Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение минерального состава лекарственного растительного сырья, содержащего эфирные масла

На правах рукописи

НГУЕН ТХИ НЬЫ КУИНЬ

ИЗУЧЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ЭФИРНЫЕ МАСЛА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 5 ДПР ¿013

Москва - 2013

005057805

005057805

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, доцент Гравель Ирина Валерьевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский

университет им. И.М. Сеченова Прокофьева Вера Ивановна

кандидат фармацевтических наук, руководитель испытательного центра

ОАО «Валента Фарм» Петров Николай Витальевич

Ведущая организация:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « /5» 2013 г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан« » 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09 доктор фармацевтических наук,профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Лекарственное растительное сырье (JIPC), содержащее эфирные масла широко используется в мировой медицинской практике для лечения и профилактики заболеваний. Вместе с биологически активными веществами фармакологическое действие обусловлено комплексом минеральных веществ отдельных видов сырья, которые заготавливают как от дикорастущих, так и культивируемых растений в разных регионах. Известно, что накопление эфирного масла в растениях, его качественный и количественный состав варьирует в зависимости от экологических условий в районах произрастания (Кириченко Е.Б., 2008; La Dinh Moi, 2001).

Влияние загрязнения окружающей среды может обусловливать накопление экотоксикантов в сырье лекарственных растений. Подобного рода исследования проводились в ряде регионов России, а также в некоторых странах Европы, Африки, Америки и Азии (Дабахов М.В., 2005; Евсеева С.Б., 2007). Немногочисленные публикации указывают на возможное накопление в ЛРС Вьетнама таких металлов, как РЬ и Cd (Thanh Nhu, 2012). Поэтому изучение содержания токсичных элементов и минеральных веществ в сырье этого региона является актуальным. Эфиромасличные растения широко распространены и используются в фармацевтической практике разных стран, что обуславливает необходимость проведения сравнительных исследований лекарственного растительного сырья отдельных регионов. Цель исследования. Проведение комплексных теоретических и экспериментальных исследований по изучению минерального состава и эфирного масла широкоиспользуемых видов сырья лекарственных растений. Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение фармакопейных требований к качеству эфиромасличного сырья в России и Вьетнаме, особенностей накопления токсичных и эссенциальных элементов в ЛРС и современных методов их анализа.

2. Разработать оптимальные условия проведения методики пробоподготовки ЛРС для количественного определения содержания Хп, Си, РЬ, Сс1 в ЛРС методом инверсионной вольтамперометрии.

3. Провести валидацию методики определения Хп, Си, РЬ, Сё в лекарственном растительном сырье и настоях методом инверсионной вольтамперометрии.

4. Изучить методом инверсионной вольтамперометрии минеральный состав сырья разных морфологических групп (мяты перечной, мяты полевой, аира болотного), заготовленных в разных районах Вьетнама и России и провести их сравнительный анализ.

5. Разработать оптимальные условия определения Zn, Си, РЬ, Сё в настоях и провести их анализ.

6. Изучить химический состав эфирного масла из сырья, собранного в разных климатических и экологических условиях.

Научная новизна полученных результатов.

Впервые проведено сравнительное изучение микроэлементов (2п, Си) и токсичных металлов (РЬ, Сф в отдельных видах сырья лекарственных растений семейств Ьат/асеае и Агасеае Вьетнама и России с использованием высокочувствительного инструментального метода анализа - инверсионной вольтамперометрии. Предложена методика, подобраны оптимальные условия определения тяжелых металлов {Тп, Си, РЬ, Сс1) в лекарственном растительном сырье и настоях, проведена валидация методики количественного определения.

Показано соответствие лекарственного растительного сырья исследованных видов допустимым уровням содержания токсичных металлов. Изучен переход тяжелых металлов из лекарственного растительного сырья в лекарственные формы (водные извлечения). Разработана методика испытаний настоев и проведена ее валидация.

Дополнены данные о диагностических признаках при микроскопическом исследовании цветков и стеблей мяты полевой (визуализированы простые и головчатые волоски, железки, кристаллы). Проведена сравнительная оценка

качества показателей и их норм эфирномасличных видов сырья, собранного в России и во Вьетнаме. Методами тонкослойной и газовой хроматографии показаны различия состава эфирных масел листьев мяты перечной и травы мяты полевой; корневищ аира болотного, заготовленных в России и Вьетнаме. Практическая значимость работы. Методика определения тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье методом инверсионной вольтамперометрии апробирована в производстве и при контроле качества препаратов из лекарственных растений фармацевтической компанией «Назап^егтарЬагт» во Вьетнаме (акт внедрения от 05.03.2013).

Полученные результаты сравнительной оценки качества листьев мяты перечной, травы мяты полевой и корневищ аира болотного использованы в учебном процессе на кафедрах фармакогнозии ГБОУ ВПО Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия (акт внедрения от 26.03.2013) и ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет (акт внедрения от 27.03.2013). Положения, выносимые на защиту.

- Результаты оптимизации условий пробоподготовки, анализа и валидации методики количественного определения тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье методом инверсионной вольтамперометрии;

- Результаты исследований по сравнительному изучению минерального состава в сырье и водных извлечениях из листьев мяты перечной, травы мяты полевой, корневищ аира болотного;

- Результаты исследований по сравнительной оценке качества фармакопейных видов сырья мяты перечной, мяты полевой, аира болотного заготовленных в России и Вьетнаме;

- Результаты исследований сравнительного изучения состава эфирных масел сырья, собранного в разных климатических зонах (Вьетнам, Россия).

Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным планом кафедры фармакогнозии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по теме: «Разработка современных

технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (код темы 24.10.07 проблема № 1056 АМН РФ, номер госрегистрации 01.2.006 06352).

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (Ярославль, 2010г.), научно-практической конференции «Проблемы сохранения биоразнообразия в северных регионах» (Апатиты, 2010г.), научно-практической конференции молодых ученых кафедры фармакогнозии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова «Актуальные вопросы фармакогнозии» (Москва, 2011г.), научно-практической конференции НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова «Стандартизация готовых лекарственных средств» (Москва, 2011г.), XXI Московской международной гомеопатической конференции «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» (Москва, 2011г.), научно-методической конференции «Гаммермановские чтения» (Санкт-Петербург, 2011г.), научной конференции профессорско-преподавательского состава «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 10 работ, в том числе 3 работы в рецензируемых журналах перечня, рекомендованного ВАК. Личный вклад автора. Автором проведен анализ отечественных и зарубежных литературных источников, нормативной и справочной документации. Вся экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно. Автором работы оптимизирована пробоподготовка и показана возможность определения тяжелых металлов (2п, Си, РЬ, Сё) в лекарственном растительном сырье и водных извлечениях методом инверсионной вольтамперометрии; проведена валидация методики. С использованием этой методики изучен минеральный состав сырья и водных извлечений из него. Проведено сравнительное информационно-

аналитическое исследование фармакопейных показателей качества лекарственного растительного сырья на примере травы мяты полевой и корневищ аира болотного флоры Вьетнама. Изучены диагностические признаки этих видов сырья с использованием макроскопического и микроскопического методов исследований. Получено эфирное масло видов мяты и аира болотного методом перегонки с водяным паром и исследован его химический состав методами тонкослойной и газовой хроматографии.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 6 и 7 паспорта специальности фармацевтическая химия, фармакогнозия. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений.

Результаты эксперимента обобщены 58 таблицами и проиллюстрированы 49 рисунками. Библиографический указатель включает 117 литературных источников, в том числе 80 на русском и 37 на иностранных языках.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе обобщены литературные данные по изучению минерального состава лекарственного растительного сырья, содержащего эфирные масла; проанализированы фармакопейные требования к качеству лекарственного растительного сырья во Вьетнаме и России; изучены методы микроэлементного анализа. Вторая глава включает описание объектов и методов исследования. Глава третья посвящена оптимизации методики пробоподготовки и анализа методом вольтамперометрии и ее валидации; в ней изложены результаты определения тяжелых металлов в сырье видов мяты и аира болотного. Четвертая глава содержит результаты проведения валидации

методики количественного определения в настоях тяжелых металлов и определения их концентраций в настоях из сырья мяты и аира болотного. В пятой главе представлены результаты сравнительного анализа фармакопейных требований к качеству JIPC во Вьетнаме и России. Шестая глава посвящена изучению компонентного состава эфирных масел мяты перечной, мяты полевой, и аира болотного, собранных в России и Вьетнаме. В разделах Обсуждение результатов и Выводы представлены заключительные результаты и выводы по работе. В Приложениях представлены материалы информационно-аналитических исследований качества эфиромасличного сырья, результаты проведения валидации, акты внедрения результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объектами исследования были листья мяты перечной (Folia Menthae piperiíae), трава мяты полевой (Herba Menthae arvensis) и корневища аира болотного (Rhizomata Acori calami), собранные в России (Ботанический сад ВИЛАР, Московская область, Краснодарский край) и Вьетнаме (окрестности г.Хошимин район 12) в 2009 - 2011 годах, а также образцы этих видов сырья, реализуемые через аптечную сеть в России и Вьетнаме. Сбор образцов осуществляли в местах, удаленных от крупных транспортных магистралей и промышленных предприятий, в период максимального накопления действующих веществ в соответствии с инструкциями по заготовке JIPC.

Изучены настои из исследованных образцов сырья. Настои готовили по методике в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI издания (ГФ XI). Всего исследовано 46 образцов сырья, 46 образцов настоев. При изучении минерального состава образцов проведено 736 элементоопределений.

Статистическая обработка результатов осуществлялась в соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI издания (ГФ XI).

Компонентный состав эфирных масел мяты и аира болотного изучали методом ТСХ на пластинках «Silufol» после детектирования 1% раствором ванилина и 10% спиртовым раствором серной кислоты; методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) на приборе Focus GC с ISQ (Италия) с использованием кварцевой капиллярной колонки длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фенилметилсилоксановой фазой толщиной пленки 0,25 мкм.

Исследования содержания тяжелых металлов (Cd, Pb, Си, Zn) проводили методом инверсионной вольтамперометрии на твердом углеситалловом электроде с линейной разверткой потенциала, для испытаний использовали анализатор вольтамперометрический АВА-3 (зав. № 166, выпуск 2009 г., компания «Буревестник», Россия). Исследования минерального состава проводили на базе промышленно — санитарной лаборатории ФГБУЗ Государственный центр гигиены и эпидемиологии ФМБА России (зав. лабораторией Максименко JI.B.) при участии кандидата химических наук Алексеевой H.A.

