Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Изучение клинико-генетической гетерогенности при наследственной и спорадической формах меланомы кожи.

На правах рукописи

ЧЕРНЕНКО ПОЛИНА АНДРЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПРИ НАСЛЕДСТВЕННОЙ И СПОРАДИЧЕСКОЙ ФОРМАХ МЕЛАНОМЫ КОЖИ

14.01.12- онкология

005048542

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 ЯНВ 2013

Москва-2012

005048542

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор

академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович Научные руководители

доктор медицинских наук Любченко Людмила Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Петерсон Сергей Борисович Официальные оппоненты

Демидов Лев Вадимович доктор медицинских наук, профессор,

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующий отделением биотерапии опухолей

Карпухин Александр Васильевич доктор биологических наук, профессор,

ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, г. Москва,

заведующий лабораторией молекулярной генетики сложно наследуемых заболеваний

Ведущая организация

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится «. » 2013 г. в « /3 » часов

на заседании диссертационного совета в Федёральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. Автореферат разослан «оЬО >■> 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н., профессор // --Шишкин Юрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Меланома кожи (МК) является одной из наиболее агрессивных форм рака. Во всем мире отмечается рост заболеваемости: в 2011 году в развитых странах было диагностировано 166 900 случаев МК [Woodman S.E. et al. 2012], а средняя продолжительность жизни при распространенных стадиях не превышает 3-11 месяцев [Garbe С. et al. 2009].

Результаты фундаментальных исследований, посвященных МК, кардинально изменили понимание молекулярно-генетических механизмов развития заболевания. Полногеномный скрининг показал зависимость последовательных генетических событий - изменений протоонкогенов, генов-супрессоров и микро- (мк) РНК генов от типа и анатомической локализации меланомы, а также определил их ключевую роль в дифференцировке и прогрессии, что позволяет рассматривать структурные и функциональные перестройки в качестве диагностических и/или прогностических маркеров [Curtin J.A. et al. 2005, McCannel T.A. et al. 2010]. В результате классификационная система, основанная на клинических и гистологических критериях первичной опухоли, в настоящее время дополнена молекулярными характеристиками, составляющими диагностическую панель для ДНК-тестирования с целью индивидуализации лечебных подходов.

Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений при наследственной и спорадической формах МК, а также оценке диагностической значимости молекулярно-генетических перестроек в генах CDKN2A и BRAF как потенциальных прогностических маркеров МК.

Превалирующее значение в развитии наследственной формы МК принадлежит гену CDKN2A, терминальные мутации которого наблюдаются, по данным литературы, в 20-50% случаев, особенно в семьях, в которых у троих и более лиц диагностирована МК [Kefford R.F. et al. 1999, Puig, S. et al. 2005].

Соматические мутации гена BRAF являются наиболее частой молекулярно-генетической патологией при спорадической МК и наблюдаются в 40-88% случаев МК и в 74-82% случаев меланоцитарных невусов [Brose M.S. et al. 2002, Görden A. et al. 2003, James M.R. et al. 2006, Maldonado J.L. et al. 2003, Pollock P.M. et al. 2003, Shinozaki M. et al. 2004].

Идентифицировано более 40 различных точковых мутаций в гене BRAF Pavies М.А. et al. 2010]. В подавляющем большинстве случаев МК обнаруживается активирующая точковая мутация Т1799А в 15 экзоне гена BRAF {BRAF Т1799А), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600-том аминокислотном остатке соответствующего полипептида (V600E), которая составляет до 90% всех мутаций гена BRAF при МК [Davies Н. et al. 2002]. Соматическая мутация гена BRAF V600E является мишенью для таргетной терапии при МК, и идентификация данной мутации легла в основу многочисленных исследований в этой области.

Таким образом, актуальность данной работы обоснована необходимостью разработки эффективной системы прогнозирования течения МК с использованием методов молекулярной диагностики генов CDKN2A и BRAF.

Цель исследования

Целью нашего исследования явилось определение частоты и спектра генетических и эпигенетических изменений генов CDKN2A и BRAF и их влияния на клиническое течение МК. Разработка и внедрение в клиническую практику молекулярно-генетической диагностики генов CDKN2A и BRAF при МК. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Определение частотного спектра генетических и эпигенетических изменений генов CDKN2A и BRAF у больных МК.

2) Определение генетической гетерогенности МК с учетом молекулярной патологии.

3) Изучение клинических особенностей и отдаленных результатов лечения больных МК в зависимости от наличия у больных МК первично-множественных злокачественных опухолей.

4) Ретроспективная оценка влияния молекулярно-генетических нарушений генов CDKN2A и BRAF на клинико-морфологические особенности, клиническое течение и прогноз МК.

5) Оценка прогностической значимости мутаций в гене BRAF при МК.

Научная новизна исследования

Впервые на материале, собранном в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН с 1989 по 2010 гг., включающем больных МК из российской популяции, проведено молекулярно-генетическое исследование и показана инактивация гена CDKN2A, определена частота терминальных мутаций и аномального метилирования гена CDKN2A и установлена взаимосвязь этих изменений с клиническими характеристиками генетически детерминированной МК (средним возрастом заболевания, наличием ПМЗО и отягощенным семейным анамнезом).

Впервые на репрезентативной выборке пациентов с МК из российской популяции выполнено молекулярно-генетическое исследование по генотипированию соматических мутаций гена BRAF с использованием молекулярных методов диагностики: биологических микрочипов, ПЦР в режиме реального времени и секвенирования. Определены частота и показана неблагоприятная прогностическая значимость наличия соматических мутаций гена BRAF в отношении возраста манифестации МК, толщины опухоли по Бреслоу и размера первичной опухоли, а также в отношении частоты местных рецидивов с поражением регионарных лимфатических узлов и выживаемости больных МК.

Впервые в российской популяции были изучены больные МК в составе ПМЗО с использованием молекулярно-генетической диагностики. Показано, что наличие ПМЗО у больных МК является прогностически благоприятным фактором, поскольку первичная множественность ассоциирована с более поздним возрастом манифестации МК и улучшением общей выживаемости больных МК. Определена частота соматических мутаций гена BRAF у больных МК в составе ПМЗО.

Практическая значимость

Систематизированные результаты проведенного клинико-молекулярноп исследования будут использованы для выявления наследственно обусловленные форм МК и лиц с генетической предрасположенностью и высоким риско\ развития МК, что позволит сформировать клинико-генетический регистр включающий больных МК и их родственников, отнесенных к контингент) повышенного генетического риска развития МК и ПМЗО с целью повышенш эффективности медико-генетического консультирования семей. Выявление молекулярно-генетических перестроек гена СОКЫ2А, ассоциированных с высоким риском развития наследственной формы МК, позволяет осуществил диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем, проведение необходимых клинико-диагностических к профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни.

ДНК-диагностика соматических мутаций гена ВЯАР с использованием технологии биологических микрочипов позволит внедрить в рутинную клиническую практику высокопроизводительный тест для индивидуализации диагностики и лечения МК и МК в составе ПМЗО.

В связи с тем, что наличие мутаций гена ВЯАР является прогностически неблагоприятным фактором, мутационный статус гена ВКАР является показанием для назначения таргетной терапии и целенаправленного индивидуального подхода к ведению, лечению и профилактике пациентов с 5Л4^-ассоциированной МК.

Наличие ПМЗО у больных МК является прогностически благоприятным фактором, что необходимо учитывать при ведении пациентов этой группы.

Результаты исследования могут быть использованы в профессиональной деятельности врачей-онкологов и врачей-генетиков в медицинских учреждениях онкологического и генетического профиля, а также в процессе медико-генетического консультирования.

Результаты проведенного исследования планируется использовать в практической деятельности врачей онкологов, генетиков в клинических

учреждениях онкологического профиля, при медико-генетическом консультировании, а также для разработки методических рекомендаций.

Внедрение результатов исследования

Молекулярно-генетическая диагностика гена BRAF при МК внедрена в клиническую практику лаборатории клинической онкогенетики ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН.

Апробация работы

Состоялась 21 июня 2012 года на совместной научной конференции с участием отделений: лаборатории клинической онкогенетики, отделения биотерапии опухолей, отделения реконструктивной и сосудистой хирургии, отделения общей онкологии, отделения радиохирургии НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН; кафедры онкологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России.

Результаты исследования доложены на Евразийском форуме по меланоме и опухолям кожи (2011 г.), XVI Российском онкологическом конгрессе (2012 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 тезис и 1 статья в журнале.

Структура и объем диссертации

Диссертация построена по традиционному плану, изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Текст иллюстрирован 45 таблицами, 29 рисунками и графиками выживаемости. Список литературы включает 5 работ отечественных и 197 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала исследования были использованы клинические, семейные и молекулярные данные больных МК (п=112) с гистологически верифицированным диагнозом, проходивших обследование и лечение на базе НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Блохина» РАМН с 1989 по 2010 гг. Мужчин - 36/112 (32,1%), женщин - 76/112 (67,9%). 55 лет (<50 лет - 39/112 (34,82%), > 50 лет - 73/112 (65,18%)). Минимальный возраст выявления МК составил 18 лет, максимальный возраст - 91 год. Медиана наблюдения составила 21,5 месяц (1 - 232 месяцев).

На следующем этапе был проведен ретроспективный анализ амбулаторных карт и стационарных историй болезни пациентов с МК. Были учтены и проанализированы такие клинические показатели, как возраст возникновения злокачественного новообразования, стадия заболевания, гистологические характеристики, локализация первичного очага, вовлеченность в злокачественный процесс регионарных лимфатических узлов, данные о рецидиве и отдаленных метастазах, проведенном лечении и его результатах, а также анамнестические, клинические и лабораторные данные относительно первично-множественных опухолей и наследственного характера заболевания.

Диагноз у пациентов был верифицирован при помощи гистологического исследования. Все образцы МК, отобранные для исследования, были проанализированы патоморфологами ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН. В спорных случаях выполнялось иммуногистохимическое исследование. Была произведена оценка гистологического типа опухоли, толщины опухоли по Бреслоу, уровня инвазии по Кларку, наличия изъязвления и лимфоидной инфильтрации, с учетом которых злокачественные образования были простадированы согласно системам TNM и AJCC.

