Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение патогенности аутоантител к различным участкам десмоглеина 3 в модели пузырчатки на животных

На правах рукописи

Р

КОЦАРЕВА ОЛЬГА ДМИТРИЕВНА 003054288

ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕННОСТИ АУТОАНТИТЕЛ К РАЗЛИЧНЫМ УЧАСТКАМ ДЕСМОГЛЕИНА 3 В МОДЕЛИ ПУЗЫРЧАТКИ НА ЖИВОТНЫХ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2007

003054288

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Свирщевская Е.В.

Официальные оппоненты:

1 .Доктор медицинских наук, профессор Людмила Федоровна Знаменская 2. Доктор биологических наук, профессор Валентина Михайловна Бержец

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится « 22 » февраля 2007 года в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИ вакцин и сывороток им И.И.Мечшкова РАМН (105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а)

С диссертацией можно ознакомиться в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Кандидат биологических наук

Характеристика работы

Актуальность проблемы Пузырчатка является достаточно редким аутоиммунным заболеванием, при котором наблюдается формирование пузырей в эпидермисе и на слизистых оболочках. Наиболее распространены и лучше других изучены две формы пузырчатки: вульгарная пузырчатка (ВП) и листовидная пузырчатка (ЛП) [Lever, 1965]. Частота встречаемости ВП составляет 0,1-0,5 на 100000 населения. Среди еврейской популяции частота встречаемости пузырчатки значительно выше. В некоторых областях Бразилии эндемичная форма листовидной пузырчатки Fogo solvagem (FS) выявляется у 3,4% населения [Ahmed et al., 1990].

Аутоантигеном при пузырчатке являются белки десмосом десмоглеины (ДСГ). Связывание аутоантител с белками-мишенями приводит к нарушению межклеточной адгезии (акантолизу) [Lever, 1953]. В результате на коже и слизистых образуются многочисленные эрозийные бляшки или пузыри. Заболевание осложняется тем, что образующиеся пузыри часто инфицируются, что служит причиной сопутствующих инфекций [Ahmed, 1982]. До появления кортикостероидных препаратов пузырчатка часто заканчивалась летальным исходом.

Показано, что доминирующим классом аутоантител при пузырчатке являются антитела преимущественно IgG4 субкласса [Ding et.al., 1997]. Как правило, титр аутоантител в сыворотке больных пемфигусом коррелирует с тяжестью заболевания [Golan et al., 1984]. Причина, почему именно антитела IgG4 субкласса являются наиболее патогенными, остается неизвестной. При наиболее распространенной форме пузырчатки - вульгарной, аутоантитала направлены к ДСГЗ почти у 100% больных и к ДСП - примерно у 50% больных [Black, 2005]. При листовидной пузырчатке - у всех больных выявляются антитела к ДСП и редко - к ДСГЗ [Amagai, 1999]. На настоящий

момент показано, что присоединение акантолитического процесса на коже при ВП связано с появлением антител к ДСП ¡ТкграШск й а1., 1980].

В настоящее время ген десмоглеина 3 клонирован и полностью охарактеризован. [Ап^а1 й а1., 1991] Определена аминокислотная последовательность белка. Получены рекомбинантные белки, содержащие различные участки молекулы десмоглеина в различных экспрессионных системах [Ата§а1 й а1. 1992, Ата§а1 е1 а1., 1994, ВЬо1 й а1., 1998].

Основным способом лечения пузырчатки является применение кортикостероидных препаратов, которые обладают множеством побочных эффектов [ВузЬуп & 81еттап, 1996].

Хотя достоверно показана роль аутоантител в развитии пемфигуса, истинная этиологическая причина, по-прежнему, остается неясной. Показано, что определенную роль в развитии данного заболевания играют наследственные факторы, поскольку частота встречаемости пемфигуса коррелирует с частотой некоторых аллелей главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) II класса. Кроме того, известны случаи, когда развитие пузырчатки было спровоцировано приемом лекарственных препаратов, вакцинацией, укусами насекомых, инфекциями. Эти факты указывают на роль активации врожденной системы иммунитета и активации эндотелия в патогенезе пузырчатки.