Разработка оптимальных условий пробоподготовки, валидация методики определения тяжелых металлов в JIPC и настоях методом инверсионной вольтамперометрии

Проведенные исследования показали, что подготовку проб ЛРС к анализу следует проводить комбинацией методов «сухой» и «мокрой» минерализации. Для каждого образца проводили подготовку двух параллельных проб и холостой пробы. В кварцевый стаканчик помещали навеску пробы массой около 0.500 г, добавляли 1 мл HN03 конц. и высушивали на электроплитке при температуре 250°С досуха, затем стаканчик с остатком пробы помешали в муфельную печь, предварительно нагретую до 250 °С. Температуру муфельной печи постепенно повышали до 400 °С, увеличение температуры проводили на 50 °С через каждые 30 мин. Пробу выдерживали в муфельной печи в течение 1 часа при температуре 400 °С. После озоления кварцевый стаканчик с остатком

пробы вынимали из муфельной печи и охлаждали. Если остаток пробы был темным, неоднородным по цвету, с темными частицами, то к охлажденному остатку добавляли 1 мл НЫОз конц., устанавливали стаканчик на электроплитку и выпаривали при 150°С досуха. После этой операции стаканчик вновь помещали в муфельную печь, нагретую до 400°С, и выдерживали в течение 1 часа. После повторного озоления пробы, если остаток был светлым, однородным по цвету, без темных частиц, то к охлажденному стаканчику с пробой добавляли 0,5 мл НЫ03 конц., устанавливали на электроплитку и выпаривали при температуре 100 °С до влажных солей. Затем добавляли 2 мл воды очищенной, выпаривали на электроплитке при температуре 100°С до влажных солей, эту операцию проводили дважды. К охлажденному остатку пробы добавляли 5 мл фонового раствора - 0.05 моль/л НС1, выдерживали пробы в течение 20-30 мин., количественно переносили в мерные цилиндры и доводили объемы до 10 мл фоновым раствором.

Проведена валидация методики и определены параметры: повторяемость ((«О 6,4 - 10,6%); внутрилабораторная точность (ЯБО 7,26 - 15,49%); правильность (86,1 - 116,7%); специфичность (абсолютная погрешность: - 2,5 —> - 0,5 мкг/л); линейность и диапазон (критерий приемлемости Zn г2 = 0,9928, Си г2 = 0,9905, РЬ г2= 0,9911, Сё г2 = 0,9926, правильность 90,67 - 123,33%); предел количественного определения 2м, Си, РЬ, С(1 составил 1,0 мкг/л (мкг/кг) (Я50 6,65 - 56,34%, правильность 64,7 - 125,1%); надежность (г = 0 - 14%). Аттестационные испытания методики показали соответствие характеристик критериям приемлемости, что указывает на достоверность полученных результатов.

Определение тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье

С использованием оптимизированной методики были определены концентрации тяжелых металлов в ЛРС. В траве мяты полевой (Вьетнам) они составили (вмг/кг): Яг - 38.2±11.5 (24.6-63.2), Си - 6.4±2.56 (4.56-8.81), РЬ-0.893±0.357 (0.61 - 1.26), Cd- 0.115i0.046 (0.035 - 0.232). В аптечных образцах травы мяты полевой (Вьетнам) было найдено (в мг/кг): 2и — 23.9±7.17 (9.1 -

53.2). Си - 6.91±2.76 (3.89 - 9.53), РЬ - 0.884±0.354 (0.211 - 1.5), С(1 -0.067±0.027(0.016 - 0.176). Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация Ъа и С<1 в цельном сырье была в 1.6 - 1.7 раза выше, чем в аптечных образцах. Средняя концентрация Си и РЬ в аптечном и цельном сырье были весьма близкие.

Концентрации тяжелых металлов листьях мяты перечной (Россия) найдены (вмг/кг): Z/t - 35.7±10.7 (9.4 - 102.7), Си - 5.65±2.26 (2.52 - 7.79), РЬ -0.86±0.344 (0.209 - 2.69), Сс1 - 0.061±0.024 (0.021 - 0.13). В аптечных образцах найдено (в мкг/г) в измельченном сырье: Z/г - 21.2±6.36 (12.5 - 28.8), Си — 9.24±3.7 (4.07-13.4), РЬ - 0.392±0.157 (0.155 - 0.585), С<1-0.033±0.013 (0.015 -0.049); в фильтр-пакетах: Z/l - 23.9±7.2 (16.8- 34.5), Си - 6.99±2.8 (3.5 - 10.6), РЬ - 0.284±0.113 (0.164 - 0.38), С(1 - 0.041±0.016 (0.031 - 0.051). Среднее содержание Си в измельченном сырье было выше по сравнению с другими образцами лишь на 24 - 39%. Средние концентрации тяжелых металлов в цельном сырье превышали содержание в других образцах: Zn в 1.5 - 1.7 раза, РЬ в 2.2 - 3 раза, С(1 в 1.5 - 1.8 раза.

Анализ корневищ аира болотного (Вьетнам) показал, что концентрации тяжелых металлов в них (в мг/кг): Zи - 44.8±13.4 (26.3 - 58.4), Си - 4.97±1.97 (1.21 - 9.62), РЬ — 0.296±0.12 (0.081 - 0.501), Cd-0.035i0.014 (0.014-0.067). В аптечном сырье найдено (в мкг/г): Z/l -16.3±4.9 (8.7 - 22.1), Си - 2.02±0.81 (1.04 - 3.65), РЬ - 0.10И0.04 (0.038 - 0.143), С Л - 0.024^0.009 (0.016 - 0.032). Средние концентрации металлов в заготовленных образцах были выше, чем в аптечных образцах: Хп в 2.7 раза, Си в 2.5 раза, РЬ в 2.9 раза, С<1 в 1.5 раза.