Средний возраст больных всей выборки составил 55 лет (<50 лет - 39/112 (34,82%), > 50 лет - 73/112 (65,18%). Минимальный возраст выявления МК был равен 18 годам, максимальный возраст —91 году. Среди 112 больных, включенных в работу, преобладали следующие стадии: IIb (27/112; 24,1%); IIc (22/112; 19,6%) и 8

Иа (19/112; 17%). При этом поражение регионарных лимфоузлов было выявлено в 9% случаев, а отдаленные метастазы на момент постановки диагноза имелись всего у двух пациентов (1,8%). Толщина первичной опухоли по Бреслоу варьировала от 0,3 до 12 мм, и в большинстве случаев была > 4 мм (36,6%). Почти в половине случаев (47,4%) уровень инвазии по Кларку был равен 3 и присутствовало изъязвление опухоли (49,1%). Наиболее часто встречались узловая (44,6%) и поверхностно-распространяющаяся (13,4%) формы МК. В подавляющем большинстве случаев опухоль локализовалась на конечностях. Семейный анамнез был отягощен МК в 6,2% случаев. Кроме того, в исследование были включены 42 (37,5%) больных МК с ПМЗО: почти в трети случаев вторым первичным образованием, помимо МК, являлся рак молочной железы (33,3%), на втором месте по частоте поражения больных МК (19%) был рак кожи (базальноклеточный и плоскоклеточный).

При ретроспективной оценке прогрессирования заболевания местный рецидив был диагностирован у 12,5% больных, метастазы в регионарные лимфатические узлы — в 71,4%, а отдаленные метастазы - в 40,2%. При этом чаще всего выявлялось поражение отдаленными метастазами сразу нескольких органов и тканей (37,8%). В зависимости от распространённости опухолевого процесса и вовлечения регионарных лимфатических узлов пациентам выполнялось хирургическое вмешательство в различных объёмах. За период течения болезни единичное иссечение первичной опухоли было выполнено 55,4% пациентов, иссечение с лимфаденэктомией — 25%, несколько операций по поводу первичной опухоли и очагов прогрессирования было проведено 16% больным. Адъювантное лечение получили 22,4% больных. В рамках адьювантной терапии практически с одинаковой частотой больным были назначены иммунотерапия (интерфероны) (48%) и химиотерапия (44%). В 68% случаев адъювантное лечение было завершено в срок, прогрессирование на фоне лечения наступило у 16% больных МК. Лечебная химио-/иммунотерапия по поводу прогрессирования МК была проведена у 28,6% больных. При оценке отдаленных результатов лечения оказалось, что полный ответ был отмечен в 9,4% случаев, частичный ответ — в

22% случаев, прогрессирование наступило у 53% больных, а стабилизация заболевания — у 15,6% больных. На момент ретроспективного анализа 47,4% были живы, а 44,6% больных умерли от прогрессирования основного заболевания.

На втором этапе было выполнено молекулярно-генетическое исследование образцов ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови и со срезов парафиновых блоков, с целью выявления терминальных мутаций и статуса метилирования гена CDKN2A/pl6 в 26 образцах МК из неотобранной на основании семейной истории выборки. Определение мутационного статуса гена CDKN2A/pl6 выполнено с использованием метода SSCP (от англ. Single Strand Conformation Polymorphism, полиморфизм конформаций одноцепочечных фрагментов ДНК). Определение статуса метилирования гена CDKN2A/pl6 выполнено на ДНК, выделенной со срезов опухолевого материала, с использованием метилчувствительной ПЦР.

Соматические мутации гена BRAF определялись в ДНК, выделенной со срезов парафиновых блоков 112-ти образцов опухолевой ткани больных МК, включая 42 образца (37,5%), полученных от пациентов с первично-множественными злокачественными образованиями (ПМЗО), одной из локализаций которых являлась МК. Анализ наличия мутации V600E в гене BRAF проводили с использованием биологических микрочипов, позволяющих определять наиболее часто встречающуюся мутацию V600E в кодоне 600 гена BRAF.

Кроме того с целью валидации использованных молекулярно-генетических методик детекция мутации гена BRAF (V600E) в 56 образцах была выполнена с использованием другого подхода - аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и секвенирования по Сенгеру.

Статистическая обработка данных производилась с использованием программы GraphPad Prism v.4.0, пакета программ Statistical Package for the Social Sciences software program (version 15.0; SPSS Inc.Chicago, IL). Основным критерием оценки было выявление взаимосвязей между наличием/отсутствием структурно-функциональных перестроек исследуемых генов и клиническими показателями. Выбывшие из-под наблюдения пациенты оценивались по дате их

последнего визита. Время до прогрессирования определялось от даты гистологической постановки диагноза до даты прогрессирования/смерти больного, либо даты последнего контакта с больным. Выживаемость была проанализирована в соответствии с методом Каплана-Мейера и сравнивалась по лог-ранг тесту. Для сравнения качественных признаков использовался ^2-тест с поправкой Йетса на непрерывность при таблицах сопряжения 2x2 или точный критерий Фишера при малых выборках. Во всех случаях применялся 95% доверительный интервал и двусторонний Р.

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Результаты исследования структурно-функциональных перестроек гена СОК1Ч2А у больных меланомой кожи Исследование герминалъных мутаций в гене СРКША Молекулярно-генетическое исследование терминальных мутаций гена СОКИ2А, вовлеченного в канцерогенез наследственной МК, было проведено с использованием метода ББСР и секвенирования ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови 26 больных МК. Из 26 пациентов терминальные мутации гена СйКША были выявлены у 3-х больных МК, что составило 11,5% (таблица 1). Отягощение семейного анамнеза злокачественными новообразованиями прослеживалось у всех пациентов-носителей мутаций.

Таблица 1. Выявленные терминальные мутации гена CDKN2A.

Эк-зон Нарушение в белке Нарушение последовательности ДНК Тип мутации Данные литературы

2 p.GlylOlTrp G301—Т Миссенс Описана ранее, впервые: Hussussian, С. J., Struewing, J. P., Goldstein, A. M., Higgins, P. А. Т., Ally, D. S., Sheahan, M. D., Clark, W. H., Jr., Tucker, M. A., Dracopoli, N. C. Germline p 16 mutations in familial melanoma. Nature Genet. 8: 15-21, 1994.

2 p.Met53Ile C.G159—С Миссенс Описана ранее, впервые: Harland, М., Meloni, R., Gruis, N., Pinney, E., Brookes, S., Spurr, N. K., Frischauf, A.-M., Bataille, V., Peters, G., Cuzick, J., Selby, P., Bishop, D. Т., Bishop, J. N. Germline mutations of the CDKN2 gene in UK melanoma families. Hum. Molec. Genet. 6: 2061-2067, 1997.

2 p.Vall26Asp С.Т377—»А Миссенс Описана ранее, впервые: Goldstein, A. M., Liu, L., Shennan, M. G, Hogg, D., Tucker, M. A., Struewing, J. P. A common founder for the V126D CDKN2A mutation in seven North American melanoma-prone families. Brit. J. Cancer 85: 527-530,2001.

Клинический пример

Больная С. (1959 г.р.) наблюдалась в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН с марта 2001 г. с диагнозом: «Меланома кожи левой лопаточной области T3N0M0, 2 стадия». 23.03.2001 г. было выполнено оперативное вмешательство в объеме иссечения опухоли с подмышечной лимфаденэктомией слева (гистологически -узловая меланома толщиной 4 мм и уровнем инвазии III). Учитывая стадию процесса, статус регионарных лимфатических узлов и отсутствие проявлений заболевания, дополнительное лечение решено было не проводить, и больная была оставлена под наблюдение.

Семейный анамнез больной отягощен двусторонним раком молочной железы (бабушка по линии отца) (рисунок 1). В рамках проводимого исследования пациентке было проведено молекулярно-генетическое исследование в объеме определения первичной структуры кодирующей части гена CDKN2A (1-3 экзоны) с целью исключения/подтверждения наследственной этиологии заболевания с использованием метода SSCP, метилчувствительной ПЦР и секвенирования.

При исследовании ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови, выявлена терминальная миссенс-мутация G101W (р. GlylOlTrp; C.G301—>Т) во 2-омэкзоне гена CDKN2A.

+80 +7б

Меланома кожи

Рисунок 1. Родословная больной С., 41 год.

Исследование статуса аномального метилирования промоторной области

гена СРШ2А

Исследование профиля аномального метилирования промоторной области гена СБКША выполнено с использованием метилчувствительной ПЦР на ДНК, выделенной из опухолевого материала 26 больных МК (общая выборка больных). Данная выборка включала трех пациентов с семейной историей МК и трех пациентов с первично-множественными злокачественными образованиями (ПМЗО).

Из 26 пациентов аномальное метилирование промоторной области гена СБКЮА было выявлено у 6-ти больных (23%). При этом сочетания терминальной мутации и гиперметилирования гена СОШ2А ни у одного пациента выявлено не было.

У трех из шести больных МК, у которых было обнаружено аномальное метилирование промоторной области гена СБШ2А, были диагностированы ПМЗО: папиллярный рак щитовидной железы, базалыю-клеточный рак кожи, рак сигмовидной кишки. Семейная история больных ПМЗО с гиперметилированием гена СБШ2А была отягощена злокачественными новообразованиями различных локализаций.

Таким образом, в изучаемой группе больных (26 человек) инактивация гена СБКША в результате терминальной мутации или гиперметилирования была выявлена у 9 пациентов, что составило 34,6% (рисунок 2). В 33,3% инактивация была связана с терминальными мутациями гена СОКЫ2А, а в 66,6% - с аномальным метилированием этого гена. Средний возраст пациентов с терминальными мутациями был ниже, чем у пациентов с гиперметилированием (50 лет и 64 года соответственно). ПМЗО в группе больных с мутацией отсутствовали, а в группе с гиперметилированием составили 50%. Отягощение семейного анамнеза различными злокачественными новообразованиями было выявлено в обеих группах, однако МК среди родственников исследуемых больных обнаружено не было.

Инактивация гона СОК.\2.А -14,5% (9/26)

I "п перл! с I И.1 пропан не гена С1ЖУ2А

(6/26) т;'общего числи больных

У) от числа бЙ.ЧЬНЫН :Ч2: НШИКЧНЙШШ £¡1 ~

гетгп'С'1>Н"Ь{ЗЛ ' '

Средний аочраст - 64 года ПМЗО.-Д/б (50%) Отягощенный семейный

. пнлмиеч— 4.'(> (йй,7вл>1

Рисунок 2. Результаты исследования инактивации гена СБКША.

