Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение процессов глюкуроноконъюгации на основе фармакокинетических и биохимических исследований

На правах рукописи

2 О АВГ 2009

БАРАНОВ ПАВЕЛ АНДРЕЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ГЛЮКУРОНОКОНЪЮГАЦИИ НА ОСНОВЕ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003475376

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте имени В. В. Закусова РАМН и в ФГУП «Антидопинговый центр» Минспорттуризма России

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Сариев Абрек Куангалиевич

кандидат химических наук Родченков Григорий Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Гарибова Таисия Леоновна

доктор медицинских наук Сычев Дмитрий Алексеевич

Ведущая организацив: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет»

Защита состоится__2009 г. в_час на заседании Диссертационного совета Д

01.024.01 при НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в ученой части НИИ фармакологии имени В. В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Россия, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан «_»_2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Вальдман Е. А.

Список сокращений

бр-ГК - бр-гидроксикортизол

а.е.м. - атомная единица массы

ВФС - временная фармакопейная статья

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВС - внутренний стандарт

ДНХ - дансилхлорид

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИЭР - ионизация электрораспылением

К - свободный кортизол

МС - масс-спектрометрия, масс-спектр

ОП - 2-этил-б-метал-З-окснпиридин

ОП-твин - 2-этил-6-метил-3-оксипиридин в 5,0 % растворе твин-80 СОП - 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцинат

СОП-твин - 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат в 5,0 % растворе твин-80

УДФ - уридин-5'-дифосфат

УФ - ультрафиолетовое излучение

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ЭПС - эндоплазматическая сеть

СУРэ - семейство цитохром Р450-зависимых монооксигеназ ийТБ - семейство ферментов УДФ-глкжуронозилтрансферазы

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одной из основных проблем современной экспериментальной и клинической фармакологии является изучение процессов биотрансформации лекарственных веществ и ксенобиотиков (Шашков В. С. и соавт., 1998; Nakano S. et. al., 1996; Navarro F. A et. al., 1993; Ramage A. et. al., 2005; Sousa De. B. et. al., 1996). В последнее время вопросам метаболизма лекарств в живых организмах уделяется все большее внимание. Это обусловлено не только возрастающим количеством оригинальных лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке, но и бурным развитием современных технологий, позволяющих проводить биохимические и фармакокинетические исследования, фенотипирование и генотипирование пациентов, а также необходимостью разработай принципов рациональной фармакотерапии (Atkinson A. J. Jr. et. al., 1977; Bloom J. С. et. al., 2003; Brockmoller J. et. al., 1994; Cohen N. et. al., 2008; Watkins P. B. et. al., 1994).

Открытия фундаментальных наук последних десятилетий коренным образом изменили представления о патогенезе заболеваний и подходы к их лечению. Индивидуализация фармакотерапии является неотъемлемой частью и качественной основой современных высокоэффективных принципов экспериментальной и клинической фармакологии (Сергиенко В. И. и соавт., 2003; Cohen N. et. al, 2008). Рациональный выбор адекватной дозы лекарственного препарата, а также режима дозирования, па основе оценки индивидуальных фенотипиче-ских и генотипических особенностей биотрансформации, может значительно .снизить число нежелательных побочных эффектов и повысить эффективность лечения (Sousa De. В. et. al, 1996).

Одним из подходов к изучению процессов биотрансформации является использование «маркерных субстратов», которое позволяет проводить комплексное и направленное изучение особенностей биотрансформации ксенобиотиков, оценивать индивидуальные фенотипи-чсские особенности метаболизма у различных биологических видов (Bloom J. С. et. al., 2003; Cohen N. et. al, 2008).

Клинической основой применения «маркерных субстратов» является оценка активности определенных ферментативных систем у пациентов, а также выявление генетических вариантов процессов биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ (Bloom J. С. et. al., 2003; Mendelsohn M. L. et. al, 1998).

Методологической основой изучения «маркерных субстратов» является комплексная оценка процессов биотрансформации потенциального субстрата с учетом влияния ферментативных систем I и II фаз, а также биохимические и клинические исследования энзиматиче-ской активности исследуемого субстрата на основании результатов прямого и косвенного фенотипирования как в условиях in vitro, так и in vivo (Ernstgard L. et. al., 2007; Fuhr U. et. al., 1996; Streetman D. S. et. al, 2000; Vincent G. et. al., 2003; Zien A. et. al, 2007).

Объектом исследования в данной работе является препарат мексидол (2-этил-6-метил-З-оксипиридина сукцинат). В ранних исследованиях биотрансформации и экскреции мекси-дола показано, что основной метаболизм данного лекарственного препарата у человека проходит с участием ферментативных систем II фазы (Сариев А.К. и соавт., 2001: Сариев АХ, 1999). Кроме того, были выявлены генотипические различия в скорости экскреции неизме-

ненного соединения и глюкуроноконъюгированного метаболита у представителей различных этнических групп (Кравцова О.Ю., 2005). На основании полученных результатов экспериментальных и клинических исследований было предложено проведение биохимических исследований с целью обоснования применения мсксидола в качестве типирующего агента реакции глюкуропоконъюгации у человека (Кравцова О.Ю., 2005).

Цель исследования

Изучение процессов глюкуропоконъюгации методами фармакокинетического и биохимического анализа в условиях in vitro и in vivo на примере препарата мексидол.

Задачи исследования

1 Разработать высокочувствительный, селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче человека.

2 Изучить влияние янтарной кислоты на процессы глюкуропоконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo.

3 Провести in vitro фенотипирование реакции глкжуроноконъюгации на примере 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцината. Определить изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюку-роноконъюгированпых продуктов биотрансформации II фазы метаболизма.

4 Исследовать процессы конъюгации мексидола у людей с использованием различных типов гидролиза (селективные ферменты p-глкжуронидазы, кислотный гидролиз).

5 Изучить влияние основных ферментативных систем I фазы биогрансформации человека на процессы метаболизма 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в условиях in vivo. На основе хромато-масс-спектрометрического анализа биологических образцов провести поиск возможных метаболитов I фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека.

Научная новизна работы

Впервые установлено влияние янтарной кислоты на процессы глюкуропоконъюгации

2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo. Показано, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-6-метил-

3-оксишгридина в среднем в три и девять раз соответственно после перорального и внутри-брюшинного введения.

На основании разработанного хромато-масс-спектрометрического метода установлено, что процесс биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека происходит при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано, что процесс конъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина является комплексным, включающим в себя образование не только глюкуроноконъюгнрованных производных, но и сульфо-, фосфоконъюгиро-ванных метаболитов и иных видов продуктов конъюгации.

Показано, что фенотипирование процесса глкжуроноконъюгации с использованием 2-этил-6-метил-З-оксипиридина невозможно, поскольку в опытах in vitro не обнаружены ка-

кие-либо взаимодействия с микросомапьным пулом человека, а также ни с одной из девяти изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А5; 1А7; 1А8; 1А10; 2В4; 2В7; SF9WT).

В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации впервые установлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGTs: 1А1; 1А10).

На основе неинвазивного метода количественного определения изменения уровня эндогенного бр-гидроксикортизола к свободному кортизолу выявлена тенденция к индукции системы CYP3A4 после пероралыюго приема препарата мексидол.'

Практическая значимость работы

Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-З-оксипиридина в моче человека. Данный метод соответствует международным требованиям ГОРАС (ИЮПАК)', предъявляемым к инструментальным методам анализа биологических образцов, и может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина.

Показана перспектива проведения дополнительных исследований с целью изучения субстратной специфичности дигидроквертицина и определения кинетических профилей субстрата по отношению к отдельным изоформам УДФ-глюкуронозилтрансферазы.

В ходе комплексного исследования биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина расширено представление о путях его биотрансформации у человека при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано активирующее влияние мекси-дола на CYP3A4.

Личное участие автора

Автором были самостоятельно выполнены все эксперименты и исследования по нижеизложенным методикам, а также обработаны результаты и сформулированы выводы.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на XIV Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.); Российском национальном съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007 г.); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва-Клязьма, 2008 г.); на VII Международном симпозиуме «7th Joint of the Association Francophone pour l'Enseignement et la Recherche en Pharmacognosies (Греция, 2008 г.); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины» (Москва, 2008 г.); на XXV Международном симпозиуме «LC/MS» (Швейцария, 2008 г.); П Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009) и па Первом Съезде нейрохирургов Республики Казахстан с международным участием (Астана, 2009 г.).

