мг/кг вызывало существенное увеличение их концентрации в сыворотке, начиная с 4-6 дня их введения (рисунки 3,4).

При использовании в качестве экспериментальных животных крыс максимальная концентрация бета-каротина регистрировалась только через 45 минут после введения чистого препарата и через 1,5 часа после введения КТК и составляла соответственно 21,0 и 8,4

Рис.1. Кинетика бета-каротина и КТК

в сыворотке крови мышей при однократном пероральном введении

Рис.2. Кинетика бета-каротина и КТК в сыворотке крови мышей линии СВА при курсовом пероральном введении

0.5 1 5

-в-бета-каротин 30 мг/кг —♦—бета-каротин 100 мг/кг —*—бета-каротин 300 мг/кг -Н-КТК 30 мг/кг —•— КТК 100 мг/кг

О I ? 3 4 5 6, 7, 8 —•—бета-каротин 0,1 т/кг —♦—бета-каротин 1,0 мг/кг -бета-каротин 10 мг/кг -КТК 0,1 мг/кг -КТК 1.0 мг/кг

Рис.3. Кинетика кантаксантина и ликопина в сыворотке крови мышей г линии СВА при однократном пероральном введении

—•—Кантаксантин 30 мг/кг —♦— Кантаксантин 100 мг/кг Кантаксантин 300 мг/кг —К-Ликопин 30 мг/кг -•-Ликопин 100 мг/кг —I— Пикппин ЯПО мг/кг

100-

Рис.4. Кинетика кантаксантина и 5 ликопина в сыворотке крови мышей 3 линии СВА при однократном ^ пероральном введении

5

23456789 10 11 Кантаксантин 0,1 мг/кг —*— Кантаксантин 1,0 мг/кг дни -*—Кантаксантин 10,0 мг/кг —К- Ликопин 0,1 мг/кг -♦-Ликопин 1,0 мг/кг —1— Пикппин 10 П мг/кг

Рис.5. Кинетика бета-каротина в Рис.6. Кинетика бета-каротина в

250

200

100-

Рис.7. Кинетика бета-каротина в сыворотке крови человека при однократном пероральном введении

200

150

100

час

Рис.8. Кинетика бета-каротина в сыворотке крови человека при курсовом пероральном введении

в 9 24

-•-0,5 мг/кг -♦—0,15 мг/кг 0,08 мг/кг

11111111 0 1 2 3 4 5 6 7 1 -в-0.5 МГ/КГ —♦—0,15 мг/кг -*-0,08 мг/кг

дн

9 10 11 1

мкг/ЮОмл (однократное внутрижелудочное введение в дозе 30 мг/кг). Однако, уровень содержания в сыворотке синтетического бета каротина после достижения максимума быстро снижался и через 1ч 40мин его показатели были близки к исходным значениям, тогда как уровень бета-каротина при введении КТК удерживался высоким до 48 часов.

Однократное пероральное введение бета-каротина собакам в дозе 250 мг/кг приводило к повышению его сывороточного уровня до 5-6 мкг/100 мл. Максимальная концентрация бета-каротина в сыворотке наблюдалась через 24 часа после введения и удерживалась в течение достаточно длительного периода, до 5 суток (рисунок 5). Курсовое введение этой же дозы препарата приводило к увеличению его сывороточного уровня до 25 мкг/100 мл уже через 4 дня от начала введения (рисунок 6). Некоторое снижение его уровня при дальнейшем введении препарата вероятно связано с активацией ферментативных систем, участвующих в метаболизме бета-каротина или изменением активности его всасывания по принципу обратной связи.

Кривая кинетики бета каротина у поросят сходна с таковой у собак не только по характеру, но и по абсолютным значениям, хотя вводимые дозы были меньше на 1 - 2 порядка.

При однократном пероральном приеме бета-каротина здоровыми добровольцам уже в дозе 0,08 мг/кг повышалось содержание его в сыворотке в 1,5-2,5 раза. Повышение вводимой дозы также приводило к соответствующему увеличению и его сывороточного уровня. Продолжение перорального приема высоких доз препарата не вызывало изменений его сывороточного уровня по сравнению с их однократным приемом. Однако, в низких дозах наблюдался кумулятивный эффект бета-каротина и после 10 дней приема различия в его сывороточной концентрации при приеме разных доз не наблюдалось (рисунки 7, 8).

Из сказанного следует, что каротиноиды слабо адсорбируются животными и их изучение в биологических моделях возможно при использовании высоких доз либо при длительном скармливании.

Исследование аитнмутагенной активности каротинондов.

Учитывая, что одним из основных факторов канцерогенеза является повреждение генетического аппарата клетки, в начале нашего исследования было изучено влияние каротиноидов на спонтанные и мутаген-индуцируемые хромосомные аберрации в клетках костного мозга мышей. В качестве индуктора хромосомных аберраций был использован цикпофосфан.

Таблица 1. Влияние каротиноидов в дозе 100 мг/кг на индукцию хромосомных аберраций под действием циклофосфана.

Условия опыта Число метафаз Редукция, %

Всего Аберрации М±т, %

Спонтанный мутагенез Контроль 300 2,25±0,46

Р-каротин 400 1,95±0,89 13,33

Кантаксантин 465 1,43±0,67 36,44*

Ликопин 300 0,6±0,31 73,4*

КТК 300 1,11±056 50,66*

ЦФ 10 мг/кг Контроль 100 6,0±2,4

Р-каротин 210 1,14±0,4 80,9*

Кантаксантин 265 2,73±1,91 54,4*

Ликопин 150 4,0±1,66 33,3

КТК 250 0,71±0,33 88,1*

ЦФ 30 мг/кг Контроль - 210 49,7±2,5

р-каротин 157 8,60±1,1 82,7*

Кантаксантин 200 19,93±2,07 59,9*

Ликопин 265 26,09±3,б 47,5*

КТК 250 7,89±0,9 84,12*

ЦФ 60 мг/кг Контроль 300 64,4±3,9

Р-каротин 250 10,75±3,1 83,3*

Кантаксантин 250 25,37±2,9 60,6*

Ликопин 340 31,88±4,6 50,5*

КТК 100 12,82±2,8 80,1*

* - р < 0,05

Таблица 2. Оценка антимутагенной активности Р-каротина (18 мкг/чаш)

в тесте Эймса

Мутагены, мкг/чаш Н1з+/чаш. М±ш

Мутаген Мутаген + р-каротин

Одновр. За 15 мин. За 18 час.

