Автореферат и диссертация по медицине (14.00.06) на тему:Изучение полиморфизма ДНК у больных инфарктом миокарда

КЗ од

2 4 НОЯ

На правах рукописи

Пушкарева Альфия Эдуардовна

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ДНК У БОЛЬНЫХ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

14.00.06,- кардиология 03.00.15,- генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

УФА - 1997

Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики наследственных болезней человека Отдела цитохимии и биохимии УНЦ РАН и на кафедре внутренних болезней № 1 БГМУ.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор медицинских наук, профессор Л.Н.Мингазетдинова кандидат биологических наук Э.К. Хуснутдинова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Э.Г. Волкова доктор биологических наук, профессор В.А. Спицын

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Государственный научно- исследовательский центр профилактической медицины Минздрава России (101953, Москва, Петроверигский переулок, 10).

Защита диссертации состоится ««Зс?» 1997 года в А с.

мин. на заседании диссертационного совета JC.08435.05. при Башкирском государственном медицинском университете по адресу : 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомите^ библиотеке БГМУ. Автореферат разослан « 199/г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор

Хайретдинова Т.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные достижения медицины в вопросах диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), они продолжают лидировать в структуре заболеваемости и смертности наиболее трудоспособной части населения большинства экономически развитых стран, в том числе и нашей страны. (Чазов Е.И., 1985, Assmann G., 1993, Оганов Р.Г., 1996) Инфаркт миокрада (ИМ) является одним из грозных исходов тех ССЗ, которые сопровождаются нарушением коронарного кровотока. В большинстве случаев ведущей причиной инфаркта миокарда является атеросклероз коронарных сосудов, что подтверждается данными селективной коронарографии. (Salfitz I.E., 1987, Шпектор A.B., 1996) Как известно, разработаны общие положения о ведущих факторах риска развития атеросклероза и ИБС, на их основе широко применяются различные методы лечения и профилактики ИБС. Но предпринимаемые меры недостаточно результативны. Наряду со средовыми факторами риска ИБС в этиологии заболевания значительную роль играет наследственная предрасположенность. (Дзизинский A.A., Пузырев В.П., 1977, Berg К., 1996) Поэтому в настоящее время возрасла актуальность исследований в области генетики ИБС. В результате многочисленных эпидемиологических, медико-генетических исследований пришли к выводу о том, что без учета особенностей генетической конституции успех в ранней диагностике, профилактике и лечении ИБС не будет полным.

К потенциальным генам-кандидатам ИБС относят, прежде всего, гены, детерминирующие формирование физиологических процессов, нарушения которых создают риск развития ИБС. Среди них выделяют группу генов апо-липопротеинов, как белков, занимающих центральное место в липидном обмене (Breslow J., 1988, Целуйко В.И., Чернышов В.А., 1991, Chan L., 1992), и генов ренин-ангиотензиновой системы (РАС), играющих ключевую роль в регуляции артериального давления (АД). (Lifton R.P., 1995, Hegele R.A., 1996)

С внедрением новых методов молекулярной генетики в практику медико-биологических исследований стало возможным изучать полиморфизм ДНК кандидатных генов с помощью генетических маркеров, например, микро- и минисателлитов, полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и т. д. (Hearne С.М., 1992, Cooper D.H., 1988)

Заболеваемость и смертность от ИБС характеризуются этно-географической неоднородностью. В литературе представлены довольно противоречивые данные об ассоциациях тех или иных аллельных вариантов кандидатных генов с развитием ИБС. По всей видимости, на формирование наследственной предрасположенности к развитию заболевания оказывает влияние генетический фон популяции. (Fisher Е.А., 1989) Поэтому необходимы исследования полиморфизма ДНК кандидатных генов ИБС для каждой, отдельно взятой популяции.

Проблема ИБС весьма остро стоит и для населения республики Башкортостан. Однако, специальные исследования, посвященные изучению кан-дидатных генов ИБС и их связи с проявлением заболевания, в России единичны (Степанов В.А. и соавт., 1992, Шварц Е.И. и соавт., 1995, Погода Т.В., 1995, Сломинский П.А. и соавт. 1995), а в Башкортостане не проводились.

Таким образом, работа, выполненная в рамках поиска ассоциаций генетических маркеров в области генов метаболизма липопротеинов и генов РАС с инфарктом миокарда и уровнем липидов плазмы крови у жителей Башкортостана, представляется весьма актуальной.

Цель работы состояла в изучении ассоциаций аллельных вариантов генов аполипопротеинов В и Е (апоВ и апоЕ) и гена ангиотензин-превращающего фермента (АГ1Ф) с инфарктом миокарда и изменчивостью концентраций липидов в сыворотке крови у жителей Башкортостана.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить липидный спектр сыворотки крови, оценить распространенность дислипопротеидемий, провести их фенотипирование у больных ИМ;

2. Изучить распространенность артериальной гипертонии среди больных ИМ;

3. Провести сравнительный анализ аллельных вариантов 3'-минисателлита гена апоВ у больных ИМ и у здоровых лиц;

4. Провести сравнительный анализ аллельных вариантов гена апоЕ у больных ИМ и у здоровых лиц;

5. Провести сравнительный анализ инсерционно-делеционного полиморфизма гена АПФ у больных ИМ и у здоровых лиц;

6. Исследовать взаимосвязь показателей липидного спектра сыворотки крови с аллельными вариантами изучаемых полиморфных ДНК - локусов у больных ИМ и у здоровых лиц;

7. Изучить полиморфизм взятых в исследование генов и липидный спектр сыворотки крови в семьях больных ИБС.