1 Международный союз теоретической и прикладной химии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 2 статьи и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 4 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический указатель, включающий работы на русском (41) и иностранных языках (149), 37 таблиц, 25 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования

Мексидол - 2-этил-б-метил-3-оксип1фнд1гаа сукцннат. Белый или белый с кремовым оттенком кристаллический порошок без запаха с температурой плавления 112,0 "С ± 3,0 °С. Легко растворим в воде, этиловом, изопропиловом спиртах; плохо растворим в ацетоне, хлороформе, бензоле, эфире, этилацетате, гексане; рН 5,0 % водного раствора мексидола 4,6 ± 0,3.

Дигидроквертицин (таксифолин; 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-

дигидрокеифенил)-4Н-бензопиран-4-он) - белый или слегка желтоватый кристаллический порошок горьковатого неприятного вкуса, без запаха, с температурой плавления 155,0 °С ± 2,0 "С. Хорошо растворим в ДМСО и этиловом спирте, ограничено растворим в слабощелочном водном растворе, плохо - в воде.

Изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъю-гации 2-этнл-6-метнл-3-оксипирндина

Экспериментальные животные

Изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина проводили на 83-х белых беспородных мышах-самцах массой 20,0 г ± 2,0 г (питомник «Столбовая» РАМН), содержащихся в обычном режиме вивария ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН. До проведения исследования животные находились в течение 12-ти часов на водной диете.

Введение препарата и отбор биологических проб

2-этил-б-метил-З-оксипиридин (ОП) животным вводили как в виде соли янтарной кислоты, так и основания. Основание 2-этил-6-метил-3-оксигшридина нерастворимо в воде, поэтому его вводили в 5,0 % растворе твина-80.

Водный раствор 2-этил-б-метнл-З-оксипнридина сукцината (СОП), а также растворы 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината в 5,0 % растворе твина-80 (ОП-твин и СОП-твин соответственно) готовили ex tempore и вводили мышам

натощак перорально с помощью металлического зонда и внутрибрюшинно с помощью инсу-линового шприца.

Доза СОП и СОП-твин, вводимая мышам, составляла 100 мг/кг, а доза ОП-твин была скорректирована с учетом молекулярной массы янтарной кислоты (118а.е.м.) и составила 53,7 мг/кг.

Животных помещали в индивидуальные метаболические клетки на 24 часа со свободным доступом к воде. Собранную в стеклянные пробирки суточную мочу доводили дистиллированной водой до 5,0 мл: из них 2,5 мл брали для определения неизмененного соединения и 2,5 мл для глюкуроноконъюгированного производного. Все разведения учитывались в дальнейших расчетах.

Обработка биологических проб, экстракция 2-этил-6-метил-3-оксипиридина и его глюкуроноконъюгированного продукта из биологических образцов

Извлечение 2-этил-6метил-3-оксипиридина (ОП) и его глюкуроноконъюгированного продукта из мочи животных осуществляли по модифицированному О. Ю. Кравцовой варианту ранее разработанной методики (Кравцова О. Ю., 2005).

Анализ конъюгированных продуктов осуществляли после предварительного энзима-тического гидролиза мочи с добавлением (3-глюкуронидазы (из печени крупного рогатого скота) в количестве 3000 Ед/мл при 23 °С в течение 24-х часов.

Условия хроматографического определения 2-этил-6-метил-3-оксипиридииа и его глюкуроноконъюгированного продукта в биологических образцах животных

Хроматографический анализ содержания 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и его глюкуроноконъюгированного метаболита в моче животных проводили на компьютеризированной системе «Beckman Coulter» (США), оснащенной изократической помпой - «Beckman System Gold 116» и флюориметрическим детектором «RF-10A XL» фирмы «Shimadzu» (Япония). Количественная оценка проводилась по данным прямой калибровки, построенной по площадям хроматографических пиков 2-этил-б-метил-З-оксипиридина.

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации проводили на основании скринип-гового метода определения активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs), разработанного M. Court (Court M. H. et. al., 2005; Court M. H. et. at., 2004).

При оценке активности процессов глюкуроноконъюгации использовали девять ре-комбинантных субмитохондриальных (S9) фракций изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А5; 1А7; 1А8; 1А10; 2В4; 2В7; SF9WT) и микросомальный пул печени человека (HLM).

Определение активности осуществляли методом отбора проб на основе количественной оценки изменения концентрации субстрата и продукта реакции в инкубационной смеси. Количественную оценку ферментативной активности проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

При оценке активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы каждую временную точку исследовали не менее чем в шести повторностях в трех отдельных опытах. При построении графиков использовались усредненные величины, определенные на основе трех-пяти измерений каждой пробы.

В качестве субстратов реакции глюкуроноконыогации использовали 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат (СОП), основание 2-этил-б-метил-З-оксипиридина (ОП) и такси-фолин. В опытах использовали субстраты в диапазоне концентраций 1,0 - 100,0 мкМ.

Условия хромато-масс-спектрометрнческого анализа инкубационной

смеси

Изменение концентрации субстрата в инкубационной смеси контролировали с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором типа ионная ловушка модели «Agilent 1100 Series LC/MSD Ion Trap», оборудованный системой автоматического ввода пробы, внешним источником ионов с электрораспыпи-телыюй ионизацией при атмосферном давлении и управляемый IBM совместимым компьютером с системой обработки данных «Chem Station».

Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке Zorbax Eclipse XDB-C18 (2,1 х 150 мм; 5,0 мкм) фирмы «Agilent Technologies» (Palo Alto, CA, США) в режиме градиентного элюирования. Во время анализа аналитическую колонку термостатиро-вали при 30 °С. Мобильная фаза состояла из 0,2 мМ ацетата аммония в 0,05 % растворе муравьиной кислоты (А) и 100 % метанола (В).

Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) и регистрацией как положительных, так и отрицательных ионов. Напряжение на капилляре составляло 3500 В. В качестве осушающего и распыляющего газа использовали азот со скоростью потока - 9,0 л/мин, давлении 2,07 бар. Температура в источнике ионов составляла 350 °С. Сканирование проводили в режимах полного ионного тока и MRM.

Количественная оценка проводилась по данным прямой калибровки, построенной по площадям хроматографических пиков.

Изучение продуктов экскреции II фазы биотрансформанин 2-этил-6-метил-3-окснпнридина в моче добровольцев

Изучение почечной экскреции мексидола проводили у добровольцев на основе данных анализа различных фракций собранной суточной мочи после приема препарата мекси-дол. С целью адекватной оценки фильтрационно-реабсорбционой функции почек у добровольцев проводили измерение уровня креатипина в суточной моче (Mazzachi В. С. et. al., 2000).

Выбор здоровых добровольцев и их рандомизация

Исследования проводились на базе ФГУП «Антидопинговый центр» с участием здоровых добровольцев мужского и женского пола при их информированном согласии. По итогам отбора к исследованиям были допущены 10 добровольцев, в возрасте 23,7 лет ± 1,06 лет, массой тела 63,7 кг ± 10,3 кг.

Прием препарата и сбор биологических образцов

Добровольцы принимали таблетки мексидола утром (в 900) однократно натощак в дозе 500 мг (4 таблетки мексидола по 0,125 г). Препарат принимали внутрь, не разжевывая, запивая 180 - 200 мл негазированной воды.

В течение всего времени исследования добровольцы соблюдали стандартный режим физической и психической нагрузки, а также стандартный режим питания. Отбор проб мочи вели в течение 24-х часов до и после приема препарата в специальные пластиковые контейнеры для сбора суточной мочи. До начала проведения анализа образцы хранили при -25 °С.

Подготовка биологических образцов суточной мочи к анализу

Изучение почечной экскреции мексидола проводили на основе данных анализа различных фракций собранной суточной мочи. Проводили анализ свободной фракции мочи и фракций мочи после проведения различных типов гидролиза:

• свободная фракция;

• энзиматический гидролиз с Р-глюкуронидазой Escherichia Coli К12;

• энзиматический гидролиз с Р-глюкуронидазой Helix Pomatia Type НР-2;

• кислотный гидролиз.

