Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение иммуномодулирующих и репаративных свойств эспа-липона

На правах рукописи

Кулько Ирина Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ И РЕПАРАТИВНЫХ СВОЙСТВ ЭСПА-ЛИПОНА

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск - 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Смахтин Михаил Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна кандидат медицинских наук Нечаев Олег Григорьевич

Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский университет

Зашита состоится «оСо » ЦЦ-ДЦУЛ & 2004 г. в « 15» часов на заседании диссертационного Совета Д 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГМУ.

Автореферат разослан « лч » 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Калуцкий П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях патологии существенная роль в развитии заболевания принадлежит целостности клеточных мембран органов и тканей. Усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) приводит к нарушению структуры клеточных мембран и повышению их проницаемости. Вследствие этого усиливается выход в сосудистое русло компонентов цитоплазмы, клеточных органелл и продуктов метаболизма клеток, обладающих выраженной иммуномодулирующей активностью (Прокопенко Л.Г. и др., 1998; Ласкова И.Л., 1995; Вгелгт й а1., 1993). Накопление в крови этих субстанций сопровождается изменениями гомеостаза и выраженными иммунными сдвигами (Конопля А.И., 2004; Иванова А.П., 1995), в свою очередь оказывающими существенное влияние на восстановление поврежденного органа (Бабаева А.Г., 1999).

Те же процессы наблюдаются и при патологии печени. Химизация про-, изводства, быта и медицины, алкоголизм, наркомания, увеличение количества хирургических вмешательств и переливаний крови способствуют росту заболеваний печени (Подымова С.Д., 1993). В связи с этим поиск новых и доступных способов иммунокорригирующей терапии, одновременно усиливающих и регенераторные потенции печени, представляется особенно актуальным.

В этих условиях можно предполагать перспективность применения препаратов, активирующих энергетический метаболизм клеток и обладающих антитоксическими свойствами. К числу таких соединений относится альфа-липоевая кислота, которая является действующим началом такого лекарственного препарата, как эспа-липон. Известно, что липоевая кислота обладает выраженными антитоксическими эффектами и по своим антидотным свойствам превосходит другие тиоловые соединения, например, унитиол.

В то же время иммунотропные эффекты эспа-липона при токсических гепатопатиях практически не известны. Не изучены механизмы влияния этого препарата на иммунную систему и их взаимосвязь с репаративными процессами. Такое положение не дает полного представления об иммунотропной эффек-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ )

БИСЛ ПОТЕКА 1 3

тивности эспа-липона и возможных механизмах его влияния на восстановление печени.

Цель работы: изучение иммунотропных и репаративных свойств эспа-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.

Задачи исследования:

1. Выявить влияние эспа-липона на выраженность гуморального иммунного ответа, гиперчувствительность замедленного типа и функциональную активность нейтрофилов в физиологических условиях.

2. Изучить иммуномодулирующие эффекты эспа-липона в условиях острой токсической гепатопатии различного генеза.

3. Установить роль спленоцитов в реализации иммуномодулирующих эффектов эспа-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.

4. Выяснить влияние эспа-липона на репаративную регенерацию и функциональную активность гепатоцитов. в условиях экспериментального токсического поражения печени.

5. Изучить иммунокорригирующую и гепатопротекторную эффективность сочетанного введения эспа-липона с тиамином при патологии печени. .

Основные положения, вытосимые на защиту.

1. Эспа-липон (5 и 50 мг/кг) стимулирует развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцированных эритроцитами барана, повышает функциональную активность нейтрофилов периферической крови в физиологических условиях.

2. Эспа-липон (50 мг/кг) в условиях острого токсического поражения печени, вызванного различными по природе и механизму действия токсикантами, оказывает выраженный иммунокорригирующий эффект.

3. Введение эспа-липона (50 мг/кг) снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени, процессов перекисного окисления липидов и активирует репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях острой тетра-

хлорметановой гепатопатии.

4. Эспа-липон стимулирует выделение прилипающими к стеклу спле-ноцитами гуморальных факторов, корригирующих иммунотропные и гепато-тропные эффекты токсикантов, а также стимулирующих процессы физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов.

5. В условиях отравления индометацином комбинация эспа-липона с тиамином по иммунокорригирующей и гепатопротекторной активностям более эффективна, чем каждый из препаратов по отдельности.

Научная новизна. Показана высокая иммунокорригирующая активность эспа-липона в условиях нарушенной иммунной реактивности, индуцированной введением гепатотропных токсикантов. Экспериментально обоснована возможность коррекции эспа-липоном нарушений оксидантного и антиокси-дантного статусов, функциональной активности гепатоцитов и стимуляции их репаративной регенерации при острой патологии печени.

Показана существенная роль изменений проницаемости клеточных мембран гепатоцитов в иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектах эспа-липона при патологии печени.

Получены данные о взаимодействии иммунокомпетентных клеток и ге-патоцитов, углубляющие существующие представления о механизмах сохранения иммунного гомеостаза в условиях токсического поражения печени. Выявлена роль прилипающих к стеклу клеток селезенки и спленоцитарных цитоки-нов животных, получавших эспа-липон, в коррекции иммунных нарушений в условиях токсического поражения печени. Показана г возможность усиления иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектов при использовании эспа-липона в комбинации с тиамином.

Практическая значимость. Установлены дозы, способы и схемы введения эспа-липона, приводящие к устойчивым иммуномодулирующим эффектам в условиях патологии, характеризующейся нарушением иммунной реактивности, что может быть использовано для профилактических и лечебных целей. Экспериментально выявлена перспектива использования эспа-липона для

иммунокоррекции при токсических поражениях печени, вызванных различными по химической природе токсикантами.

Экспериментально доказана возможность применения эспа-липона в качестве иммуномодулятора, антиоксиданта и средства, активирующего репара-тивные процессы в печени в условиях токсической гепатопатии. Показана высокая эффективность сочетанного введения эспа-липона и тиамина при патологии печение

Результаты работы используются в учебном процессе медицинских вузов (Воронеж, Самара,* Иваново, СанктгПетербург) и расширяют современные, представления о закономерностях иммуномодулирующего, антиоксидантного и гепатопротекторного действия эспа-липона и его комбинации с тиамином в условиях патологии печени.

Материалы диссертации вошли в рабочие учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии, биохимии, клинической иммунологии? и пропедевтики внутренних болезней КГМУ.