Научная новизна работы.

Впервые для населения Башкортостана описан полиморфизм генов апоВ, апоЕ и гена АПФ у больных ИМ и среди лиц без клинических признаков ИБС. Получены данные о влиянии полиморфных локусов этих генов на наследственную предрасположенность к ИБС и обозначены аллельные варианты, детерминирующие пониженный и повышенный генетический риск развития ИБС, осложненной ИМ. Обнаружено "взаимодействие" двух генетических систем (гена апоВ и гена АПФ) при формировании генетического риска ИМ. Показано влияние полиморфизма ДНК кандидатных локусов на вариабельность уровня липидов в сыворотке крови. Полученные результаты дополняют сведения о генетических локусах, патогенетически значимых для сердечно-сосудистых заболеваний и могут стать основой последующих ис-

следований по определению генетических факторов риска развития ИБС у населения Башкортостана.

Практическая значимость работы.

На основе проведенного анализа полученных данных по полиморфизму кандидатных генов ИБС (генов апоВ, апоЕ и АПФ) были выявлены аллели пониженного риска развития ИМ (аллели апоВ 30 и апоВ34), аллели повышенного риска (апоЕ2 и апоЕ4 , аллель О гена АПФ) и неблагоприятные комбинации генотипов апоВ36-Ь с гомозиготами ОБ гена АПФ. В дальнейшем полученные результаты могут быть использованы для разработки методов раннего выявления лиц, предрасположенных к ишемической болезни сердца, осложенной ИМ в возрасте до 55 лет, до появления фенотипических признаков, а также разработки новых индивидуальных принципов профилактики и лечения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 61-й научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 1996), на конференции «Проблемы клинической медицины» (Уфа, 1996), семинарах лаборатории популяционной генетики наследственных болезней человека ОБЦ УНЦ РАН, на 9-м Международном Конгрессе Генетики человека (Рио-де-Жанейро, 1996), на Международном Конгрессе Молекулярной Медицины (Берлин, 1997).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 печатных

работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 254 работы, в том числе 211 публикаций на иностранных языках.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Атерогенные изменения в липидном спектре сыворотки крови и артериальная гипертония способствуют развитию инфаркта миокарда в возрасте до

55 лет.

2, У жителей Башкортостана тестирование по аллелям 3' - минисателлита гена апоВ открывает возможности для оценки риска развития ИБС, осложненной ИМ в возрасте до 55 лет.

3; Носительство аллелей апо е2 и апо е4, генотипа апо Е2/4 можно рассматривать как генетический фактор риска нарушений метаболизма липидов и риска ИМ у населения Башкортостана.

4. Инсерционно-делеционный полиморфизм по локусу АПФ вносит вклад в развитие ИМ у жителей Башкортостана.

Материалы и методы.

Структура и объем материала. Данные, представленные в работе, получены с использованием трех выборок населения республики Башкортостан: контрольной выборки здоровых лиц, группы больных ИБС, перенесших инфаркт миокарда, и выборки членов семей больных ИМ.

Контролем послужили практически здоровые лица, мужчины в возрасте до 55 лет (всего 75 человек, средний возраст 40,5 ±1,2 года), без признаков ИБС на ЭКГ и в анамнезе, отобранные из обширной выборки, использованной в исследовании дислипидемий среди городских и сельских жителей Башкортостана, проводимом УНЦ РАН.

В группу больных включены 96 неродственных пациента, мужчин в возрасте до 55 лет, 1-го кардиологического отделения ГКБ №13 г.Уфы, кардиологического отделения ГКБ г.Сибая и ЦРБ Абзелиловского и Архангельского районов Башкортостана. Средний возраст больных составил 41,3+0,9. Крупноочаговый ИМ диагносцирован у 60 пациентов, трансмуральный ИМ -у 36 больных, в том числе повторный ИМ у 7 больных. ИМ с локализацией в области передней стенки левого желудочка зафиксирован у 21, передне-перегородочной области - у 18, передне-боковой - у 12, передне-верхушечной - у 13, задне-диафрагмальной -у 10, задне-базальной - 11, зад-не-боковой - у 6, распространенный задний ИМ - у 5 больных. Диагностика ИМ проводилась в соответствии с критериями ВОЗ (1970) на основании характерных клинических (наличие длительных, интенсивных коронарных болей), лабораторных (лейкоцитоз, повышение СОЭ, уровня кардиоспецифиче-ских ферментов) и инструментальных (электро- и эхокардиографии) данных .

Группа больных ИМ и группа здоровых лиц были полностью сопоставимы по этническому составу и отражают национальный состав населения республики Башкортостан.

В третью группу включены члены 20 семей, отобранных по пробанду из группы больных ИМ, всего 79 человек.

Типирование полиморфизма ДНК. ДНК выделяли из крови методом фенольно-хлороформной экстракции. (Mathew С.С., 1984)

Участки генов аполипопротеинов В и Е, гена ангиотензин-превращаю-щего фермента амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили на автоматическом термоциклере «Биотерм» с использованием Taq-полимеразы (Бион, Россия) и праймеров, описанных Boer-winkle Е. ct al. (1989) для гена апоВ, Hixon J.E. et al. (1990) для гена апоЕ , Rigat В. et al.(1990) для гена АПФ.