Данная работа посвящена изучению роли активации эндотелия в патогенезе пузырчатки, а также изучению перспективности создания вакцин для лечения пузырчатки на основе индукции конкурирующих 1§01 к непатогенным участкам молекулы десмоглеина 3. Кроме того, нами была разработана модель пузырчатки на конвенционных мышах и на кроликах, что позволяет изучать эффективность различных препаратов и методов лечения пузырчатки. Поэтому актуальность представленной работы заключается в том, что она содержит как новые фундаментальные данные, касающиеся роли активации эндотелиального барьера в патогенезе пемфигуса, так и важна в прикладном аспекте, поскольку

2

полученные данные о протективном действии антител к непатогенным доменам десмоглеина 3 могли бы лечь в основу создания вакцины против пемфигуса. Цель работы: Целью данной работы является изучение патогенности аутоантител к разным доменам десмоглеина 3 в модели пузырчатки на животных.

В рамках данной работы нами были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать и экспрессировать участки гена десмоглеина 3, кодирующие внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена, в E.coli.

2. Получить и охарактеризовать рекомбинантные белки Д1-5 и Д1-2, соответствующие внеклеточной части молекулы десмоглеина 3 и ее первым двум доменам, соответственно.

3. Разработать модель пузырчатки in vivo на мышах и кроликах.

4. Оценить патогенность аутоантител к Д1-2 и Д1-5 in vitro и in vivo.

Научная новизна

1. Впервые в России было осуществлено клонирование генных фрагментов десмоглеина 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.

2. В экспрессионной системе E.coli были получены рекомбинантные белки Д1-2 и Д1-5, содержащие первые два и все пять внеклеточных доменов молекулы десмоглеина 3.

3. Были получены кроличьи антитела к рекомбинантным белкам Д1-2 и Д1-5 и исследована их акантолитическая способность при инкубации с эксплантатами кожи неонатальных мышей.

4. Впервые было показано, что в патогенезе пузырчатки одну из ведущих ролей играет активация клеток эндотелия, что обеспечивает доступ аутоантител в эпидермис.

5. Впервые была разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных мышах, а также на кроликах.

Практическая значимость

1. Нами продемонстрировано антиакантолизное, протективное действие антител, направленных к непатогенным доменам молекулы ДСГЗ. Протективное действие антител к доменам 3-5 молекулы ДСГЗ может лечь в основу создания вакцины на основе соответствующего рекомбинантного белка.

2 Впервые разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных мышах, а также на кроликах, что позволит проводить тестирование новых фармакологических препаратов для лечения пузырчатки.

Апробация работы и публикации Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Отдела иммунологии ИБХ РАН, на пятой международной иммунологической летней школе им Дж.Хэмфри (Пущино, 2000), на VIII всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), на XXII Конгрессе Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Париж, 2003).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ: в «Вестнике дерматологии и венерологии», в материалах российских и зарубежных научно-практических конференций и съездов, из них 5 - в центральной печати. Внедрение в практику Результаты настоящего исследования внедрены в практику Отдела иммунологии ИБХ РАН и кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета РГМУ и КВКД №1 КЗ г. Москвы. Полученные в данной работе фрагменты генов, кодирующие домены 1-2 и 1-5 молекулы ДСГЗ, были клонированы в дрожжевой системе экспрессии и получены дрожжевые белки. На основе дрожжевого белка, содержащего 1-2 домены

ДСГЗ, разработан диагностикум для анализа циркулирующих аутоантител к десмоглеину человека (диссертация И.С.Дзуцевой, 2005).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков, 9 таблиц. Список литературы включает 143 источника, из которых 138 иностранные.

Материалы и методы

Антигены Рекомбинантный белок Д1-2, соответствующий двум дистальным доменам белка ДСГЗ человека, и Д1-5, соответствующий пяти внеклеточным доменам белка ДСГЗ человека, были получены в бактериях E.Coh. Суммарную РНК выделяли из клеток линии кератиноцитов человека НаСаТ стандартным методом. Кодирующая ДНК была получена обратной транскрипцией по стандартной методике. Полученную кДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными для ДСГЗ человека, для амплификации фрагмента гена, кодирующего белок Д1-5. Полученный фрагмент был клонирован в векторе pBluescript SK(+). Далее, фрагменты гена ДСГЗ, кодирующие Д1-2 и Д1-5, были переклонированы в экспрессионный вектор рЕТ22Ь(+). Выделение рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5 проводили с помощью Ni-хроматографии.