Апробация результатов работы. Основные положения диссертации обсуждены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2002, 2004), Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001, 2002), V Конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 2002), IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002), совместном заседании кафедр фармакологии; биологической химии, микробиологии, пропедевтики: внутренних болезней Государственного образовательного учреждения* высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (2003).

Публикации. Результаты проведенных исследований полностью отражены в 7 научных работах в центральной и местной печати, в которых содержится •, полный объем информации, касающейся темы диссертации.

Структура и объем работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы; главы «Материалы и методы исследования», 5-ти глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 205 источников: на русском, и 61 - на иностранном языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ»

Материалы и методы исследования

Исследования проведены на 1430 крысах Вистар массой 180-220 г и 160 мышах-гибридах И (СБЛ*С57БЬ) массой 18-22 г, полученных из питомника «Столбовая» (г. Москва). Объектом исследования служили кровь, сыворотка крови, клетки селезенки, ткань печени, подколенные лимфатические узлы.

Исследуемые соединения и экспериментальные модели. Эспа-липон 300 (Ефагша, Германия), содержащий в ампуле 12 мл раствора для инъекционного применения: (1 мл содержит 32,3 мг этилендиаминовой соли альфа-липоевой кислоты, что соответствует 25 мг альфа-липоевой кислоты), вводили внутривенно и внутрибрюшинно десятикратно с интервалом 24 часа между инъекциями в дозах 5 и 50 мг/кг на одну инъекцию.

При изучении иммунотропной активности препарата также использовали схему пятикратного введения препарата до иммунизации. В качестве препарата сравнения использовали тиамин, который вводили десятикратно в разовой дозе 1 мг/кг массы тела.

Токсическую гепатопатию у лабораторных животных моделировали путем введения индометацина (Скакун Н.П., Климнюк Е.В., 1990) или четырех-хлористого углерода (ЧХУ) (Конопля А.И., 1989). Выбранные дозы и схемы введения токсикантов обусловливали развитие цитолитического, холестатиче-ского, мезенхимально-воспалительного и гепатодепрессивного синдромов поражения печени. .

Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа. В качестве антигена в опытах использовались эритроциты барана

(ЭБ). Кровь консервировали в растворе Ольсвера, хранили ее при температуре +4°С и использовали для приготовления взвеси эритроцитов. Перед приготовлением 5% взвеси их несколько раз отмывали изотоническим раствором хлористого натрия путем центрифугирования при 400 g в течение 10 минут»

Развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) индуцировали эритроцитами барана, которые вводили внутрибрюшинно, однократно из расчета 2х108 клеток на 1 кг массы тела. Выраженность ГИО на ЭБ оценивали на 5-е сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообра-зующих клеток (АОК) (Мальберг К., Зигль Э., 1987) и розеткообразующих клеток (РОК) (Зауэр X., 1987).

Для развития гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) крысам внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую дозу ЭБ в виде 0,1 мл 0,5%-ной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия, содержащей 106 ЭБ. Через 4 суток в подушечку стопы правой лапки вводили 108 ЭБ в 0,1 мл физиологического раствора (разрешающая доза), а в подушечку левой лапки - 0,1 мл изотонического раствора хлорида натрия (контроль). Спустя 24 часа животных умерщвляли и выделяли регионарный (по месту введения ЭБ) и контралате-ральный (по месту введения изотонического раствора хлорида натрия) подколенные лимфоузлы. О выраженности ГЗТ судили по разнице масс (РМ) регионарного и контралатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них ядросодержащих клеток (РК) (Федосеева Т.В. и др., 1993).

Оценка кислородзависимых механизмов защиты и фагоцитарной активности нейтрофилов. Фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови исследовали после их инкубации с латексом (Медведев А.Н. и др. 1991] Фримель Г., 1987), по уровню фагоцитарного индекса (ФИ) и фагоцитарного числа (ФЧ). ФИ (процент нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе) и ФЧ (среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому (Медведев А.Н. 1991).

Активность кислородзависимых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Параллель-

но со спонтанным (НСТ-сп.) ставили стимулированный (НСТ-инд.), при этом в качестве стимулятора использовали зимозан. При микроскопии определяли количество (в %) диформазан-положительных клеток (Виксман М.Е. и др. 1979; Щербаков В.И» 1989). Функциональный резерв рассчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста.

Фракционирование клеток селезенки.. Получение культуральной жидкости спленоцитов и их фракций. Ткань селезенки извлекали в асептических условиях, гомогенизировали. Суспензию дважды отмывали средой 199 в течение 10 мин при 200g. Аутологичные эритроциты удаляли гемолитическим шоком. Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (Полушкина Э.Ф., 1983). Количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Иммуномодулирующую активность спленоцитов и их фракций определяли путем однократного внутривенного введения в дозе 2х107 клеток интактным аллогенным реципиентам одновременно с иммунизацией ЭБ в день последнего введения спленоцитов.

Прилипающие и неприлипающие клетки селезенки культивировали в течение 4 часов и готовили пул надосадочной жидкости прилипающих и не прилипающих к стеклу спленоцитов (НЖСПи НЖСН), содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных (Прокопенко Л.Г. и др., 1982; Конопля НД, 2001). Концентрацию белка в надосадочной жидкости определяли с использованием красителя Кумаси в-250 по Бредфорд. Иммуномодулирующую активность НЖСП и НЖСН определяли путем однократного внутрибр;.!шинно-го введения интактным аллогенным реципиентам из расчета 5 мг белка на 1 кг массы тела одновременно с иммунизацией ЭБ.

Гель-хроматографическое разделение надосадочной жидкости проводили на сефадексе в-150. Для определения иммуномодулирующей активности полученные хроматографические фракции вводили интактным аллогенным реципиентам однократно внутрибрюшинно из расчета 2 мг белка на 1 кг массы тела одновременно с иммунизацией ЭБ.

Оценка выраженности перекисного окисления липидов и функционального состояния печени. Выраженность ПОЛ оценивали по содержанию в сыворотке крови и гомогенате печени малонового диальдегида (Стальная И.Д1, Гаришвили Т.В., 1977; Прохорова МИ., 1982), ацилгидроперекисей (Бенисо-вич В.И., Идельсон Л.И., 1973), диеновых конъюгатов жирных кислот (Стальная И.Д., 1977), изучали активность каталазы (Подильчак М.А., 1987).