Пробоподготовку свободной фракции суточной мочи после приема препарата добровольцами осуществляли с применением метода твердофазной экстракции. Экстракцию проводили на колонках Strata-X (8B-S100-TAK; 33,0 мкм; 30,0 мг) фирмы «Phenomenex» (Torrance, СА, США) с использованием вакуумного экстрактора «System 48» фирмы «Сегех, The Nest Group» (Southborough, MA, США).

Колонку предварительно активировали пропусканием через нее 3,0 мл метилового спирта и кондиционировали 3,0 мл воды деионизованной. Через подготовленную колонку пропускали 1,0 мл собранной у добровольцев суточной мочи с добавлением 20 мкл внутреннего стандарта (3-оксипиридип). После пропускания образца колонку промывали 2,0 мл воды деионизованной и проводили элюирование 2,0 мл трет-бутил-метилового эфира. Элюи-рованную фракцию высушивали в токе азота при 20 °С и проводили стадию дериватизации с получением дапсилышх производных. В случае анализа гидролизных фракций мочи, вначале проводили гидролиз, а после образцы мочи анализировали в соответствии с методикой пробоподготовки свободной фракции.

Для получения дансильных производных 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 3-оксипиридина (ВС) к сухому остатку, полученному после высушивания элюата в токе азота добавляли 100 мкл буферного раствора бикарбоната натрия (рН 10,5) и 100 мкл раствора дансилхлорида в ацетоне (концентрация раствора 1,0 мг/мл). Полученную смесь выдерживали в течение 20 минут при температуре 60 °С, охлаждали и направляли на хромато-масс-спектрометрический анализ.

Условия хромато-масс-спектрометрического анализа

Анализ образцов суточной мочи, после проведения различных способов пробоподготовки и получения дансильных производных проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

и

Использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф с масс-селективпым детектором типа ионная ловушка модели «Agilent 1100 Series LC/MSD Ion Trap», оборудованный системой автоматического ввода пробы, внешним источником ионов с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и управляемый IBM совместимым компьютером с системой обработки данных «Chem Station».

Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6 х 150 мм; 5,0 мкм) фирмы «Agilent Technologies» (Palo Alto, CA, США) в режиме градиентного элюироваиия. Во время анализа аналитическую колонку термостатировали при 30 °С. Мобильная фаза состояла из 0,2 мМ ацетата аммония в 0,05 % растворе муравьиной кислоты (А) и 100 % метанола (В).

Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) и регистрацией как положительных, так и отрицательных ионов. Напряжение на капилляре составляло 3500 В. В качестве осушающего и распыляющего газа использовали азот со скоростью потока - 9,0 л/мин, давлении 2,07 бар. Температура в источнике ионов составляла 350 °С. Сканирование проводили в режимах полного ионного тока и MRM.

Изучение влняния мексидола на соотношение 6В-гидрокснкортизол / свободный кортизол. Косвенная оценка влияния мексидола на CYP3A4

Целью работы было проведение скринингового исследования потенциального влияния мексидола на I фазу биотрансформации, а именно изоформу CYP3A4 цитохрома Р450.

Синтез öß-гидроксикортизол у человека проходит при участии микросомальной системы цитохрома печени - CYP3A4 из эндогенного кортизола. В дальнейшем сам 6ß-гидроксикортизол и в свободном (не конъюгированном) виде выводятся с мочой (Lipman М. М. et. al., 1962). Изменение соотношения öß-гидроксикортизол / свободный кортизол позволяет судить об активности микросомальной системы печени CYP3A4 (Кукес В. Г., 2004; Tran J. Q. et. al., 1999).

Выбор здоровых добровольцев и их рандомизация

По итогам отбора к исследованиям на базе ФГУП «Антидопинговый центр» были допущены 6 добровольцев, в возрасте 24,0 лет, массой тела 63,16 кг ± 5,88 кг. Всем участникам исследования были присвоены соответствующие номера.

Прием препарата и сбор биологических образцов

Добровольцы принимали таблетки мексидола утром (900) однократно натощак в дозе 750 мг (6 таблеток мексидола по 0,125 г). Препарат принимали внутрь, не разжевывая, запивая 180 - 200 мл негазированной воды. В течение всего времени исследования добровольцы соблюдали стандартный режим физической и психической нагрузки, а также стандартный режим питания.

Отбор проб мочи вели в течение трех дней до и трех дней после приема препарата в специальные пластиковые контейнеры для сбора суточной мочи. До начала проведения анализа контейнеры хранили в холодильнике при -25 °С.

Подготовка биологических образцов суточной мочи к анализу

Пробу мочи (5,0 мл) подщелачивали твердым буфером (смесь гидрокарбоната натрия с карбонатом калия 2:1) до pH 9,0; добавляли 5,0 мкл 100 нг/мл раствора внутреннего стан-

дарта (флюоксиместерон) и 2,0 г сульфата натрия. Экстракцию проводили 5,0 мл смеси толуола с диэтиловым эфиром (50/50 об. %) в течение 2-х минут на автоматическом экстракторе. Смесь центрифугировали при 25 °С в течение 5 минут при 2500 об/мин. Отбирали органический слой и упаривали его в токе азота при 20 °С. Сухой остаток перерастворяли в 50 мо метилового спирта и направляли на хромато-масс-спектрометрический анализ.

Условия хромато-масс-спектрометрического анализа определения бр-гидроксикортизола и свободного кортизола в биологических образцах суточной мочи человека

Использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф с масс-селективным детектором типа ионная ловушка модели «Agilent 1100 Sériés LC/MSD Ion Trap», оборудованный системой автоматического ввода пробы, внешним источником ионов с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и управляемый IBM совместимым компьютером с системой обработки данных «Chem Station».

Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке Ultra Cl8 (2,1 х 150мм; 5,0 мкм) фирмы «Restek» (Со, США) в режиме градиентного элюирования. Во время анализа аналитическую колонку термостатировали при 30 °С. Мобильная фаза состояла из 0,2 мМ ацетата аммония в 0,05 % растворе муравьиной кислоты (А) и 100 % метанола (В).

Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) в режиме регистрации отрицательных ионов. Напряжение на капилляре составляло 3500 В. В качестве осушающего и распыляющего газа использовали азот со скоростью потока - 9,0 л/мин, давлении 2,07 бар. Температура в источнике ионов составляла 350 °С. Сканирование проводили в режимах полного ионного тока и MRM.

Статистическая обработка полученных результатов

Полученные экспериментальные данные были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программ «Statistica v. 6.0» и «Origin Pro v. 6.0».

В таблицах представлены средние арифметические значения величин ( х), стандартные отклонения среднего результата (SD), стандартная ошибка среднего арифметического (S х), коэффициент вариации (C.V.), полуширина доверительного интервала (Д х), ошибка среднего результата (е %).

Достоверность различий оценивали по t-критерию Стъюдента для независимых выборок, по t-критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений, а также на основании непараметрического метода анализа по t-критерию Вилкоксона для зависимых выборок.

Иллюстративный материал представлен с использованием программы «Microsoft Excel 2007», «Adobe Photoshop CS», «Origin Pro v. 6.0» и «Graph Pad Prism v. 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъю-гации 2-этил-6-метнл-3-окснпирндина

Мексидол - 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат, относится к группе антигипок-сантных и аптиоксидантных средств с ноотроппыми и анксиолитическими свойствами.

По химической структуре мексидол - простейший гетероциклический аналог ароматических фенолов (структурный аналог пиридохсина - витамина В6) и в этой связи проявляет антиоксидантные и аптирадикальные свойства. С другой стороны, в его состав входит остаток янтарной кислота, который в организме человека является субстратом для повышения энергетического обмена в клетке и, следовательно, частично обуславливает фармакодинами-ческие свойства препарата (Воронина Т. Л. и соавт., 2001; Дюмаев К. М. и соавт., 1995).

До проведения непосредственного процесса фенотипирования глюкуроноконъюгации необходимо было оценить степень влияния янтарной кислоты на процесс конъюгации 2-этил-6-метил-З-оксипридина. Таким образом, целью исследования было изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина (ОП) после перорального и внутрибрюшинного введения в виде сукцината и в виде основания беспородным мышам-самцам.