Результаты исследования соматических мутаций гена ВЯАГ у больных меланомой кожи

Валидация методов исследования

Для проведения молекулярно-генетической диагностики гена ВЯАК с использованием биологических микрочипов, разработанных в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, было отобрано 112 больных МК, проходивших обследование и лечение на базе НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Блохина» РАМН. Однако исследование 10 из 112 образцов выполнено не было в связи с недостаточным количеством и качеством выделенной ДНК. Эти образцы были исключены из исследования. Соматическая мутация У600Е гена ВЯАР была обнаружена у 50 из 102 (49%) пациентов. Все мутантные варианты были секвенированы с целью подтверждения изменений нуклеотидной последовательности.

Параллельно мутационный анализ гена BRAF в 56 из 112 образцов МК был выполнен с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ЯТ-ПЦР). 8 образцов были исключены из исследования в связи с недостаточным количеством и качеством выделенной ДНК. Соматическая

мутация У600Е гена ВЯАР была обнаружена у 25 из 48 (52%) пациентов.

Следующим этапом нашего исследования явилась валидация использованных методик мутационного анализа гена ВЯАР. С использованием обоих методов (биологических микрочипов и аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени) было протестировано 56 образцов (рисунки 3, 4, 5). При этом расхождение в результатах было выявлено в 3-х образцах, соответственно результаты исследования совпали для 53 из 56 образцов (94,6%). Образцы, по которым было выявлено расхождение результатов, были повторно исследованы методом биологических микрочипов с выделением ДНК и последующим ресеквенированием. В спорных образцах мутация УбООЕ гена ВЯАЕ была повторно подтверждена, что свидетельствует о высокой специфичности и чувствительности метода биочипов. Расхождение результатов может быть связано с различной чувствительностью методик, а также с генетической гетерогенностью самой опухолевой ткани, что в свою очередь было продемонстрировано в работе Уапсоукг М. с соавторами на большом клиническом материале МК (112 опухолевых образцов от 73 больных МК) [Уапсоуйг М. 2012].

а) Образец не содержит мутаци УбООЕ I гене ВИЛИ (ууЦ

б) Образец содержи т мутацию V600E в гене BRAF(mt)

ф

т т

ш

> w -р .w '

i- >> . 'Ir'r:: tili;

Рисунок 3. Гибридизационная картина образцов МК.

Сиквенс образца дикого типа

Сиквенс образца с мутацией У600Е в гене ВИАР „ 1

\Л

v \

1, I А

А \

Рисунок 4. Секвенирование образцов МК.

Детекция мутации BRAF-V600E с помощью ПЦР в реальном времени

Контрольная ПЦР

ПЦР BRAF-V600E

r.i.W.v.ßpor: •ул/Т-......i..........

ill вофофг^-

1! A ...J.

10 нг ДНК в реакцию

WT — ДНК человека без мутации BRAF

Положительный стпндарт (красная пиния) — мормапьмая ДНКчвповина

0«ээ мутации ВRAF с добавлением ДНК-копий BRAF VfeOOE.

Контроль »Sea ДНК (вода) — гопубая пиния. Уровень <j>o«-te» — золеная пиния.

Рисунок 5. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени.

Метод детекции соматической мутации V600E гена BRAF с использованием биочипов был валидирован в Лаборатории молекулярной диагностики (руководитель лаборатории - Professor Dr. Dieter Zimmermann) Института клинической патологии (директор - Professor and Chairman Holger Moch) Университетского госпиталя г. Цюриха, Швейцария (Institute of Surgical Pathology at the University Hospital in Zürich, Switzerland) путем автоматического секвенирования 15 экзона гена BRAF. Расхождения результатов выявлено не было, что подтверждает 100%-ную чувствительность и специфичность использованного метода диагностики.

Сравнительная характеристика больных в зависимости от мутационного статуса гена BRAF

Частота соматической мутации V600E гена BRAF составила 49% (50/102 пациентов), что согласуется с данными, полученными ранее в исследованиях Brose MS, Görden A, James MR и др. [Brose MS et al. 2002, Görden A et al. 2003, James MR et al. 2006, Pollock PM et al. 2003, Shinozaki M et al. 2004].

Для изучения клинических характеристик МК в зависимости от статуса гена BRAF больные были разделены на 2 группы: с мутацией гена BRAF - mt BRAF (п=50) и без мутации - wt BRAF (п=52). Возраст манифестации МК был достоверно ниже в группе пациентов с мутацией гена BRAF (р=0,002). Разница в возрасте больных МК, составившая 10 лет, статистически значимо зависела от

мутационного статуса гена BRAF. При этом больных моложе 50 лет было достоверно больше в группе с наличием мутации гена BRAF (р=0,001), аналогичные данные были получены и в других исследованиях. В работе Liu W с соавторами было показано, что мутация гена BRAF V600E чаще встречается у пациентов в возрасте < 50 лет по сравнению с пациентами старше 50 лет (р=0,001) [Liu W et al. 2007]. В исследовании Shinozaki М с соавторами наиболее часто мутации гена BRAF наблюдались у больных в возрасте < 60 лет (р=0,001), при этом частота мутаций превышала 50% у пациентов моложе 40 лет. Тогда как в возрастной группе пациентов 70 лет и старше частота мутаций не превышала 10% [Shinozaki М et al. 2004].

В настоящем исследовании в группе с мутацией гена BRAF чаще встречались женщины (р=0,1), аналогичные данные были получены в работе Shinozaki М с соавторами (р=0,09) [Shinozaki М et al. 2004].

Отягощение семейного анамнеза случаями МК чаще наблюдалось в группе с мутацией гена BRAF (р=0,6), хотя в исследовании Liu W с соавторами [Liu W et al. 2007] такой взаимосвязи выявлено не было (р=0,4). Однако эти данные не достигли статистической значимости.

При оценке размера первичной опухоли показатель Т1 достоверно чаще наблюдался в группе без мутации (15,4%) по сравнению с группой mt BRAF (2%) (р=0,03), что может говорить в пользу высокой скорости удвоения BRAF-ассоциированной МК. В этой же группе пациентов (mt BRAF) достоверно чаще встречалась толщина опухоли > 1 мм (р=0,05), что является определяющим, поскольку толщина опухоли по Бреслоу признана одним из наиболее точных прогностических факторов на ранних стадиях развития МК [Elder D.E. et al. 1996]. Наличие мутации гена BRAF было ассоциировано с тенденцией к более частому возникновению изъязвления по сравнению с группой wt BRAF (р=0,07), в связи с чем частота развития местных рецидивов и поражения регионарных лимфатических узлов была достоверно выше в группе больных с мутацией гена BRAF по сравнению с группой wt BRAF (р=0,01). Поверхностно-распространяющаяся форма МК была характерна для группы без BRAF -мутаций (р=0,1). Аналогичные данные были

представлены в работе Pacheco I с соавторами [Pacheco I et al. 2011], тогда как в исследовании Liu W с соавторами мутация V600E гена BRAF достоверно чаще определялась при поверхностно-распространяющейся МК (р=0,055) [Liu W et al. 2007]. Описанные различия в клинических характеристиках МК подтверждают неблагоприятную прогностическую значимость наличия мутации гена BRAF.

В нашей работе не было выявлено статистически достоверного влияния мутации на локализацию первичного опухолевого очага, хотя расположение очагов на туловище было выявлено чаще при наличии мутации гена гена BRAF, а на конечностях и голове, доступных для воздействия солнечных лучей, мутация чаще отсутствовала (р=0,6). В работе Maldonado JL с соавторами было показано, что трансверсия Т>А, связанная с мутацией V600E, не является результатом УФ-индуцированного повреждения ДНК [Maldonado JL et al. 2003]. В исследовании Bauer J с соавторами было продемонстрировано, что меланомы, ассоциированные с мутацией в гене BRAF, развиваются в молодом возрасте при суммарно низких дозах воздействия УФ-лучей [Bauer J et al. 2011]. Curtin с соавторами более детально изучили данную взаимосвязь [Curtin JA et al. 2005]. Оказалось, что большинство образцов МК с отсутствием хронического солнечного повреждения (средние уровни УФ-экспозиции) имели мутации в генах BRAF или NRAS (59% и 22% соответственно). Общая частота мутаций этих генов была значительно ниже в опухолях кожи с наличием хронического солнечного повреждения или расположенных на участках, не подвергающихся воздействию солнечных лучей. Это свидетельствует о том, что мутация гена BRAF не связана с влиянием УФ-излучения и чаще наблюдается в группе МК со средними (промежуточными) показателями солнечной экспозиции.

Оценка результатов выживаемости

При оценке отдаленных результатов лечения в работе Ugurel S с соавторами было показано снижение медианы выживаемости у больных BRAF-ассоциированной МК — 8,0 месяцев по сравнению 11,8 месяцами у пациентов-носителей гена BRAF «дикого типа» (р = 0,055) [Ugurel S et al. 2007]. В исследовании Shinozaki М соавторами [Shinozaki М et al. 2007] наличие мутаций

гена BRAF было связано со значительным снижением показателей общей выживаемости (р=0,04). Исследование Jovanovic В. с соавторами [Jovanovic В et al. 2008] подтвердило, что наличие mt BRAF и изъязвления в образцах МК значительно снижало выживаемость (р=0,001). Частота ДЯЛ^мутаций была в два раза выше в группе пациентов с выживаемостью менее 5 лет.

В нашем исследовании при анализе отдаленных результатов лечения

больных МК в зависимости от

мутационного статуса гена BRAF

показано, что продолжительность

жизни в группе пациентов с наличием

мутации была ниже на 27 месяцев,

чем в группе без мутации (медианы

продолжительности жизни при mt

BRAF - 40 месяцев против wt BRAF - „ , „

г Рисунок 6. Кривые продолжительности

67 месяцев) (рисунок 6). Как и в жизни больных МК.

представленных выше работах в нашем исследовании наличие мутации гена BRAF было связано с неблагоприятным прогнозом, однако полученные результаты не достигли статистической значимости (р=0,6).

При анализе безрецидивной и беспрогрессивной выживаемости были выявлены аналогичные показатели: наличие мутации было ассоциировано со снижением времени до развития местного рецидива и прогрессирования. Медиана времени до прогрессирования в группе пациентов с мутацией составила 22 месяца, что на 6 месяцев меньше, чем в группе пациентов без мутации (р=0,6) (рисунок 7). Медиана времени до развития рецидива в группе пациентов с мутацией составила 66 месяцев, что на 17 месяцев меньше, чем в группе пациентов без мутации (р=0,5) (рисунок 8).