В сыворотке крови экспериментальных животных определяли активность аспартат- и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы, концентрацию билирубина по Йендрассику-Клеггорну-Грофу, холестерина по Ильку, фибриногена, Р-липопротеидов по Бурштейну, общего белка. Кроме этого, ставили тимоловую пробу и определяли протромбиновый индекс. Величины всех" перечисленных показателей определяли унифицированными методами (Меньшиков В.В., 1987).

Индикаторами синдрома цитолиза служила активность АлТ и АсТ; синдрома холестаза - активность ЩФ, концентрация билирубина, холестерина и Р-липопротеидов; гепатодепрессивного синдрома - протромбиновый индекс, концентрация с общего белка, фибриногена; мезенхимально-воспалительного синдрома-тимоловая проба (Подымова С.Д., 1993).

Морфологические методы. Влияние эспа-липона на процессы физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов изучали с помощью морфологических показателей, характеризующих пролиферативную активность ге-патоцитов (митотический индекс (МИ). Также измеряли диаметр ядер гепато-цитов (ДЯГ) и индекс двуядерных клеток (ИДК)) (Саркисов Д.С. и др., 1987; Бабаева А.Г., 1987).

Примечание: морфологическая часть работы выполнена на базе патоморфологиче-

ской лаборатории при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» при консультативной помощи к.м.н., доцента Дудки В.Т., за что выражаем ему искреннюю благодарность.

Статистическая обработка материала. Статистическую обработку материала проводили путем вычисления средней арифметической (М) и средней ошибки средней (т). Существенность различий средних величин оценивали с

. помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни при р<0,05 и по критерию I Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние эспа-липона на приобретенный и врожденный иммунитет.

Предварительно для выбора оптимальной дозы, схемы и способа введения эспа-липона было изучено влияние препарата на формирование ГИО, индуцированного ЭБ, в дозах 5 и 50 мг/кг массы тела при внутривенном и внутрибрюшин-ном способах введения. Выраженность иммунотропных эффектов эспа-липона зависела от дозы препарата и от времени его поступления относительно антигена, но не от способа его введения (таблица 1).

Таблица 1

Влияние эспа-липона на развитие ГИО, индуцированного ЭБ, при внутривенном н внутрнбрюшинном способах введения .

Условия опыта Дол препарата, мг/кг Время введения Внутривенное введение Внутрибрюшинное введение

относительно иммунизации ■ АО К РОК АОК РОК

1. Интактные животные ■ - - 14,3±2,2 63,5±7,4 14,112,1 65.0±7,3

2. Введение физиологического раствора - до, после 15,2±1,8 67,1±б,2 . 16.0±1,7 65,9±б,8

3. Введение эспа-липона 5 до 29,4±3,3'и 82.2±7,4'и 28,9±3.0'и 84,0±7,5'1'2

4. Введение эспа-липона 50 до П7,1±10,5'13 159,5±17,4'м 114,1±10,5'13 162,7±15.0''1

5. Введение эспа-липона 5 до, после 17,5±2,7*:М 70,1±5,9*4 18,1±2,8'3'4 74,4±б,0ч

6. Введение эспа-липона 50 ДО, после 103,4±10.2'м 75,0±6,9-м 108,2110,9"5

7. Введение тиамина 1 ДО, после 80,5±6,1'1А" 34.2±3,0"и" 82,9±6,4"1'"'

Примечание: здесь и в последующих таблицах * - р<0,05, рядом стоящая цифра - номера групп сравнения.

При дозах 5 и 50 мг/кг эспа-липон стимулировал ГИО на ЭБ при его десятикратном введении до антигена. При введении препарата до и после иммунизации ЭБ эспа-липон в дозе 5 мг/кг не влиял, а в дозе 50 мг/кг - также стимулировал развитие ГИО. Кроме того, в дозе 50 мг/кг эспа-липон при любом использованном режиме введения превосходил иммуностимулирующий эффект тиамина (препарата сравнения). Так как иммунотропные эффекты эспа-липона

при внутривенном и внутрибрюшинном способах введения были сопоставимы друг с другом, в дальнейшем использовалось технически более простое внут-рибрюшинное введение. Кроме того, пятидневное введение препарата до иммунизации обладало менее выраженным влиянием на уровень ГИО, чем десятидневное, которое использовали в последующих экспериментах;

Эспа-липон в дозе 5 мг/кг, введенный до, а также до и после сенсибилизации ЭБ, не влияет на выраженность реакции ГЗТ, а его применение в дозе 50 мг/кг при тех же режимах стимулирует ее, о чем свидетельствует увеличение РМ и РК по сравнению с контрольными группами животных, соответственно, в 2,0 и 1,6 раза (рисунок 1).

Так как выраженность ГЗТ была наибольшей при введении препарата до сенсибилизации, возможно, препарат оказывает более выраженное влияние на

процесс образования клона антиген-специфических Т-лимфоцитов, чем на способность этих лимфоцитов при встрече с антигеном продуцировать провоспа-лительные цитокины. Стимулирующее влияние эспа-липона на развитие ГЗТ превосходило эффекты тиамина.

В качестве антиген-неспецифических механизмов иммунитета изучалось влияние эспа-липона на поглотительную стадию фагоцитоза и на активность кислородзависимых механизмов нейтрофилов периферической крови. Препарат вводился десятикратно с интервалом 24 часа между инъекциями.

Установлено, что эспа-липон в дозе 5 мг/кг массы тела менее выражен-но, а в дозе 50 мг/кг - существенно стимулировал как показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, так и процент диформазан-положительных клеток в стимулированной реакции НСТ-теста (таблица 2). В использованных дозах препарат повышает резервные возможности кислородзависимых механизмов, о чем свидетельствует более высокий уровень функционального резерва нейтро-филов. При этом эспа-липон оказывает более выраженное стимулирующее влияние на показатели фагоцитоза и кислородзависимых механизмов защиты по сравнению с тиамином.