Штаммы Е coli, использованные в данной работе Для клонирования фрагмента гена ДСГЗ в плазмиде pBluescript SK(+) использовали компетентные клетки штамма Е coli XL-1 Blue. Для клонирования фрагментов гена ДСГЗ в плазмиде рЕТ22Ь(+) использовали компетентные клетки штамма E.coli DH5a. Для наработки рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5 использовали компетентные клетки штамма Е coli, BL21 (DE3).

Сыворотки больных ВП Сыворотки от 25 больных ВП были получены в НИИ ЦКВИ. Донорскую кровь брали у студентов РГМУ. Сыворотки пулировали. Получение кроличьей антисыворотки Для получения антител, специфичных к ДСГЗ человека, проводили иммунизацию кроликов в/м рекомбинантными белками Д1-2 (1мг) и Д1-5 (0,5 мг) в смеси с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизация проводили 7 раз с интервалами 1-2 недели до получения высоких титров антител. Сыворотку хранили замороженной при -20°С до использования. Выделение фракции IsG из раствора эуглобулинов Выделение IgG из сывороток здоровых доноров, больных ВП и иммунных кроликов проводили стадийно: фракцию эуглобулинов получали методом высаливания с помощью (NH^SC^, а затем на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой по инструкции производителя. Полученные фракции были диализованы против ФБ, сконцентрированы центрифугированием на конусах и стерилизованы фильтрованием через фильтры Millipore 0,22 мкм. Полученные белки разливали на аликвоты и хранили замороженными при -20°С до использования.

Ni-аффинная хроматография рекомбинантных белков Хроматографическое выделение рекомбинантных белков осуществляли с использованием сорбента Ni-NTA агарозы согласно рекомендации производителей.

Оценка продукции антиген-специфических IsG антител Продукцию IgG антител, специфических к рекомбинантным белкам Д1-2 и Д1-5, оценивали методом твердофазного ИФА. Белки наносили на 96-луночные планшеты в концентрации 10 мкг/мл. В качестве проявляющих использовали антитела против IgG человека, кролика или мышей, конъюгированные с пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин. Конечный результат оценивали по разности поглощения при длинах волн 690 и 492 нм. Анализ участия IsG из сывороток иммунных кроликов в акантолизе кожи Для постановки реакции акантолиза in vitro использовали IgG, полученные из

сыворотки крови кроликов, иммунизированных рекомбинантными белками Д1-2 и Д1-5. В качестве положительного контроля использовали очищенные IgG, выделенные из пулированной сыворотки крови больных пузырчаткой. Неонатальную кожу получали от мышат линии BALB/c (2-3 день после рождения) стерильно в ламинаре. Для получения культуры эксплантатов кожи ее нарезали на фрагменты размером 5x5 мм2 и помещали в среду DMEM с добавлением 1% ФС в лунки 24-луночного планшета. Эксплантаты кожи инкубировали 2 суток в инкубаторе при 37°С в присутствии различных антител. По окончании инкубации эксплантаты подсушивали и фиксировали 10% формалином в фосфатном буфере.

Модель пузырчатки на мышах Для индукции антител к ДСГЗ мышей линий BALB/c, СВА и C57BL6 иммунизировали 7 раз Д1-2 в ПАФ с интервалом в одну неделю дозой 10 мкг/мышь. Мониторинг антител проводили с помощью ИФА еженедельно, начиная с третьей иммунизации. По достижении высоких титров антител к Д1-2 (без видимых проявлений акантолиза) мышам вводили подкожно в холку 50 мкл инактивированных прогреванием бактерий Micrococcus Lysodeikticus (ML).0 Акантолиз, выявляемый покраснением кожи и появлением внутриэпидермального апоптоза, развивался в течение 48 часов. Модель пассивного пеуеноса пузырчатки на кроликах Кроликам вводили в ушную вену 40 мг IgG от больных ВП или 40 мг кроличьих анти Д1-2 IgG. Для индукции воспаления вводили 200 мкл инактивированных бактерий ML в четыре участка на коже спины. Акантолиз развивался в течение 3-4 суток и проявлялся в виде формирования пузырей, покраснения, шелушения кожи на спине, формирования эрозий в ушных раковинах, а также в виде гиперкератоза, сопровождаемого апоптозом клеток эпидермиса, что было показано с помощью гистологии.