В качестве фазы для растворения основания ОП пробовали использовать 1,0; 5,0; 10,0 и 15,0 % раствор крахмала, однако, приготовленные растворы с течением времени образовывали гетерогенные дисперсные системы, что затрудняло процесс их дозирования и введения животным. В связи с этим параллельно проводили оценку влияши твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации ОП, так как в случае введения основания 5,0 % раствор твин-80 являлся основой для растворения соединения, что явилось сопутствующей задачей.

Установлено, что как после перорального, так и после внутрибрюшинного введения трех формуляций ОП (СОП, ОП-твин и СОП-твин) неизмененного соединения выводится с мочой животных достоверно меньше (р < 0,05), чем его глкжуронокояыогированного продукта П фазы биотрансформации. Так при пероральном введении, глюкуроноконъюгата элиминируется в среднем в 7 раз больше, чем ОП, а при впутрибрюшинном введении - в 10 раз больше (см. рис. 1 и 2). Наибольшее количество глюкуроноконъюгированного продукта выводится после введения как СОП-твин, так и СОП перорально и внутрибрюшинно (см. рис 2).

Таким образом, янтарная кислота оказывает существенное влияние на конъюгацию ОП с глюкуроновой кислотой, что отчетливо видно при сопоставлении данных о выведении глюкуроноконъюгированного метаболита как после внутрибрюшинного, так и пероральпого введения СОП-твин и ОП-твин.

Сравнительный анализ данных после введения СОП и ОП-твин выявил, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного ОП в среднем в три и девять раз соответственно, как при пероральном, так и внутрибрюшинном введении.

- 6 1

СОП ОП-твин СОП-твин

Формуляций

Примечание - темные столбики — внутрибрюшинное введение; светлые столбики - перораль-ное введение. СОП - 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукинат; ОП-твин - основание 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в 5,0 % растворе твин-80; СОП-твин - 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцинат в 5,0 % растворе твин-80.

Рисунок 1 - Выведение неизмененного соединения после перорального (светлые столбики) и внутри-брюшинного (темные столбики) введения формуляций ОП.

Примечание - темные столбики - внутрибрюшинное введение; светлые столбики - перораль-ное введение СОП - 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукинат; ОП-твин - основание 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в 5,0 % растворе твин-80; СОП-твин - 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцинат в 5,0 % растворе твин-80.

Рисунок 2 - Выведение глюкуроноконъюгированного соединения после перорального (светлые столбики) и внутрибрюшинного (темные столбики) введения формуляций ОП.

Влияние твин-80 анализировали, сравнивая данные после введения водного раствора СОП и СОП в 5,0 % растворе твин-80 (СОП-твин). Установлено, что наличие твин-80 достоверно увеличивает содержание нативного соединения в моче животных лишь при внутри-брюшинном введении, а количество зкскретируемого глюкуроноконъюгированного метаболита при пероральном введении (рис. 2). В остальных же случаях получены статистически незначимые данные.

Таким образом, можно заключить, что на процесс глкжуроноконъюгации ОП однозначно и достоверно влияет присутствие янтарной кислоты. Влияние твин-80 на глюкуроно-

СОП

ОП-твин СОП-твин Формуляцпп

конъюгирование не столь выражено, как янтарной кислоты, однако, при пероральном введении оно обуславливает возрастание экскреции почти в три раза.

На основании полученных дшшых изучение реакции фенотипирования И фазы биотрансформации проводили как с сукцинатом, так и с основанием 2-этил-б-метип-З-оксипиридила с целью адекватной и достоверной оценки течения процесса.

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro на примере сукцииата и основания 2-этнл-6-метил-3-оксиниридина

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации проводили на основании скринин-гового метода определения активности УДФ-глюкуронозштгрансферазы, разработанного М. Court (Court М. Н. et. al., 2005; Court М. Н. et. at., 2004).

На основании вновь полученных данных о потенциальном влиянии янтарной кислоты на процессы глюкуроноконъюгации, при постановке реакции фенотипирования в условиях in vitro в качестве субстратов использовали как основание, так и сукцинат 2-этил-б-метил-З-оксипиридина.

а г-

Начальная концентрация субстрата в инкубационной смеси -1,0 мкМ

— Оснса&ниа 2-эт<л-е-*<гги/>-3-о<ссипир«д

- 2<этш<£-мет>1Л>3-оксилиридиьа су «м кат

60 1СО 150 200 250 ЗОО 3S0 «00 Время инкубами, мин

Начальная концентрация субстрата в инкубационной смеси - 10,0 мкМ

— Основзша

- 2-згил-в-метмл-3-о*сипирмдиня еукинет

SO 100 160 230 250 100 350 Время инкубации, мни

Начальная концентрация субстрата в инкубационной смеси - 50,0 мкМ

— Основание 2-этил-6-метил-3-оксилирцаима

- 2-зтил-б-(иетил-3-£№ип^ридйна сукин ат

100 160 200 250 ; Время инкубе цим, мии

Начальная концентрация субстрата в инкубационной смеси - 100,0 мкМ

— Основание 2-этил-&-метил-1-«ксилирид»*ма

- 2-зтнл-б-метил-З-ОкСипиридинв сухинат

100 150 200 250 Вреия инкубацмм, мин

Рисунок 3 - Изменение концентрации субстрата 2-этил-6-метш1-3-оксипиридина в инкубационной смеси с участием микросомального пула человека в зависимости от времени инкубации.

В опытах использовали субстраты в диапазоне концентраций 1,0-100,0 мкМ. Для адекватного сопоставления данных ферментативной активности между субстратами, в случае использования сукцината 2-этил-6-метил-3-оксипиридина проводили корректировку концентрации рабочих растворов с учетом молекулярной массы янтарной кислоты (118 а.е.м.).

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы времени (0 - 360 минут) не выявил присутствия глюкуроно-конъюгированного продукта реакции. При этом количественный анализ полученных данных свидетельствует о флукгуационном (случайном) и неконтролируемом изменении концентрации субстрата в исследуемой инкубационной смеси (см. рис. 3).

Анализ данных по фенотипированию реакции глюкуроноконъюгации с девятью отдельными изоформами УДФ-глюкуронозилтрансферазы также не выявил образование конъ-югированного продукта II фазы биотрансформации.

Данные количественного анализа реакции были сходны с ранее полученными данными инкубации субстратов с микросомальным пулом печепи человека.

Фенотипированне реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro на примере таксифолина Сдигидроквертицина')

С целью адекватной оценки воспроизведения скринингового метода определения активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы было принято решение о воспроизведении реакции глюкуроноконъюгации на примере таксифолина (дигидроквертицин; 2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Н-бензопиран-4-он).

Фенотипированне реакции глюкуроноконъюгации в условиях in vitro на примере таксифолина проводили в условиях аналогичных при изучении сукцината и основания 2-этил-6-метил-3-оксипиридина. В эксперименте использовали таксифолин в диапазоне концентраций 1,0- 100,0 мкМ.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы времени (0 - 360 минут) установил присутствие как нативного соединения, так и конъюгированного продукта с глюкуроновой кислотой.

2 60-, S

Время инкубации, мин

Рисунок 4 - Кинетические профили микросомального пула человека (HLM) и субмитохондриальных (S9) фракций изоформ UGTs: 1А1; 1АЗ и 1А10 УДФ-глюкуронозилтрансферазы на примере таксифолина.

МС-МС спектр конъюгированного продукта инкубационной смеси содержал массы характерные для таксифолина и был идентифицирован как глюкуроноконъюгированное про-

изводное таксифолина. Полученный МС-МС спектр инкубационной смеси полностью совпадал с ранее полученным МС-МС спектром конъюгированного производного таксифолина в моче животных.

Анализ данных по фенотщшрованию реакции глюкуронокоиъюгации таксифолина с девятью различными рекомбинантными субмитохондриальными (S9) фракциями УДФ-гшокуронозилтрапсферазы выявил образование конъюгированного продукта лишь в трех случаях (изоформы 1А1; 1АЗ и 1А10).

Сравнение кинетических профилей микросомального пула печени человека и субми-тохондриальных (S9) фракций показал, что образование максимального количество конъюгированного продукта таксифолина происходит в течение 30 минут с начала времени инкубации (см. рис. 4).

Установлены изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс глюкуронокоиъюгации таксифолина в условиях in vitro (изоформы 1А1; 1АЗ и 1А10).

На примере фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации с таксифолицом показана адекватность и методологическая рациональность используемого метода.