Таким образом, мы не получили статистически значимых различий в безрецидивной, беспрогрессивной и общей выживаемости у больных МК. Поскольку 84% образцов МК, включенных в наше исследование, представляли собой первичные опухоли, можно предположить, что наличие мутации гена BRAF

Продолжительность жизни

Время до прогрессирования

Безрецидивная выживаемость

-8RAF-- BRAF+

100И

«> и). ' " 1 '

О 12 24 38 48 S0 72 >4 86 108 120 месяцы

Рисунок 7. Кривые времени до прогрессирования больных МК в зависимости от мутационного статуса гена BRAF.

§ Ю

Е «он

г зо. о- 20. 100-

-BRAF--BRAF+

0 12 24 Зв 48 60 72 >4 98 108 120 месяцы

Рисунок 8. Кривые времени до развития рецидива у больных МК в зависимости от мутационного статуса гена ВЯАГ.

в первичной опухоли не оказывает отрицательного влияния на выживаемость без прогрессирования или общую выживаемость, однако обнаружение этих мутаций в очагах метастатического поражения, возможно, будет ассоциировано с ухудшением прогноза заболевания у больных МК. Результаты подобных исследований, подтверждающих данное предположение, описаны в литературе. НоиЬеп Я. с соавторами продемонстрировали, что наличие ВЯАР-мутаций в первичной опухоли не оказывало отрицательного влияния на выживаемость без прогрессирования (р = 0,74) или общую выживаемость (р = 0,28), однако наличие этих же мутаций в очагах метастатического поражения было связано со значительно худшим прогнозом и снижением показателя общей выживаемости (р = 0,02) [НоиЬеп Я. е1 а1. 2004].

Результаты исследования больных мелаиомой кожи с наличием первично-множественных злокачественных образований

Изучаемая выборка больных МК, включенных в исследование, содержала 42 пациента с ПМЗО, что составило 37,5%. Вопросы этиологии и патогенеза ПМЗО остаются до конца не изученными, и генетическая основа их развития все еще не определена. Имеющиеся данные подтверждают, что наличие семейных накоплений злокачественных образований является наиболее существенным фактором риска развития опухолей различных локализаций. Это обосновывает необходимость исследования больных МК с ПМЗО.

Все больные с ПМЗО были включены в молекулярно-генетический

скрининг с целью определения мутационного статуса BRAF. Подобных работ в литературе нами встречено не было.

В нашем исследовании средний возраст пациентов с ПМЗО составил 63 года. Мужчин - 16/42 (38,1%), женщин - 26/42 (61,9%). Семейный анамнез этих пациентов не был отягощен случаями МК. В трети случаев второй локализацией ПМЗО был рак молочной железы (33,3%), второе место занимал рак кожи (базальноклеточный и плоскоклеточный) (19%). Медиана времени наблюдения больных в группе ПМЗО+ составила 45 месяцев (1-232 мес.). Для проведения сравнительного анализа клинических признаков, ассоциированных с наличием ПМЗО, 112 больных МК были разделены на 2 группы: 70 больных только МК (ПМЗО-) (%) и 42 больные с ПМЗО (ПМЗО+) (37,5%), одной из локализаций которых была МК.

В исследовании Bellet R.E. с соавторами было показано, что больные МК с наличием другой злокачественной опухоли в анамнезе были значительно старше на момент постановки диагноза МК по сравнению с больными только МК [Bellet R.E. et al. 1977]. В нашей работе у больных с ПМЗО МК развивается на 13 лет позже по сравнению с больными только МК. Средний возраст больных на момент постановки диагноза МК достоверно различался между двумя группами: в группе ПМЗО+ он составил 63 года, а в группе ПМЗО- 50 лет (р=0,001). Кроме того, больные МК в возрасте до 50 лет статистически значимо преобладали в группе без ПМЗО (ПМЗО+ 14,3% против ПМЗО- 47,1%), а больные МК 50 лет и старше чаще встречались в группе с наличием ПМЗО (ПМЗО+ 85,7% против ПМЗО- 52,9%) (р=0,0001). Изъязвление первичной опухоли достоверно чаще встречалось в группе ПМЗО- (58,6%) по сравнению с группой ПМЗО+ (33,4%) (р=0,03). Аналогичная ассоциация была отмечена в отношении лимфоидной инфильтрации: в группе без ПМЗО (30%) по сравнению с группой с наличием ПМЗО (14,3%) (р=0,01). При этом отягощение семейного анамнеза случаями МК статистически значимо преобладало в группе без ПМЗО (14,3%), тогда как в группе с наличием ПМЗО отягощение семейной истории случаями МК выявлено не было (р=0,01).

В исследовании Duchateau C.S. с соавторами было показано, что пациенты с

ПМЗО имеют значительно лучшие показатели выживаемости по сравнению с бальными, имеющими единственную злокачественную опухоль (р=0,029) [Бий^еаи С.Б. е1 а1. 2005]. БоиЬгоузку А. с соавторами изучали пациентов с первично-множественной МК и пришли к выводу, что продолжительность жизни пациентов с множественными очагами МК значительно выше по сравнению с пациентами с единичным поражением (р=0,01) [БоиЬгоузку А. е! а1. 2003]. Данные об улучшении выживаемости больных с ПМЗО были также представлены в работах Уетщора1 В. с соавторами и Aguil6 Я с соавторами Я. й а1. 2008, Venugopal

В. е1 а1.2009].

В нашей работе при анализе отдалённых результатов лечения больных МК было показано, медианы продолжительности жизни в группе пациентов с наличием нескольких первичных опухолей и в группе больных только МК статистически значимо отличались: в группе ПМЗО- медиана продолжительности жизни составила 40 месяцев, а в группе ПМЗО+ оказалась на 78 месяцев больше (р=0,007) (рисунок 10), что согласуется с данными литературы. Однолетняя общая выживаемость была выше у пациентов с ПМЗО: в группе ПМЗО-составила 93%, а в группе ПМЗО+ равнялась 95%.

Соответственно, частота местных рецидивов и отдаленного прогрессирования была выше в группе больных только МК, возможно, это связано с большей частотой изъязвления первичной опухоли у этих больных. Однако данные показатели не достигли статистической значимости (р>0,05). Кроме того, по нашим данным, наличие ПМЗО у больных МК увеличивает беспрогрессивную (64 и 18 мес. соответственно, р=0,006) и безрецидивную (83 и 48 мес. соответственно, р=0,16) выживаемость (рисунки И, 12).

Продолжительность жизни

-пмзо--ПМЗО +

0 12 24 36 48 во 72 84 вв 108120132144 месяцы

Рисунок 10. Кривые продолжительности жизни больных МК в зависимости от наличия ПМЗО.

Выживаемость без прогрессирования 100-,

Время до развития рецидива

0 12 24 36 48 60 72 84 96 10В 120 месяцы

Рисунок 11. Кривые времени прогрессирования больных МК зависимости от наличия ПМЗО.

- ПМЗО --ПМЗО +

0 12 24 36 48 60 72 64 96 108 120 месяцы

до Рисунок № 12. Кривые времени до развития в рецидива у больных МК в зависимости от наличия ПМЗО.

Также был проведён анализ времени до развития отдаленных метастазов у больных МК в зависимости от наличия ПМЗО (рисунок 13). Медианы времени до развития отдаленных метастазов достоверно различались между группами: в группе пациентов без ПМЗО медиана составила

Время до развития отдаленных метастазов 100-1

2 805 70-

ПМЗО-ПМЗО +

33 месяца, что на 43 месяца меньше, чем

в группе больных с ПМЗО (р=0,03).

Полученные в нашей работе

результаты свидетельствуют о том, что

наличие ПМЗО у больных МК является

прогностически благоприятным

фактором. ПМЗО является одним из РисУн°к 13- кР™ые времени до

развития отдаленных метастазов у

0 12 24 36 48 80 72 84 96 108 120 месяцы

генетической больных МК в зависимости от наличия ПМЗО.

критериев

детерминированности, ассоциированной с терминальными молекулярными перестройками высоко- и низко-пенентрантных генов. В ряде работ показано, что консервативные терминальные генетические дефекты определяют молекулярный патогенез наследственных опухолей, связанный со снижением/отсутствием репарации двунитевых разрывов ДНК. Этот факт связан с лучшим ответом на проводимое химиотерапевтическое лечение [James, C.R. et al. 2007, Kennedy R.D. et al. 2004, Kirova Y.M. et al. 2005]. Таким образом, влияние проведенного лечения, а также выявление последующих злокачественных образований на ранней стадии в связи с прицельным наблюдением по поводу первичной опухоли могут объяснить улучшение

показателей выживаемости больных с ПМЗО.

Кроме того, в работе АЛайГ Б.!, с соавторами были проанализированы механизмы, лежащие в основе зарождения и развития ПМЗО [А.1а^ БЛ. е1 а1.2011]. Раковые клетки обладают способностью продуцировать патологические сигналы, которые могут восприниматься только мутантными рецепторами. Кроме того, они также могут контролировать нормальные клетки за счет секреции различных хемокинов, а также способности к образованию новых кровеносных сосудов. Поскольку злокачественные клетки первичной опухоли используют окружающую среду для обеспечения своего роста и выживания, они способны контролировать рост и деление клеток другой злокачественной опухоли в результате продукции подавляющих сигналов, влияющих на мутантные рецепторы раковых клеток иного происхождения (другая первичная опухоль). Ингибирование второй первичной опухоли будет зависеть от типа и силы сигналов, продуцируемых первой опухолью. Если сигналы эквивалентны, возможно развитие ПМЗО. Но в этом случае вследствие подавляющего влияния рост и распространение будут происходить в более медленном темпе, что приведет к увеличению показателей выживаемости пациентов. Эта теория объясняет, что несмотря на влияние генетических факторов и воздействие неблагоприятных условий внешней среды, которые могут вызвать инициацию различных видов злокачественных опухолей, развитие ПМЗО у пациентов является довольно редким явлением. Вторая первичная опухоль может появиться только после лечения или удаления первого очага, так как он продуцирует ингибирующие сигналы в отношении развития последующих образований. Этой теорией можно объяснить более благоприятные клинико-морфологические характеристики больных МК в составе ПМЗО, а также увеличение показателей выживаемости.