В корневищах аира болотного (Россия) концентрации тяжелых металлов составили (вмг/кг): Zí! - 20.5±6.2 (11.0 - 29.6), Си - 11.48±3.44 (1.63 - 25.05), РЬ - 0.186±0.074 (0.047 - 0.291), С(1 - 0.163±0.065 (0.017 - 0.283). В аптечных образцах: измельченном сырье (в мкг/г): Zи - 27.9±8.37 (19.8 - 34.3), Си -8.73±3.49 (4.04 - 13.15), РЬ - 0.157±0.063 (0.067 - 0.4), СЛ 0.048±0.019 (0.0260.083). В фильтр-пакетах (в мкг/г): Z/l - 27.2±8.2 (22.4 - 34.4), Си - 4.62±1.85 (3.94 - 6.0), РЬ 0.145^0.058 (0.087 - 0.211), Са - 0.063±0.025 (0.042 - 0.078).

Обнаружено, что средняя концентрация Хп в сырье из фильтр-пакетов лишь на 25 - 26.5% выше по сравнению с другими образцами. Максимальные концентрации остальных металлов отмечены в цельном сырье: Си в 1.3 - 2.5 раза, РЬ в 1.2 - 1.3 раза, Ссі в 2.6 - 3.4 раза выше, чем в остальных образцах.

Установлено, что концентрации металлов в сырье мяты и аира болотного убывали в ряду: Ъх\ —> Си —► РЬ —> Ссі и не превышали средних значений в растениях [Кабата-Пендиас А., Пендиас X., 1989] (Рисунок 1).

гп Си рь ей

Рисунок 1. Средние концентрации эссенциальных и токсичных металлов в сырье.

Ш . П _ Н

Обозначения: трава мяты полевой, 1-1 листья мяты перечной, корневища аира болотный (Вьетнам), ^ корневища аира болотного (Россия).

Средние концентрации С(1, РЬ в траве мяты полевой превышали таковые в листьях мяты перечной более, чем в 2 раза. В сырье аира болотного (Россия), средние концентрации С(1, Си в 3 раза превышали таковые в сырье аира болотного (Вьетнам). Найденные концентрации токсичных металлов не превышали допустимых уровней для БАД на растительной основе (СанПин 2.3.2 1078-01).

Определение тяжелых металлов лекарственных формах (настоях)

Анализ настоев из травы мяты полевой (Вьетнам) показал, что концентрации в них тяжелых металлов составили (в мг/л): Zя - 0.336±0.134 (0.245 - 0.45), Си - 0.128±0.051 (0.087 - 0.175), РЬ - 0.007±0.003 (0.0063 -

0.0075), Cd - 0.0009i0.0004 (0.0005 - 0.0013). В настоях из аптечного сырья найдено (в мг/л): Zn - 0.243±0.097 (0.156 - 0.322), Си - 0.08 0.032 (0.035 -0.119), РЬ - 0.0084+0.0034 (0.0033 - 0.0159), Cd - 0.0009+0.0004 (0.0004 -0.0015). Средняя концентрация Zn и Си в настоях из цельного сырья в 1.4 - 1.6 раза была выше, чем в настоях из аптечных образцов. Средние концентрации РЬ и Cd в настоях практически не различались (0 - 17%).

В настоях листьев мяты перечной (Россия) концентрации тяжелых металлов составили (в мг/л): Zn - 0.358±0.143 (0.078 - 0.857), Си - 0.057±0.023 (0.024 - 0.098), РЬ - 0.0074±0.003 (0.0031 - 0.0142), Cd - 0.0008±0.0003 (0.0004

— 0.0019). В настоях из измельченного сырья (в мг/л): Zn - 0.29+0.116 (0.231 -0.355), Си - 0.087±0.035 (0.029 - 0.135), РЬ - 0.0062±0.0025 (0.0035 - 0.0092), Cd-0.0008i0.0003 (0.0007 - 0.0008). В настоях из филыпр-пакетов (вмг/л): Zn

- 0.459±0.184 (0.332 - 0.567), Си - 0.154±0.062 (0.09 - 0.3), РЬ - 0.0117+0.0047 (0.009 - 0.0189), Cd - 0.0016+0.0006 (0.001 - 0.0032). Содержание металлов в настоях изменялось в зависимости от исходного сырья и убывало в ряду: фильтр-пакеты —> цельные листья —» измельченные листья. Средняя концентрация в настоях из фильтр-пакетов превышала: Zn в 1.2 - 1.6 раза, Си в 1.5 - 2.7 раза, РЬ в 1.2 - 1.9 раза, Cd в 2 раза по сравнению с другими образцами.

Результаты анализа настоев из корневищ аира болотного (Вьетнам) обнаружили, что концентрации тяжелых металлов (в мг/л): Zn - 0.389+0.155 (0.198 - 0.489), Си - 0.092+0.037 (0.038 - 0.16), РЬ - 0.0062+0.0025 (0.0052 -0.007), Cd - 0.0008+0.0003 (0.0004 - 0.0010). В настоях из аптечного сырья (в мг/л): Zn - 0.256+0.103 (0.194 - 0.334), Си - 0.065+0.026 (0.048 - 0.079), РЬ -0.0036+0.0014 (0.0018 - 0.0048), Cd - 0.0005+0.0002 (0.0005 - 0.0006). Средняя концентрация металлов выше в заготовленных образцах по сравнению с аптечными: Zn в 1.5 раза, Си в 1.4 раза, РЬ в 1.7 раза, Cd в 1.6 раза.