Изучение продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-6-метнл-З-оксиппридина в моче добровольцев

В экспериментальных и клинических исследованиях биотрансформации мексидола установлено, что основной путь метаболизма препарата в организме человека и животных -конъюгация с глюкуроновой кислотой (Жердев В. П. и соавт., 1988; Кравцова О. Ю., 2005; Сариев А. К., 1987). Методологической основой данных исследований являлся анализ биологических образцов на основании предварительного их гидролиза с ß-глюкуронидазой, выделенной из печени крупного рогатого скота. При экспериментальных и клинических исследованиях фармакокинетики препарата не проводилась комплексная оценка экскреции иных конъюгированных продуктов II фазы биотрапсформации. Таким образом, данные экскреции препарата не отражают потенциальную способность препарата к взаимодействию со всеми возможными ферментативными системами II фазы метаболизма.

Анализ продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче человека

Анализ продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче добровольцев проводили на основе хромато-масс-спектромегрических данных, полученных после исследования различных фракций биологических образцов.

Исследовали свободную фракцию, а также фракции суточной мочи добровольцев после проведения различных типов гидролиза: ферментативный гидролиз с ß-глюкуронидазой Е. Coli К 12 и Н. Pomatia Туре НР-2; кислотный гидролиза с 6 М кислотой хлористоводородной.

В результате исследования продуктов экскреции II фазы метаболизма 2-этил-6-метил-3-оксипиридина выявлено, что препарат из организма добровольцев выводится, как в неизмененной форме, так и в виде многочисленных продуктов конъюгации II фазы биотрапсформации (см. рис. 5).

30,15% Сульфоконъюгиро ванные продукты

15,16% Иные типы кпн*.югипп1занных продуктов

20,17%

Глюку роноконъюгированные продукты

0,39% Неизмененное соединение

Рисунок 5 - Анализ продуктов экскреции II фазы метаболизма 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче человека.

Анализ усредненных данных показал, что в свободном виде в течение первых 24-х часов после приема мексидола с мочой добровольцев экскретируется 1,99 мг± 0,32 мг неизмененного препарата, что составляет 0,39 % ± 0,02 % от введенной дозы.

Анализ образцов мочи после проведения энзиматического гидролиза с Е.СоН К 12 показал, что в течение первых 24-х часов 109,68 мг ± 17,79 мг препарата выводится в виде глю-куроноконъюгированного производного 2-этил-6-метил-3-оксипиридина, что составляет 20,71 % ± 4,18 % от изначально введенной дозы мексидола.

Экскрецию сульфоконъюгированных производных 2-этил-б-метил-З-оксипридина оценивали на основании данных суточной фракции мочи добровольцев после проведения энзиматического гидролиза с р-пюжуронидазой Н. Ротайа Туре НР-2. При этом было установлено, что 150,77 мг ± 21,35 мг препарата выводится в первые 24 часа в виде сульфоконъюгированных форм 2-этил-б-метил-З-оксипиридина, что составляет 30,15 %±4,27% от изначально введенной дозы мексидола.

На основании данных кислотного гидролиза суточной мочи добровольцев оценивали экскрецию иных форм конъюгированных продуктов 2-этил-6-метил-3-оксилиридина, среди которых потенциально возможными являлись конъюгаты с остатками фосфорной кислоты и аминокислот.

При этом было установлено, что в течение первых 24-х часов 67,8 мкг ± 7,69 мкг препарата выводится в виде иных форм конъюгированных продуктов, что в свою очередь составляет 15,56 % ± 1,54 % от введенной дозы мексидола.

В ходе исследования проведена комплексная оценка возможных продуктов экскреции II фазы бнотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче добровольцев.

Впервые установлено, что экскреция мексидола включает в себя формирование не только глюкуроноконыогированных производных 2-этил-б-метил-З-оксипиридина, но и иных форм конъюгированных продуктов взаимодействия препарата с ферментативными системами II фазы биотрансформации.

Показано, что в течение первых 24-х часов с мочой здоровых добровольцев более 65,5 % препарата выводится в виде различного рода конъюгированных продуктов II фазы биотрансформации.

Изучение влияния мексидола на соотношение бв-гндроксикортизол / свободный кортнзол. Косвенная оценка влияния мексидола на CYP3A4

Изучено влияние мексидола (2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцината) после однократного перорального приема па соотношение уровня бр-гидроксикортизолу (6Р-ГК) к свободному кортизолу (К) в суточной моче добровольцев.

В отличие от человека, в организме животных процесс биотрансформации мексидола проходит при участии ферментативных систем как II, так и I фазы метаболизма, о чем свидетельствуют данные экспериментальной фармакокинегики фармакологически активного де-метшшрованного метаболита - 2,6-диметил-З-оксипиридина (Кравцова О. Ю., 2005; Сариев А. К., 1987).

Согласно данным биохимических и фармакокинетических исследований в процессах деметилирования активное участие принимает CYP3A4 системы цитохрома Р450 (Bellec G. et. al., 1996; Denton R. M. et. al., 1976; Ioannides C. et. al., 2008). По нашему предположению, отсутствие продуктов I фазы биотрансформации мексидола не является свидетельством отсутствия влияния препарата на данные метаболические пути.

Таким образом, целью проведенного исследования было изучение потенциального влияния мексидола на I фазу биотрансформации, а именно на изоформу CYP3A4 системы цитохрома Р450.

Оценку активности CYP3A4 проводили на основании неинвазивного метода количественного определения изменения уровня эндогенного бР-гидроксикортизола к свободному кортизолу до и после приема препарата. Оценка активности CYP3A4 на основе анализа уровня эндогенных глюкокортикостероидов является перспективным методом по сравнению с «классическими» тестами - эритромициновым дыхательным тестом и MEG-X тестом, поскольку не только не требует введения сторонних лекарственных препаратов и маркерных субстратов, но и значительно упрощает сбор биологических образцов для последующих анализов.

В ходе исследования у добровольцев дополнительно проводили измерения суточного уровня креатинина в биологических образцах с целью адекватной оценки фильтрационно-реабсорбционной функции почек.

Для каждого из добровольцев естественный уровень активности CYP3A4 оценивали на основании данных среднего значения соотношения бр-ГК/К в суточной моче, полученного в течение трех дней до приема препарата. Изучение влияние мексидола на активность CYP3A4 оценивали в течение последующих трех дней после приема препарата по изменению уровня бр-ГК/К в сравнении с естественным уровнем также у каждого из добровольцев (см. табл. 1).

Таблица 1 - Соотношение бр-гидроксикортизол / свободный кортизол у добровольцев до и после перорального приема препарата мексидол

№ добровольца Соотношепис бр-ГК/К до приема мексидола Соотношение бр-ГК/К после приема мексидол

среднее значение за 3 суток 1 сутки 2 сутки 3 сутки

1 8,73 ± 2,01 17,07 9,99 13,66

2 9,19 ±2,87 34,01 16,04 11,89

3 4,95 ± 0,79 16,63 6,88 18,22

4 7,87 ±1,58 64,32 45,67 45,54

5 33,54 ±8,58 78,95 22,48 84,46

6 12,86 ± 3,42 44,21 30,10 44,70

Анализ дшшых выявил достоверное (р = 0,03) увеличение соотношения бр-ГК/К по сравнению с его естественным уровнем в первые 24 часа после перорального приема мекси-дола (в среднем в 2,96 ± 0,76 раза). На вторые и третьи сутки после приема наблюдалось достоверное снижение соотношения 6р-ГК/К по сравнению с первыми сутками. При этом не было выявлено достоверных различий (р = 0,21) уровня бр-ГК/К по сравнению с естественным до приема мексидола.

Полученные данные коррелируют с вновь полученными данными по комплексному изучению продуктов экскреции 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека, которые свидетельствуют о том, что более 65,5 % препарата выводится с мочой за первые 24 часа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ мочи, полученной у добровольцев в ходе изучения экскреции, не выявил присутствия хотя бы следовых количеств самого неизмененного 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и его метаболитов на вторые и третьи сутки после приема препарата. Продуктов биотрансформации I фазы метаболизма в образцах мочи добровольцев найдено не было.

Таким образом, предположительно индукция системы СУРЗА4 под действием мексидола наблюдается лишь в момент активной его биотрансформации и экскреции и не сохраняется после полной элиминации соединения из организма человека.