Гистология Гистология кожи выполнена Т.В.Абрамовой (ВОНЦ, Москва). Гистологические срезы окрашивались гематоксилин-эозином. Анализ

7

гистологических срезов был проведен двумя независимыми исследователями вслепую. Образцы кожи больных получены в НИИ ЦКВИ из архива. Инактивированные бактерии Грамположительные бактерии Micrococcus Lysodeikticus (ML) наращивали в LB среде, дополненной 2% глюкозой при 28°С, при встряхивании 250 об/мин. Клетки выращивали до оптической плотности OD6oo=0,6. Затем прогревали при 60°С, 30 мин , отмывали ФБ и замораживали при -20 °С.

Статистический анализ Статистический анализ проводили с использованием пакета MS Office Excell по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследований

Получение рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5 Для клонирования в векторе pBluescript SK(+) были выбраны два фрагмента гена ДСГЗ: один, кодирующий все пять внеклеточных доменов белка ДСГЗ, и второй - кодирующий только два внеклеточных домена молекулы. Встраивание проводилось по сайту EcoV. Клонированная последовательность была секвенирована. Было показано, что клонированная последовательность соответствует последовательности, кодирующей внеклеточные домены белка ДСГЗ, за исключением нескольких несущественных замен.

Для клонирования участков гена ДСГЗ в экспрессионном векторе рЕТ-22(+) мы использовали рекомбинантную плазмиду как матрицу для ПЦР. Встраивание амплифицированных фрагментов в плазмиду проводилось по сайту BamHI. Последовательности обратных праймеров кодировали 6 остатков гистидина, что давало возможность провести очистку рекомбинантных белков с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. В результате реакции ПЦР были получены продукты нужного размера. Продукты ПЦР подвергались очистке, переосаждению и последующей обработке рестриктазами. После этого проводилось лигирование ПЦР продуктов и вектора рЕТ-22, рестрицированного

8

по сайту BamHI. Для трансформации в качестве компетентных клеток использовались клетки штамма E.coli DH5a. В результате рестриктного анализа полученных клонов, были отобраны те, которые содержали нужные нам вставки. Эти клоны были использованы для получения препаративного количества рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5.

Получение рекомбинантных белков Д1-2 иД1-5 Для получения рекомбинантных белков Д1-2 и Д1-5 трансформировали клетки штамма E.coli BL-21SK плазмидной ДНК из отобранных нами клонов. Полученные трансформанты использовались для наработки рекомбинантных белков. Для определения молекулярных масс полученных белков использовали электрофорез в 15% ПААГе. Размер белка Д1-2 составил 35 кД, а размер белка Д1-5 примерно 70-75 кД, что соответствовало ожидаемому размеру белков (Рис.1). Оценка продукции кроличьих антител на рекомбинантные белки Д1-2 и Д1-5 Полученными рекомбинантными белками проводили иммунизацию кроликов. Для оценки уровня продукции антител в кроликах использовали иммуно-ферментный анализ. На рисунке 2 приведены результаты продукции антител IgG класса к ДСГЗ после 6-кратной иммунизации кроликов рекомбинантными белками. В результате 6-7 кратной иммунизации титры антител к Д1-2 достигали 1:100000, а к Д1-5 - примерно 1:20000, что свидетельствует о меньшей иммуногенности фрагмента Д1-5 по сравнению с фрагментом Д1-2. Из сывороток иммунных кроликов, а также из сывороток больных ВП и доноров выделяли фракции: нормальные иммуноглобулины G человека (НЧИ), иммуноглобулины G от больных ВП (ВПИ), кроличьи IgG, специфичные к белку Д1-2 (КД1-2), и кроличьи IgG, специфичные к белку Д1-5 (КД1-5).

Анализ патогенности IsG различной специфичности Для постановки реакции акантолиза in vitro использовали эксплантаты кожи (ЭК) неонатальных мышей.

Дорожка 1: Рекомбинантный белок Д1-2;

1 ' Д-.'"л 66 го 45 ГО .^у/;5;".'''*?Г- : 31Ш Дорожка 2: Рекомбинантный белок Д1-5; Дорожка 3: Лизат неактивированной культуры с рекомбинантной плазмидой,

1 21 го кодирующей 1-5 домены ДСГЗ;

14 ГО Дорожка 4: Белковый маркер.

Рис.2.Продукция 1§0 антител кроликами, иммунизированными 5-кратно Д1-2 (светлые кружки) или Д1-5 (темные кружки). В качестве подложки использован рекомбинантный белок Д1-5 (правое окно) или Д1-2 (левое окно).