Таблица 2

Влияние эспа-липона на функциональную активность нейтрофилов периферической крови

Показатели Условия опыта

Введение физиологического раствора Введение -эспа-липона (5 мг/кг) у Введение эспа-липона (50 мг/кг) Введение тиамина

Фагоцитарная активность ФИ 29,7±2,8 42,5+4,Г1 67,4+6,З*1'2 44.8+5,0*и

ФЧ • 2,6±0,2 3,5 ±0,4*' 7,4±0,9*1,2- з,о±о,з*3

ИАФ 0,77+0,1 1,49±0,09*' 5,0+0,7*'г 1,3+0,Г1-3

Активность кисло-родзависимых механизмов защиты НСТ-сп. 6,7+0,2 7,2±0,4 7,4+0,7 6,9±0,3

НСТ-стим,- 1б,2±1,1 25,2±2,3*' 28,9±3,7М 26,9±3,1*'

ФРН 9,4±0,8 18,0±1,8М 21,4±2,9*' 19.8+2,7*'

Таким образом, эспа-липон в дозах 5 и 50 мг/кг обладает выраженной? иммуностимулирующей: активностью в отношении как антиген-

специфического, так и антиген-неспецифического иммунитета. Наиболее выраженные иммуностимулирующие эффекты эспа-липона наблюдаются в дозе 50 мг/кг при различных схемах введения препарата относительно поступления Т-зависимого антигена. По сравнению с тиамином (препарат сравнения) стимулирующие свойства эспа-липона более выражены.

Иммуномодулирующие эффекты эспа-липона:в:условиях токсических гепатопатий. После исследования иммунотропного влияния эспа-липона в физиологических условиях, представляло интерес изучение его эффектов в условиях токсических поражений печени, при которых может наблюдаться как повышение иммунологической реактивности (Конопля А.И., 1989), так и ее снижение (Иванова А.П., 1995).

Поскольку эспа-липон в дозе 50 мг/кг обладал более выраженной иммуностимулирующей активностью, в дальнейших исследованиях использовали именно эту разовую дозу. Препарат вводился внутрибрюшинно десятикратно с интервалами 24 часа между инъекциями до и во время поступления токсикантов в организм.

Токсическое поражение печени, вызванное индометацином; сопровождается супрессией гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствует снижение в селезенке отравленных крыс числа АОК и РОК, соответственно, в 2,0 и 1,7 раза по сравнению с аналогичными показателями у животных, получавших изотонический раствор хлорида натрия (таблица 3). Введение эспа-липона животным с токсическим поражением печени нормализовало выраженность ГИО. Препарат оказывал аналогичное влияние ив отношении реакции ГЗТ.

Таблица 3

Влияние эспа-липона на формирование ГИО в условиях вторичного« иммунодефицита, вызванного индометацином

№ Условия опыта, АОК РОК

1. Введение физиологического раствора 14,4+2,1 63,9+7,5

2. Введение индометацина 7,2±1,Г' 36,7±3,7М

3. Введение индометацина и физиологического раствора ■ 7,911,3*' 41,4±4,2*'

4. Введение индометацина и эспа-липона (50 мг/кг) И.Ш.О*^ 70,4±б,8*2,3

Иммунокорригирующее действие препарата наблюдалось также и на сниженные в результате введения индометацина показатели функциональной активности нейтрофилов (за исключением НСТ-сп.). В условиях отравления животных ЧХУ наблюдается повышение как ГИОЛ так и ГЗТ. Введение отравленным животным эспа-липона снижает повышенное в этих условиях- число АОК и нормализует количество РОК в селезенке (таблица 4). Также эспа-липон снижал выраженность реакции ГЗТ, повышенную в результате введения ЧХУ. Препарат обладает корригирующим эффектом и в отношении функциональной активности нейтрофилов периферической крови.

Таким образом, эспа-липон в дозе 50 мг/кг обладает выраженным имму-номодулирующим эффектом в отношении антиген-специфических и антиген-неспецифических механизмов иммунитета в условиях острых токсических ге-патопатий, сопровождающихся как снижением, так и повышением иммунологической реактивности.

Таблица 4

Влияние эспа-липона на развитие ГИО в условиях отравления ЧХУ

№ Условия опыта АОК. РОК

1. Введение физиологического раствора 15,2±2,3 62,5±7,9

2. Введение ЧХУ 38,1±3,4" 99,8±9,0М

3. Введение ЧХУ и физиологического раствора 40,014,7*' 101,4110,2''

4. Введение ЧХУ и эспа-липона (50 мг/кг) 27,4±3,З*11 75,9+6,0'"

Влияние эспа-липона на функциональную активность гепатоцитов и их репаративную регенерацию при экспериментальной патологии пене-

ни. Учитывая коферментную роль липоевой кислоты во внутриклеточном метаболизме (Марри Р. и др., 1993), ее антитоксические эффекты (Кундиев Ю.И., 2002) и существенную роль процессов ПОЛ в патогенезе заболеваний печени (Подымова С.Д., 1993), были изучены гепатопротекторные, антиоксидантные и регенераторные эффекты эспа-липона.

Поступление в организм ЧХУ приводит к развитию цитолитического, холестатического, гепатодепрессивного и мезенхимально-воспалительного биохимических синдромов поражения печени. Эспа-липон в дозе 5 мг/кг не

оказывает существенного влияния на эти биохимические показатели. Введение эспа-липона в дозе. 50 мг/кг пятикратно до поступления ЧХУ и пятикратно одновременно с токсикантом снижает активность АлТ, АсТ и ЩФ, концентрацию билирубина и Р-липопротеидов сыворотки крови, повышает уровень фибриногена, протромбиновый индекс и снижает выраженность тимоловой пробы (ри-

сунок 2). .

Рис. 2. Гепатопротекгорная, антиоксидантная и регенераторная активности эспа-липона в условиях острого поражения печени ЧХУ.

Обозначения. 1. радиус окружности - показатели здоровых крыс.

2. - ----отравление ЧХУ.

3. ------------- отравление ЧХУ + введение эспа-липона

(50 мг/кг).

4. # - р<0,05 - достоверность различий средних 2 и 3 групп по сравнению с I группой.

1 - показатели < функциональной активности гепатоцитов;:2 - показатели оксидантной и ан-тиоксидантной активности гепатоцитов; 3 - показатели репаративной активности гепатоци-тов.

Эспа-липон в этой же дозе, но введенный десятикратно до отравления ЧХУ, менее выражение влиял на исследованные показатели. Таким образом, использование эспа-липона в дозе 50 мг/кг до и одновременно с токсикантом практически нормализует биохимические синдромы поражения печени четы-реххлористым углеродом.