Амплификацию фрагментов гена апоВ проводили в следующем режиме: денатурация - 95°С 1мин, отжиг праймеров - 60° С 1 мин, элонгация -72°С 2 мин. Участок гена апоЕ амплифицировали в следующем режиме: денатурация - 94°С 1мин, отжиг праймеров - 62° С 1 мин, элонгация -72°С 1 мин. Ам-шшфикаты гидролизовали соответствующей рестриктазой Hha I. Участок гена АПФ'амплифицировали в следующем режиме: денатурация - 94°С 1мин,

отжиг праймеров - 62° С 1 мин,элонгация -72°С 1 мин. Рестрикцию, разделение, окраску проводили в соответствии с общепринятыми методами. (Маниатис Т. с соав., 1984) Определение аллельных вариантов гена апоВ проводили с помощью электрофореза в 5% полиакриламидном геле (ПААГ), содержащим 7% глицерин. Определение аллельных вариантов генов апоЕ и АПФ проводили с помощью электрофореза в 12% и 7% ПААГ, соответственно.

Определение липидного профиля сыворотки крови. Забор крови для анализа линидов проводили в утренние часы натощак, у больных - при первичном поступлении в стационар до использования препаратов, понижающих концентрацию липидов.

Содержание общего холестерина (ХС) и ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП) определяли по методу. (Ilea S., 1962) ЛП низкой и очень низкой плотностей (ЛНП и ЛОНП) перед определением ХС ЛВП осаждали марганец-гепариновой смесью. Концентрацию триглицеридов(ТГ) определяли по методу. (Carlson L.A., 1963) Электрофорез липопротеинов проводили в градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) по методу (Маграчева . Е.А., 1973) с последующей денситометрией. (Людовичек И.А. и др., 1979) Содержание ХС ЛНП и ХС ЛОНП рассчитывали по формулам, предложенным в работе. (Friedewald W.T., 1972) Фенотипироваиие дислипо-протеидемий осуществляли в соответствии с предъявляемыми требованиями. (Климов А.Н., 1995)

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакеты компьютерных программ Statistica for Windows 402 (Stat Soft), Row x Columns и программное обеспечение Microsoft Excl. Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали критерий х1 (Животовский Л.А., 1991); достоверность различий при попарном сравнении частот аллелей и генотипов определяли по х2-тест, с помощью компьютерной программы Row х Columns по алгоритму, описанному Roff P. and Bentzen P. (1989) Достоверность различий между средними показателями липидного спектра крови проверяли с помощью критерия Стыодента. (Лакин Г.Ф., 1986) Достоверность различий частот фенотипов ДЛП оценивали методом, основанном на <р- преобразовании Фишера. (Лакин Г.Ф., 1986)

Относительный риск заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли как соотношение (Emery А.Е., 1976): R =a*d /Ь»с, где ,

а - частота аллеля в выборке больных, b - частота аллеля в контрольной выборке, с - сумма частот остальных аллелей в выборке больных, d - сумма частот остальных аллелей в контрольной выборке; с=1-а, d=l-b.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ распространенности дислипопротеидемий среди лиц с инфарктом миокарда

Нарушения липидного спектра крови являются доказанным ведущим фактором риска развития ИБС.

Анализ липидного спектра сыворотки крови показал, что среди больных ИМ и в контрольной группе (рис.1) дислипопротеидемии (ДЛП) встречаются с высокой частотой. Достоверные различия между группами больных ИМ и здоровых лиц прослеживались по частоте потенциально атерогенных фенотипов (19,9% - в группе контроля и 32,2% - в группе больных ИМ, р < 0,01). У больных ИМ в отличие от здоровых лиц встречался III тип ДЛП, была повышена частота встречаемости Иа-, IV- типов, причем среди фенотипов ДЛП превалировал Иатип гиперлипидемии. В то же время, у больных ИМ не были обнаружены такие типы ДЛП, как гипобета - ЛП, сочетание гиперальфа-ЛП с гипобета-ЛП.

Известно, что ДЛП, для которых характерно повышение концентраций ХС и/или ТГ, липопротеинов низкой и очень низкой плотности (На-, 116-, IV-типы ДЛП), понижение концентраций ХС липопротеинов высокой плотности (гипоальфа-липопротеинемия), предрасполагают к атерогенезу и представляют собой в связи с этим факторы и маркеры риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. (Климов, 1995)

Таким образом, продемонстрирована роль нарушений липидного обмена при инфаркте миокарда в возрасте до 55 лет среди населения республики Башкортостана путем выявления достоверного повышения частоты атерогенных типов ДЛП у этих больных по сравнению с контрольной группой.

Распространенность артериальной гипертонии среди больных инфарктом миокарда

Значение повышенного артериального давления как фактора риска ИБС бесспорно, что мы и наблюдали среди лиц с инфарктом миокарда. Среди 96 больных ИМ у 44% отмечалась артериальная гипертония (п=42). В целом, в группе больных ИМ у 36 человек был выставлен диагноз трансму-рального инфаркта миокарда. Интересным нам представляется тот факт, что 21 больной, перенесший трансмуральный ИМ, был с артериальной гипертонией. Причем при распределении по возрастным группам 16 больных с трансмуральным ИМ, страдающих АГ, были в возрасте до 39 лет, и оставшиеся 5 - в возрасте 40-49 лет. Подобная тенденция к « омоложению» наблюдалась и среди всех больных с инфарктом миокарда, страдающих артериальной гипертонией: около 74% этих больных находились в возрасте от 30 до39 лет (табл.1).