Для оценки патогенности различной специфичности в культуры ЭК добавляли очищенные антитела или их смеси. Акантолиз кожи оценивали по 4-х балльной системе: 0 - нет акантолиза, 1 - единичные участки отслоения эпидермиса от базальной мембраны; 2 - множественные неглубокие участки отслоения эпидермиса; 3 - сливные участки отслоения эпидермиса от базальной мембраны; 4 - тотальное отслоение эпидермиса по всей длине эксплантата. Было показано, что антитела КД1-2 и ВПИ вызывали акантолиз кожи, а НЧИ и КД1-5 нет (Таблица 1, Рис.3).

Таблица 1

Оценка степени акантолиза в эксплантатах кожи неонатальных мышей, вызванным из различных сывороток

igG, добавленные в культуру Акантолиз

1 Контроль (ФБ) 0

2 .. , . НЧИ (нормальные антитела доноров) 0

3 ВПИ (антитела от больных) 4+

4 КД1-2 (кроличьи антитела к Д1-2) 3+

5 КД1-5 (кроличьи антитела к Д1-5) 0

Естественно, что при добавлении антител ВПИ наблюдался акайтолиз (Рис.ЗБ), это их основное патогенное действие. При добавлении к ЭК кроличьих антител, распознающих домены 1-2 ДСГЗ (КД1-2) (Рис.3В), также наблюдалась ярко выраженная картина супрабазального акантолиза, что свидетельствует о патогенности кроличьих антител к Д1-2. Напротив, ^О из сыворотки кроликов, иммунизированных рекомбинантным белком, содержащим с 1 по 5 домены ДСГЗ (КД1-5), не вызывали акантолиза (Рис.ЗГ) также, как не вызывали акантолиз нормальные (Рис.ЗА). Отсутствие акантолиза в культуре ЭК с антителами КД1-5 было неожиданным, поскольку эти антитела направлены к ДСГЗ.

Для объяснения полученных результатов были выдвинуты две гипотезы: Гипотеза 1. Антитела КД1-5 менее патогенны потому, что титр специфических антител сыворотки, из которой они были выделены, ниже в 5 раз, чем титр сыворотки к Д1-2.

Гипотеза 2. С другой стороны, в составе антисыворотки к Д1-5 есть антитела к непатогенным доменам ДЗ-5. Эти антитела могут конкурировать с АТ к патогенным доменам за связывание с молекулой десмоглеина 3 и, таким образом, препятствовать развитию акантолиза.

Для проверки 2-ой гипотезы в следующем эксперименте использовали культуры ЭК, в которые добавляли смесь патогенных и потенциально лротехтивных (Таблица 2, Рис.4).

Рис.3,Гистологические срезы кожи неонатальных мышей после инкубации (А) с 1§0, выделенными из пула сывороток здоровых доноров, (Б) с выделенными из пула сывороток больных ВП, (В) с 1еО, выделенными из сыворотки кролика, иммунизированного белком Д1-2, (Г) с ^С, выделенными из сыворотки кролика, иммунизированного белком Д1-5. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200.

В этом случае антисыворотка к Д1-5 вызывала прямое протективное действие и подавляла акантолиз, вызванный антителами больных ВП {Рис.4).

12

Таким образом, косвенно была подтверждена гипотеза 2. Для прямого подтверждения этой гипотезы требуется получение белка ДЗ-5 и антител к нему, что будет сделано в дальнейшем.

Таблица 2

Протективный эффект антител к Д1-5 при совместном добавлении с патогенными антителами из сывороток больных ВП

добавленные в культуру ЭК 1дС, добавленные в культуру ЭК для протекции Акантолиз Протективный эффект

1 Контроль - 0

2 ВПИ - 4+

3 ВПИ КД1-2 4+ Нет

4 ВПИ КП1-5 0 Есть

Изучение роли активаиии эндотелия в патогенезе пузырчатки Следующая часть работы была посвящена изучению роли активации эндотелия в патогенезе пузырчатки. Известно, что у достаточно большого количества здоровых людей обнаруживаются низкие титры аутоантител к ДСГЗ без видимого проявления болезни.