В настоях корневищ аира болотного (Россия) найдено (в мг/л): Zn — 0.180+0.072 (0.123 - 0.2 77), Си - 0.111+0.044 (0.016 - 0.21), РЬ - 0.0047+0.0019 (0.0034 - 0.0055), Cd - 0.0008+0.0003 (0.0003 - 0.0014). В настоях из

измельченного сырья (вмг/л): 2п - 0.409±0.164 (0.268 - 0.607), Си - 0.167+0.067 (0.101 - 0.274), РЬ - 0.0056+0.0022 (0.0035 - 0.01), Cd-0.001i0.0004 (0.00060.0012). В настоях аз фильтр-пакетов (вмг/л): Zл - 0.339+0.136 (0.291 - 0.43), Си - 0.103+0.041 (0.058 - 0.188), РЬ - 0.0057+0.0023 (0.0043 - 0.0068), СЛ -0.0011±0.0004 (0.0009 - 0.0014). Отмечено, что в настоях из измельченного сырья содержание Zn в 1.2 - 2.3 раза, Си в 1.1 - 1.6 раза выше по сравнению с другими образцами. Содержание токсичных металлов (РЬ, Сс1) в настоях всех образцов имело близкие значения, которые различались не более, чем на 27%.

Изучен переход тяжелых металлов в настои (Рисунок 2). Значения степени перехода в настои травы мяты полевой (Вьетнам) варьировали в диапазонах: 5.8%- 23.2%, Си - 8.3% - 30%, РЬ - 5% - 21.3%, Сс1 - 5.6% -31.3%; в настои листьев мяты перечной (Россия): 7л\ - 5.7% — 22.9%, Си — 5.5% - 31.9%, РЬ - 5.4% -73.3%, Сс1 - 6.8% - 63.5%; в настои корневищ аира болотного (Вьетнам): Ъп - 7.5% - 22.2%, Си - 8% - 50.6%, РЬ - 12.8% -64.2%, (41 - 14.9% - 39.1%; в настои корневищ аира болотного (Россия): 7м -4.7 - 27%, Си - 8.4 - 33.2%, РЬ - 17.9 - 98.6%, С(1 - 3.7 - 31.6%.

о о. с

о о. с;

1 2 3 4 5 6 7

9 10 11 12 13 14 15 16

Рисунок 2. Среднее содержание тяжелых металлов в сырье и степень перехода их в настои, ш п га

Обозначения: трава мяты полевой, ^ листья мяты перечной, ™ корневища

аира болотного (Вьетнам). ^ корневища аира болотного (Россия); Степень перехода,%; по оси абсцисс содержание в сырье: \-4 /.и; 5-8 Си; 9-12 РЬ; 13-16 Сс1.

Обнаружено, что средние концентрации Ъх\, РЬ, С(1 в водных извлечениях мяты полевой ниже, чем в водных извлечениях мяты перечной на 7.2 - 18.2%, а средние концентрации Си - весьма близкие. Средние концентрации в водных извлечениях аира болотного (Россия), были выше, чем в извлечениях из аира болотного (Вьетнам): Си, РЬ, Сс1 на 11.3 - 40%, а Zn -весьма близкие.

Исходя из рекомендаций по применению настоев мяты и аира (по 1/3-1/4 стакана 3 раза в день), были рассчитано возможное поступление тяжелых металлов в организм человека с разовыми и суточными дозами (таблица 1).

Таблица 1 - Возможное поступление металлов в организм человека с настоями

Металл Разовая доза, мкг Суточная доза, мкг Адекватный уровень потребления, мг

Мята перечная Мята полевая Мята перечная Мята полевая

гп 4.68-51.42 9.36-27 14.04-154.26 28.08-81 12

Си 1.44-18 2.1-10.5 4.32-54 6.3-31.5 1

РЬ 0.186-1.134 0.198-0.954 0.558-3.402 0.594-2.862 -

са 0.024-0.192 0.024-0.09 0.072-0.576 0.072 - 0.27 -

Примечание: прочерк означает, что адекватные уровни потребления не установлены.

Обнаружено, что с настоями мяты поступление эссенциальных элементов достигало 5,4% адекватных уровней потребления, токсичных металлов - 34% от допустимых уровней. Рассчитано возможное поступление металлов с настоями аира болотного, которое с разовыми дозами не превышало (в мкг): Ъъ

- 30.4, Си - 13.7, РЬ - 0.5, Сс1 - 0.07; с суточными дозами (в мкг): Хп - 91.1, Си

- 41.1, РЬ - 1.5, С(1 - 0.21. С настоями аира болотного поступление эссенциальных элементов достигало 4.11% от адекватных уровней потребления, токсичных металлов не превышало - 15% от допустимых уровней.

Изучение фармакопейных требований к качеству сырья во Вьетнаме и их сравнительный анализ

Результаты информационно-аналитического исследования статей Государственной фармакопеи Вьетнама 4-го издания 2009г. (ГФВ) показали,

что она включает 3 общие и 257 частных статей на ЛРС, из которых - 50 ЛРС, содержащих эфирные масла. Стандартизация их проводится по содержанию эфирного масла, кроме 7 видов ЛРС, где нормируются экстрактивные вещества, извлекаемые водой и этанолом разных концентраций (50%, 90%, 96%), в одном сырье (листьях полыни однолетней) - содержание артемизинина (не менее 0.7%), а в 7 видах ЛРС нормы содержания БАВ отсутствуют.