Результаты исследования будут расширены и направлены на дополнительное изучение влияния мексидола на систему СУРЗА4. Предварительные скрининговые данные активности СУРЗА4 будут сопоставлены с результатами «классических» тестов - эритромицинового дыхательного теста и теста МЕй-Х (Кукес В. Г., 2004).

Полученные в данном исследовании результаты, представляют особый интерес не только ввиду присутствия у человека внутри- и межиндивидуальных различий активности СУРЗА4, но и с точки зрения подверженности влияния межлекарствепным взаимодействиям, а также нарушений со стороны функции печени при различных патологических состояниях.

ВЫВОДЫ

1 Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометричсский метод количественного определения копъюгированных продуктов бно-трансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина на основе анализа различных фракций мочи человека.

2 Наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экс-кретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в среднем в три и девять раз соответственно после перораль-ного и внутрибрюшишюго введения.

3 В условиях in vivo процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-6-мстил-3-оксипиридипа является одним из основных путей биотрансформации препарата, в то время как в in vitro исследованиях процесс образования копъюгированных продуктов с глюкуроно-вой кислотой не наблюдался. Рациональность выбранного методологического подхода фено-типирования реакции глюкуроноконъюгации показала па примере дигидроквертицина. Доказано, что процесс гшокуропокопъюгации наблюдается как в условиях in vivo, так и в исследованиях in vitro. В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации выявлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А10).

4 Установлено, что в течение 24-х часов после приема мексидола с мочой человека экскретируется 0,39 % ± 0,02 % неизмененного препарата; 20,71 % ± 4,18 % глюкуроноконъюгированного производного; 30,15 %±4,27 % сульфошнъюгированных форм препарата и 15,56 %± 1,54 % иных форм копъюгированных продуктов от введенной дозы мексидола.

5 Однократный пероральный прием мексидола в дозе 750 мг приводит к изменению соотношения 6[?-гидроксикортизол / свободный кортизол, что может свидетельствовать об индукции системы CYP3A4 под действием препарата в течение 24-х часов после его приема.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кравцова О. Ю. Кумулятивная экскреция мексидола и его глюкуроноконъюгата у представителей различных этнических групп [Текст] / О. Ю Кравцова, П. А. Баранов, А. К. Сариев, В. П. Жердев // Сборник тезисов XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, сентябрь 2007 г. - С. 295.

2. Баранов П. А. Глюкуроноконъюгация мексидола после перорального и внутрибрюшинного введения [Текст] / П. А. Баранов, О. Ю. Кравцова, А. К. Сариев, В. П. Жердев // Российский национальный съезд фармакологов. Санкт-Петербург, 23 - 28 сентября

2007 г.-С. 35.

3. Баранов П. А. Определение метаболитов и стадий выведения мексидола в моче человека методом ВЭЖХ-МС [Текст] / П. А. Баранов, С. А. Апполонова, А. К. Сариев, Г. М. Родченков, В. П. Жердев // Тезисы всероссийского симпозиума «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (к 100-летию проф. Киселева А. В.), Москва - Клязьма, 14-18 апреля

2008 г. - С. 79.

4. Zheidev V. Pharmacokinetics and metabolism of Dihydroquercetin isolated from Larix sibirica Ladeb [Текст] / V. Zherdev, G. Kolyvanov, A. Litvin, A. Sariev, Y. Kolesnik, E. Titova, VP Tikhonov, D. Shmatkov., S. Appolonova, P. Baranov // 7th Joint of the Association Francophone pour l'Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie (AFERP), American Society of Pharmacognosy (ASP), Socciety for Medicinal Plant Research (GA), Phytochemical Society of Europe (PSE), and Societa Italana di Fitochimica (SIF), Athens, Greece, 3-8 august 2008, - P. 1021.

5. Баранов П. А. Изучение влияния янтарной кислоты и твина-80 на процесс глкжуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина [Текст] / П. А. Баранов, О. Ю. Кравцова, А. К. Сариев, В. П. Жердев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Москва, - 2008. - №7. - С. 62 - 64.

6. Baranov P. A. Metabolism of 2-ethyl-6-methyl-3-oxypyridine in human [Текст] / P. A. Baranov, M. A. Dikunets, S. A. Appolonova, G. M. Rodchenkov // 25a' LC/MS Montreux Symposium, Montreux, Switzerland, 12 - 14 November 2008 - P. 30.

7. Баранов П. А. Влияние мексидола на изоформу CYP3A4 [Текст] / П. А. Баранов, С. А. Апполонова, Г. М. Родченков, А. К. Сариев, В. П. Жердев // Научно-практическая конференция «Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины». 45 лет Медико-биологическому факультету. Москва, 28 ноября 2008 г. - С. 23.

8. Баранов П. А. Конъюгация - основной путь биотрансформации мексидола у человека [Текст] / П. А. Баранов, А. К. Сариев, В. П. Жердев, С. А. Апполонова, Г. М. Родченков // Тезисы II Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 17 февраля 2009 г. - С. 34 - 36.

9. Сариев А. К. Является ли глюкуроноконъюгация мексидола основным путем биотрансформации у людей? [Текст] / А. К. Сариев, П. А. Барапов, В. П. Жердев, С. А. Апполонова, Г. М. Родченков // Тезисы I Съезда нейрохирургов Республики Казахстан с международным участием, Астана, 22 - 24 июля 2009 г. - С. 56.

10. Баранов П. А. ВЭЖХ-МС метод определения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина. Оптимизация пробоподготовки и снижение эффекта матрицы [Текст] / П. А. Баранов, С. А. Апполонова, М. А, Дикунец, Г. М. Родченков, А. К. Сариев, В. П. Жердев. // Экспериментальная и клиническая фармакология - 2009 - №3. - С. 22 - 25.

Подписано в печать 23.06.2009 г.

Заказ № 19 Типография ООО "Медлайн-С" 125315, г. Москва, Ленинградский пр-т, д.78, к.5 Тел. (499)152-00-16 Тираж 100 шт.

Актуальность проблемы

Одной из основных проблем современной экспериментальной и клинической фармакологии является изучение процессов биотрансформации лекарственных веществ и ксенобиотиков-[41, 141, 142, 153, 165]. В-последнее время вопросам метаболизма лекарственных веществ в живых организмах, образованию метаболитов, их распределению и выведению уделяется все большее и большее внимание. Это обусловлено не только возрастающим количеством оригинальных лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке, но и с бурным развитием современных технологий, позволяющих проводить биохимические и фармакокинетические исследования, фенотипи-рование и генотипирование пациентов; а также необходимостью разработки принципов рациональной фармакотерапии [43, 53, 57, 68, 182].

Открытия фундаментальных наук последних десятилетий коренным образом изменили представления о патогенезе заболеваний и подходы к их лечению. Индивидуализация фармакотерапии является неотъемлемой частью и качественной основой современных высокоэффективных принципов экспериментальной и клинической фармакологии [30, 68]. Рациональный выбор адекватной дозы лекарственного препарата, а также режима дозирования, на основе оценки индивидуальных фенотипических и генотипических особенностей биотрансформации, может значительно снизить число нежелательных побочных эффектов и повысить эффективность лечения [165].

Одним из подходов к изучению процессов биотрансформации является использование «маркерных субстратов», которое позволяет проводить комплексное и направленное изучение особенностей биотрансформации ксенобиотиков, оценивать индивидуальные фенотипические особенности метаболизма у различных биологических видов [53, 68].

Клинической основой применения «маркерных субстратов» является оценка активности определенных ферментативных систем у пациентов, а

10 также выявление генетических вариантов процессов биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ [53,133].

Методологической основой изучения «маркерных субстратов» является комплексная оценка процессов биотрансформации потенциального субстрата с учетом влияния ферментативных систем I и II фаз, а также биохимические и клинические исследования энзиматической активности исследуемого субстрата на основании результатов прямого и косвенного фенотипирования как в условиях in vitro, так и in vivo [81, 85,167,178,189].

Объектом исследования в представленной работе является мексидол (2-этил-6-метил-З-оксипиридина сукцинат). В ранних работах по изучению биотрансформации и экскреции мексидола показано, что основной метаболизм данного лекарственного препарата у человека проходит с участием ферментативных систем II фазы [14, 29]. Кроме того, были выявлены генотипиче-ские различия в скорости экскреции неизмененного соединения и глюкуро-ноконъюгированного метаболита у представителей различных этнических групп* [15]. На основании полученных результатов экспериментальных и клинических исследований было предложено проведение биохимических исследований с целью обоснования применения мексидола в качестве типи-рующего агента реакции глюкуроноконъюгации у человека [15].