Введение четыреххлористого углерода приводит к выраженному повышению уровня первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов ПОЛ в крови и в печени; Кроме того, отмечается снижение активности каталазы. Введение.эспа-липона в дозе 5 мг/кг сопровождается слабо выраженным снижением концентрации ДК, МДА и АГП, и повышением активности каталазы. Эспа-липон, введенный до и одновременно с токсикантом в дозе 50 мг/кг, нормализовал пока-» затели ПОЛ (рисунок 2), а введение препарата в той же дозе; но до токсиканта, таким эффектом не обладало. Возможно, с антиоксидантным эффектом эспа-липона, снижающим ПОЛ мембран гепатоцитов и, соответственно, выход им-мунотропных субстанций, связан один из механизмов иммунокорригирующего действия препарата в условиях токсических гепатопатий.

Введение эспа-липона в дозе 5 мг/кг массы тела не влияет на показатели физиологической регенераций печени, а использование препарата в дозе 50 мг/кг повышало только МИ, но не ИДК и ДЯГ, что свидетельствует о слабо выраженном влиянии эспа-липона на процессы физиологической регенерации гепатоцитов. Более выраженное влияние эспа-липон оказывает на процессы ре-паративной регенерации печени, так как в дозе 50 мг/кг повышает все показатели регенерации (МИ, ДЯГ и ИДК) (рисунок 2). Стимулирующего эффекта в отношении репаративной регенерации при дозе 5 мг/кг массы тела не наблюдалось.

Выявленные эффекты эспа-липона могут быть использованы в условиях токсических гепатопатий, когда требуется одновременное применение имму-номодуляторов, антиоксидантов и репарантов.

Влияние эспа-липона на иммуномодулирующие, гепатопротектор-ные и регенераторные свойства спленоцитов и их фракций. Поскольку су— щественную роль в процессах восстановления печени играет селезенка и синте-

зируемые ею гепатотропные факторы (Бабаева А.Г. и др., 1991; Miau L.H. et al., 1996), представляло интерес исследование роли спленоцитов в реализации эффектов эспа-липона.

Установлено, что введение спленоцитов,здоровых доноров интактным аллогенным реципиентам не вызывало, а введение спленоцитов крыс, получавших эспа-липон, стимулировало развитие гуморального иммунного ответа на ЭБ. При разделении спленоцитов по способности прилипать к стеклу (Полуш-кина Э.Ф., 1983) установлено, что введение интактным аллогенным реципиентам как при топающих, так и не прилипающих к стеклу спленоцитов здоровых доноров ре члияет на ГИО кЭБ. Введение же прилипающих к стеклу спленоцитов доноров, получавших эспа-липон, стимулировало иммунную реактивность. Фракция не прилипающих к стеклу клеток селезенки крыс, получавших препарат, такой активностью не обладала. Таким образом, иммуностимулирующие эффекты эспа-липона опосредуются фракцией прилипающих к стеклу сплено-цитов, как известно, состоящих на 80-85% из макрофагов (Подушкина Э.Ф. и др., 1983).

Введение надосадочной жидкости спленоцитов (НЖС) интактных крыс не влияло на развитие ГИО к ЭБ, а введение НЖС крыс, получавших эспа-липон, стимулировало формирование иммунного ответа у интактных аллоген-ных реципиентов (таблица 5). Также надосадочная жидкость прилипающих к стеклу спленоцитов крыс (НЖСП), получавших эспа-липон, обладает выраженными иммуностимулирующими свойствами, в то время как надосадочная жидкость не прилипающих к стеклу спленоцитов (НЖСН) крыс той же группы таким эффектом не обладала.

Таблица 5

Нммуномодулирующая активность спленоцитарных субстанций крыс,

получавших эспа-липон

№ Условия опыта АОК РОК

1. Иммунизация ЭБ 15,2±2,0 54,3+4,8

2 Введение НЖС интактных аллогенных доноров 17,3+2,5 59,0+3,9

3. Введение НЖС крыс, получавших эспа-лнпон 32,7±3,Г'2 97,1+7,0*12

4. Введение НЖС И крьк;, получавших эспа-липон 36,5±4,9*12 m^+sy-2

5. Введение 11ЖСН крыс, получавших эспа-липон 18^±3,2*3* 61,3+5, б*3 4

При введении спленоцитов интактных аллогенных доноров крысам с острым индометациновым поражением печени биохимические синдромы повреждения гепатоцитов не изменяются, тогда как введение спленоцитов крыс, получавших.эспа-липон, существенно ослабляет проявления синдрома цитолиза (снижение активности АлТ), холестаза (снижение активности ЩФ и концентрации билирубина), гепатодепрессивного и мезенхимально-воспалительного синдромов (повышение концентрации, фибриногенами снижение тимоловой пробы), снижает выраженность ПОЛ в крови и в печени. Также повышалась митотическая активность гепатоцитов. Установлено, что этими эффектами обладает фракция прилипающих к стеклу спленоцитов и НЖСП.

Таким образом, гепатопротекторные, антиоксидантные и регенераторные свойства эспа-липона так же, как и его иммуномодулирующая активность, связаны со способностью данного препарата индуцировать выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки хелперных цитокинов. При гель-хроматографическом разделении НЖСП крыс, получавших эспа-липон,' получено три фракции. Установлено, что введение Ш фракции НЖСП, содержащей i субстанции с ММ 15 и менее кДа, оказывает выраженное стимулирующее влияние на ГИО у интактных аллогенных реципиентов. Кроме того, введение отравленным индометацином животным I (ММ 150 кДа и более) и Ш гель-хроматографических фракций оказывало выраженное корригирующее влияние на биохимические синдромы поражения печени, процессы ПОЛ и репаративной регенерации гепатоцитов (рисунок 3).

П фракция, содержащая субстанции с ММ 50-60 кДа, гепатопротектор-ным, антиоксидантным и регенераторным эффектами не обладала. Полученные данные подтверждают тот факт, что спленоцитам и их цитокинам принадлежит существенная роль в регуляции не только иммунного гомеостаза организма, но также и функционального состояния клеток печени и процессов ПОЛ.

АлТ

Тимоловая проба

Рис. 3. Гепатопротекторные' и репаративные эффекты гель-хроматографических фракций НЖСП крыс, получавших эспа-липон. ■

Обозначения, 1. - радиус окружности - показатели крыс, отравленных индометацином

(1 группа); 2.---введение I фракции НЖСП; 3.-------введение И фракции НЖСП;

4...........- введение III фракции НЖСП; 5.#- р<0,05 по сравнению с 1 группой.