При оценке мутационного статуса гена ВОЛР у больных МК с наличием второй злокачественной опухоли оказалось, что ПМЗО достоверно чаще обнаруживаются при отсутствии мутации гена ВЯАР (50% против 26% в группе пй ВЯАР; р=0,01). У больных МК с наличием вторых первичных опухолей мутации гена ВЯАР были выявлены в 33,3% случаев. Это может говорить о том,

что в патогенез ПМЗО, кроме соматических мутаций гена BRAF, вовлечены другие структурно-функциональные дефекты, в связи с чем требуется расширение молекулярно-генетической диагностической панели при ПМЗО.

При разделении всех больных на две группы (молодые - возраст менее 50 лет и пожилые - возраст 50 лет и более) ПМЗО достоверно чаще встречались в группе больных МК менее 50 лет при отсутствии мутации гена BRAF (mt BRAF 7,7% против wt BRAF 36,4%; р=0,05).

При анализе отдалённых результатов лечения больных МК с ПМЗО в зависимости от наличия мутации гена BRAF статистически достоверного влияния на общую и безрецидивную выживаемость выявлено не было. Однако наличие мутации гена BRAF было ассоциировано с достоверным улучшением беспрогрессивной выживаемости у больных МК с ПМЗО (рисунок 14). Медиана времени до прогрессирования у этих больных в группе mt BRAF составила 155 месяцев, что на 127 месяцев больше по сравнению с больными МК с ПМЗО в группе wt BRAF (р=0,01). В нашей работе получено улучшение беспрогрессивной выживаемости, что может быть связано с проводимым химиотерапевтическим лечением. Видимо, несмотря на то, что мутации гена BRAF являются прогностически неблагоприятным фактором, наличие у больных МК ПМЗО является определяющим вследствие неизвестного потенциального молекулярно-генетичес-кого дефекта, а также взаимоподавляющего влияния множественных опухолей.

На основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы: своевременная идентификация генетических нарушений у больных МК позволяет улучшить диагностику данного заболевания, прогнозировать его течение, разрабатывать наиболее эффективную стратегию для лечения уже протекающего заболевания и осуществлять профилактику других

Рисунок 14. Кривые времени до прогрессирования у больных МК с ПМЗО в зависимости от наличия мутации гена BRAF.

злокачественных новообразований, что особенно актуально не только для заболевших пациентов, но и для их практически здоровых родственников, у которых еще не возникла опухолевая патология.

ВЫВОДЫ:

1. Инактивация гена CDKN2A выявлена в 34,5% случаев МК. Частота терминальных мутаций у пациентов с онкологически отягощенным семейным анамнезом составила 11,5%, а гиперметилирование гена CDKN2A наблюдалось в 23% случаев МК.

2. Манифестация МК в составе ПМЗО отмечена на 13 лет позже по сравнению с изолированным поражением МК (р=0,001).

3. Общая и беспрогрессивная выживаемость в группе пациентов с наличием нескольких первичных опухолей достоверно выше по сравнению с этими показателями в группе больных только МК (продолжительность жизни 118 и 40 мес. соответственно (р=0,007); время до развития прогрессирования 64 и 18 мес. соответственно (р=0,006)).

4. Частота соматических мутаций гена BRAF (V600E) у больных МК и МК в составе ПМЗО составила 49% и 33,3%, соответственно.

5. Проведена валидация использованных молекулярно-генетических методик определения соматических мутаций гена BRAF (V600E). Результаты мутационного анализа ^использованием биологических микрочипов совпали с секвенированием в 100% случаев, а с результатами определения BRAF-статуса с использованием метода RT-ПЦР - в 94,6%.

6. Возраст манифестации МК у пациентов с мутацией гена BRAF на 10 лет достоверно ниже по сравнению с пациентами с wt BRAF (р=0,002).

7. В группе пациентов с мутацией гена BRAF достоверно чаще встречалась толщина опухоли > 1 мм по сравнению с группой wt BRAF (р=0,05), что в свою очередь приводит к увеличению частоты местных рецидивов с поражением регионарных лимфоузлов (42% против 28,8%; р=0,1).

8. Наличие мутации гена BRAF ассоциировано со снижением общей, безрецидивной и беспрогрессивной выживаемости, однако полученные результаты не достигли статистической значимости (р=0,9, р=0,5 и р=0,6 соответственно).

26

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Черненко, П.А. Молекулярно-генетический анализ предрасположенности к развитию меланомы кожи / П.А. Черненко, С.Б. Петерсон, Л.Н. Любченко // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11, № 2. - С. 11-19.

2. Черненко, П.А. Клинико-молекулярные аспекты предрасположенности к развитию меланомы кожи / П.А. Черненко, С.Б. Петерсон, Л.Н. Любченко // Саркомы костей, мягких тканей и опухоли кожи. - 2012. - № 1. - С. 42-51.

3. Черненко, П.А. Наследственная меланома кожи: клинико-молекулярная диагностика / П.А. Черненко, Л.Н. Любченко // Биотерапевтический журнал. -2012.-Т. 11,'№3. -С. 81-90.

1. Любченко, Л.Н. Клинико-генетическая гетерогенность меланомы кожи / Л.Н. Любченко, П.А. Черненко, М.А. Емельянова, С.А. Хатырев, Е.Е. Писарева, В.А. Шаманин, С.П. Коваленко, Т.В. Наседкина// Злокачественные опухоли. - 2012. -Т. 2,№2.-С. 81-90.

2. Черненко, П.А. Генетические и эпигенетические изменения гена CDKN2A у больных меланомой кожи / П.А. Черненко, Т.П. Казубская, A.B. Михайловский, Е.Б. Кузнецова, Л.Н. Любченко // Тезисы Евразийского форума по меланоме и опухолям кожи, 22-23 июля 2011 г.-М.,2011.- С. 28.

Подписано в печать 19.12.12. Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеШСору». Тираж 100 экз. Заказ № 1198. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Список других работ, опубликованных по теме диссертации:

Актуальность проблемы

Меланома кожи (МК) является одной из наиболее агрессивных форм рака. Во всем мире отмечается рост заболеваемости: в 2011 году в развитых странах было диагностировано 166 900 случаев МК [197], а средняя продолжительность жизни при распространенных стадиях не превышает 3-11 месяцев [68].

Результаты фундаментальных исследований, посвященных МК, кардинально изменили понимание молекулярно-генетических механизмов развития заболевания. Полногеномный скрининг показал зависимость последовательных генетических событий - изменений протоонкогенов, генов-супрессоров и микро- (мк) РНК генов от типа и анатомической локализации меланомы, а также определил их ключевую роль в дифференцировке и прогрессии, что позволяет рассматривать структурные и функциональные перестройки в качестве диагностических и/или прогностических маркеров [45, 130]. В результате классификационная система, основанная на клинических и гистологических критериях первичной опухоли, в настоящее время дополнена молекулярными характеристиками, составляющими диагностическую панель для ДНК-тестирования с целью индивидуализации лечебных подходов.

Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений при наследственной и спорадической формах МК, а также оценке диагностической значимости молекулярно-генетических перестроек в генах СВ1Ш2А и ВЯАГ как потенциальных прогностических маркеров МК.

Актуальность данной работы подтверждается тем, что, несмотря на значительные достижения лекарственной терапии ряда опухолей, успехи в лекарственном лечении меланомы остаются весьма скромными, о чем свидетельствуют неудовлетворительные и устойчиво низкие показатели выживаемости. В связи с этим особенно важно разработать эффективную систему прогнозирования и ранней диагностики МК.

Превалирующее значение в развитии наследственной формы МК принадлежит гену СОК№2А, мутации которого наблюдаются, по данным разных авторов, в 20-50% случаев, особенно в семьях, в которых у троих и более лиц диагностирована МК [106, 147].

Соматические мутации гена ВКАР являются наиболее частой молекулярно-генетической патологией при спорадической МК и наблюдаются в 40-88% случаев МК и в 74-82% случаев меланоцитарных невусов [34, 80, 98, 126,145, 166].

Идентифицировано более 40 различных точковых мутаций в гене ВКАР [52]. В подавляющем большинстве случаев МК обнаруживается активирующая точковая мутация Т1799А в 15 экзоне гена ВКАР (ВКАР Т1799А), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600-том аминокислотном • остатке соответствующего полипептида (У600Е), которая составляет до 90% всех мутаций гена ВКАР при МК [50]. Учитывая эти данные, соматическая мутация гена ВКАР У600Е является мишенью для таргетной терапии при МК, и идентификация данной мутации легла в основу многочисленных исследований в этой области. Цель исследования

Целью нашего исследования явилось определение частоты и спектра генетических и эпигенетических изменений генов СВКЫ2А и ВЯАР и их влияния на клиническое течение МК. Разработка и внедрение в клиническую практику молекулярно-генетической диагностики генов СЭКЫ2А и ВКАР при МК.

Задачи исследования:

1) Определение частотного спектра генетических и эпигенетических изменений генов СБШ2А и ВМР у больных МК.

2) Определение генетической гетерогенности МК с учетом молекулярной патологии.

3) Изучение клинических особенностей и отдаленных результатов лечения больных МК в зависимости от наличия у больных МК первичномножественных злокачественных опухолей.

4) Ретроспективная оценка влияния молекулярно-генетических нарушений генов CDKN2A и BRAF на клинико-морфологические особенности, клиническое течение и прогноз МК.

5) Разработка системы эффективного прогнозирования течения МК с использованием молекулярно-генетической диагностики с целью улучшения медико-генетической консультативной помощи.

Научная новизна исследования

Впервые на материале, собранном в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН с 1989 по 2010 гг., включающем пациентов из российской популяции, проведено молекулярно-генетическое исследование и показана инактивация гена CDKN2A, определена частота терминальных мутаций и аномального метилирования гена CDKN2A и установлена взаимосвязь этих изменений с клиническими характеристиками генетически детерминированной МК (средним возрастом заболевания, наличием ПМЗО и отягощенным семейным анамнезом).

Впервые на репрезентативной выборке пациентов с МК из российской популяции выполнено молекулярно-генетическое исследование по генотипированию соматических мутаций гена BRAF. Определены частота и показана неблагоприятная прогностическая значимость наличия соматических мутаций гена BRAF в отношении возраста манифестации МК, толщины опухоли по Бреслоу и размера первичной опухоли, а также в отношении частоты местных рецидивов с поражением регионарных лимфатических узлов и выживаемости больных МК.

Впервые в российской популяции были изучены больные МК в составе ПМЗО с использованием молекулярно-генетической диагностики. Наличие ПМЗО у больных МК является прогностически благоприятным фактором, поскольку первичная множественность ассоциирована с более поздним возрастом манифестации МК и улучшением общей выживаемости больных МК. Определена частота соматических мутаций гена BRAF у больных МК в составе ПМЗО.