ТЭФ (ТА-ЮО)ЗО 155±16 153±16 165±11 173±14

ТЭФ (ТА-100) 100 248±23 231 ±7 239±6 219±11

ТЭФ (ТА-100)300 433±29 286±18 449±47 459±46

ДДДТДП (ТА-98)10 603±4 547±94 602±123 645±97

ДДДТДП (ТА-98)50 360±47 343±18 342±30 365±17

* - р < 0,05

Из данных представленных в таблице 1 следует, что все исследуемые препараты снижали число как спонтанных, так и мутаген-индуцируемых хромосомных аберраций. Степень активности изучаемых веществ в отношении спонтанного мутагенеза прямо зависела от их антиоксидантной активности. Более выраженным антимутагенным действием в этом случае обладали ликопин и каротин-токофероловый комплекс. При мутагенезе, индуцированном циклофосфаном, расположение препаратов в ряду активности было несколько иным. Максимальным эффектом обладал каротин-токофероловый комплекс и бета-каротин. Причем в случае с бета-каротином степень защитного эффекта была прямо пропорциональна дозе циклофосфана - наиболее выраженный антимутагенный эффект препаратов наблюдался при использовании высоких доз циклофосфана, а с понижением дозы мутагена защитное действие изучаемых каротинидов снижалось. Это наводит на мысль о конкурентном действии этих веществ в отношении общего пути метаболизма. Вероятно, это связано с тем, что бета-каротин вступает в конкурентные взаимоотношения с циклофосфаном, поскольку и тот и другой в процессе метаболизма требуют цитохром р-450 зависимых ферментов. Так, бета-каротин нуждается в них для превращения в ретинол. И, кроме того, он также нуждается в атоме кислорода при расщеплении двойных сопряженных связей, что также может вызывать ингибицию индуцированной формы цитохрома р-450, ответственного за превращение мутагена в активные формы. Относительно ретинола предполагают, что он при переходе из цис- состояния' в транс-конкурирует с цитохромом р-450 за электроны .

Данное предположение подтверждается при исследовании свойств каротиноидов в тесте Эймса. Наличие мутагенного эффекта в штаммах Salmonella typhimurium, являющимся ауксотофом по отношению к гистидину учитывали по индукции обратных мутаций к прототрофности.

Результаты различных опытов с прямыми мутагенами -тиофосфамидом (ТЭФ) и производными пирена (ДДДТП) ясно показывают, что бета-каротин, добавленный в культуру в максимально возможной степени, не оказывает влияние на мутагенез (таблица 2). С непрямыми мутагенами был получен выраженный положительный эффект с 2-ААФ и умеренный с БП. При этом наблюдается обратно пропорциональная зависимость эффекта бета-каротина от количества вносимого гомогената печени в составе активирующей микросомальной смеси (таблица 3). При курсовом введении бета-каротина существенно снижалась

способность микросомапьной фракции печени этих мышей активировать оба промутагена - 2-ААФ, и БП (таблица 4).

Таблица 3. Оценка антимутагенной активности Р-каротина в

тесте Salmonella/микросомы (штамм ТА-98'

Мутаген мкг/чаш. S-9 mix мл/чаш Шз+/чаш, М±т Редукция, %

Мутаген Мутаген+БК

2-ААФ 8 0,6 1310±36 1106±18 15,58*

2-ААФ 8 0,5 881±69 658±53 25,31*

2-АФФ 8 0,3 973±67 645±33 33,71*

БП 5 0,6 495±69 457±35 7,67

БП5 0,3 483±54 403±14 16,56*

* - р < 0,05

Таблица 4. Оценка влияния перорального введения Р-каротина (300 мг/кг, 14 дней) на активность Б-9 в тесте 8а1шопе11а/микросомы (штамм ТА-98)

Мутаген (мкг/чаш) ЬПз+/чаш, М±ш Редукция, %

Мутаген Мутаген+БК

2-ААФ (8) 1753±203 252±66 85,62*

Бенз(а)пирен (5) 128±12 68±5,2 46,88*

* - р < 0,05 Спонтанный фон: 15-181Ш7чаш.

Иммунофармакологня каротинондов.

Учитывая важную роль иммунной системы в противоопухолевой защите, было изучено влияние каротиноидов на основные эффекторные звенья иммунной системы и процессы, приводящие к их активации.

При изучении влияния каротиноидов на гуморальное звено иммунной системы использовалась модель первичного иммунного ответа мышей линии СВА в ответ на внутрибрюшинную иммунизацию эритроцитами барана. При однократном внутрибрюшинном введении 10'2 г/кг провитамина А за трое суток до иммунизации синтез АОК снижался до 31,3% от контроля. Инъекцирование препарата в этой же дозе за 48 часов до введения антигенного стимула подавляло антителогенез еще сильнее - до 9,5%. При введении бета-каротина за сутки до иммунизации число АОК составляло 37% относительно контрольного уровня. Введение максимально высокой дозы препарата после антигенного стимула снижало его иммуносупрессивный эффект. Препарат в дозе 10"3 г/кг

не изменял уровень антителобразования при введении его за трое суток до иммунизации. С приближением срока его введения к моменту иммунизации проявлялись его иммунодепрессивные свойства. Этот иммунодепрессивный эффект исчезал при введении препарата после антигенного стимула. Доза 10"4 г/кг подавляла антителообразование только в случае ее введения одновременно с антигеном и вызывала выраженную стимуляцию иммунного ответа (300% - 350%) при ее использовании после антигена.

Из последующих экспериментов следует, что бета-каротин при внутри&рюшинном однократном инъекцировании в интервале доз 10"5—10' г/кг за 72 и 48 часов до введения антигена вызывал умеренное повышение антителообразования. Снижение интервала времени между введением исследуемого препарата и антигена приводило к увеличению стимулирующего эффекта. Так, использование провитамина А в дозе 10'5 г/кг за 24 часа до нанесения антигенного раздражителя давало прирост антителогенеза на 135% к контрольному уровню. Максимальный стимулирующий эффект этой и других низких доз бета-каротина проявлялся при его введении на 2 сутки иммунного ответа. Снижение вводимой дозы вызывало и снижение его стимулирующих свойств до их отмены в дозе 10'8 г/кг.

Введение кантаксантина во всех изучаемых дозах (10*2-108 г/кг) не вызывало иммунодепрессии. Однако и стимулирующий эффект препарата был относительно невысоким и проявлялся только в дозе 10'6 г/кг и выше. Причем наиболее эффективным было введение препарата одновременно с антигеном и через 24 часа после иммунизации. Введение кантаксантина до антигенного стимула приводило к снижению его стимулирующих свойств.

Ликопин при введении его по этой же схеме вызывал эффект, сходный с таковым у кантаксантина. Однако его стимулирующее влияние носило более выраженный характер. Существенное повышение числа антителопродуцентов наблюдалось уже в дозе 10"6 г/кг. Дозы препарата выше, чем 10'5 обладали одинаково выраженным стимулирующим эффектом.