Так, в эндемичных по пемфигусу областях Бразилии повышенный уровень аутоантител к ДСП наблюдается у 30% здоровых родственников больных пузырчаткой. С большой вероятностью можно предположить, что для индукции заболевания необходимо, но не достаточно, наличия циркулирующих аутоантител к десмоглеинам. Барьером между аутоантителами, а также клетками иммунной системы и эпидермисом является эндотелий сосудов. В норме активация клеток эндотелия необходима для миграции макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов в ткани. В норме иммуноглобулины ОиМклассов циркулируют в крови. Интенсивное поступление внеклеточной жидкости,

содержащей в ткани происходит при активации эндотелия, что происходит при попадании инфекции.

Рис.4. Прогективный эффект антител из сыворотки против белка Д!-5. Гистологические срезы кожи неонатальных мышей после инкубации (А) с патогенными антителами из сыворотки больных ВП; (Б) совместной инкубации с антителами из сыворотки больных ВП и из сыворотки кролика, иммунизированного белком Д1-2 (Б) или (В) Д1-5, или (Г) с антителами из сыворотки здоровых доноров. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200,

Это и может являться одним из триггерных механизмов пузырчатки, 'Именно

активацией эндотелия можно объяснить случаи пузырчатки, вызванные

14

инфекциями, лекарственными препаратами, укусами насекомых; Активация эндотелия является Одним из компонентов иммунного ответа на патогены, например, па попадание в кожу бактерии.

Для анализа участия воспаления в патогенезе пузырчатки использовали мышей -¡рек разных линий. Воспаление вызывали с помощью инъекции инактивированных бактерий взрослым мышам, предварительно иммунизированных Д1-2 и имеющих высокие титры антител к Д1-2 (Рис,5), Мыши линии С57ВЬ6 быстрее вырабатывали аутоанштела к ДСГЗ (Рис,6). Поскольку ДСГЗ мыши и человека имеют высокую степень гомологии, то индукция антител к этому белку как у мышей, так и у кроликов, требует многократных иммунизаций. После 2-х иммунизации достоверный уровень антител к ДСГЗ выявляли только у С57В1.6 мышей. Всего было проведено 7 иммуннзаций, при этом никаких признаков патологии кожи выявлено не было, что определяли как визуально, после депиляции шерсти на спине, так и с гюмошью гисгологаИ.

Рис.5. Схема индукции пузырчатки у мышей. Мышей иммунизировали многократно белком Д1 -2. что вызывало формирование аутоантител к этому белку, но не вызывало патологии. После достижения высокого титра антител однократная инъекция ннактивированных бактерий вызывала воспаление кожи, которое также провоцировало акантолиз кожи мышей, выявляемый на гистологических срезах.

Иммунизация Д1-2. Определение Введение бактерий, еженедельно, 7 раз ант ител 2 раза

Забор кожи на

гистологию

Рис.6. Продукция антител к Д1-2 мышами различных линий после 3, 4 и 5 иммунизаций. Разведение сыворотки 1:500.

Группы иммунизированных животных далее разделили пополам и половине ввели в верхнюю часть спины ин активн ро ванные грам-положительные непатогенные бактерии Micrococcus lyzodeikticus (ML) (Рис.5). Группе интактных контрольных мышей вводили только ML. Группе иммунных контрольных мышей вводили физиологический раствор вместо бактерий. Инъекции проводили раз в день в одно и тоже место на спине, в течение двух дней. У всех мышей удаляли шерсть со спины. Начиная со второго дня на сшше мышей всех линий опытной группы наблюдали гиперемию и микроэрозии. На 3 и 4 день после введения ML забирали биоптаты кожи для гистологии из области, расположенной рядом с местом введения бактерий. На гистологических срезах биоптатов мышей двух контрольных групп патологии не наблюдали. Однако в экспериментальной группе у мышей всех трех линий, иммунизированных Д1-2 и получивших дополнительную инъекцию ML, выявили интенсивный апоптоз эпидермиса с признаками нарушения рядности эпидермиса и образования щелей (Рис.7). Наиболее сильные проявления акантолиза наблюдали у мышей линии C57BL/6, у которых также был и самый