В ЛРС, представленном подземными органами не нормируются побуревшие корневища, другие части растений; органические и минеральные примеси в отдельности, но имеется показатель «примеси», которые включает все виды допустимых примесей (Таблица 2).

Таблица 2 — Сравнительный анализ фармакопейных требований к качеству аира болотного

№ Показатель Норма

ГФ XI ГФВ

1. Эфирное масло Не менее 2% Не менее 2%

2. Влажность Не более 14% Не более 12%

3. Зола общая Не более 6% Не более 4.6%

4. Зола нерастворимая в 10% НС1 - Не более 1.3%

7. Корневищ побуревших на изломе Не более 5% -

8. Корневищ плохо очищенных от корней и остатков листьев Не более 5% -

9. Органической примеси Не более 1% -

10. Минеральной примеси Не более 2% -

11. Примеси (земля, камни, другие части растения...) - Не более 1%

Примечание: ГФ XI - Государственная фармакопея СССР XI изд.; ГФВ -Государственная фармакопея Вьетнама (Duoc dien Viet Nam); «-« признак отсутствует в фармакопее.

Определение показателей подлинности и доброкачественности сырья видов мяты, собранных во Вьетнаме и России

Анализ внешних признаков травы мяты полевой показал, что она имеет мелкие листья (длиной 1,2-4,Зсм, шириной 0,5-1,8см), неопушенные, по

жилкам под лупой заметны редкие волоски в отличие от листьев мяты перечной; стебли полые; цветки бежевого цвета, расположены в пазухах листьев.

При изучении анатомических признаков обнаружено, что в листьях мяты полевой устьица с двумя околоустьичными клетками, простые 2-6-клеточные волоски, мелкие головчатые волоски и с обеих сторон листа эфирномасличные железки более мелкие и с меньшим содержанием эфирного масла, чем в листьях мяты перечной (Таблица. 3).

Таблица 3 - Отличия анатомических признаков сырья мяты перечной и мяты полевой

Признак Листья мяты Трава мяты нолевой Трава мяты полевой

перечной (ОКр. Г.ХОШИМИН) (аптека, г.Ханой)

1. Волоски:

- размер 50-520,9 мкм 100-375 мкм 87,5-500 мкм

- расположение по всей поверхности по жилкам, редкие по всей поверхности

листа листа и по жилкам

2. Желёзки:

- в 1мм2 6-37 железки 5-66 железки 8-30 железки

- диаметр 65,6-83,3 мкм 49,2-66,7 мкм 62,5-83,34 мкм

Изучены, подробно описаны и подтверждены фотоматериалами диагностические признаки цветков и стеблей мяты полевой, невключенные в ГФВ. Обнаружено, что цветки мяты полевой и мяты перечной при микроскопическом исследовании различаются по количеству железок, волосков и кристаллов.

Стебли мяты полевой четырёхгранные с полостью внутри. На поперечном срезе стебля видны: уголковая и пластинчатая колленхима, зеленоватый слой хлоренхимы, округло - продолговатые клетки эндодермы, склеренхима, коллатеральные сосудисто - волокнистые пучки, сердцевина с тонкостенными округлыми изодиаметрическими клетками и полость в центре (Рисунок 3).

А Б В

Рисунок 3. Мяты полевой трава

А - Волоски на концах зубцов чашечки (1 ООх);

Б - Отдельные кристаллы (400х); 1 - редкие одиночные игольчатые сферы; В - Поперечный срез стебля (40х); 2 - крупные сосудисто-волокнистые пучки в углах рёбер, 3 - мелкие пучки в стенках стебля.

Определены числовые показатели сырья видов мяты. В исследованных образцах травы мяты полевой найдено, содержание эфирного масла 1,171,78%, влажность 6,35 - 8,9%, зола общая 6,01 - 6,78%, зола нерастворимая в 10% HCl 0,17 - 0,31%; в листьях мяты перечной: эфирного масла 2,57 - 3,76%, влажность 9,18 - 11,35%, зола общая 9,26 - 9,74%, зола нерастворимая в 10% HCl 0,35 - 0,55%. Сравнительный анализ показал, что значения числовых показателей в листьях мяты перечной выше, чем для травы мяты полевой. Было установлено, что все исследованные образцы травы мяты полевой и листьев мяты перечной соответствовали требованиям ГФВ и ГФ XI.

Определение показателей подлинности и доброкачественности сырья аира болотного, собранного во Вьетнаме и России

Внешние признаки корневищ аира, заготовленные в России и Вьетнаме, полностью соответствовали фармакопейным требованиям и не имели явно выраженных различий между собой.

В результате исследования микроскопических признаков на поперечном срезе корневищ, заготовленных в России и Вьетнаме видна покровная ткань-

18

эпидермис, основная ткань-аэренхима, состоящая из круглых и овальных клеток, заполненных крахмальными зернами. В аэренхиме встречаются крупные клетки с эфирным маслом бледно-желтого цвета. Проводящие пучки расположены беспорядочно. В коре пучки коллатерального типа, окружены механическими волокнами, иногда с кристаллоносной обкладкой. В центральном цилиндре пучки концентрические, в основном находятся вблизи эндодермы. При рассмотрении поперечного среза корневищ, в аэренхиме встречались еще клетки с содержимым оранжево-бурого цвета (флобафены). У аира болотного (Вьетнам) эфирномасличные клетки размером 41.7 - 54.2 мкм, в 1мм2 от 15 - 37 железок; а у аира болотного (Россия) — 42 - 58.3 мкм, в 1мм2 от 15 - 30 железок соответственно.