Несколько иная дозо-временная зависимость наблюдалась при изучении каротин-токоферолового комплекса. Низкие дозы этого препарата не вызывали достоверного стимулирующего эффекта, как в случае бета-каротина, однако и высокие дозы КТК не подавляли иммунный ответ. Что касается временной зависимости, то приближение времени введения препарата к моменту иммунизации

300 п

250

200-

100

50

Рис.9. Влияние курсового введения каротиноидов на содержание АОК в селезенке мышей линии СВА при первичном иммунном ответе

1 ю

"Контроль бета-каротин кантаксантин ликопин ктх

100 мг/кг

160 140 120 100 8060 40 20 0

Рис.10. Влияние курсового введения каротиноидов (100мг/кг) на иммуносупрессивный эффект радиационного облучения

аШ

Облучение 4 Гр

250

200

Рис.11. Влияние курсового введения

каротиноидов на митоген-индуцируемую (ФГА) пролиферацию спленоцитов

0,1 1 Контроль -бета-каротин -кантаксантин -ликопин

- 1ГТ1Г

600 1

500-

400

300

200

100

100 0

Рис.12. Влияние курсового введения каротиноидов на

хемилюминисценцию перитонеальных макрофароа

мг/и

С23 Контроль 10 юо —■—бета-каротин —кантаксантин

-ликопин

-1ГТ1Г

о

приводило к более выраженному первичному иммунному ответу также как и в случае отдельных каротиноидов.

Все исследуемые препараты повышали образование антителпродудентов при курсовом введении. Минимальной активностью в этой модели обладали кантаксантин и ликопин, а бета-каротин и каротин-токофероловый комплекс в 2,5-3,2 раза стимулировали изучаемый эффект (рисунок 9).

Поскольку используемый антиген - эритроциты барана является тимусзависимым в его реализацию вовлечен ряд регуляторных клеток иммунной системы (хеяперы, супрессоры т.д.). Для понимания механизмов иммуностимулирующего действия витамина А интерес представляло бы проведение опытов по использованию какого-либо тимус-независимого антигена. В качестве такового был использован Уьантиген брюшнотифозных бактерий. Результаты этих исследований свидетельствуют, что все изучаемые препараты даже при длительном введении (40 дней) не оказывали никакого влияния на продукцию АОК при иммунизации указанным антигеном во всех изучаемых дозах. Полученные данные указывают на то, что положительное действие каротиноидов в отношении гуморального иммунного ответа реализуется с участием Т-клеточного звена иммунной системы (вероятно Т-хелперов).

Важным свойством потенциального химиопрофилактического средства является способность восстанавливать сниженный по тем или иным причинам уровень иммунного ответа. Поэтому была изучена возможность коррекции иммунного ответа бета-каротином при радиационной иммунодепрессии. Из ; результатов представленных на рисунке 10 следует, что облучение мышей за сутки до иммунизации приводило к 5 кратному снижению образования антителпродуцентов. Предварительное курсовое введение каротиноидов приводило к возрастанию числа антителобразующих клеток. В данном случае радиопротекторный эффект каротиноидов прямо кореллировал с их антиоксидантным потенциалом.

При иммунодепрессии, индуцированной введением цитостатика винбластина, оказывающим тормозящее действие на пролиферацию клеток в стадии метафазы, содержание антителпродуцентов снижалось до 34% относительно контрольной группы. Так, результаты исследования, представленные на рис.3.3.2.2., показывают, что введение только антигена мышам линии СВА приводило к синтезу 94 214±2 613 АОК. Введение антигена и винбластина сопровождалось формированием в селезенках мышей 32 375±1 724 антителпродуцентов.

Таблица 5. Влияние курсового введения каротиноидов (100 мг/кг) на фагоцитоз _ перитонеальных макрофагов мышей._

Группа животных Фагоцитарное число (М±ш) Фагоцитарный индекс (М±ш)

Контрольная 42,5±1,1 2,0±0,07

Бета-каротин 56,5±1,б* 4,7±0,3*

Кантаксантин 52,8±3,6* 3,8±0,4*

Ликопин 50,0±0,7* 2,7±0,08*

КТК 6б,2±4,0 5,5±0,3*

* - р < 0,05

зоо

150

100

50

Рис.13. Влияние курсового введения г каротиноидов на активность

натуральных киллеров

мг/кг

250

200

100

50

контроль —»- бета-каротин —♦— кантаксактин —*—ликопин -КТК

ю

100

Рис.14. Влияние курсового введения каротиноидов на активность цитолитических Т-лимфоцитов

¿I

мг/кг

1/ 1 Контроль

бета-каротин

кантаксантин

ликопин

КТК

Ю

100

250 -

200-

0

Рис.15 Влияние курсового введения каротиноидов на синтез ИЛ-2

1 2

I 1 Контроль

-»- Бета-каротин

—♦— Кантаксантин

—А—Ликопин

У ЦТУ

мг/кг

юо

200 • 180160 140120 1008060 40 200

й

Рис 16. Влияние курсового введена бета-каротина на синтез ИЛ-2 на фоне иммунодепрессии, вызванной введением гидрокортизона

4

мгЛ

Гк

100

Курсовое введение бета-каротина в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг приводило к снижению иммунотоксического действия винбластина. Число антителпродуцентов составило 59 и 92 % соответственно. При повышении вводимой дозы, содержание АОК также сохранялось на уровне интактного контроля. Каротин токофероловый комплекс обладал выраженным

иммуностимулирующим действием при использовании его уже в минимальной дозе. Этот положительный эффект также возрастал с увеличением вводимой дозы препарата. Ликопин и кантаксантин на этой модели обладали минимальными защитными свойствами.

Рассматривая влияние каротиноидов на первичный иммунный ответ у животных с врожденным иммунодефицитом (мыши линии С57ВЬ6), обращает на себя внимание факт достоверной статистической стимуляции первичного иммунного ответа и переход его на качественно высокий уровень, достигающий таковой у высокоотвечающих животных (мыши линии СВА).

Так как пролиферативный эффект лимфоцитов в ответ на стимулирующие воздействия является интегративным показателем функционального состояния иммунной системы изучено влияние каротиноидов на митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов. В культурах с ФГА пролиферация лимфоцитов существенно повышалась при курсовом введении высоких доз кантаксантина и ликопина. Некоторое иммуностимулирующее действие бета-каротина при использовании малых доз сменялось торможением пролиферативной активности при их повышении. А каротин-токофероловый комплекс во всех исследуемых дозах обладал достаточно выраженным стимулирующим эффектом (рисунок 11).

Вероятно, факт разнонаправленного эффекта бета-каротина связан с его трансформацией в витамин А, который являясь дифференцировочным фактором, в высоких дозах может ингибировать пролиферативный эффект митогенов.

Важным звеном иммунной системы являются макрофаги, которые с одной стороны, как вспомогательные клетки обеспечивают кооперативные взаимодействия других иммунокомпетентных клеток, в том числе и путем синтеза лимфокинов и являются также эффекторными клетками иммунной системы с другой стороны.

О функциональной активности перитонеальных макрофагов судили по их способности продуцировать активные метаболиты кислорода в процессе фагоцитоза. Количество таких метаболитов

определяли с помощью люминол-зависимой хемилюминесценции в процессе фагоцитоза, индуцированного частицами зимозана.