Эффекты сочетанного введения эспа-липона и тиамина. Учитывая сходство биохимических механизмов действия а-липоевой кислоты и тиамина, повышающих эффективность сопряжения гликолиза и цикла трикарбоновых кислот в клетках (Марри Р. и др., 1993), представляло интерес изучение эффектов их сочетанного введения при токсических гепатопатиях. Была изучена возможность усиления фармакологических эффектов при использовании препарата в неэффективной концентрации (5 мг/кг), но в комбинации с тиамином.

Установлено, что в условиях гепатопатии, вызванной индометацином, эспа-липон (5 мг/кг) не влияет, а тиамин обладает слабым корригирующим эффектом и лишь частично снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени и ПОЛ. Кроме того, при использовании препаратов по отдельности усиления репаративной регенерации гепатоцитов не выявлено. В то же

время введение отравленным животным комбинации эспа-липона (5 мг/кг) и тиамина снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени, нормализует показатели ПОЛ и стимулирует репаративную регенерацию печени. Кроме того, при таком сочетании препаратов наблюдается выраженный иммунокорригирующий эффект в отношении ГИО и ГЗТ (таблица 6).

Таблица 6

Влияние сочетанного введения эспа-липона и тиамина: на формирование ГИО и ГЗТ в условиях вторичного иммунодефицита, вызванного индометацином

м Условия опыта АОК РОК РМ- РК

1. Введение физиологического раствора 17,3+2,2 63,5±7,4 1,8±0,2 0,81+0,08

2. Введение индометацина и физиологического раствора 7,9+1,3*' 41,4±4,2*' 0,7+0,1*' 0,4410,04*'

3. Введение индометацина и эспа-липона (5 мг/кг) 8,1±1,2*' 43,5±5,4*' 0,9+0,1*' 0,45±0,05*'

4. Введение индометацина и тиамина 10,4±1,6*' 52,915,2** и±0,Г'"3 0,59±0,06*'-3

5. Введение индометацина, эспа-липона (5 мг/кг) и тиамина 17,1+2,I*2"4 61,8±6,9*" 1,910,2"" 0,83±0,08*2"*

Таким образом, эспа-липон обладает иммуномодулирующим, гепато-протекторным, антиоксидантным и регенераторным эффектами, которые опосредуются цитокинами прилипающих к стеклу спленоцитов, а использование эспа-липона в сочетании с тиамином повышает эффективность этих препаратов и в таком сочетании позволяет на порядок снизить эффективную разовую дозу эспа-липона.

ВЫВОДЫ

1. Эспа-липон при использовании в дозах 5 мг/кг и в большей степени 50 мг/кг стимулирует формирование гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцированных эритроцитами барана. Иммуностимулирующие свойства препарата зависят от времени его поступления относительно иммунизации и проявляются наиболее эффективно при десятикратном введении эспа-липона до антигена.

2. Десятикратное введение эспа-липона (5 или 50 мг/кг) повышает функциональную активность нейтрофилов периферической крови (активность поглотительной фазы фагоцитоза и кислородзависимых механизмов защиты).

3. В условиях острого токсического поражения печени, вызванного ин-дометацином или четыреххлористым углеродом, эспа-липон (50 мг/кг, десятикратное введение) оказывает выраженный иммуномодулирующий эффект, снижая повышенные и повышая сниженные показатели гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, а также частично или полностью корригирует функциональную активность нейтрофилов периферической крови.-

4. Иммуностимулирующий эффект эспа-липона в физиологических условиях и при острых токсических поражениях печени опосредован выделением« хелперных цитокинов, имеющих молекулярную массу 15 и менее кД, продуцируемых прилипающей к стеклу и обогащенной макрофагами фракцией сплено-цитов.

5. Эспа-липон не влияет на биохимические показатели, характеризующие функциональную активность гепатоцитов и процессы перекисного окисления липидов в физиологических условиях. При острых токсических поражениях печени препарат в дозе 5 мг/кг не влияет, а в дозе 50 мг/кг - снижает показатели цитолитического, холестатического, гепатодепрессивного и мезенхималь-но-воспалительного биохимических синдромов поражения гепатоцитов и корригирует выраженность перекисного окисления липидов. Гепатопротекторный и антиоксидантный эффекты эспа-липона более выражены при его одновременном поступлении с токсикантом по сравнению с введением препарата до отравления.

6. Десятикратные инъекции эспа-липона в дозе 5 мг/кг не влияют, а 50 мг/кг - стимулируют как физиологическую, так и репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях токсического поражения печени четыреххлори-стым углеродом.

7. Гепатопротекторные эффекты эспа-липона опосредуются хелперны-ми цитокинами с молекулярной массой 150 кД и 15 кД и менее, которые выделяются прилипающей к стеклу фракцией спленоцитов.,

8. В условиях отравления индометацином применение эспа-липона в сочетании с тиамином усиливает их иммунокорригирующий и гепатопротек-торный эффекты и позволяет в десять раз снизить эффективную разовую дозу эспа-липона (с 50 до 5 мг/кг).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В рекомендации по клиническому использованию эспа-липона должны быть включены сведения о его иммунотропном действии.

2. Выраженные иммуномодулирующие эффекты эспа-липона позволяют рекомендовать его в качестве гепатопротекторного средства иммунореаби-литации при заболеваниях печени токсической этиологии.

3. Эспа-липон целесообразно использовать <- в сочетании с тиамином, что позволяет снизить эффективную разовую дозу препарата.

4. Полученные экспериментальные данные могут быть учтены при создании гепатопротекторов, обладающих иммуномодуляторной активностью.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кулько, И.Н. Иммуномодулирующие свойства эспа-липона / И.Н. Кулько, А.И. Конопля, А.И. Князев // Тез. науч. тр. Первой междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств» (20-22 ноября» 2001 г., г. Москва). - М., 2001. - С. 152.

2. Изучение регенерационных свойств эспа-липона при экспериментальном остром токсическом поражении печени / И.Н. Кулько, А.И. Конопля, А.И. Князев, Е.Н. Конопля // IX Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». Тез. докл. (8-12 апреля 2002 г., г. Москва). - М., 2002. - С. 634.

3. Кулько, И.Н. Антиоксидантная и гепатопротекторная активность эс-па-липона при остром токсическом поражении печени / И.Н. Кулько, А.И. Конопля, А.И. Князев // Сб. науч. тр. 67-й науч. сес. КГМУ и отд-ния мед-биолог.

наук Центр-Чернозем, науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2002. - Ч. 1. -С.32-33.