Таким образом, у больных с инфарктом миокарда в возрасте до 55 лет артериальная гипертония выступает не только как фактор риска развития ин

Фенотип ДЛП

Рис.1. Частота встречаемости фенотипов дислипопротеидемий: 1- гиперальфа-ЛГ1, 2- гипоальфа-ЛП, 3- сочетание гиперальфа- с гипобета-ЛП, 4- гипобета-ЛП, 5- IIa-, 6-116-, 7- III-, 8- IV типы гиперлипидемий, 9- "другие" фенотипы ДЛП

^ 45 40 35 30 25 20 15 10 5 О

□ Контроль

□ Больные ИБС

Аллель АРОВ

Рис.2. Частота встречаемости аллелей З'минисателлита гена аполипопротеина В

фаркта миокарда, но и как усугубляющий тяжесть поражения миокарда при инфаркте и способствующий его «омоложению» . Таблица 1.

Распределение больных инфарктом миока рда по возрастным группам

Возраст больных (годы) Число больных ИМ (частота в %) Число больных ИМ, страдающих АГ (частота в %)

30-39 33 (34%) 31 (74%)

40-49 37 (39%) 7(17%)

50-55 26 (27%) 4 (9%)

Учитывая, что ДЛП и артериальная гипертония, являясь ведущими факторами риска развития ИМ, имеют каждый генетическую предрасположенность, мы изучили аллельные варианты генов, потенциально наиболее ответственных за данные фенотипические проявления.

Анализ распределении аллельных вариантов 3'- минисателлита гена аполипопротеина В в контрольной выборке и у больных, перенесших

инфаркт миокарда

При ПЦР-анализе аллельных вариантов 3'-минисателлита гена апоВ нами было обнаружено 13 аллелей данного локуса; 26 генотипов среди здоровых лиц и 34 генотипа среди больных ИМ. Частоты встречаемости генотипов в группе здоровых лиц достоверно не отличались от теоретически ожидаемых согласно уравнению Харди-Вайнберга (р > 0,9). По распределению частот аллелей гена апоВ выборки достоверно различаются между собой (р<0,05). •

Как показал анализ литературных данных, для ряда европейских популяций были получены неоднозначные результаты об ассоциациях аллельных вариантов 3'- минисателлита гена апоВ с риском развития ИБС. Для жителей Австрии у больных ИБС по сравнению с распределением в популяцион-ной выборке чаще встречались аллельные варианты с большим числом повторов (Friedl W., 1990), а у больных ИБС из Германии в два раза чаще по сравнению с контролем обнаруживался аллель с 48 повторами (Marz W., 1993). Среди больных ИБС - жителей Москвы чаще встречались аллель апоВ 32 и «длинные» аллели апоВ L (Погода Т.В., 1995).

Согласно полученным нами данным, распределение частот аллелей в выборке мужчин без признаков ИБС имеет ряд особенностей, характерных для популяций европеоидов: аллели апоВ 34 и апоВ 36 встречаются с наибольшей частотой, суммарно превышающей 50%, аллели апоВ 30 и апоВ 38 -с частотами, близкими к 10%, аллель апо В 32 - с частотой, превышающей 5%, а остальные аллели (с числом повторов 28, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52) - с частотами менее 5%, т.е. 8 из 13 аллелей апоВ являются редкими. В целом, среди больных ИМ по сравнению с контролем снижены частоты встречаемо-

cti! аллелей аноВ 30 (р < 0,01) и апоВ 34 (р < 0,05), в то же время наблюдается выраженная тенденция к повышению частоты встречаемости аллеля апоВ 36 (р < 0,1) (рис.2). Определенные изменения частот аллелей в связи с ИМ наблюдаются и для редко встречающихся аллелей апоВ: несколько повышается частота аллелей апоВ 32, апоВ 42, ano В 44, апоВ 46, апоВ 48 и понижается частота аллелей апоВ 38, апоВ 40, апоВ 50, но статистически достоверных изменений частот редко встречающихся аллелей апоВ нами не отмечено (рис.2).

Для выявления возможной тенденции в динамике частот генотипов апоВ при ИМ и проверки ее статистической значимости была проведена следующая группировка данных. Аллели были обозначены в соответствии с числом тандемно повторяющихся единиц: S (от англ. «short») - с числом повторов менее 34 (апоВ 28, апоВ 30, апоВ 32) и L (от англ. « long») - с числом повторов более 36 (апоВ 38 , апоВ 40, апоВ 42 , апоВ 44, апоВ 46 , апоВ 50, апоВ 52); в связи с такого рода обозначениями было классифицировано 10 генотипов (S-S, 34-S, 34-L, 34-34, 34-36, 36-36, 36-S, 36-L, L-L, L-S) вместо эмпирически найденных 34 генотипов у больных ИМ и 29 генотипов апоВ у лип контрольной группы.

У больных ИМ существенно (в 5,6 раз) понижена частота встречаемости генотипа ano В 34-34 (р<0,01), и этот факт можно интерпретировать как очень низкий (0,15) относительный риск ИМ в возрасте до 55 лет для гомозигот апоВ 34-34 (рис.3). Наблюдается тенденция к повышению частоты гомозигот апоВ 36-36 (р<0,1) среди больных ИМ; относительный риск ИМ для генотипа апоВ 36-36 составил 1,91. Очевидно, что результаты анализа частоты встречаемости генотипов апоВ (рис.3) дополняют приведенные ранее данные о прогностической значимости аллеля апоВ 34: генотип апоВ 34-34 является маркером низкого риска ИМ.