При курсовом введении препаратов интактным мышам зависимость эффекта от дозы проявлялась слабо, выраженным стимулирующим эффектом обладали все изучаемые дозы бета-каротина и каротин-токоферолового комплекса, которые повышали синтез активных форм кислорода до 200 - 400% (рисунок 12).

Все изучаемые препараты активировали процессы фагоцитоза при использовании в качестве тест-микроба золотистого стафилококка, вызывая увеличение числа фагоцитирующих клеток и количества микробов, приходящихся на 1 фагоцит. Причем активность в ряду изучаемых препаратов в отношении фагоцитирующих свойств соответствовала таковой при изучении их влияния на хемилюминесценцию (таблица 5).

Кроме макрофагов иммунная система располагает еще одним типом клеток-киллеров, способных без предварительной сенсибилизации лизировать различные типы генетически чужеродных (в том числе и злокачественных) клеток - это естественные киллерные клетки. Полученные данные свидетельствуют о том, что влияние кантаксантина и ликопина в этой модели в определенной степени зависит от дозы. Оба вещества обладали выраженным стимулирующим эффектом в дозах выше 0,1 мг/кг. Каротин-токофероловый комплекс уже в минимальной дозе обладал выраженным стимулирующим эффектом, который слабо менялся при изменении дозы препарата. При использовании бета-каротина умеренное- повышение цитолитической активности происходило только при использовании высоких доз (рисунок 13).

При изучении влияния каротиноидов на функциональную активность специфических цитолитических Т-лимфоцитов обнаружено, что стимулирующий эффект бета каротина прямо зависел от вводимой дозы, специфический цитолиз повышался в 1,5 раза. На этом же уровне наблюдался эффект и от введения каротин-токоферолового комплекса. Кантаксантин и ликопин сколько-нибудь значимым эффектом на этой модели не обладали (рисунок 14).

Учитывая исключительно важную роль интерлейкина-2 в сигналах, запускающих пролиферативные процессы иммунокомпетентных клеток, да и в функционировании иммунной системы в целом, предметом дальнейших наших исследований явилось изучение влияния каротиноидов на продукцию интерлейкина-2. Из всех изученных препаратов только бета-каротин и КТК повышали продукцию интерлейкина-2 в дозе 10 -100 мг/кг (рисунок 15). В другом эксперименте оценивали

иммунопротекторные возможности провитамина А на модели иммуносупрессии, индуцированной гидрокортизоном, которая является следствием не только прямой ингибиции синтеза цитокинов и в частности ИЛ-2 лимфоидными клетками, но может опосредоваться и более сложными механизмами, поскольку введение гидрокортизона запускает целый каскад триггерных реакций, которые иногда имеют и разнонаправленное влияние в частности и на иммунокомпетентные клетки. Инъекцирование гидрокортизона снижало синтез интерлейкина-2 до 60% от контрольного уровня. Введение бета-каротина в дозе 10 мг/кг частично предотвращало ингибирующее действие гидрокортизона. Тогда как повышение дозы до 100 мг/кг способствовало сохранию продукции интерлейкина-2 на уровне контроля (рисунок 16).

Суммируя полученные данные о влиянии каротиноидов на иммунную систему можно заключить, что их действие не сводится к какому-либо локальному эффекту, а затрагивает сложный и интегральный процесс прямого и опосредованного влияния на иммунокомпетентные клетки и медиаторы иммунной системы.

Иммуномодулирующие и антиканцерогенные свойства природных каротннондов при развитии экспериментального рака желудка у обезьян.

Исходя из имеющихся экспериментальных и клинических данных об ингибирующем влиянии бета-каротина на предраковые изменения в слизистой оболочке желудка, было изучено влияние каротин-токоферолового комплекса на развитие рака желудка у обезьян Macaca fascicularis (Яванский макак). Предпосылкой также послужил и тот факт, что индуцированные химическими гастротропными канцерогенами злокачественные опухоли желудка у обезьян по своим анатомическим особенностям, клиническому течению и морфологии идентичны с такими же опухолями, встречающимися у людей, вследствие чего они могут быть использованы в качестве экспериментальной модели.

Обезьяны были разделены на три группы:

1 группа - контроль (8 обезьян) содержались на стандартной

диете.

2 группа - (11 обезьян) получала только гастротропный канцероген ЭННГ (этил-нитро-нитрозоганедин) в виде 2% суспензии в подсолнечном масле в дозе 50 мг/кг 2 раза в неделю.

3 группа - (13 обезьян) получала каротин-токофероловый комплекс в дозе 10 мг/кг в пересчете на бета-каротин (3,5 мл на животное), который вводили ежедневно перорально. Через месяц после начала введения КТК животным вводили канцероген.

Наблюдение за животными проводили в течение двух лет.

Таблица 6. Влияние КТК на канцерогенез, индуцируемый ЭННГ в __течение 24 мес. у обезьян__

Группа К-во Выживаемость, Число Латентный

животных групп % опухолей, % период,

мес.

Контроль 8 8 100 0 0

ЭННГ 11 8 72,7 4 36,3 9*2,1

ЭННГ+КТК 13 12 92,3 3 23,0 15±2,6

0,8 ч я

0,7 -

0,6-

0,5-

0,4 •

Рис.17. Фармакокинетика бета-каротина при курсовом введении КТК обезьянам

Рис. 18. Влияние КТК на пролиферативный ответ лимфоцитов переферической крови при гастроканцерогенезе .индуцированном ЭННГ

1 2 3 4 22 26 . 30 34

1-1-1

8 16 24

о

Из результатов, представленных в таблице 6, следует, что выживаемость в группе животных получавших КТК вместе с канцерогеном, выше, чем у животных, получавших только канцероген. Количество опухолей обнаруженных при фиброгастроскопии также снижалось в группе животных получавших КТК. Наиболее ярко защитный эффект каротиноидного комплекса проявлялся при исследовании такого показателя, как средний латентный период (от начала дачи канцерогена до появления опухоли) в этом случае КТК практически в 2 раза увеличивал этот период.

Основной причиной гибели обезьян были опухоли желудка, гистологически определяемые, как аденокарциномы.

Из данных по фармакокинетике (рисунок 17) следует, что исходный уровень бета-каротина во всех группах составлял 20-30 мкг/100 мл. В контрольной группе этот уровень сохранялся в течение всего эксперимента. Уровень бета-каротина в 3 группе стал повышаться уже с 1 недели и вышел на плато уже к 3-4 неделе. С этого момента животные во 2 и 3 группе стали получать ЭННГ. Начиная, примерно, с 22 недели концентрация бета-каротина в группе животных получавших ЭННГ стала снижаться, что вероятно связано как с изменениями в желудочно-кишечном тракте под влиянием канцерогена, так и с нарушением гомеостатических механизмов на уровне всего организма под влиянием того же фактора. Аналогичное снижение этого показателя обнаружено и в группе животных, получавших совместно с канцерогеном и КТК, однако, во всех случаях содержание бета-каротина превышало этот показатель в контрольной группе.