4. Кулько, И.Н. Иммуномодулирующие и гепатопротекторные свойства эспа-липона в условиях острого токсического поражения печени / И.Н. Кулько, А.И. Конопля // «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и имму-нофармакологии». Сб. науч. тр. 5-го конгр. Рос. ассоц. аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (12-14 ноября 2002 г., г. Москва). - М., 2002. -Т. 2.-С. 357.

5. Кулько, И.Н. Изучение иммуномодулирующих и гепатопротектор-ных свойсп эспа-липона у животных с острым токсическим поражением печени / И.Н. Кулько, А.И. Конопля // Тез. науч. тр. Второй междунар. конф. «Клинические исследования лекарственных средств» (20-22 ноября 2002 г., г. Москва). - М., 2002. - С. 118-119.

6. Смахтин, М.Ю. Иммуномодулирующее действие эспа-липона в условиях острых токсических гепатопатий / М.Ю. Смахтин, И.Н. Кулько // Сб. науч. тр. 69-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед-биолог наук Центр-Чернозем, науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2004. - С. 115-116.

7. Смахтин, М.Ю. Гепатопротекторные и репаративные эффекты эспа-липона в условиях острой тетрахлорметановой гепатопатий / М.Ю. Смахтин, И.Н. Кулько, В.Т. Дудка // Сб. науч. тр. 69-й итог. науч. сес. КГМУ и отд-ния мед-биолог, наук Центр-Чернозем, науч. центра РАМН. - Курск: КГМУ, 2004. -С. 116-117.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АлТ

аланинаминотрансфераза, ммоль/(ч х л) аспартатаминотрансфераза, ммоль/(ч х л) антителообразующие клетки, 103/селезенку

АсТ

АОК

ГЗТ

гиперчувствительность замедленного типа

ГИО

гуморальный иммунный ответ

ДЯГ

диаметр ядер гепатоцитов, мкм

ИАФ - индекс активации фагоцитоза ИДК - индекс двуядерных клеток, %о МДА - малоновый диальдегид, мкмоль/л МИ — митотический индекс, %о ММ — молекулярная масса, кДа НЖС - надосадочная жидкость спленоцитов

НЖСН - надосадочная жидкость спленоцитов, не прилипающих к стеклу НЖСП - надосадочная жидкость спленоцитов, прилипающих к стеклу НСТ-сп. - тест восстановления нитросинего тетразолия, спонтанный, % НСТ-стим. - тест восстановления нитросинего тетразолия, стимулированный

зимозаном, % ПОЛ - перекисное окисление липидов

РК - разница количества кариоцитов в регионарном и контралатераль-

ном лимфатических узлах, 106 РМ - разница массы регионарного и контралатерального лимфатических узлов, мг РОК - розеткообразующие клетки, 106/селезенку ФИ - фагоцитарный индекс, % ФРН - функциональный резерв нейтрофилов

ФЧ - фагоцитарное число (среднее количество поглощенных частиц

латекса на один фагоцит) ЧХУ - четыреххлористый углерод ЩФ - щелочная фосфатаза, мккат/л ЭБ - эритроциты барана

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 12.02.2004 г. Подписано в печать 16.02.2004 г. Формат 30x4278. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 21 А.

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Р - 37 0 t

Актуальность темы. В условиях патологии существенная роль в развитии и исходе заболевания принадлежит целостности клеточных мембран органов и тканей. Усиление свободно-радикальных процессов и пере-кисного окисления липидов (ПОЛ), ускорение образования гидроперекисных радикалов приводит к нарушению клеточных мембран и повышению их проницаемости. Вследствие этого усиливается выход в сосудистое русло компонентов цитоплазмы, клеточных органелл и продуктов нарушения метаболизма клеток. Некоторые из этих соединений (протеолитические ферменты, антипротеолитические белки, липопротеиды низкой и очень низкой плотности, глюкозаминогликаны, протеогликаны) обладают выраженной иммуномодулирующей активностью (Николаева И.Н., Яхонтов Ю.О.,1994;' Ласкова И.Л.,1995; Прокопенко Л.Г. и др.,1998; Brevini et al.,1993). Особенностью взаимосвязи патологии внутренних органов с функционированием иммунной системы является накопление в крови одновременно субстанций, обладающих как иммуносупрессорным, так и иммуностимулирующим воздействием (Конопля А.И.,1989; Барт Е.В.,1994; Иванова А.П.,1995).

Исходя из этого, возникает необходимость комплексного подхода в лечении различных патологических состояний, воздействуя как на патогенетическое звено развития заболевания - нарушение процессов перекисного окисления липидов и, как следствие, нарушение целостности клеточных мембран, так и устраняя последствия срыва иммунологического гомеостаза организма.

Принимая во внимание то, что нарушение иммунологических функций при многих видах патологии обусловлено дезорганизацией мембран клеток различных органов и тканей, иммуноцитов и клеток их микроокружения, есть основания ожидать, что выраженный иммуностимулирующий и репара-тивный эффект в этих условиях можно вызвать введением препаратов, регулирующих энергетический внутриклеточный обмен и обладающих антиокси-дантным эффектом. К числу таких соединений относится эспа-липон (альфа-липоевая кислота), применяющаяся в клинической практике исключительно для лечения диабетической полинейропатиии.

Цель работы: изучение иммунотропных и репаративных свойств эс-па-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.

Задачи исследования:

1. Выявить влияние эспа-липона на выраженность гуморального иммунного ответа, гиперчувствительность замедленного типа и функциональную активность нейтрофилов в физиологических условиях.

2. Изучить иммуномодулирующие эффекты эспа-липона в условиях острой токсической гепатопатии различного генеза.

3. Установить роль спленоцитов в реализации иммуномодулирующих эффектов эспа-липона в физиологических условиях и при экспериментальной патологии печени.

4. Выяснить влияние эспа-липона на репаративную регенерацию и 9 функциональную активность гепатоцитов в условиях экспериментального токсического поражения печени.

5. Изучить иммунокорригирующую и гепатопротекторную эффективность сочетанного введения эспа-липона с тиамином при патологии печени.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Эспа-липон (5 и 50 мг/кг) стимулирует развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцированных эритроцитами барана, повышает функциональную активность нейтрофилов периферической крови в физиологических условиях.

2. Эспа-липон (50 мг/кг) в условиях острого токсического поражения печени, вызванного различными по природе и механизму действия токсикантами, оказывает выраженный иммунокорригирующий эффект.