Нами предпринята попытка проанализировать динамику концентраций липидов и коэффициента атерогенности (КА) в зависимости от полиморфизма З'-минисателлита гена апоВ. В контрольной группе достоверных различий между средними значениями концентраций липидов по отдельным генотипам не было обнаружено. Среди лиц, перенесших ИМ (табл.2), среднестатистические концентрации липидов на момент обследования находились в пределах физиологической нормы. По содержанию липидов обозначенные генотипические группы не отличались. В то же время между отдельными генотипами прослеживались достоверные различия по коэффициенту атерогенности (КА): между генотипами апоВ 34-34 и апоВ 36-L (р < 0,01), апоВ 34-34 и апоВ 36-S (р < 0,01), апоВ 34-34 и апоВ 36-36 (р < 0,05). Корреляционный анализ данных, представленных в таблице 3 продемонстрировал, что в выборке больных ИМ, из которой исключены носители генотипов S-S, 34-S, 3434 или, другими словами, в выборке, включающей гомо- и гетерозиготы по апоВ 36 или по апоВ L наблюдаются достоверные положительные корреля-

ции содержания общего холестерина (0,29 при р < 0,05) и коэффициента ате-рогенности (КА) (0,27 при р < 0,05) с «длиной» (т.е. с числом повторов базовой нуклеотидной последовательности З'-минисателлита) аллеля апоВ. Также следует отметить, что хотя нами и не обнаружено в контрольной группе значимых различий между генотипическими группами по содержанию липи-дов и КА, в выборке здоровых лиц, гетерозиготных по апоВ 36 и апоВ Ь аллелям, и также не имеющих в генотипе аллеля апоВ34 и апоВ 5, прослежена достоверная (р < 0,05) корреляция (0,27 ) между содержанием ХС и числом

Таблица 2.

Динамика значений липидных показателей в связи с полиморфизмом 3'-мииисателлнта гена аподипопротеина В при раннем инфаркте

Генотип Концентрация (мг/дл), х(, х±Э; КА

ХС ХС лвп ТГ

5-5 211.95±31.50 56.78±6.51 209.77±58.12 3.15=ь1.20

34-Б 227.67±22.33 44.15±5.42 200.05±28.20 4.22±2.42

34-1 192.71±55.91 46.76±5.73 205.75±39.30 3.16±0.52

34-34 219.94±25.92 64.61±3.81 146.56± 16.40 2.38±0.18

34-36 193.56±10.52 60.71±5.49 139.66±15.20 2.49±0.28

36-36 204.76±17.43 46.93i3.06 143.79±43.10 3.55±0.49

36-Ь 246.88±14.42 54.96±3.01 240.69±53.80 3.7-5±0.20

36-Б 196.83±14.21 38.85±2.42 137.07±25.10 4.33±0.47

209.57±15.33 55.59±5.52 183.10±29.10 2.88±0.41

Б-Ь 216.40±15.58 59.84±2.61 144.83±18.50 2.86±0.35

Примечание: *- р< 0,05 при сравнении с генотипом апоВ34-34. Таблица 3.

Матрица корреляций числа гандемных повторов аллеля (ЧТПА) 3'минисателлита гена апоВ и липидных показателей

Переменная ЧТПА ХС ХС лвп ТГ КА

ЧТПА 1

ХС 0,29* 1

ХС ЛВП -0,12 0,29* 1

ТГ 0,24 0,45* -0,17 1

КА 0,27* 0,60* -0,52* 0,55* 1

Примечания: *- р<0.05 ;

ЧТПА - имеются ввиду аллели с числом повторов 36-52, гомозиготы апоВ 34-34 и гетерозиготы, включающие апоВ 34 и аллели с меньшим числом повторов исключены из анализа

20 п

О Контроль □ Больные ИМ

1а_]

со со

Генотип апоВ

Рис.З. Частота встречаемости генотипов аполипопротеина В

повторяющихся единиц в L-аллеле. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что в связи с увеличением числа повторов в 3'- минисателлите гена апоВ свыше 34 (от 36 до 52), опосредованно происходит повышение концентрации ХС в крови, причем в зависимости от «длины» аллеля.

Анализ распределения аллельных вариантов гена аполипопротепна Е в контрольной выборке и у больных ИМ

Генетический полиморфизм апоЕ является одной из главных детерминант уровня липидов плазмы крови и, следовательно, риска развития ИБС. В общемировой мозаике исследований роли генетического полиморфизма апоЕ преобладает точка зрения, что аллель е4 ассоциируется с повышенным риском развития ИБС и атерогенными сдвигами лшидного спектра крови. (TikJcanen M.J. et al., 1990, Hixson J.E. et al., 1992, Heng A.I.et al., 1996) Среди населения республики Башкортостан подобного исследования ранее не проводилось. Нами был изучен аллельный состав гена апоЕ в группе здоровых лиц, не имеющих признаков ИБС, и в группе лиц, перенесших ИМ. Частота встречаемости генотипов в группе здоровых лиц достоверно не отличалась от теоретической, рассчитанной согласно уравнению Харди-Вайнберга (р > 0,8). По распределению частот аллелей гена апоВ выборки достоверно различаются между собой (р < 0,05).

По частоте встречаемости генотипов (Е 3/3, Е 3/4, ЕЗ/2, Е2/4, Е4/4, Е2/2) и аллелей (е2, еЗ, е4) между группами прослеживаются существенные различия (рис. 4, 5).

При ИМ наблюдалось достоверное накопление лиц с генотипом Е 2/4 (42,31% в сравнении с 11,63% в группе контроля, р< 0,01) и , соответственно, носителей аллелей е2 (32,69% против 16,28% в контрольной группе, р < 0,05) и е4 (36.54% против 24,42% в контрольной группе, р < 0,01). Относительный риск ИМ по аллелям е2 и е4 оказался высоким (2,5 и 1,8 соответственно). Кроме того, среди больных ИМ нами отмечено достоверное снижение числа лиц с генотипом ЕЗ/З (7,69% по сравнению с 32,56% в контрольной группе, р <0,01).