Пролиферативный ответ лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогеном был выше контрольной группы в первые месяцы от начала эксперимента в обеих группах обезьян, получавших ЭННГ. В последующем наблюдалось падение пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием митогена. Однако, защитное действие КТК, наиболее выраженное в начальной стадии эксперимента сохранялось и все последующее время (рисунок 18).

Уровень опухолевых маркеров определяли в сыворотке венозной крови (рисунок 19).

Содержание раково-эмбрионального антигена (РЭА) - а он является специфичным для опухолей пищеварительного тракта и в случаях с аденокарциномой его уровень кореллируе^ со стадией опухоли, существенно повышалось, начиная с 9-12 месяца от начала эксперимента обеих группах животных получавших канцероген. КТК оказывал тормозящее действие на образование этого опухолевого маркера (на 40-60%), что свидетельствует о торможении опухолевого процесса.

Определение концентрации бета-хорионического

гонадотропина, который применим для диагностики и мониторинга опухолей герминативных органов, показало отсутствие колебаний этого показателя выше средних значений контрольной группы при даче, как канцерогена, так и канцерогена вместе с КТК.

Содержание альфа-фетопротеина (АФП), который имеет клиническое значение при первично-клеточной карциноме печени, биллиарной карциноме, рака желудка и панкреаса, печеночных метастазов, в группе животных получавших ЭННГ и КТК достоверно повышалось, начиная с уже с 3 месяца от начала

ИСХ 3 6 9 12 15 18 21 24

Время (мес.)

эксперимента относительно контрольного уровня и группы животных, получавших только канцероген. Этот феномен мы связываем с включением защитных механизмов, в частности с активацией пролиферации иммунокомпетентных клеток, переход их в бластное состояние и активацией репаративных процессов под действием КТК в ответ на повреждающее действие канцерогена, что и может приводить к некоторому увеличению уровня АФП. Существенное возрастание содержания этого маркера наблюдается после 12 месяцев от начала эксперимента. Что, вероятно, соответствует стадии промоции опухолевого процесса, когда возможно интенсивное увеличение опухолевых клеток экспрессирующих АФП. В этом случае также хорошо проявляется защитное действие КТК.

Коррекция бета-каротнном реакций клеточного иммунитета при экспериментальной химиотерапии злокачественных новообразований.

С целью исследования возможности использования бета-каротина в качестве вспомогательного препарата при комплексном лечении больных РТК было изучено его влияние на показатели иммунологического и антиоксидантного статуса при лечении этого заболевания.

В предоперационном периоде все пациенты получали препарат бета-каротина в дозе 30 мг/день в течение 5-9 дней, а затем дистанционную гамма-терапию на фоне продолжающегося приема бета-каротина. Контрольная группа включала 11 здоровых лиц, а опытная 43 больных РТК второй, третьей и четвертой клинической стадии заболевания, которая в свою очередь делилась на - 20 лиц не получавших бета-каротин й 23 - с использованием бета-каротина в предоперационной подготовке.

В результате выявлено некоторое снижение концентрации БК у больных РТК. В процессе дистанционного гамма-облучения, во время предоперационной подготовки выявлено 2-кратное уменьшение содержания бета-каротина в сыворотке крови у пациентов, не получавших бета каротин. Это позволяет сделать вывод о форсированном использовании бета-каротина при радиационном воздействии, вероятно, для нейтрализации супероксидных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов. Прием бета-каротина пациентами, получающими гамма-терапию, сопровождался повышением в 1,6 раза концентрации этого вещества в сыворотке крови больных РТК по сравнению с исходным значением и в 3,1 раза по сравнению с группой пациентов, предоперационная подготовка которых не включала иммунокоррекции (рисунок 20).

Рис.20. Концентрация бета-каротина в сыворотке крови больных РТК в ходе комбинированной терапии (мкг/мл)

□ Здоровые

□ Больные РТК, исходное значение

□ Гамма-терапия

□Гамма-терапия с бета-каротином

Таблица 7. Изменение пролиферативной активности, чувствительности к индометацину и эндогенной супрессии МНК у больныхРТК в ходе комбинированной терапии

Показатель Здоровые Больные PTR гамма-терапия Гамма-терапия с р-каротином

Индекс стимуляции в РБТЛ 4,29±1,05 1,23±0,27* 0,62±0,13* 1,93±0,58*

Супрессорная активность клеток ММР 155Д±99,1 240,3±16,7* 181,0±10,б1* 108,0±18,47*

Индекс чувствительности к индометацину в РТБЛ 0,48±0,12 1,79±0,46* 0,78±0,0б* 0,99±0,07* 1

• - р < 0,05 • Таблица 8. Изменение цитотоксической активности натуральных киллеров у больных РТК в ходе комбинированной терапии больных раком толстой кишки.

Эффектор/мишень Здоровые Больные РТК Гамма-терапия Гамма-терапия с Р-каротином

50:1 33,4±3,70 28,7±2,49 22,5±2,9* 29,5±3,60*

25:1 20,4±5,19 14,1 ±2,44* 12,3±2,53 18,8±2,55*

12,5:1 9,3±2,16 5,9±0,14 6,6±1,32 6,7±1,1б

* - р < 0,05

У обследованных нами онкологических больных функциональная активность МНК по сравнению с группой здоровых лиц имела выраженные отличия: ослабление

пролиферативного ответа лимфоцитов на стимулирующее воздействие митогена ФГА, увеличение супрессорной активности клеток моноцит-макрофагального ряда (когда их добавление к культуре мононуклеарных клеток приводило к ингибиции пролиферативной активности лимфоцитов). Вероятно это происходило вследствие гиперпродукции простагландина Е2, поскольку супрессорное действие моноцит-макрофагальных клеток отменялось при добавлении индометацина - тест на чувствительность к индометацину (таблица 7).

Воздействие гамма-терапии, проведенной без назначения бета-каротина, проявилось еще более выраженным снижением показателей в РБТЛ (50%). Супрессорная активность клеток моноцит-макрофагального ряда также снижалась, вероятно, под токсическим воздействием того же фактора. Это сопровождалось и положительным изменением в тесте на чувствительность к индометацину.

Напротив, лучевая терапия, проведенная в сочетании с бета-каротином, не сопровождалось столь неблагоприятными изменениями в отношении лимфоидной ткани. Отмечено увеличение индекса стимуляции лимфоцитов в РБТЛ и снижение уровня эндогенной супрессии МНК.

Цитотоксичность натуральных киллеров против клеток-мишений Мо11-4, пониженная у больных РТК под действием бета-каротина, возрастала практически до уровня здоровых людей (таблица 8).