Практическая значимость исследования

Систематизированные результаты проведенного клинико-молекулярного исследования будут использованы для выявления наследственно обусловленных форм МК и лиц с генетической предрасположенностью и высоким риском развития МК, что позволит сформировать клинико-генетический регистр, включающий больных МК и их родственников, отнесенных к контингенту повышенного генетического риска развития МК и ПМЗО с целью повышения эффективности медико-генетического консультирования семей. Выявление молекулярно-генетических перестроек гена СИКЫ2А, ассоциированных с высоким риском развития наследственной формы МК, позволяет осуществить диагностику предрасположенности к данной форме онкологического заболевания, а в дальнейшем, проведение необходимых клинико-диагностических и профилактических мероприятий по предотвращению развития болезни.

ДНК-диагностика соматических мутаций гена ВЯАЕ с использованием технологии биологических микрочипов позволит внедрить в рутинную клиническую практику высокопроизводительный тест для индивидуализации диагностики и лечения МК и МК в составе ПМЗО.

В связи с тем, что наличие мутаций гена ВЯАГ является прогностически неблагоприятным фактором, мутационный статус гена является показанием для назначения таргетной терапии и целенаправленного индивидуального подхода к ведению, лечению и профилактике пациентов с Я&^-ассоциированной МК.

Наличие ПМЗО у больных МК является прогностически благоприятным фактором, что необходимо учитывать при ведении пациентов этой группы.

Результаты исследования могут быть использованы в профессиональной деятельности врачей-онкологов и врачей-генетиков в медицинских учреждениях онкологического и генетического профиля, а также в процессе медико-генетического консультирования.

выводы

1. Инактивация гена CDKN2A выявлена в 34,5% случаев МК. Частота терминальных мутаций у пациентов с онкологически отягощенным семейным анамнезом составила 11,5%. Гиперметилирование гена CDKN2A является функцонально значимым при развитии МК и составляет 23%.

2. Манифестация МК в составе ПМЗО отмечена на 13 лет позже по сравнению с изолированным поражением МК (р=0,001).

3. Общая и беспрогрессивная выживаемость в группе пациентов с наличием нескольких первичных опухолей достоверно выше по сравнению с этими показателями в группе больных только МК (продолжительность жизни 118 и 40 мес. соответственно (р=0,007); время до развития прогрессирования 64 и 18 мес. соответственно (р=0,006)).

4. Частота соматических мутаций гена BRAF (V600E) у больных МК и МК в составе ПМЗО составила 49% и 33,3%, соответственно.

5. Проведена валидация использованных молекулярно-генетических методик определения соматических мутаций гена BRAF (V600E). Показано, что мутационный анализ с использованием биологических микрочипов и секвенирования обладает 100% чувствительностью и • специфичностью, тогда как чувствительность и специфичность определения Д&4^-статуса с использованием метода RT-ПЦР составляют 94,6%.

6. Возраст манифестации МК у пациентов с мутацией гена BRAF на 10 лет достоверно ниже по сравнению с пациентами с wt BRAF (р=0,002).

7. В группе пациентов с мутацией гена BRAF достоверно чаще встречалась толщина опухоли > 1 мм по сравнению с группой wt BRAF (р=0,05), что в свою очередь приводит к увеличению частоты местных рецидивов с поражением регионарных лимфоузлов (42% против 28,8%; р=0,1).

8. Наличие мутации гена BRAF ассоциировано со снижением общей, безрецидивной и беспрогрессивной выживаемости, однако полученные результаты не достигли статистической значимости (р=0,9, р=0,5 и р=0,6 соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Меланома кожи (МК) по особенностям роста, клиническому течению и прогнозу относится к числу наиболее злокачественных опухолей человека. Несмотря на все профилактические и терапевтические мероприятия МК по-прежнему остается одним из наиболее агрессивных и смертельно опасных злокачественных новообразований.

Рост заболеваемости МК отмечен практически во всех регионах мира и за последние 40 лет составил примерно 5% в год [175]. В России в 2007 г. зарегистрировано 7732 вновь выявленных случаев МК. Показатели заболеваемости составляют 3,6 случаев на 100 тысяч мужчин и 4,2 случая на 100 тысяч женщин. С 2002 по 2007 г. прирост абсолютного числа заболевших составил 17%.

МК, как одна из наиболее агрессивных форм рака, требует комплексного подхода к изучению этиологии и патогенеза, усовершенствования методов ранней диагностики и своевременного лечения с учетом индивидуального генотипа, а также разработки и внедрения в практику профилактических мероприятий.

Настоящее исследование посвящено одной из самых актуальных проблем в клинической онкологии: изучению генетической детерминированности, молекулярно-этиологических факторов и клинической гетерогенности МК и первично-множественных злокачественных опухолей, одной из локализаций которых является МК с учетом CDKN2A- и BRAF-статусов.

В качестве материала исследования были использованы клинические, семейные и молекулярные данные больных МК (п=112) с гистологически верифицированным диагнозом, проходивших обследование и лечение на базе НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Блохина» РАМН с 1989 по 2010 гг. Мужчин - 36/112 (32,1%), женщин - 76/112 (67,9%). 55 лет (<50 лет -39/112 (34,82%), >50 лет - 73/112 (65,18%)). Минимальный возраст выявления МК составил 18 лет, максимальный возраст - 91 год. Медиана наблюдения составила 21,5 месяц (1 - 232 месяцев).

На первом этапе был проведен ретроспективный анализ амбулаторных карт и стационарных историй болезни пациентов с МК. Были учтены и проанализированы такие клинические показатели, как возраст возникновения злокачественного новообразования, стадия заболевания, гистологические характеристики, локализация первичного очага, вовлеченность в злокачественный процесс регионарных лимфатических узлов, данные о рецидиве и отдаленных метастазах, проведенном лечении и его результатах, а также анамнестические, клинические и лабораторные данные относительно первично-множественных опухолей и наследственного характера заболевания.

На следующем этапе было выполнено молекулярно-генетическое исследование образцов ДНК больных МК, выделенной из лимфоцитов периферической крови и со срезов парафиновых блоков, с целью выявления терминальных мутаций и статуса метилирования гена CDKN2A в 26 образцах МК. Определение мутационного статуса гена CDKN2A выполнено с использованием метода SSCP (от англ. Single Strand Conformation Polymorphism, полиморфизм конформаций одноцепочечных фрагментов ДНК). Определение статуса метилирования гена CDKN2A выполнено на ДНК, выделенной со срезов опухолевого материала, с использованием метилчувствительной полимеразной цепной реакции.

Соматические мутации гена BRAF определялись в ДНК, выделенной со срезов парафиновых блоков 112 образцов опухолевой ткани включенных в исследование больных МК, в том числе 42 образцов (37,5%), полученных от пациентов с первично-множественными злокачественными образованиями (ПМЗО), одной из локализаций которых являлась МК. Анализ наличия мутации V600E в гене BRAF проводили с использованием биологических микрочипов, позволяющих определять наиболее часто встречающуюся мутацию V600E в кодоне 600 гена BRAF. Кроме того, детекция мутации гена BRAF (V600E) в 56 образцах была выполнена с использованием другого подхода (аллель-специфичной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, RT-ПЦР).

В первой части нашей работы мы исследовали инактивацию гена CDKN2A, отвечающего за наследственную предрасположенность к МК. В исследовании Peric В. с соавторами терминальные мутации гена CDKN2A наблюдаются у < 25% больных МК [143]. Аналогичные данные были получены Goldstein A.M. с соавторами при исследовании пациентов с МК - частота терминальных мутаций гена CDKN2A колеблется в пределах 10-25% [76]. В нашем исследовании терминальные мутации во втором экзоне гена CDKN2A были выявлены у 11,5% (3/26) пациентов, что согласуется с литературными данными. Соответственно, дикий тип гена был обнаружен в 88,5% случаев (23/26).

Средний возраст пациентов с терминальными мутациями в гене CDKN2A составил 50 лет. Важно отметить, что в исследование были включены семейные случаи МК. У трех из 26 (11,5%) больных МК в семье был родственник, пораженный аналогичным заболеванием. Однако при изучении аномалий гена у этих больных мутаций во втором экзоне гена CDKN2A обнаружено не было. Случаев поражения МК родственников больных-носителей мутаций в гене CDKN2A отмечено не было, однако прослеживалось накопление случаев злокачественных опухолей женской репродуктивной системы у всех 3 изучаемых больных. У больной С. МК была диагностирована в 41 год, ее бабушка по линии отца получала лечение по поводу билатерального рака молочных желез и рака тела матки. Больной Ч., мать которой умерла от прогрессирования рака тела матки, диагноз МК был поставлен в 48 лет. У больного Ф. МК была диагностирована в 66 лет, мать пациента болела раком тела матки.

К основным клиническим критериям наследственной МК, помимо раннего возраста манифестации заболевания и первично-множественных очагов поражения, относится наличие большого количества пигментных невусов на коже. Синдром, основным проявлением которого является большое количество невусов на поверхности кожи, некоторые из которых клинически атипичны, получил название синдрома множественных диспластических невусов, ассоциированного с меланомой (FAMMM-синдром, Familial Atypical Multiple Mole Melanoma syndrome). Однако в работе Newton Bishop J. с соавторами было продемонтрировано, что взаимосвязь между FAMMM-синдромом и наличием терминальных мутаций гена CDKN2A у больных МК не является настолько определяющей и нельзя использовать факт наличия данного синдрома в качестве фактора, предсказывающего CDKN2А-статус [26]. В нашем исследовании у больных-носителей терминальных мутаций гена CDKN2A пигментных невусов на коже не наблюдалось.

Гиперметилирование промотора гена CDKN2A является частым событием в канцерогенезе различных видов опухолей, включая МК. Straume О. с соавторами при исследовании 202 образцов МК обнаружили, что частота аномального метилирования промоторной области гена CDKN2A составляет 19% [174]. При исследовании 101 образца, полученного от 34 меланом, Rastetter M. с соавторами обнаружили гиперметилирование этого гена в 52% случаев [148]. В нашем исследовании аномальное метилирование промоторного района гена CDKN2A было выявлено у 23% (6/26) больных МК. Средний возраст пациентов с гиперметилированием составил 64 года. Семейный анамнез был отягощен злокачественными образованиями различным локализаций у 66,7% (4/6) больных. При этом аномальное метилирование гена CDKN2A отмечалось у всех включенных в исследование больных с ПМЗО (п=3), позволяя предположить, что гиперметилирование гена CDKN2A является функционально значимым при развитии как МК, так и ПМЗО. Таким образом, эти данные подтверждают, что ПМЗО являются генетически детерминированными, и в канцерогенезе ПМЗО задействовано гиперметилирование гена CDKN2A.