При анализе ассоциаций липидного спектра сыворотки крови с генетическим полиморфизмом апоЕ было установлено следующее, (табл. 4). В варьировании концентраций липидов в зависимости от генотипа апоЕ наблюдается тенденция к увеличению содержания ХС, ХС ЛНП, ХС ЛОНП, ТГ, КА соответственно последовательности генотипов ЕЗ/З, ЕЗ/2, ЕЗ/4, Е2/4, Е4/4 (табл. 4). Наиболее низкие концентрации ХС ЛНП отмечены при ЕЗ/З (122,47 мг/дл), а наиболее высокие при Е4/4 (189,60 мг/дл); напротив, содержание ХС ЛВП наиболее высоко при ЕЗ/З (50, 93мг/дл) и наиболее низко при Е4/4 (37,1 мг/дл). Наличие аллеля е2 ассоциируется, прежде всего, со снижением ХС ЛОНП и, соответственно, с низкими значениями соотношения ХС/ТГ

45-% 40.

35 -30 -25 20

Л

О -г-

Й1

□ контроль В больные ИБС

Е 3/3

Е 3/2

Е 3/4

Е 2/4

Е 4/4 Е 2/2

Г'сиотип апоЕ

Рис.4. Частота встречаемости генотипов аполипопротеина Е

□ контроль ■ Больные ИБС

с4 Аллель АРОЕ

15

Рис.5. Частота встречаемости аллелей аполипопротеина Е

(1,4). В то же время в связи с аллелем е4 прослеживается увеличение содержания ХС, ХС ЛНП, ХС ЛОНП, ТГ, уменьшение содержания ХС ЛВП, а следовательно, и высокие значения КА. В группе больных ИМ отмечалась та же самая тенденция в динамике концентраций липидов в зависимости от генотипа апоЕ, что и в контрольной группе. Однако у больных ИМ генотипу ЕЗ/2 соответствовали отдельные случаи гипохолестеринемии и гиперальфа - ЛП, сочетанной с гипертриглицеридемией (при нормальных значениях ХС, ХС/ТГ=0.40, КА=0.80 ), а также случаи гипоальфа - ЛП. В целом, при генотипе ЕЗ/2 50% обследованных больных имели ДЛП. У 80% лиц с ИМ, имеющих генотип ЕЗ/4, диагносцировали ДЛП: Па тип, гипераггьфа-ЛП; также у 90% больных носителей генотипа Е2/4 типировали такие ДЛП, как гипоальфа- ЛГ1, IV тип ГЛП (сочетание гиперхол сстер и нем и и с гипертриглицеридемией).

Таблица 4.

Динамика лишцных показателей в зависимости от генотипа апоЕ у больных ИМ

Генотип апоЕ

3/3 3/2 3/4 2/4 4/4

Лица с ИМ (п) 8 22 22 41 3

ХС 182,715,6 134,818,9 250,017,1 268,3+9,3 . 299,6

ХСЛВП 47,0±3,3 50,713,1 75,0+4,8 42,613,7 52,5

хелнп 110,4+10,0 62,616,3 153,516,0 175,917,4 219,9

хслонп 25,3+4,2 33,3+4,1 21,5+2,4 55,1+4,0 27,2

ТГ 126,7+11,0 166,4+8,9 107,619,0 202,1 + 11,0 136,2

КА 2,9±0,9 1.810,2 2,6+0,5 5,510,8 4,7

Анализ ннсерционно - делеционного полиморфизма гена АПФ в группе больных, перенесших ИМ и в группе контроля.

В научной литературе сформировалась точка зрения о том, что основные представители РАС (АПФ, ангиотензиноген), вносят большой вклад в развитие сердечно-сосудистых заболеваний (Bohn М.Е. et al., 1994, Lifton R.P., 1995, Berg К. et al., 1996). Среди европейских популяций наличие аллеля D гена АПФ ассоциировалось с повышенным риском развития инфаркта миокарда и гипертонии (Cambien F.I., 1992, Raynolds M.V., 1993, Morris B.J., 1993).

Среди населения Башкортостана нами впервые изучен инсерционно-делеционный полиморфизм гена АПФ. Распределение генотипов гена АПФ в группе здоровых лиц соответствовало теоретически ожидаемому по уравнению Харди-Вайнберга (р > 0,9). Как видно из рис.6, группы контроля и больных ИМ достоверно различались как по частоте генотипов, так и по частоте аллелей (р<0,001 и р<0,01, соответственно). Среди больных ИМ мы наблюда-

ли достоверное увеличение частоты встречаемости генотипа DD и частоты аллеля D. Относительный риск развития ИМ по D аллелю оказался высоким (2,08).

У больных эссенциальной гипертонией ряда европейских популяций выявлена ассоциация заболевания с инсерционно-делеционным полиморфизмом гена АПФ. (Monis В.J.,1994, Higara Н.,1996) Нами также была предпринята попытка проанализировать распределение аллельных вариантов и генотипов гена АПФ у больных ишемической болезнью сердца с нормальным артериальным давлением (п=54) и с артериальной гипертонией (п=-42).

Но статистически достоверных различий по частоте аллелей I и D гена АПФ у больных ИМ с гипертонией и у больных с артериальным давлением в пределах нормы не обнаружено. Частота аллеля D в этих двух группах была соответственно 0,61 и 0,56. По видимому, у больных ИМ данный полиморфизм гена АПФ не ассоциируется с развитием гипертонии.