Обобщая показатели иммунитета, определяемые по экспрессии ряда антигенных маркеров у обследованных нами больных РТК (таблица 9), следует отметить изменение регуляторных процессов в сторону супрессии иммунного ответа: уменьшение численности регуляторной популяции фенотипа С04 (Т-хелперы/индукторы), что и проявилось в функциональном тесте пролиферации лимфоцитов в ответ на митогенный стимул (ФГА); уменьшение в гейте лимфоцитов количества клеток, эксперессирующих маркер С07, сочеталось с гипоактивностыо натуральных киллеров в функциональном тесте против клеток-мишеней М011-4. Параллельно уменьшалось и количество Т-зависимых клеток, несущих В-клеточный маркер С022. Снижалось и количество клеток, экспрессирующих рецептор к трансферину (С071), контакт которого с соответствующим белком запускает пролиферацию.

Назначение больным только гама-терапии приводило к еще большему снижению экспрессии этих и других клеточных маркеров.

После курса гамма-терапии в сочетании с бета-каротином у больных происходило увеличение количества клеток несущих 10 из 18 анализированных нами дифференцировочных маркеров лимфоцитов.

Полученные данные свидетельствует о том, что возрастание концентрации бета-каротина в сыворотке крови больных РТК ходе предоперационной гамма-терапии имело стимулирующие влияние на реакции клеточного иммунитета и способствовало тем самым повышению резистентности иммунной системы человека к действию радиационного облучения.

Реактивные метаболиты кислорода принимают участие в процессах инвазии и метастазирования злокачественно-трансформированной ткани,, способствуя промоции опухолевого процесса, деструкции клеточных мембран, и пенетрации опухолевых элементов в окружающие ткани. При раке толстой кишки опухолевая ткань содержит значительно больше реактивных соединений, по сравнению с нормальной, из-за повышенной продукции их внутри новообразования или низкой активности антиоксидантных факторов.

При сравнении интенсивности перекисного окисления липидов (по концентрации одного из его конечных продуктов -малонового диальдегида) и активности важных антиоксидантных энзимов СОД, которая реакцией дисмутирования нейтрализует активные радикалы 0-2 с образованием перекиси водорода, нейтрализуемой в дальнейшем каталазой,. в плазме крови обследованных нами больных РТК отмечено возрастание концентрации МДА и снижение активности СОД - по сравнению со здоровыми лицами контрольной группы.

Курс предоперационной гамма-терапии не вызывал изменений рассматриваемых показателей СОД, снижал активность каталазы и увеличивал содержание МДА.

Гамма-терапия, проводимая на фоне насыщения организма бета-каротином, сопровождалась снижением концентрации МДА в плазме крови больных. Это с одной стороны может быть связано с прямым антиоксидантным эффектом бета-каротина, который в этом случае прямо связывает свободные радикалы, образующиеся при гамма облучении и с другой стороны происходить опосредованно, через активацию эндогенной антиоксидантной системы поскольку активность исследованных нами ферментов, ответственных за

нейтрализацию супероксидных радикалов и перекиси водорода, имела достоверное увеличение (таблица 10).

Полученные нами данные по стимуляции бета-каротином иммунного статуса больных РТК, возможно, объясняются не только изложенными ранее иммуномодулирующими свойствами этого препарата, но и его антиоксидантным потенциалом, нивелирующим иммунотоксическое действие перекисных соединений и свободных радикалов.

ВЫВОДЫ

1 .Сравнительный анализ фармакокинетики каротиноидов свидетельствует, что каротиноиды слабо адсорбируются животными, их биодоступность имеет существенные видовые различия и возрастает в следующем порядке: собаки - мыши -крысы - поросята - человек. Поэтому их изучение в биологических моделях с использованием животных возможно при использовании высоких доз изучаемых препаратов, либо путем длительного скармливания с диетой.

2,Минимальной биодоступностыо, при однократном пероральном введении мышам линии СВА, обладает бета-каротин, достоверное повышение его эндогенного уровня наблюдается в дозах 100 мг/кг и выше. При курсовом введении повышение его сывороточного уровня начинается с 6 дня применения в дозе 0,1 мг/кг. Кантаксантин и ликопин обладают лучшей биодоступностью, повышение их сывороточного уровня достоверно при однократном использовании дозы 30 мг/кг, а курсовое введение минимальной дозы (0,1 мг/кг) приводит к повышению их сывороточного уровня начиная с 3 дня применения. Бета-каротин в составе природного каротин-токоферолового комплекса обладает лучшей биодоступностью (в 4-5 раз) по сравнению с синтетическим бета-каротином.

3.Изученные каротиноиды обладают выраженной антимутагенной активностью в отношении спонтанных и при радиационно-индуцированных хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей линии СВА, этот эффект прямо зависит от их антиоксидантного потенциала. Так, максимальным антимутагенным эффектом обладают лейкопин и каротин-токофероловый комплекс, который снижают уровень хромосомных повреждений в клетках костного мозга мышей в 1,5-2 раза. При хромосомных аберрациях индуцированных непрямым мутагеном циклосфаном, максимальным антимутагенным эффектом обладает бета-каротин.

4.Бета-каротин, не влияет на мутагенность клеток Salmonella typhimrium под действием прямых мутагенов в различных модификациях теста Эймса. Однако, он проявляет антимутагенный эффект в отношении непрямых мутагенов бенз(а)пирена и 2-ацетил-аминофлуорена с показателем антимутагенной активности от 0,2 до 0,34 в тесте Salmonella/микросомы. При этом наблюдается зависимость от дозы мутагена и от количества вносимой активирующей микросомальной смеси. Бета-каротин, вводимый с пищей, снижает способность микросомальной фракции печени мышей активировать непрямые мутагены в тесте Salmonella/ микросомы.

5.Влияние каротиноидов на гуморальное звено иммунной системы зависит от пути введения и длительности применения. Так, синтетический бета-каротин и бета-каротин в составе каротин-токоферолового комплекса повышают образование антителобразующих клеток до 350% при однократном внутрибрюшинном введении в ранние сроки (1-2 сутки) после иммунизации мышей линии СВА эритроцитами барана. Кантаксантин и ликопин стимулировали образование антителобразующих клеток на этой модели до 200-300% при введении за 24 часа до иммунизации и ранее. Курсовое пероральное введение всех my4aieMbix каротиноидов не влияет на число антителобразующих клеток к Т-независимому антигену (Vi-АГ) и приводит к увеличению числа антителобразующих клеток к Т-зависимому антигену (эритроциты барана). Бета-каротин обладает протективным действием в отношении гуморального иммунного ответа при радиационной, химической или генетически детерминированной иммунодепрессии.