Цель исследования

Изучение процессов глюкуроноконъюгации методами фармакокинети-ческого и биохимического анализа в условиях in vitro и in vivo на примере препарата мексидол.

Задачи исследования

1 Разработать высокочувствительный, селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче человека.

2 Изучить влияние янтарной кислоты на процессы глюкуроно-конъюгаци и 2-этил-б-метшг-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo.

3 Провести in vitro фенотипирование реакции глюкуроноконъюга-ции на примере 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцината. Определить изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуро-ноконъюгированных продуктов биотрансформации 1Г фазы метаболизма.

4 Исследовать процессы конъюгации мексидола у людей с использованием различных типов гидролиза (селективные ферменты (3-глюкуронидазы, кислотный гидролиз).

5 Изучить влияние основных ферментативных систем I фазы, биотрансформации человека на процессы! метаболизма 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в: условиях in vivo. На основе хромато-масс-спектрометрического анализа биологических образцов провести поиск возможных метаболитов I фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека.

Научная новизна работы

Впервые установлено влияние янтарной кислоты на процессы глюку-роноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных, в условиях in vivo. Показано, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества-экскретируемого неизмененного и глюкуро-ноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перораль-ного и внутрибрюшинного введения:

На основании разработанного хромато-масс-спектрометрического метода установлено, что процесс биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека происходит при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Впервые показано, что процесс конъюгации 2-этил-бметил-З-оксипиридина является комплексным, включающим в себя образо

12 вание не только глюкуроноконъюгированных производных, но и сульфо-, фосфоконъюгированных метаболитов и иных видов продуктов конъюгации.

Показано, что фенотипирование процесса глюкуроноконъюгации с использованием 2-этил-6-метил-3-оксипиридина не возможно, поскольку в опытах in vitro не обнаружены какие-либо взаимодействия с микросомаль-ным пулом человека, а также ни с одной из девяти изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А5; 1А7; 1А8; 1А10; 2В4; 2В7; SF9WT).

В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации впервые установлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

На основе неинвазивного метода количественного определения изменения уровня эндогенного 6р-гидроксикортизола к свободному кортизолу выявлена тенденция к индукции системы CYP3A4 человека под действием мексидола.

Практическая значимость работы

Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче человека. Метод соответствует международным требованиям IUPAC (ИЮПАК)1, предъявляемым к инструментальным методам анализа биологических образцов, и может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях продуктов биотрансформации мексидола.

Показана перспективность проведения дополнительных исследований с целью детального изучения субстратной специфичности дигидроквертицина и определения кинетических профилей субстрата по отношению к отдельным изоформам УДФ-глюкуронозилтрансферазы.

1 Международный союз практической и прикладной химии.

13

В ходе комплексного исследования биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина расширено представление о путях его биотрансформации у человека при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано потенциальное активирующее влияние мексидола на изоформу CYP3A4.

Положения, вынесенные на защиту

1 Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина на основе анализа различных фракций мочи человека.

2 Установлено, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформаций 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

3 Выявлено, что в условиях in vivo процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина является одним из основных путей биотрансформации препарата, в то время как в in vitro исследованиях процесс образования конъюгированных продуктов с глюкуроновой кислотой не наблюдался. Рациональность выбранного методического подхода фенотипиро-вания реакции глюкуроноконъюгации показана на примере дигидрокверти-цина. Установлено, что процесс глюкуроноконъюгации наблюдается как в

•г условиях in vivo, так и в исследованиях in vitro. В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации выявлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

4 Впервые установлено, что в течение 24-х часов после приема мексидола, с мочой человека экскретируется 0,39 % ± 0,02 % неизмененного препарата; 20,71 % ± 4,18 % глюкуроноконъюгированного производного;

14

30,15 % ± 4,27 % сульфоконъюгированного продукта и 15,56 % ± 1,54 % иных форм конъюгированных продуктов от введенной дозы мексидола.

5 Однократный пероральный прием мексидола в дозе 750 мг приводит к изменению соотношения 6(3-гидроксикортизол / свободный кортизол, что может свидетельствовать об индукции системы CYP3A4 под действием препарата в течение 24-х часов после его приема.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на XIV Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.); Российском национальном съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007 г.); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва-Клязьма, 2008 г.); на VII Международном симпозиуме «7th Joint of the Association Francophone pour l'Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie» (Греция, 2008 г.); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины» (Москва, 2008 г.); на XXV Международном симпозиуме «LC/MS», (Швейцария, 2008 г.); II Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009); Первом Съезде нейрохирургов Республики Казахстан с международным участием (Астана, 2009 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 2 статьи и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 4 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический указатель, вклю

Выводы

1 Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина на основе анализа различных фракций мочи человека.

2 Наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

3 В-условиях in vivo процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-3-оксипиридина является* одним из основных путей биотрансформации препарата, в то время* как в in vitro исследованиях процесс образования конъюгированных продуктов с глюкуроновой кислотой не наблюдался: Рациональность выбранного «методологического подхода. фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации показана на примере дигидроквертицина. Доказано, что процесс глюкуроноконъюгации наблюдается как в условиях in vivo, так и в исследованиях in vitro. В ходе фенотипировании реакции глюкуроноконъюгации выявлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

4 Установлено, что в течение 24-х часов (после приема мексидола с мочой человека экскретируется 0,39 % ± 0,02 % неизмененного препарата; 20,71 % ± 4,18 % глюкуроноконъюгированного производного; 30,15 % ± 4,27 % сульфоконъюгированных форм препарата и 15,56 % ± 1,54 % иных форм конъюгированных продуктов от введенной дозы мексидола.

5 Однократный пероральный прием мексидола в дозе 750 мг приводит к изменению соотношения бр-гидроксикортизол / свободный кортизол, что может свидетельствовать об индукции системы CYP3A4 под действием препарата течение 24-х часов после его приема. к

Заключение

В ранних исследованиях было показано, что основным путем биотрансформации мексидола является конъюгация его с глюкуроновой кислотой [14, 29]. Рассматривая мексидол в качестве потенциального маркерного агента реакции глюкуроноконъюгации, необходимо обратить внимание на его химическое строение. По химической структуре мексидол — простейший гетероциклический аналог ароматических фенолов (структурный аналог пиридоксина - витамина Вб) и в этой связи проявляет антиоксидантные и антирадикальные свойства. С другой стороны, в его состав входит остаток янтарной кислоты, который в организме человека является субстратом для повышения энергетического обмена в клетке и, следовательно; частично обуславливает фармакодинамиче-ские свойства препарата [4, 13].

Таким образом, до-проведения! непосредственного процесса фенотипиро-вания глюкуроноконъюгации вусловиях in vitro ¡необходимо был о оценитьсте-пень влияния, янтарной кислоты на процесс конъюгации 2-этил-6-метил-3-оксипридина (ОП). . .'.•(>,

Оценку влияния^ янтарной кислоты проводили в эксперименте после пе-рорального и внутрибрюшинного введения 2'-этилг1б-метил-3-оксипиридина в виде сукцината.и ввиде основания беспородным мышам-самцам. Основание 2-этил-6-метил-З-оксипиридина не растворимо в воде, поэтому параллельно проводили оценку влияния твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации ОП, так как в случае введения основания 5,0 % раствор твин-80 являлся основой для растворения соединения, что явилось сопутствующей задачей. Влияние янтарной кислоты и твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина уценивали на основании данных экскреции по,-собранной суточной моче у животных.

В ходе проведенного исследования было изучено влияние янтарной кислоты и,твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации ОП при различных способах введения. Как и в предыдущих экспериментах.по изучению экскреции 2j I t этил-6-метил-З-оксипиридина было подтверждено, что основным путем экскреции ОП является конъюгации с глюкуроновой кислотой.