В группах контроля и больных ИМ проанализирована ассоциация ли-пидных показателей сыворотки крови с аллельными вариантами АПФ (табл. 5). У больных ИМ обнаружена связь между наличием аллеля D и атероген-ным характером нарушений липидного профиля крови, так как у больных ИМ с генотипом DD уровни ХС, ХС ЛНП, были достоверно выше, чем у больных ИМ, гомозиготных по аллелю I гена АПФ (р < 0,05; р < 0,01 соответственно), а для концентраций ХС ЛВП и ТГ такой закономерности не наблюдалось.

У лиц контрольной группы ассоциации аллеля D с повышением уровня линидных показателей сыворотки крови не отмечено.

С учетом достоверного увеличения частоты аллеля D гена АПФ у больных ИМ можно предположить, что он является фактором риска развития ИМ. Более того, при наличии ИБС аллель D ассоциирует с повышением уровней общего холестерина и холестерина ЛНП в сыворотке крови. Этот факт указывает на то, что у больных ИБС, перенесших ИМ, аллель D гена АПФ маркирует изменения атерогенного характера липидного спектра сыворотки крови. 11ри попытке сопоставления полученных результатов но каждому из обследованных генов, нами были отмечены сочетания генотипов повышенного и пониженного риска развития ИМ. У больных ИМ с генотипами апоВ 36-36 и anoB36,L наблюдается повышение частоты встречаемости DD генотипа гена АПФ , что свидетельствует о сочетапном влиянии двух генетических систем на реализацию наследственной предрасположенности к инфаркту миокарда. У больных ИМ полностью отсутствует сочетание генотипа апоВ 34-34 с DD генотипом гена АПФ. Можно предположить, что сочетание апоВ 34-34,1 1/ID является комбинацией пониженного риска развития ИМ.

%

80 т| 60 40 20 0

д.-. у*;

00

0 Контроль □ Больные ИМ

Ю

Генотип АПФ

Рис.6.Сравнительная частота встречаемости генотипов гена ангиотензин- превращающего фермента у больных ИМ и контрольной группы.

Таблица 5.

Динамика показателей липидного спектра сыворотки крови у лиц с различными генотипами по инсерционио-делеционному полиморфизму гена АПФ

Генотип Липидиые показатели

ХС ХС лвп ХС лнп КА тг

Контроль

II 244,8±11,4 44,9+10,3 168,7+20,4 4,6+0,4 187,4+25,1

Ю 208,7±6,0 5!,4±5,3 143,9+15,8 2,9+0,3 ¡74,6+10,5

йБ 258,1 + 12.4 51,1+9,8 157,2+18,0 4,2+1,2 162,5+17.8

Больные ИМ

Л 201,3+9,2 44.5+6,0 124,1+18,3 3,5+0,5 198,9±14,2

ю 221,7±11,1 52,2+4,5 136,0±12,3 3,2±0,2 187,7+32,1

оо ■ 247,5+12.4** 51,6±10,2 170,1+14,4* 3;8±0,8 212,5+23,4

Примечание: *- р < 0,05 , ** - р < 0,01 при сравнении с гомозиготами по 1 аллелю у больных ИМ.

Анализ полиморфизма ДНК в семьях больных ИМ

В 11 семьях из 20 (55%) имело место накопление случаев ИМ. При анализе 3'- минисателлита полиморфизма гена апоВ в этих семьях выделено б семей (30%), где наблюдалось накопление «длинных» аллелей апоВ, как и предполагалось ранее, когда сравнивали по частоте аллелей апоВ Ь больных ИМ с отягощенной наследственностью и при ее отсутствии.

При изучении распределения частот аллелей и генотипов 1/0 полиморфизма гена АПФ среди членов семей 20 пробандов, перенесших ИМ в возрасте до 55 лет, накопления ВО генотипа, как можно было ожидать исходя из многочисленных литературных данных о связи ИМ с этим генотипом, не было найдено. Причем это характерно, как для семей без накопления, так и с накоплением случаев ИМ. По частоте аллелей I и О среди родственников больных ИМ достоверных отличий от контрольной группы не обнаружено. Ассоциаций между Б аллелем и атерогенным сдвигом липидного спектра крови у родственников не выявлено.

При изучении распределения частот аллелей и генотипов апоЕ среди членов семей больных ИМ достоверных отличий от группы контроля не было обнаружено. Возможно, это является следствием того, что информативность мультиаллельных локусов (например, апоВ) выше , чем у локусов с малым числом аллелей.

При изучении липидного спектра у детей с «неблагополучным» аллелем апоВ Ь, ожидаемый агерогенный сдвиг липидного спектра крови отмечался лишь в единичных случаях ( в семье С. у дочери пробанда, представлена на рис.7. ) . По данным Метельской В.А. и соавт. (1986), вступление в по-

ловое созревание детей из группы риска сглаживает атерогенные липидные сдвиги в сыворотке крови, обусловленные отягощенной наследственностью, и лишь повышение уровня апоВ в крови и соотношение апоВ/апоА-1 остаются достоверными критериями отличия детей группы риска от здоровых.

1 2

Рис.7. Пример семьи с накоплением аллелей 3 - минисателлита гена апоВ с большим числом повторов.

Семья С.:

1 - отец пробанда, перенес ИМ в 54 года,

2 - мать пробанда, страдает АГ II стадии

3 - пробанд, перенес ИМ в 36 лет

4 - жена пробанда

5 и 6- дети пробанда ( 7 и 12 лет)

Нами сделано предположение, что наличие аллелей апоВ с числом повторов от 36 до 52 у детей из семей с наследственной отягощенностью является ранним маркером повышенного риска развития инфаркта миокарда. ДЛП будет уже фенотипическим проявлением наличия «неблагоприятного» аллеля в дальнейшем.