б.Изученные каротиноиды усиливают клеточный иммунный ответ мышей линии СВА. Каротин-токофероловый комплекс стимулирует образование специфических цитолитических Т-лимфоцитов до 200% только при курсовом внутрижелудочном введении низких доз (0,1 и 1,0 мг/кг), тогда как стимулирующие свойства бета-каротина, кантаксантина и ликопина на этой модели повышались до 150% с увеличением используемой дозы. Все исследуемые каротиноиды в 1,5-2 раза повышают цитолитическую активность естественных киллерных клеток. Бета-каротин и каротин-токофероловый комплекс в 3-4 раза, а кантаксантин и ликопин в 1,5-2 раза повышают активность макрофагов, определяемую по способности к фагоцитозу и продукции активных форм кислорода. Иммуностимулирующие свойства бета-каротина опосредуются через его влияние на синтез интерлейкина-2, так как его курсовое пероральное введение повышает синтез этого

цитокина у интактных мышей линии СВА и при гидрокортизоновой иммунодепрессии. Бета-каротин стимулирует пролиферативный ответ лимфоцитов в малых дозах (0,1 и 1,0 мг/кг) и снижает его при введении высоких доз (100 мг/кг). Каротин-токофероловый комплекс, кантаксантин и ликопин обладают стимулирующим влиянием на этот показатель иммунного статуса.

7.Каротин-токофероловый комплекс обладает антиканцерогенными свойствами при гастроканцерогенезе индуцированном ЭННГ у обезьян Macaca fascicularis (яванский макак). Его длительное введение приводит к нарастанию содержания бета-каротина в крови обезьян в 2,5 раза в течение 3-х недель приема препарата. Введение канцерогена ЭННГ приводит к снижению содержания бета-каротина. Этот препарат повышает выживаемость обезьян, оказывает ингибирующее влияние на частоту возникновения опухолей и увеличивает латентный период их развития при гастроканцерогенезе индуцированном ЭННГ. Каротин-токофероловый комплекс снижает содержание раково-эмбрионального антигена, альфа-фетопротеина и не влияет на уровень бета-хорионического гонадотропина. Он, также, стимулирует пролиферативный ответ лимфоцитов при гастроканцерогенезе индуцированном ЭННГ.

8.Дистанционная гамма-терапия (суммарная очаговая доза 25 Грей) вызывает 2-кратное падение концентрации бета-каротина в сыворотке крови больных раком толстой кишки. Пероральное введение бета-каротина в дозе 30 мг/день в период предоперационного облучения приводит к увеличению в крови концентрации препарата в 1,6-2,7 раза, что сопровождается стимуляцией пролиферации лимфоцитов периферической крови в ответ на действие фитогемагглютинина, снижением эндогенной супрессии, усилением цитотоксичности натуральных киллеров и увеличением количества клеток, экспрессирующих дифференцировочные маркеры CD7, CD25, CD45, CDw50, HLA-1. Гамма-терапия рака толстой кишки, проводимая на фоне насыщения тканей бета-каротином, характеризуется снижением концентрации малонового диальдегида и увеличением активности СОД, катапазы в плазме крови больных.

9.Результаты проведенных исследований позволяют пересмотреть установившиеся представления о бета-каротине и других каротиноидах, как веществах с провитаминной активностью и классифицировать их, как лекарственные средства, обладающие иммуномодулирующими антиоксидантными, антиканцерогенными и антиканцерогенными свойствами. В свете установленных закономерностей можно рекомендовать их применение в клинике

для иммунокоррекции при комбинированном лечении злокачественных новообразований, в терапии заболеваний сопровождающихся проявлениями вторичного иммунодефицита, среди здоровых людей, по роду своей деятельности регулярно подвергающимся вредным воздействиям и в группах онкологического риска.

Основные работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Коростелев С.А., Атониязов М.К., Голубева З.Ф. и другие. Разработка средств активной профилактики опухолей на основе нетоксичных иммуномодуляторов. - Материалы I Конференции НИИ ЭДиТО ВОНЦ «Терапия, диагностика и профилактика опухолей в эксперименте», Москва, 1990, с. 101-105.

2. Коростелев С.А., Буюклинская О.В., Привалова Э.Г., Самохвалов Г.И., Толкачев В.Н. Иммуномодулкрукзщая активность каротиноидов. - Тез. докл. Всесоюзной конференции «Клиническая витаминология», Москва, 1991, с. 107-108.

3. Молочников В.В., Агафонычев В.П., Нуртдинов Ф.Х., Рыбчинская B.C., Коростелев С.А. Разработка средств активной профилактики опухолей на основе, лечебно-профилактических продуктов питания. - Тез. докл. Всесоюзной конференции «Совершенствование технологических процессов производства новых видов пищевых продуктов», Киев, 1991, с. 290.

4. Шлянкевич М.А., Дризе О.Б., Хабибулина В.М., Сергеев A.B., Коростелев С.А. Антимутагенная активность каротинсодержащих препаратов in vivo и in vitro. -Материалы симпозиума «Каротиноиды в онкологии», 1992, с. 74-78.

5. Коростелев С.А., Хабибулина В.М., Сергеев A.B. Иммуномодулирующие свойства высококаротиноидного комплекса из плодов шиповника. - Материалы симпозиума «Каротиноиды в онкологии», 1992, с. 111-114.

6. Шлянкевич М.А., Дризе О.Б., Коростелев С.А Иммуномодулирующие и антимутагенные свойства каротиноидов. - Тез. докл. XI Научной конференции «Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях»,

Челябинск, 1992, с. 96-97.

7. Коростелев С.А., Буюклинская О.В., Наполов Ю.К., Потапова A.A., Утешев Б.С. Бета-каротин в иммунокоррекции первичных и вторичных иммунодефицитных состояний. - Тез. докл. XI Научной конференции «Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях», Челябинск, 1992, с. 17-18.

8. Коростелев С.А., Шашкина М.Я., Мкртчян Т.В. и другие. Стратегия создания лечебно-профилактических средств предупреждения рака. - Тез. докл. I Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1992, с. 339.

9. Коростелев С.А., Шеренешева Н.И. Иммуномодулирующая и антиканцерогенная активность каротиноидов. - Вопросы медицинской химии, № 4,1992, с. 42-45.

10. Буюклинская О.В., Коростелев С.А., Потапова A.A., Утешев Б.С. Влияние бета-каротина на продукцию интерлейкина-2 и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. - Вопросы медицинской химии, 1992, т. 38, №6, с. 29-31.

11. Буюклинская О.В., Коростелев С. А., Остапова A.A., Утешев Б.С. Влияние бета-каротина на продукцию интерлейкина-2 и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. - Сб. «Каротиноиды в онкологии», Москва, 1992. с. 94-98.

12. Буюклинская О.В., Коростелев С.А., Потапова A.A., Сергеев A.B. Влияние бета-каротина на продукцию интерлейкина-2 и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. - Материалы симпозиума «Каротиноиды в онкологии», 1992, с. 94 - 101.