Проведенное сравнительное изучение числовых показателей корневищ аира болотного показало, что в сырье аира болотного (Вьетнам) содержание эфирного масла 2,14 - 3,48%, влажность 6,6 - 8,95%, зола общая 2,88 - 3,77%, зола нерастворимая в 10% НС1 0,16 - 0,7%; в сырье аира болотного (Россия): эфирного масла 2,1 - 2,9%, влажность 7,05 - 8%, зола общая 2,33 - 2,46%, зола нерастворимая в 10% НС1 0,18 - 0,21%. Сравнительный анализ полученных результатов обнаружил более высокие значения для корневищ аира болотного (Вьетнам). Однако, все исследованные образцы корневищ аира болотного соответствовали требованиям фармакопеи ГФ XI и ГФВ.

Изучение компонентного состава эфирных масел сырья видов мяты и аира болотного

Определение содержания эфирного масла в сырье проводили методом перегонки с водяными паром в соответствии с ОФС «Определение содержания эфирного масла в лекарственном растительном сырье» ГФ XI издания.

Компонентный состав эфирных масел изучен методом ТСХ. Для эфирного масла мяты исследованы системы с толуолом : этилацетатом (93:7), бензолом : этилацетатом (5:1), циклогексаном : этилацетатом : ацетоном (8:1:1). Лучшее разделение компонентов получено в системе толуол : этилацетат (93:7).

Отчетливо наблюдались 5 пятен: от тёмно-фиолетового до сиреневого (ЯГ = 0,9; 0,87; 0,83; 0,64; 0,51). Во всех образцах обнаружен ментол (ЯГ = 0,51). ТСХ - хроматограммы эфирных масел мяты перечной и мяты полевой имели схожий вид.

Методом ГХ установлено в эфирном масле мяты полевой содержание 27 соединений, а в эфирном масле мяты перечной - 25 соединений. Во всех исследованных образцах найдены: лимонен, изопулегол, ментон, ментол, метилацетат. Сравнительный анализ обнаружил различия в содержании основных компонентов в эфирных маслах мяты полевой и мяты перечной соответственно: ментола - 56.91% и 44.12%; лимонена - 1.33% и 3.96%; изопулегона - 0.64% и 1.15%; ментона - 9.41% и 13.86%; метилацетата - 6.92% и 8.9% (Рисунок 4).

Содержание, % 60

50 40 30 20 10

іш

н Ш

- л І»

ЕЗ Мята полевая В Мята перечная

лимонен изо пуле гон ментон ментол

Ве ще С ТВ

метил ацетат

Рисунок 4. Основные компоненты эфирных масел мяты перечной и мяты полевой.

Выявлено, что состав основных компонентов эфирных масел мяты перечной и мяты полевой сходный, но различается в количественном соотношении.

Для ТСХ эфирного масла аира болотного исследованы системы с толуолом : этилацетатом (93:7), бензолом : этилацетатом (5:1), бензолом : хлороформом (1:1), н-гексаном : этилацетатом (85:15). Лучшее разделение компонентов получено в системе толуол : этилацетат (93:7). На хроматограммах эфирного масла аира болотного (Россия) отчетливо

наблюдались 8 пятен: от серого до голубого цвета (Яґ = 0,88; 0,77; 0,67; 0,57; 0,5; 0,35; 0,28; 0,18). На хроматограмме эфирного масла аира болотного (Вьетнам) было отмечено 2 пятна: коричнево-фиолетового (Яґ = 0,5) и сиреневого (Яґ = 0,57) цветов.

Методом ГХ установлено содержание в эфирном масле аира болотного (Россия) 15 соединений, а в эфирном масле аира болотного (Вьетнам) — 2 соединения (Рисунок 5).

А Б

Рисунок 5. ГХ-МС - хроматограмма эфирного масла аира болотного из Вьетнама (А) и России (Б). Во всех исследованных образцах эфирных масел обнаружен азарон. Средние концентрации азарона в масле аира болотного, собранного во Вьетнаме достигали 95.24%, что в 5 раз выше по сравнению с образцами из России (18.13%).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Выявлены особенности фармакопейных показателей ЛРС для ГФВ и ГФ XI на примере растительного сырья, содержащего эфирные масла. В ГФВ отсутствуют такие показатели качества сырья как почерневшие и побуревшие листья, стебли, травы; не нормируются другие части растений, органические и минеральные примеси в отдельности. Однако включены как показатель для всех видов сырья измельченность и примеси.

2. Разработаны оптимальные условия пробоподготовки образцов для определения микроконцентраций свинца, кадмия, цинка и меди в лекарственном растительном сырье комбинацией методов «сухой» и «мокрой» минерализации с добавлением азотной кислоты конентрированной и последующим использованием буферного раствора 0.05 моль/л НС1 в качестве фонового электролита.