3. Введение эспа-липона (50 мг/кг) снижает выраженность биохимических синдромов поражения печени, процессов перекисного окисления ли пидов и активирует репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях острой тетрахлорметановой гепатопатии.

4. Эспа-липон стимулирует выделение прилипающими к стеклу спленоцитами гуморальных факторов, корригирующих иммунотропные и ге-патотропные эффекты токсикантов, а также стимулирующих процессы физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов.

5. В условиях отравления индометацином комбинация эспа-липона с тиамином по иммунокорригирующей и гепатопротекторной активностям более эффективна, чем каждый из препаратов по отдельности.

Научная новизна. Показана высокая иммунокорригирующая активность эспа-липона в условиях нарушенной иммунной реактивности, индуцированной введением гепатотропных токсикантов. Экспериментально обоснована возможность коррекции эспа-липоном нарушений оксидантного и анти-оксидантного статусов, функциональной активности гепатоцитов и стимуляции их репаративной регенерации при острой патологии печени.

Показана существенная роль изменений проницаемости клеточных мембран гепатоцитов в иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектах эспа-липона при патологии печени.

Получены данные о взаимодействии иммунокомпетентных клеток и гепатоцитов, углубляющие существующие представления о механизмах сохранения иммунного гомеостаза в условиях токсического поражения печени. Выявлена роль прилипающих к стеклу клеток селезенки и спленоцитарных цитокинов животных, получавших эспа-липон, в коррекции иммунных нарушений в условиях токсического поражения печени. Показана возможность усиления иммунокорригирующих и гепатопротекторных эффектов при использовании эспа-липона в комбинации с тиамином.

Практическая значимость. Установлены дозы, способы и схемы введения эспа-липона, приводящие к устойчивым иммуномодулирующим эффектам в условиях патологии, характеризующейся нарушением иммунной реактивности, что может быть использовано для профилактических и лечебных целей. Экспериментально выявлена перспектива использования эспа-липона для иммунокоррекции при токсических поражениях печени, вызванных различными по химической природе токсикантами.

Экспериментально доказана возможность применения эспа-липона в качестве иммуномодулятора, антиоксиданта и средства, активирующего ре-паративные процессы в печени в условиях токсической гепатопатии. Показана высокая эффективность сочетанного введения эспа-липона и тиамина при патологии печени.

Результаты работы используются в учебном процессе медицинских вузов (Воронеж, Самара, Иваново, Санкт-Петербург) и расширяют современные представления о закономерностях иммуномодулирующего, антиокси-дантного и гепатопротекторного действия эспа-липона и его комбинации с тиамином в условиях патологии печени.

Материалы диссертации вошли в рабочие учебные программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях кафедр фармакологии, биохимии, клинической иммунологии и пропедевтики внутренних болезней КГМУ.

Апробация результатов работы. Основные положения диссертации обсуждены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета (2002, 2004), Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 2001, 2002), V Конгрессе аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (Москва, 2002), IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002), совместном заседании кафедр фармакологии, биологической химии, микробиологии, пропедевтики внутренних болезней Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский госуд'арственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» (2003).

Публикации. Результаты проведенных исследований полностью отражены в 7 научных работах в центральной и местной печати, в которых содержится полный объем информации, касающейся темы диссертации.

Структура и объем работы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 5 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 205 источников на русском, и 61 - на иностранном языках.

ВЫВОДЫ

1. Эспа-липон при использовании в дозах 5 мг/кг и в большей степени 50 мг/кг стимулирует формирование гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцированных эритроцитами барана. Иммуностимулирующие свойства препарата зависят от времени его поступления относительно иммунизации и проявляются наиболее эффективно при десятикратном введении эспа-липона до антигена.

2. Десятикратное введение эспа-липона (5 или 50 мг/кг) повышает функциональную активность нейтрофилов периферической крови (активность поглотительной фазы фагоцитоза и кислородзависимых механизмов защиты).

3. В условиях острого токсического поражения печени, вызванного индометацином или четыреххлористым углеродом, эспа-липон (50 мг/кг, десятикратное введение) оказывает выраженный иммуномодулирующий эффект, снижая повышенные и повышая сниженные показатели гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, а также частично или полностью корригирует функциональную активность нейтрофилов периферической крови.

4. Иммуностимулирующий эффект эспа-липона в физиологических условиях и при острых токсических поражениях печени опосредован выделением хелперных цитокинов, имеющих молекулярную массу 15 и менее кД, продуцируемых прилипающей к стеклу и обогащенной макрофагами фракцией спленоцитов.

5. Эспа-липон не влияет на биохимические показатели, характерис зующие функциональную активность гепатоцитов и процессы перекисного окисления липидов в физиологических условиях. При острых токсических поражениях печени препарат в дозе 5 мг/кг не влияет, а в дозе 50 мг/кг -снижает показатели цитолитического, холестатического, гепатодепрессивно-го и мезенхимально-воспалительного биохимических синдромов поражения гепатоцитов и корригирует выраженность перекисного окисления липидов.

Гепатопротекторный и антиоксидантный эффекты эспа-липона более выра жены при его одновременном поступлении с токсикантом по сравнению с введением препарата до отравления.

6. Десятикратные инъекции эспа-липона в дозе 5 мг/кг не влияют, а 50 мг/кг - стимулируют как физиологическую, так и репаративную регенерацию гепатоцитов в условиях токсического поражения печени четыреххлори-стым углеродом.

7. Гепатопротекторные эффекты эспа-липона опосредуются хелпер-ными цитокинами с молекулярной массой 150 кД и 15 кД и менее, которые выделяются прилипающей к стеклу фракцией спленоцитов.

8. В условиях отравления индометацином применение эспа-липона в сочетании с тиамином усиливает их иммунокорригирующий и гепатопротекторный эффекты и позволяет в десять раз снизить эффективную разовую дозу эспа-липона (с 50 до 5 мг/кг).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В рекомендации по клиническому использованию эспа-липона должны быть включены сведения о его иммунотропном действии.

2. Выраженные иммуномодулирующие эффекты эспа-липона позволяют рекомендовать его в качестве гепатопротекторного средства иммуно-реабилитации при заболеваниях печени токсической этиологии.

3. Эспа-липон целесообразно использовать в сочетании с тиамином, что позволяет снизить эффективную разовую дозу препарата.

4. Полученные экспериментальные данные могут быть учтены при создании гепатопротекторов, обладающих иммуномодуляторной активностью.