13. Коростелев С.А., Ананьев B.C., Мкртчян Т.В. и другие. Использование биоантиоксидантов в комплексном лечении онкологических больных. - Тез. докл. IV конференции «Биоантиоксидант», Москва, 1992, т. II, с. 126-127.

14. Коростелев С.А., Страшненко Е.С., Алпатов С.П., Бражников С.М., Газин М.Ю., Зазуленко Т.В. Лечебно-профилактические пищевые добавки на основе лиофилизированных овощных соков, обладающих антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами. -

III международный симпозиум «Экология человека», 1993, с. 173-174.

15. Коростелев С.А., Мухаметжанова Д.М., Банашек В.Э., Жучков В.Н. Антиоксидантные и антимутагенные свойства природного каротин-токоферолового комплекса. - Тез. докл. III Международного симпозиума «Экология человека», 1993, с. 266-267.

16. Korostelev S.A., Syrkin А.В, Buiuklinskaya O.V. Immunopharmacology of beta-caroten. - Abc. Second Int. Cancer Chemo Prevent Conf., Berlin, Germ., 1993, p. 127.

17. Абронина И.Ф., Раманаускайте Р.И., Рытенко A.H., Коростелев С.А. Стимуляция бета-каротином клеточного иммунного ответа мышей. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1993, с. 116 (9), 295-8.

18. Буюклинская О.В., Коростелев С.А., Потапова A.A. Влияние бста-карстина на продукцию интерлейкина-2 и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. -Вопросы медицинской химии, т. 38 № 6, 1994, с. 29-31.

19. Korostelev S.A., Shlyankevich М.А., Drize О.В. et. al. Antimutagenic and immunomodulating activity of carotene-tocopherol complex from rose' s fruts. - Abst. XYI Int. Cancer Congress-New-Delhi-1994 - PSB 48-06.

20. Страшненко E.C., Алпатов С.П., Брюжников C.M., Коростелев С.А. и другие. Лечебно-профилактические пищевые добавки на основе лиофилизированных овощных соков, обладающих антиоксидантными и иммуномодулирующими свойствами. - Тез. докл. III Международного симпозиума «Экология человека: проблемы и сост. проф. питания», Москва, 1994, с. 171-173.

21. Мухамеджанова Д.М., Банашек В.Э., Жучков В.Н., Коростелев С.А. и другие. Антиоксидантные и антимутагенные свойства природного каротинтокоферолового комплекса. - Тез. докл. III Международного симпозиума «Экология человека: проблемы и сост. проф. питания», Москва, 1994, с. 266-267.

22. Коростелев С.А., Хабибулина В.М., Дризе О.Б. Исследование антимутагенной активности бета-каротина. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, № 9, 1995, с. 276-278.

23. Коростелев С.А., Утешев Б.С., Алпатов С.П. и другие. Разработка лекарственных средств на основе каротиноидов для коррекции иммунодефицитных состояний. - Тез. докл. II Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1995, с. 143.

24. Коростелев С.А., Утешев Б.С., Сергеев А.В. Анализ современных направлений в создании иммунотропных средств. - Экспериментальная и клиническая фармакология, Т. 58, № 3, 1995, с. 3-7.

25. B.S. Uteshev, S.A. Korostelev, T.V. Mkrtchyan, A.V. Sergeev Pharmacology and toxicology of synthetic beta-carotene - I European congress of pharmacology, Milan, Italt, June 16-19, 1995, p. 195.

26. Сергеев A.B., Дурнов Л.А., Ильяшенко B.B., Коростелев С.А., Сыркин А.Б. Поиск и разработка средств химиопрофилактики рака. - Тез. докл. I Съезда онкологов стран СНГ, Москва, 1996, с. 42.

27. Korostelev S.A., Sergeev A.V., Mkrtchyan T.V. Pharmaceutical and Biomedical Aspects of beta-carotene-based Drug Development. — 9-th NCI - EORTC Symposium on new drugs in cancer therapy, Amsterdam, 1996, N 212.

28. Хабибулина B.M., Юрченко Н.Я., Коростелев C.A., Шашкина М.Я., Сергеев А.В. Включение бета-каротина в различные курсы химиотерапии лимфолейкоза L 1210. - Вопросы медицинской химии, Т. 43, № 2, 1997, с. 94-97.

29. Сергеев А.В, Клейбанов Г.И., Утешев Б.С., Коростелев С.А. Антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства каротиноидов и токоферолов. - Тез. докл. IV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1997, с. 291.

30. Korostelev S.A., Sergeeva T.I., Shachkina M.Ya., Mkrtchyan T.V. Developmen and investigation of Cancer Chemoprevention Antioxidant Complex Drug. - 8-th Eighth Internetional Congress on Anti - Cancer Treatment, Paris, France, 3- 6 febr., 1998, p 144.

31. Sergeev A.V., Korostelev S.A., Mkrtchyan T.V., Penkov V. Chemoprevention cancer drug based on ascorbinic acid and beta-carotene. - 8-th Internetional Congress on Anti - Cancer Treatment, France, Paris 3-6 febr., 1998, p. 228.

32. Сергеев A.B., Шашкина М.Я., Коростелев С.А., Утешев Б.С. Создание профилактических средств, обладающих антимутагенными, антиканцерогенными и иммуномодулирующими свойствами. - Тез. докл. V Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 21-25 апреля 1998, Москва, с. 406.

33. Мкртчян Т.В., Коростелев С.А., Оленев А.Л., Пенков М.П., Соколова И.А., Сергеев A.B., Шашкина МЛ. Разработка биологически активных добавок к пище на основе антиоксидантных витаминов. - Материалы 4-го Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище: 21 век» 22-24 мая 2000, С.-Петербург, с. 165166.

34. Утешев Б.С., Коростелев С.А., Сторожаков Г.И., Барышников А.Ю. Ретиноевая Кислота как фактор дифференцировки клеток гемопоеза. - Современная онкология, 2001, № 2, т.З, с.48-51

35. Сергеев A.B., Ананьев B.C., Коростелев С.А., Шашкина М.Я. Фармацевтические .и медико-биологические аспекты создания средств химиопрофилактики рака. - Вестник ОНЦ РАМН, №3 2001, Москва, с. 11-16.

36. Коростелев С.А. Ликопин: потенциальное онкопрофилактическое действие. - В мире лекарств, №1(11) 2001, Москва, с.48-50.

37. Сергеев A.B., Шашкина М.Я., Мкртчян Т.В., Коростелев С.А. Разработка средств химиопрофилактики рака. -Российский биотерапевтический журнал, №2, т.1, 2002, Москва, с. 126.

ПАТЕНТЫ

38. Шашкина М.Я., Сергеев A.B., Буюклинская О.В., Мкртчян Т.В., Соколова И.А., Коростелев С.А. Состав, обладающий адаптогенным действием. - Патент на изобретение № 2063750,1996.

Участок множительной техники POHU им. H.H. Блохина РАМН Заказ 42 Тираж 100 экз.