3. Проведена валидация оптимизированной методики определения минерального состава лекарственного растительного сырья по показателям: повторяемость (ЯЗЭ < 13%), внутрилабораторная точность (Р^Э < 25.5%), правильность (значение правильности: 80 - 110%), специфичность (не превышали 5 мкг/л), линейность и диапазон (квадрат коэффициента корреляции линейной зависимости г2 >0,99, значение правильности: 75 - 115%), предел количественного определения (Я8Э не более 20,0 %, правильность в диапазоне от 75 до 115%), надежность (допустимые расхождения между измерениям г < 15%), которые полностью отвечали критериям приемлимости.

4. Изучен минеральный состав широко используемых видов эфиромасличного ЛРС и определены диапазоны концентраций металлов в траве мяты полевой (в мг/кг): Ъл - 9.1 - 34.7, Си - 3.89 - 9.53, РЬ - 0.211 - 1.56, Сё - 0.016 - 0.09; в листьях мяты перечной (в мг/кг): Тп - 12.5 - 47.8, Си - 2.52 - 13.4, РЬ - 0.155 - 0.73, С<1 - 0.0121 - 0.066; в корневищах аира (в мг/кг): 1п -15.7 - 49.6, Си - 1.04 - 13.15, РЬ 0.067 - 0.305, Сс1 0.014 - 0.083. Лекарственное растительное сырье, собранное в разных климатических зонах различалось по содержанию элементов на 7-15%. Содержание токсичных металлов не превышало допустимых уровней. Отмечено, что содержание тяжелых металлов в ЛРС разных морфологических групп уменьшалось в ряду: трава —* листья —► корневища.

5. Разработаны оптимальные условия определения концентраций Zn, Си, РЬ, Сс1 в настоях. Проведена валидация разработанной методики определения минерального состава настоев методом инверсионной вольтамперометрии. Определены средние концентрации в настоях травы мяты полевой (в мг/л): Хп

- 0.290, Си - 0.104, РЬ - 0.0077, Сс1 - 0.0009; в листьях мяты перечной (в мг/л): Хп - 0.369, Си - 0.099, РЬ - 0.0084, Сс1 - 0.0011; в корневищах аира (в мг/л): Ъл -0.310, Си-0.114, РЬ -0.0052, Сё-0.0009.

6. С использованием методов ТСХ и ГХ изучен химический состав эфирного масла мяты полевой и аира болотного флоры Вьетнама. Установлено, что содержание ментола в эфирном масле мяты полевой на 22.5% выше, чем в мяте перечной (56.9% и 44.12% соответственно). Концентрации других компонентов были выше в эфирном масле мяты перечной по сравнению с мятой полевой (соответственно): лимонена 3.96% и 1.33%, изопулегона 1.15% и 0.64%, ментона 13.86% и 9.41%, метилацетата 8.9% и 6.92%. Найдено, что концентрация азарона в эфирном масле аира болотного, собранного во Вьетнаме на 81% выше, чем в эфирном масле аира болотного из России (95.24% и 18.13% соответственно).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В. Изучение видового разнообразия фармакопейных видов лекарственных растений, содержащих эфирные масла, флоры России и Вьетнама // Проблемы сохранения биоразнообразия в северных регионах: Тезисы доклад Всероссийской научной конференции с международным участием, Апатиты-Кировск, 2010. - с. 32 - 33.

2. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В. Оценка качества эфиромасличного сырья фармакопейных видов лекарственных растений России и Вьетнама // XI международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни», 2010. -с. 171.

3. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В. Сравнительный анализ требований к качеству сырья мяты в России и Вьетнаме // Гаммермановские чтения, Научно-методическая конференция, Санкт-петербург, 1 -3 февраля 2011. - с. 53 - 54.

4. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Горшкова А.В., Гравель И.В. Изучение морфолого-анатомических признаков сырья аира болотного, произрастающего

в России и Вьетнаме // Развитие гомеопатического метода в современной медицине, Тезисы докладов XXI Московской международной гомеопатической конференции, М., 24-25 января 2011. - с. 180-182.

5. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Горшкова A.B., Гравель И.В. Определение характеристик подлинности сырья аира болотного, произрастающего в России и Вьетнаме // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции, Пятигорск, 2011. - с. 130-133.

6. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В. Хроматографический анализ эфирного масла мяты перечной и мяты полевой // Актуальные проблемы фармакологии и фармации, Барнаул, 2011. - с. 145 - 148.

7. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В., Филиппова A.B. Сравнительный морфолого-анатомический анализ сырья мяты перечной и мяты полевой // Известия алтайского государственного университета, 2011. - 3/2(71). -с. 30-33.

8. Nguyen Thi Nhu Quynh Nghien cuu thanh phan khoang chat trong duoc lieu kho va thuoc sac cay thuy xuong bo (Acorus Calamus L.) / Thi Nhu Quynh Nguyen, I.V. Gravel // Y hoc thuc hanh (843), 2012. -№ 10. - c. 20 - 23.

9. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В., Каденаци И.Б., Шустова JI.B., Моисеева Е.С., Тарасенко O.A. Анализ эфирного масла мяты перечной и мяты полевой//Традиционная медицина, 2012.-№ 5.-с. 278-281.

10. Нгуен Тхи Ньы Куинь, Гравель И.В., Алексеева H.A., Тарасенко O.A. Изучение минерального состава сырья и водных извлечений мяты перечной и мяты полевой // Фармация, 2013. -№ 3. - с. 24 - 27.

Подписано в печать 10.04.2013г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 101 экз. Заказ № 1625 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-т, д.28 Тел. 8(495)782-88-39