В целом инактивация гена CDKN2A была отмечена в 34,5%. Средний возраст пациентов с мутацией гена CDKN2A был на 14 лет ниже (50 лет) по сравнению со средним возрастом пациентов с гиперметилированием данного гена (64 года). ПМЗО у больных с мутацией гена выявлены не были, а у больных с аномальным метилированием наблюдались в 50% случаев. При этом семейный анамнез, отягощенный различными злокачественными

118 новообразованиями, наблюдался у всех (100%) пациентов с мутацией и у 66,7% больных МК с гиперметилированием гена СОКЫ2А.

Во второй части нашей работы была выполнена ДНК-дигностика образцов опухолевой ткани 102 больных МК с целью определения мутационного статуса гена ВЯАР. Соматические мутации гена ВЯАР являются наиболее частой молекулярно-генетической перестройкой при МК и наблюдаются по данным разных авторов в 40-88% случаев [34, 80, 98, 126, 145, 166]. В подавляющем большинстве случаев. МК обнаруживается активирующая точковая мутация Т1799А в 15 экзоне гена ВЯАР (ВЯАРТ1799А), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600-том аминокислотном остатке соответствующего полипептида (У600Е), которая составляет около 90% всех мутаций гена ВЛАР при МК [50].

Молекулярно-генетическое исследование гена ВЛАР был проведено с использованием двух методик: 102 образца опухолевой ткани было исследованы при помощи метода биологических микрочипов, из них 56 образцов было протестировано с использованием аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. При этом расхождение в результатах было выявлено в 3-х образцах, соответственно результаты исследования совпали для 53 из 56 образцов (94,6%). Образцы, по которым было выявлено расхождение результатов, были повторно исследованы методом биологических микрочипов с выделением ДНК и последующим ресеквенированием. В этих трех образцах мутация У600Е гена ВЛАР была повторно подтверждена, что свидетельствует о высокой специфичности и чувствительности метода биочипов. Расхождение результатов может быть связано с различной чувствительностью методик, а также с генетической гетерогенностью самой опухолевой ткани, которая может давать различные результаты ДНК-диагностики, что в свою очередь было продемонстрировано в статье Уапсоукг М. с соавторами (2012) на большом клиническом материале МК (112 опухолевых образцов от 73 больных МК) [199]. Метод детекции соматической мутации У600Е гена ВЯАР с использованием биочипов был валидирован в Лаборатории молекулярной

119 диагностики (руководитель лаборатории - Professor Dr. Dieter Zimmermann) Института клинической патологии (директор - Professor and Chairman Holger Moch) Университетского госпиталя г. Цюриха, Швейцария (Institute of Surgical Pathology at the University Hospital in Zürich, Switzerland) путем автоматического секвенирования 15 экзона гена BRAF. Расхождения результатов выявлено не было, что подтверждает 100%-ную чувствительность и специфичность обеих методик. Соматическая мутация V600E гена BRAF была обнаружена у 50 из 102 (49%) пациентов, что согласуется с данными литературы [34, 80, 98, 126, 145, 166].

Для изучения клинических характеристик МК в зависимости от статуса гена BRAF больные были разделены на 2 группы: с мутацией гена BRAF - mt BRAF (п=50) и без мутации - wt BRAF (п=52). Медиана времени наблюдения больных составила 21,5 месяцев (1-232 мес.). Средний возраст всей выборки больных равнялся 55 месяцам (18-91 год). Возраст манифестации МК был достоверно ниже в группе пациентов с мутацией гена BRAF (р=0,002). Разница в возрасте больных МК, составившая 10 лет, статистически значимо зависела от мутационного статуса гена BRAF. При этом больных моложе 50 лет было достоверно больше в группе с наличием мутации гена BRAF (р=0,001), аналогичные данные были получены в других исследованиях. В работе Liu W. с соавторами был исследован 251 пациент с МК, и было показано, что мутация гена BRAF V600E чаще встречается у пациентов в возрасте < 50 лет по сравнению с пациентами старше 50 лет (р=0,001) [121]. В исследовании Shinozaki М. с соавторами, было оценено 59 больных МК [166]. Наиболее часто мутации гена BRAF наблюдались у больных младше 60 лет (р=0,001). При этом частота мутаций была > 50% у пациентов < 40 лет по сравнению с < 10% у пациентов > 70 лет. В нашем исследовании в группе больных моложе 50 лет при наличии мутации лимфоидная инфильтрация и толщина опухоли > 1 мм встречались чаще (р=0,08 и р=0,09 соответственно).

Кроме того, в общей выборке в группе с мутацией гена BRAF чаще встречались женщины по сравнению с мужчинами (74% против 38,5%; р=0,1),

120 аналогичные данные были получены в работе Shinozaki М. с соавторами (45% против 23%; р=0,09) [166]; При разделении пациентов на 2 группы: мужчины и женщины были получены тенденции к достоверному различию: у мужчин при наличии мутации отдаленное прогрессирование развивалось позже (р=0,06), а у женщин при наличии мутации местный рецидив развивается раньше (р=0,07). Аналогичных работ в литературе мы не встретили.

Для оценки распространенности злокачественных заболеваний используется международная классификация TNM. На основе этой классификации определяются прогноз, выбор тактики лечения и ведения пациентов, а также оценка результатов лечения. В этой классификации показатель Т отражает размеры и распространенность первичной опухоли. В нашем исследовании при оценке первичной опухоли после исключения больных, у которых данный показатель был неизвестен, оказалось, что показатель Т1 достоверно чаще наблюдался в группе без мутации (15,4%) по сравнению с группой с наличием мутации (2%) (р=0,03).

В группе пациентов с мутацией достоверно чаще встречалась толщина опухоли > 1 мм (р=0,05), что является особенно важным, поскольку толщина опухоли по Бреслоу признана одним из наиболее точных прогностических факторов на ранних стадиях развития МК [61].

Поверхностно-распространяющаяся форма МК была характерна для группы без мутации (21,2% против 8% в группе с мутацией; р=0,1). Аналогичные данные были представлены в работе Pacheco I. с соавторами [138], хотя в исследовании Liu W. с соавторами мутация V600E гена BRAF достоверно чаще определялась при поверхностно-распространяющейся МК (р=0,055) [121].

Наличие мутации гена BRAF было ассоциировано с тенденцией к более частому возникновению изъязвления по сравнению с группой без мутации (66,7% и 47,7%, соответственно; р=0,07), в связи с чем частота развития местных рецидивов и поражения регионарных лимфатических узлов также была достоверно выше в группе больных с мутацией гена BRAF по сравнению с

121 группой без мутации (53,3% и 19%, соответственно; р=0,01).

В работе Maldonado J.L. с соавторами было показано, что трансверсия Т>А, связанная с мутацией V600E, не является результатом УФ-индуцированного повреждения ДНК [126]. В исследовании Bauer J. с соавторами было продемонстрировано, что меланомы, ассоциированные с мутацией в гене BRAF, развиваются в молодом возрасте при суммарно низких дозах воздействия УФ-лучей [21]. Curtin с соавторами более детально изучили данную взаимосвязь [45]. Оказалось, что большинство образцов МК с отсутствием хронического солнечного повреждения (средние уровни УФ-экспозиции) имели мутации в генах BRAF или NRAS (59% и 22% соответственно). Общая частота мутаций этих генов была значительно ниже в опухолях кожи с наличием хронического солнечного повреждения или расположенных на участках, не подвергающихся воздействию солнечных лучей. Это свидетельствует о том, что мутация гена BRAF не связана с влиянием УФ-излучения и чаще наблюдается в группе МК со средними (промежуточными) показателями солнечной экспозиции. В нашей работе не было выявлено статистически достоверного влияния мутации на локализацию первичного опухолевого очага, хотя расположение очагов на туловище было выявлено чаще при наличии мутации гена гена BRAF (44% в группе mt BRAF против 38,5%) в группе wt BRAF), а на конечностях и голове, доступных для воздействия солнечных лучей, мутация чаще отсутствовала (56% в группе mt BRAF против 61,5% в группе wt BRAF) (р=0,6). Отягощение семейного анамнеза случаями МК чаще наблюдалось в группе с мутацией гена BRAF (6% и 3,8% соответственно; р=0,6), хотя в исследовании Liu W. с соавторами [121] такой взаимосвязи выявлено не было (р=0,4).

Что касается отдаленных результатов лечения, в 2007 году было проведено исследование [180], в котором анализировался мутационный профиль генов BRAF и NRAS в биопсийных образцах и соответствующих клеточных линиях очагов метастатического поражения 109 больных меланомой (III и IV стадии), а также влияние этих мутаций на выживаемость. Были

122 получены следующие результаты: в сравнении с генами «дикого типа» у пациентов, опухоли которых несли мутации гена BRAF, было выявлено снижение медианы выживаемости (8,0 против 11,8 месяцев, р = 0,055). Другое аналогичное исследование [167] включало 103 пациента со стадиями заболевания I-IV, которые получали биохимиотерапевтическое лечение. У 38 пациентов (37%) были обнаружены ЯЯЛ^Р-мутации. Наличие этих мутаций было связано со значительным снижением показателей общей выживаемости (р=0,04). У большинства пациентов с IV стадией, не ответивших на лечение, наблюдались циркулирующие уровни белка BRAF в крови после окончания терапии. Присутствие мутаций гена BRAF у этих пациентов было связано с отсутствием клинического ответа, а также со снижением общей выживаемости. Исследование Jovanovic В. с соавторами [101] показало, что у пациентов с присутствием мутаций гена BRAF и изъязвления в образцах меланомы наблюдалось значительное снижение выживаемости по сравнению с пациентами без таковых (р=0,001). Частота ЯКЛ/^-мутаций была в два раза выше в группе пациентов с выживаемостью менее 5 лет.