Установлено что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгиро-ванного ОП в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

Влияние твин-80 менее выражено, при этом установлено, что наличие твин-80 достоверно увеличивает содержание нативного соединения в моче животных лишь при внутрибрюшинном введении, а количество экскретируемого глюкуроноконъюгированного метаболита при пероральном введении. В остальных случаях получены статистически незначимые данные. j На основании полученных экспериментальных данных, а также литературных источников [69, 75, 82], было выдвинуто предположение, что янтарная кислота способствует увеличению степени ионизации ОП по сравнению с основанием, тем самым снижая процесс реабсорбции соединения (обратного всасывания) в почечных канальцах, что соответственно приводит к увеличению экскреции, ОП. В свою очередь, твин-80, обладая ярко выраженными гидрофильными свойствами, а также способностью к мицеллообразованию, способствует увеличению скорости всасывания 2-этил-6-метил-3-оксипиридина из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток.(

Вновь полученные данные учитывали в исследованиях по фенотипирова-нию реакции глюкуроноконъюгации на примере 2-этил-6-метил-3-оксипиридина. Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации проводили на основании скринингового метода определения i активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы, разработанного М. Court и соавт. [73]. В эксперименте .использовали девять различных субмитохондриальных (S9) изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы, а также микросомальный пул, выделенный из печени человека. При постановке реакции фенотипирования в условиях in vitro в качестве субстратов использовали как основание; так и сукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина.

В ходе эксперимента.впервые были получены MC и MG/MC спектры, 2-этил-6-метил-З-оксипиридина с использованием масс-спектрометра типассион-ная< ловушка» в условиях электрораспылительной, ионизации.«при'атмосферном давлении-и регистрации положительных ионов.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы времени' (0 -360 минут) не выявил присутствия глюкуроноконъюгированного продукта реакции. При этом количественный. анализ полученных данных свидетельствует о>флуктуационном (случайном) и, неконтролируемом изменении* концентрации^ субстрата в, исследуемой инкубационной^ смеси.

Анализ, данных по фенотипированию реакции глюкуроноконъюгации с девятью • отдельными,* изоформами- УДФ-глюкуронозилтрансферазы. также не выявил образование конъюгированного продукта Пфазы биотрансформации.

С целью адекватной оценки воспроизведения .скринингового метода определения' активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы было принято решение о воспроизведении .реакции глюкуроноконъюгации^ на примере таксифолина (дигидроквертицина).

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в условиях in vitro на примере таксифолина проводили в условиях, аналогичных, при изучении сукци-ната и основания 2-этил-6гметил-31оксипиридина. .

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы.времени (0 - 360 минут) выявил присутствие как нативного соединения, так и глюкуроноконъюгированного производного таксифолина, при этом, полученный МС-МС спектр полностью совпадал с., ранее .полученным МС-МС спектром конъюгированного производного таксифолина в моче животных. . .

Анализ данных по фенотипированию реакции глюкуроноконъюгации таксифолина с девятью различными рекомбинантными субмитохондриальными (S9) фракциями УДФ-глюкуронозилтрансферазы показал образование конъю-гированного продукта лишь в трех случаях (изоформы 1А1; 1АЗ и 1А10).

В результате проведенного исследования был воспроизведен метод скри-нинговой оценки субстратной специфичности таксифолина по отношению к УДФ-глюкуронозилтрансферазе. На примере фенотипированияфеакции глюкуроноконъюгации с таксифолином показана адекватность и методологическая рациональность используемого метода.

В экспериментальных и клинических исследованиях биотрансформации мексидола установлено, что основной путь метаболизма препарата в организме человека и животных - конъюгация с глюкуроновой кислотой [15, 25, 29]. Методологической основой данных исследований являлся» анализ биологических образцов на основании предварительного их гидролиза с р-глюкуронидазой, выделенной из, печени крупного рогатого^ скота., При экспериментальных и клинических исследованиях фармакокинетики препарата не проводилась комплексная оценка экскреции иных конъюгированных продуктов II фазы биотрансформации. Таким образом, данные экскреции препарата не отражают потенциальную, способность препарата к взаимодействию со всеми возможными ферментативными системами II фазы метаболизма.

На основании вышеизложенного, а также опираясь на данные результатов фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации сукцината и основания 2-этил-6-метил-З-оксипиридина в условиях in vitro, было проведено детальное изучение, продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче добровольцев после перорального приема мексидола.

Для .решения поставленной задачи был разработан хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина на основе анали

4 I за различных фракций мочи добровольцев. В ходе разработки метода проведена оптимизация процесса пробоподготовки и экстракции 2-этил-6-метил-3-оксипиридина из мочи человека. На основании проведенных исследований был предложен метод твердофазной экстракции в сочетании с последующим процессом дериватизации дансилхлоридом в качестве основного способа пробоподготовки биологических образцов мочи добровольцев.

Анализ продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче добровольцев проводили на- основе данных свободной фракции, а также фракции суточной мочи добровольцев после проведения различных типов гидролиза: ферментативный гидролиз с ß-глюкуронидазой Е. Coli и Н. Pomatia; кислотный гидролиза с 6 М кислотой хлористоводородной.

В результате исследования^ продуктов экскреции II фазы метаболизма 2-этил-6-метил-З-оксипиридина впервые показано, что в течение-первых 24-х часов с мочой добровольцев выводится более 65,5 % препарата в виде различного рода конъюгированных продуктов II фазы биотрансформации.

Анализ усредненных данных показал, что в течение первых 24-х часов после 0 приема, мексидола с мочой добровольцев- экскретируется 1,99 мг± 0,32 мг неизмененного препарата (0,39 % ± 0,02 % от введенной дозы); 109,68 мг± 17,79 мг глюкуроноконъюгированного производного 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (20,71 % ± 4,18 % от введенной дозы мексидола); 150,77 мг ± 21,35 мг в виде сульфоконъюгированных ,форм 2-этил-6-метил-3-оксипиридина, (30,15 %± 4,27 % от изначально введенной дозы мексидола) и 67,8 мкг ± 7,69 мкг в виде иных форм конъюгированных продуктов (15,56 % ± 1,54.% от введенной дозы мексидола). , ,

Стоит отметить, что в отличие от человека, в,организме животных про

• ч цесс биотрансформации мексидола проходит. при, участии ферментативных систем как II, так и I фазы метаболизма, о чем свидетельствуют данные экспериментальной фармакокинетики фармакологически, активного деметилирован-ного метаболита - 2,6-диметил-З-оксипиридина. Согласно данным биохимических и фармакокинетических исследований в процессах деметилирования активное участие принимает СУРЗА4 [54, 56, 75]. По нашему предположению, отсутствие продуктов I- фазы биотрансформации мексидола не является- свидетельством отсутствия влияния препарата на данные метаболические пути.

Таким образом, было проведено изучение потенциального влияния мексидола на Г фазу биотрансформации, а именно на изоформу СУРЗА4. Оценку активности СУРЗА4 проводили на основании неинвазивного метода количественного определения изменения« уровня эндогенного 6(3-гидроксикортизола к свободному кортизолу до и после приема препарата [17, 121].

Для каждого из добровольцев естественный уровень активности СУРЗА4 оценивали на основании данных среднего-значения соотношения- 6(3-ГК/К в суточной моче, полученного в течение трех дней до приема препарата. Изучение влияние мексидола на активность СУРЗА4 оценивали в течение последующих трех дней после приема препарата по изменению уровня 6(3-ГК/К в сравнении с естественным уровнем также у каждого из добровольцев.

Анализ данных выявил достоверное (р = 0,03) увеличение соотношения' 6(3-ГК/К по сравнению, с его естественным уровнем в первые 24 часа после пе-рорального приема мексидола (в среднем в 2,96 раз ± 0,76 раза).

Полученные данные коррелируют с вновь полученными данными по комплексному изучению продуктов экскреции 2-этил-6-метил-3-оксипиридина у человека, которые свидетельствуют о том, что более, 65,5 % препарата выводится с мочой'за первые 24 часа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ мочи, полученной у добровольцев в ходе изучения экскреции, не выявил присутствия хотя бы следовых количеств самого неизмененного 2-этил-б-метил-ЗтОКсипиридина и его метаболитов на вторые и третьи сутки после приема препарата. Продуктов биотрансформации I фазы метаболизма в образцах мочи добровольцев найдено не было. Таким образом, предположительно индукция системы СУРЗА4 под действием мексидола наблюдается лишь в момент активной его. биотрансформации и экс креции и не сохраняется после полной элиминации соединения из организма человека.