16

высокий уровень антител к ДСГЗ в крови. Таким образом, в данной модели введение убитых бактерий ML мышам, иммунизированным ДСГЗ, приводило к развитию патологии эпидермиса кожи, характерной для пузырчатки. Модель пассивного переноса пузырчатки на кроликах В описанной мышиной модели пузырчатки в патогенезе заболевания принимают участие Т-клетки, В-клетки и местное воспаление. Участие Т-клеток в этом процессе является принципиальным, поскольку переключение B-клеток на синтез IgG полностью зависит от помощи антиген-специфичных Т-клеток. Однако известно, что эффекторным звеном в патогенезе пузырчатки являются аутоантитела. Поэтому было важно выяснить, необходимо ли участие Т-клеток в данной модели пузырчатки на животных для развития эффекторного звена заболевания. С этой целью был проведен эксперимент на кроликах с пассивным введением антител к ДСГЗ. Кролику №1 вводили внутривенно 40 мг IgG, полученных от больных ВП, кролику №2 вводили столько же IgG, ранее полученных от кролика, иммунизированного белком Д1-2, кролику №3 вводили 40 мг IgG нормальных доноров, контрольному кролику вводили физиологический раствор. Наблюдение за состоянием кожи проводили на участке спины с удаленной шерстью. Наблюдение за состоянием слизистых оболочек проводили по ушной раковине. Никаких признаков заболевания в течение недели после введения антител ни у одного из кроликов не наблюдали. После этого всем кроликам ввели 200 мкл суспензии инактивированных ML в четыре участка (по углам квадрата) на спине. После введения ML у кроликов №1 и №2, но не у кроликов №3 и №4 через 3 дня была заметна гиперемия, а на 4-5 день возникли эрозии на коже, особенно в тех местах, которые были расчесаны.

У кролика №2 процесс был более выражен: развивались обширные эрозийные бляшки на спине, эрозии на слизистых ушей и развивался акантолиз, что было видно на гистологических препаратах (Рис.8).

иммунизация Иммунизация и

Рис 7. Индукция акантолиза (Б и Е) и агюптоза (Г) у мышей линий ВАЬВ/с (А и Б). СВА (В' и Г) и ( 57В1./6 (Д и Е) только иммунизированных Д1-2 (А. В и Д) или иммунизированных и получивших 2 инъекции бактерий МЬ (Б, Г и Е). Стрелками указаны зоны акантолнча и апоптотмческис клетки. Окраска — гематоксилин-эозин. Увеличение х400.

Рис.S. Модель пузырчатки на кроликах. А и Б. Спина и ухо кролика, которому вводили только бактерии (кролик №4), В и Г. Спина и ухо кролика №2 после внутривенного введения кроличьих антител к Д1-2 к последующего подкожного введения бактерий. Места введения бактерий ML указанны стрелками. Эрозии развивались спустя 4-5 дней после внедения бактерий только у кролика, получившего предварительно в/в антитела к Д] -2.

[

Выводы:

!, Проведено клонирование и экспрессия в бактериях E.coli участков гена десмоглеинз 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.

2. Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки Д1-5 и Д1-2, соответствующие внеклеточной части молекулы десмоглеина 3 и ее первым двум доменам.

3. Показано в модели in vitro на эксплантатах кожи неонатальных мышей, что антитела к Д1-5 блокируют акантолиз, вызванный патогенными аутоантителами к десмоглеину 3 из сывороток больных ВП.

4. Разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных взрослых мышах и кроликах.

5. Показано в модели на животных, что для индукции акантолиза эпидермиса кожи требуется наличие циркулирующих аутоантител к ДСГЗ и локальное воспаление кожи, которое и является триггером пузырчатки.

6. В модели пассивного переноса антител к Д1-2 на кроликах выявлено, что эффекторным звеном патогенеза являются аутоантитела, действие которых реализуется только в случае неспецифического воспаления кожи.

Практические рекомендации

1. Полученные в данной работе фрагменты гена ДСГЗ, кодирующие домены 1-2 и 1-5 белка, были переклонированы в дрожжевую систему, и получены дрожжевые белки. На основе дрожжевого белка Д1-2 разработан диагностикум для анализа циркулирующих аутоантител к десмоглеину 3 человека, который может быть внедрен в практику здравоохранения России. В настоящее время в мире имеется диагностикум для выявления антител к десмоглеинам на основе инсектных белков. В России нет аналогичной тест-системы.

2. Показана возможная роль локального воспаления кожи и слизистых в патогенезе пузырчатки. Рекомендуется провести исследование уровня молекул адгезии в крови больных пузырчаткой. При наличии повышенного уровня таких молекул как E-selectin, ICAM1 и VCAM использование ингибиторов этих молекул в период ремиссии может предупредить рецидив заболевания.