ВЫВОДЫ

1. В.группе больных ИМ в возрасте до 55 лет наблюдается высокая отягощенность по ДЛП; по сравнению с контролем более распространены ДЛИ атерогенного характера, причем среди них преобладает На тип ДЛП.

2. Среди больных ИМ артериальная гипертония является не только одним из ведущих факторов риска (АГ отмечалась у 44% больных), но и фактором. усугубляющим тяжесть поражения миокарда при ИМ, и способствующим «омоложению» ИМ.

3. Среди населения Башкортостана аллели аполипопротеина В 30 и аполинопротеина В34 являются аллелями низкого риска ИБС, отягощенной ИМ в возрасте до 55 лет. Обнаружена связь числа повторов от 36 до 52 в 3'-минисателлите гена апоВ с повышением концентрации холестерина в крови и коэффициента атерогенности.

4. Показано влияние генетического полиморфизма аполипопротеина Е на предрасположенность к ИМ у жителей Башкортостана. «Носительство» аллелей е2 и е4. генотипа Е 2/4 можно рассматривать как генетический фактор риска нарушений метаболизма липидов и ИМ в возрасте до 55 лет.

5. Показано, что в наследственную предрасположенность к ИБС с ИМ в возрасте до 55 лет у населения Башкортостана вносит вклад инсерционно-делеционный полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента. Аллель Г) и генотип БЭ являются факторами риска развития инфаркта миокарда и маркерами атерогенного сдвига липидного спектра сыворотки крови у больных ИБС. Сочетанное носительство генотипов апоВ 36-36 или апоВЗб-Ь гена апоВ с СЮ генотипом гена АПФ маркирует повышенный риск развития ИМ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мустафина O.E., Хуснутдинова Э.К., Туктарова И.А., Пушкарева А.Э., Нафикова В.А. Исследование генетических факторов риска ИБС // «Актуальные вопросы клиники внутренних болезней». Республ. сб. Уфа. 1996. С. 82-83.

2. Пушкарева А.Э., Мустафина O.E., Хуснутдинова Э.К., Мингазетди-нова Л.Н. Изучение роли инсерционно-делеционного полиморфизма гена АПФ у больных ИМ // Материалы 61-й научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. Уфа. 1996. Часть I. С. 41-42.

3. Пушкарева А.Э., Мингазетдинова Л.Н., Хуснутдинова Э.К., Гафуров Р.Х., Киреева P.A. Изучение роли генетических факторов у больных инфарктом миокарда // Материалы республиканской конференции «Молодые ученые - практическому здравоохранению». Уфа.1996. С. 19-20.

4.Мустафина O.E., Туктарова И.А., Пушкарева А.Э., Нафикова В.А., Хуснутдинова Э.К. Полиморфизм аполипопротеина Е при ишемической болезни сердца // Материалы конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний нервной системы ». Уфа. 1996. 4.II. С. 21-23.

5. О.Mustafina, A. Pushkaryova, P. Slomynsky, L. Mingazetdinova, I. Tuk-tarova, E. Khusnutdinova. Insertion/deletion polymorphism of the angiotensin -converting enzyme gene in families of patients with myocardial infarction // 9th In-tern.Congress of Hum. Gen. Brazil. J. of Genetics. 1996. V.19.№2.P.112.

6. И.А.Туктарова, O.E. Мустафина, А.Э. Пушкарева, Э.К. Хуснутдинова. Изучение липидного спектра сыворотки крови и полиморфизма ДНК «генов-кандидатов» ишемической болезни сердца среди населения республики Башкортостан // Материалы республиканской научно-практической конференции «Состояние здоровья и организация медицинской помощи населению в регионе с развитой нефтехимической промышленностью». ■ Стерлита-мак. 1997. С. 41-42.

7. А.Э.Пушкарева, O.E. Мустафина, Э.К. Хуснутдинова, Л.Н. Мингазетдинова, Г..Я. Камалтдинова. Изучение влияния генетического полиморфизма АпоВ на риск развития ИБС // Сб.научных трудов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 60-летию кафедры госпитальной терапии БГМУ. Уфа. 1997. С. 54-56.

8. А.Э.Пушкарева, O.E. Мустафина, Э.К. Хуснутдинова, Л.Н. Мингазетдинова. Полиморфизм ДНК «генов-кандидатов» ишемической болезни сердца // Материалы 62-й научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ, посвященной 50- летиго студенческого научного общества БГМУ. Уфа. 1997. Ч.З.С.42.

9. O.Mustafína, Е. Khusnutdinova, A. Pushkaryova, I. Tuktarova, L. Mingazetdinova, V. Vachitov. Investigation of genetic factor coronary heart disease risk // 9lhIntern. Congress of Genes, Gene Families and Isozymes. San Antonyo, Texas. 1997. Abstr.216.

10. T.Victorova, R. Fatchlislamova, A. Pushkaryova, E. Khusnutdinova. Polymorphism of v - region of mt DNA in the Volga-Urals populations // 4th[ntem.workshop «Mutation detection' 97». Brno. Czech Rep. 1997. Abstr. 50.

И.О. Mustafma, A. Pushkaryova, I. Tuktarova, E. Khusnutdinova. Investigation of apolipoproteins and angiotensin - converting enzyme genetic polymorphism in patients with CHD // Congress of Molecular Medicine. Berlin, Germ. 1997. Abstr. 47.

12. O.E. Мустафииа, Э.К. Хуснутдинова, А.Э. Пушкарева, И.А. Тукта-рова. Основные достижения и перспективы развития концепции о наследственной предрасположенности к ишемической болезни сердца // Здравоохранение Башкортостана. 1997. Принята в печать.