В исследовании, проведенном в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, при анализе отдаленных результатов лечения больных МК в зависимости от мутационного статуса гена BRAF оказалось, что продолжительность жизни в группе пациентов с наличием мутации была ниже на 27 месяцев, чем в группе без мутации (медианы продолжительности жизни при mt BRAF 40 месяцев против wt BRAF - 67 месяцев). Как и в представленных выше работах в нашем исследовании наличие мутации гена BRAF было связано с неблагоприятным прогнозом, однако полученные результаты не достигли статистической значимости (р=0,6).

При анализе безрецидивной и беспрогрессивной выживаемости были выявлены аналогичные показатели: наличие мутации было ассоциировано со снижением времени до развития местного рецидива и прогрессирования, однако результаты не достигли статистически значимых различий (р=0,5 и р=0,6 соответственно).

Таким образом, мы не получили статистически значимых различий в безрецидивной, беспрогрессивной и общей выживаемости у больных МК. Поскольку 84% образцов МК, включенных в наше исследование, представляли собой первичные опухоли, можно предположить, что наличие мутации гена ВЯАГ в первичной опухоли не оказывает отрицательного влияния на выживаемость без прогрессирования или общую выживаемость, однако обнаружение этих мутаций в очагах метастатического поражения, возможно, будет ассоциировано с ухудшением прогноза заболевания у больных МК. Результаты подобных исследований, подтверждающих данное предположение, описаны в литературе. НоиЬеп К. с соавторами продемонстрировали, что наличие ЯКЛ.Р-мутаций в первичной опухоли не оказывало отрицательного влияния на выживаемость без прогрессирования (р = 0,74) или общую выживаемость (р = 0,28), однако наличие этих же мутаций в очагах метастатического поражения было связано со значительно худшим прогнозом и снижением показателя общей выживаемости (р = 0,02) [93].

Изучаемая выборка больных МК, включенных в исследование, содержала 42 пациента с ПМЗО, что составило 37,5%. Многие вопросы этиологии и патогенеза ПМЗО остаются до конца не изученными, и генетическая основа их развития все еще не определена. Имеющиеся данные подтверждают, что наличие семейных накоплений злокачественных образований является наиболее существенным фактором риска развития опухолей различных локализаций. Это обосновывает необходимость исследования больных МК с ПМЗО.

Все больные с ПМЗО были включены в молекулярно-генетический скрининг с целью определения мутационного статуса ВЯАР. Подобных работ в литературе нами встречено не было.

В нашем исследовании средний возраст пациентов с ПМЗО составил 63 года. Мужчин - 16/42 (38,1%), женщин - 26/42 (61,9%). Семейный анамнез этих пациентов не был отягощен случаями МК. В трети случаев второй локализацией ПМЗО был рак молочной железы (33,3%), второе место занимал рак кожи (базальноклеточный и плоскоклеточный) (19%). Медиана времени

124 наблюдения больных в группе ПМЗО+ составила 45 месяцев (1-232 мес.). Для проведения сравнительного анализа клинических признаков, ассоциированных с наличием ПМЗО, 112 больных МК были разделены на 2 группы: 70 больных только МК (ПМЗО-) (%) и 42 больные с ПМЗО (ПМЗО+) (37,5%), одной из локализаций которых была МК.

В исследовании Bellet R.E. с соавторами было показано, что больные МК с наличием другой злокачественной опухоли в анамнезе были значительно старше на момент постановки диагноза МК по сравнению с больными только МК [22]. В нашей работе у больных с ПМЗО МК развивается на 13 лет позже по сравнению с больными только МК. Средний возраст больных на момент постановки диагноза МК достоверно различался между двумя группами: в группе ПМЗО+ он составил 63 года, а в группе ПМЗО- 50 лет (р=0,001). Кроме того, больные МК в возрасте до 50 лет статистически значимо преобладали в группе без ПМЗО (ПМЗО+ 14,3% против ПМЗО- 47,1%), а больные МК 50 лет и старше чаще встречались в группе с наличием ПМЗО (ПМЗО+ 85,7% против ПМЗО- 52,9%) (р=0,0001). Изъязвление первичной опухоли достоверно чаще встречалось в группе ПМЗО- (58,6%) по сравнению с группой ПМЗО+ (33,4%) (р=0,03). Аналогичная ассоциация была отмечена в отношении лимфоидной инфильтрации: в группе без ПМЗО (30%) по сравнению с группой с наличием ПМЗО (14,3%) (р=0,01). При этом отягощение семейного анамнеза случаями МК статистически значимо преобладало в группе без ПМЗО (14,3%), тогда как в группе с наличием ПМЗО отягощение семейной истории случаями МК выявлено не было (р=0,01).

В исследовании Duchateau C.S. с соавторами было показано, что пациенты с ПМЗО имеют значительно лучшие показатели выживаемости по сравнению с больными, имеющими единственную злокачественную опухоль (р=0,029) [59]. Doubrovsky А. с соавторами изучали пациентов с первично-множественной МК и пришли к выводу, что продолжительность жизни пациентоа с множественными очагами МК значительно выше по сравнению с пациентами с единичным поражением (р=0,01) [57]. Данные об улучшении

125 выживаемости больных с ПМЗО были также представлены в работах Vénugopal В. с соавторами и Aguiló R с соавторами [6, 187].

В нашей работе при анализе отдалённых результатов лечения больных МК было показано, что продолжительность жизни в группе пациентов с наличием нескольких первичных опухолей достоверно выше по сравнению с продолжительностью жизни в группе больных только МК (р=0,007), что согласуется с данными литературы. Однолетняя общая выживаемость была выше у пациентов с ПМЗО: в группе ПМЗО- составила 93%, а в группе ПМЗО+ равнялась 95%. Соответственно, частота местных рецидивов и отдаленного прогрессирования была выше в группе больных только МК, возможно, это связано с большей частотой изъязвления первичной опухоли у этих больных. Однако данные показатели не достигли статистической значимости (р>0,05). Кроме того, по нашим данным, наличие ПМЗО у больных МК увеличивает беспрогрессивную (64 и 18 мес. соответственно, р=0,006) и безрецидивную (83 и 48 мес. соответственно, р=0,16) выживаемость.

Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют о том, что наличие ПМЗО у больных МК является прогностически благоприятным фактором. ПМЗО является одним из критериев генетической детерминированности, ассоциированной с терминальными молекулярными перестройками высоко- и низко-пенентрантных генов. В ряде работ показано, что консервативные терминальные генетические дефекты определяют молекулярный патогенез наследственных опухолей, связанный со снижением/отсутствием репарации двунитевых разрывов ДНК. Этот факт связан с лучшим ответом на проводимое химиотерапевтическое лечение [96, 107, 108]. Таким образом, влияние проведенного лечения, а также выявление последующих злокачественных образований на ранней стадии в связи с прицельным наблюдением по поводу первичной опухоли могут объяснить улучшение показателей выживаемости больных с ПМЗО.

Кроме того, в работе A.latif S.I. с соавторами были проанализированы механизмы, лежащие в основе зарождения и развития ПМЗО [10]. Раковые

126 клетки обладают способностью продуцировать патологические сигналы, которые могут восприниматься только мутантными рецепторами. Кроме того, они также могут контролировать нормальные клетки за счет секреции различных хемокинов, а также способности к образованию новых кровеносных сосудов. Поскольку злокачественные клетки первичной опухоли используют окружающую среду для обеспечения своего роста и выживания, они способны контролировать рост и деление клеток другой злокачественной опухоли в результате продукции подавляющих сигналов, влияющих на мутантные рецепторы раковых клеток иного происхождения (другая первичная опухоль). Ингибирование второй первичной опухоли будет зависеть от типа и силы сигналов, продуцируемых первой опухолью. Если сигналы эквивалентны, возможно развитие ПМЗО. Но в этом случае вследствие подавляющего влияния рост и распространение будут происходить в более медленном темпе, что приведет к увеличению показателей выживаемости пациентов. Эта теория объясняет, что несмотря на влияние генетических факторов и воздействие неблагоприятных условий внешней среды, которые могут вызвать инициацию различных видов злокачественных опухолей, развитие ПМЗО у пациентов является довольно редким явлением. Вторая первичная опухоль может появиться только после лечения или удаления первого очага, так как он продуцирует ингибирующие сигналы в отношении развития последующих образований. Этой теорией можно объяснить более благоприятные клинико-морфологические характеристики больных МК в составе ПМЗО, а также увеличение показателей выживаемости.

При оценке мутационного статуса гена BRAF у больных МК с наличием второй злокачественной опухоли оказалось, что ПМЗО достоверно чаще обнаруживаются при отсутствии мутации гена BRAF (50% против 26% в группе mt BRAF; р=0,01). У больных МК с наличием вторых первичных опухолей мутации гена BRAF были выявлены в 33,3% случаев. Это может говорить о том, что в патогенез ПМЗО, кроме соматических мутаций гена BRAF, вовлечены другие структурно-функциональные дефекты, в связи с чем требуется

127 расширение молекулярно-генетической диагностической панели при ПМЗО.

При разделении всех больных на две группы (молодые - возраст менее 50 лет и пожилые - возраст 50 лет и более) ПМЗО достоверно чаще встречались в группе больных МК менее 50 лет при отсутствии мутации гена BRAF (mt BRAF 7,7% против wt BRAF 36,4%; р=0,05).

При анализе отдалённых результатов лечения больных МК с ПМЗО в зависимости от наличия мутации гена BRAF статистически достоверного влияния на общую и безрецидивную выживаемость выявлено не было. Однако наличие мутации гена BRAF было ассоциировано с достоверным улучшением беспрогрессивной выживаемости у больных МК с ПМЗО. Медиана времени до прогрессирования у этих больных в группе mt BRAF составила 155 месяцев, что на 127 месяцев больше по сравнению с больными МК с ПМЗО в группе wt BRAF (р=0,01). В нашей работе получено улучшение беспрогрессивной выживаемости, что может быть связано с проводимым химиотерапевтическим лечением. Видимо, несмотря на то, что мутации гена BRAF являются прогностически неблагоприятным фактором, наличие у больных МК ПМЗО является определяющим вследствие неизвестного потенциального молекулярно-генетического дефекта, а также взаимоподавляющего влияния множественных опухолей.

На основании проведенного исследования можно сделать следующие выводы: своевременная идентификация генетических нарушений у больных МК позволяет улучшить диагностику данного заболевания, прогнозировать его течение, разрабатывать наиболее эффективную стратегию для лечения уже протекающего заболевания и осуществлять профилактику других злокачественных новообразований, что особенно актуально не только для заболевших пациентов, но и для их практически здоровых родственников, у которых еще не возникла опухолевая патология.