3. Полученные данные по протективному эффекту антисыворотки к Д1-5 позволяют рекомендовать проведение исследований по анализу протективною эффекта антител к ДЗ-5.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Свирщевская Е.В., Матушевская Е.В., Коцарева О.Д. Идентификация нового антигена нормального эпидермиса, ассоциированного с дерматозами различного генеза. Вестник дерматологии и венерологии, 2001, Т.2, с.4-7.

2. Матушевская Е.В., Коцарева О.Д., Багаева JI.B., Дзуцева И.Р., Лысенко A.A. Блокада акантолиза эпидермиса при вульгарной пузырчатке протективными антителами. Вестник дерматологии и венерологии, 2003, т.4, с.4-7.

3. Свирщевская Е.В., Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Матушевская Е.В. Роль эндотелиальных клеток в патогенезе пузырчатки: экспериментальная модель. Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии, 2006, т.1, с.10-17.

4. Kotsareva O.D, Viskova N.J., Fedorichenko M.S, Svirshchevskaya E.V. А comparative study of antibodies to epidermal antigens in normal subjects, pemphigus and other form dermatitis to epidermal antigens. Материалы пятой международной иммунологической летней школы им Дж.Хэмфри (15-21 сентября, 2000, Пущино), с.48.

5. Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В. Роль эндотелиального барьера в патогенезе pemphigus vulgaris, Медицинская иммунология. 2006, т.8, №2-3, с. 154.

6. Коцарева О.Д., Марченко А.Н., Беневоленский C.B., Дзуцева И.Р., Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В. Создание тест-системы для диагностики вульгарной пузырчатки, Медицинская иммунология. 2002,

т. 4, №2, с.151.

7. Kotsareva O.D, Viskova N.J., Svirshchevskaya E.V., Matushevskaya E.V, Dzutseva I.R, Lysenko A.A. High affinity antibodies to proximal domains of extracellular desmoglein 3 protect from acantolysis induced by pemphigus autoantibodies. Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology, 2003. 7-11 June, Paris, Abs. p. 148.

8. Лысенко A.A., Коцарева О.Д., Мушенкова H.B., Дзуцева И.Р., Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В. Создание модели пузырчатки на мышах. Медицинская иммунология. 2004, т. 6, №3-5, с.238.

9. Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В., Вискова Н.Ю., Коцарева О.Д. Иммунологические аспекты патогенеза и кортикостероидная терапия больных пузырчаткой. VIII всероссийский съезд дерматовенерологов. Москва, 2001, с.23.

Принято к исполнению 19/01/2007 Исполнено 19/01/2007

Заказ № 41 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

ML бактерии Micrococcus Lysodeikticus

PBS фосфатный буфер

RT обратная транскриптаза

PVA антиген вульгарной пузырчатки pemphigus vulgaris antigen)

SDS додецилсульфат натрия

Th 1, Th2 хелперы 1, хелперы 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.6

ВЫВОДЫ

1. Проведено клонирование и экспрессия в бактериях E.coli участков гена десмоглеина 3, кодирующих внеклеточную часть молекулы и ее первые два домена.

2. Получены и охарактеризованы рекомбинантные белки Д1-5 и Д1-2, соответствующие внеклеточной части молекулы десмоглеина 3 и ее первым двум доменам.

3. Показано в модели in vitro на эксплантатах кожи неонатальных мышей, что антитела к Д1-5 блокируют акантолиз, вызванный патогенными аутоантителами к десмоглеину 3 из сывороток больных ВП.

4. Разработана модель пузырчатки in vivo на конвенционных взрослых мышах и кроликах.

5. Показано в модели на животных, что для индукции акантолиза эпидермиса кожи требуется наличие циркулирующих аутоантител к ДСГЗ и локальное воспаление кожи, которое и является триггером пузырчатки.

6. В модели пассивного переноса антител к Д1-2 на кроликах выявлено, что эффекторным звеном патогенеза являются аутоантитела, действие которых реализуется только в случае неспецифического воспаления кожи.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор приносит благодарность Кузину И.И. и Багаевой Л.В. за помощь в клонировании фрагмента гена dsg3 в плазмидном векторе pBluescript-SK(+), А.Н.Марченко и С.В.Беневоленскому за помощь в клонировании генных фрагментов dsg3 в плазмидном векторе рЕТ-22, М.А.Шевченко за помощь в постановке гель-электрофореза, А.А.Лысенко за помощь в иммунизации мышей, а также Т.В.Абрамовой (ВОНЦ, Москва) за подготовку гистологических препаратов.