Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение физико - химических свойств, разработка методик анализа и стандартизация 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида

4855592

На правах рукописи

БОРОВСКИЙ БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ

Изучение физико - химических свойств, разработка методик анализа и стандартизация 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой

~ I

кислоты дигидрохлорида

14.04.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

- 6 окт 2011

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

ПЯТИГОРСК, 2011

4855592

Официальные оппоненты:

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской

Федерации

Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ,

доктор фармацевтических наук, профессор Беликов Владимир Георгиевич

доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович кандидат фармацевтических наук, доцент Кичев Дмитрий Геннадьевич ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая

академия» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится »ШЛАиМ^мХ^2011 года в часов на заседании диссертационного совета Д.208.069.01 при ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития РФ (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Пятигорская ГФА Минздравсоцразвития РФ (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).

'»сгяллслХ;

Ведущая организация:

Автореферат разослан «•/7)

Ученый секретарь диссертационного совета

2011 г

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Увеличение числа заболеваний, связанных с нарушениями мозгового кровообращения, когнитивных функций головного мозга и сердечно-сосудистой системы, делает все более актуальными поиск и внедрение в медицинскую практику высокоэффективных нейропротекторных и кардиопротекторных лекарственных препаратов. Параллельно с поиском лекарственных препаратов, обладающих такими фармакологическими свойствами, необходимо решать вопросы стандартизации и контроля качества этих веществ. Одними из широко применяемых в клинической кардиологии и неврологии лекарственных веществ являются гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) и ее производные, которые вызывают большой интерес благодаря их разнообразной фармакологической активности. В настоящее время продолжаются поиски новых производных у-аминомасляной кислоты путем введения в ее структуру гетероаромэтических радикалов.

С этой целью на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) под руководством профессора Берестовицкой В.М. было синтезировано несколько биологически активных соединений - производных ГАМК и пиридина, одним из которых является РГПУ-195 — 4-амино-З-(пиридил-З)-бутановой кислоты дигидрохлорид:

Предварительные доклинические исследования РГПУ-195, проведенные в Волгоградском государственном медицинском университете под руководством профессора Тюрлг" а И.Н., показали перспективность его применения в медицинской практик, особенно в кардиологии, в качестве нейропротекторного, кардиопротекторного и кардиоваскулярного лекарственного вещества. Контроль качества и разработка современных и

объективных методик фармацевтического анализа лекарственных веществ является одним из базовых этапов внедрения лекарственного средства в производство. Однако для его внедрения в медицинскую практику необходимо глубокое исследование физико-химических характеристик, которые предопределяют его фармакокинетику и фармакодинамику, а также выбор и обоснование метод анализа и контроля качества.

Поэтому изучение этих вопросов является актуальным для фармацевтической науки.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является изучение физико-химических свойств РГПУ-195 обоснование методик его анализа в субстанции и биологических жидкостях и их валидация, изучение стабильности и стандартизация лекарственного вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить физические и физико-химические свойства РГПУ-195, предложить методики его идентификации физико-химическими методами.

2. Разработать методики количественного определения титриметрическими и физико-химическими методами.

3. Выявить оптимальные условия и предложить методики ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ определения органических примесей в исследуемой субстанции.

4. Провести подбор условий и разработать методику определения РГПУ-195 в биологических жидкостях.

5. Рассмотреть влияние физических факторов на стабильность исследуемого вещества, установить сроки годности.

6. Разработать нормы качества и подготовить проект фармакопейной статьи предприятия (ФСП) на субстанцию РГПУ-195.

Научная новизна. Впервые проведено химико-фармацевтическое изучение нового производного ГАМК - 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида (РГПУ-195).

Установлены УФ- спектрофотометрические, ИК- спектроскопические, ЯМР параметры РГПУ-195. Выявлены условия определения нелетучих

органических примесей в субстанции РГПУ-195 методом обращено-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и ТСХ. Установлено, что полупродукт синтеза РГПУ-195 пиридил-у-пирролидон является основной определяемой примесью. В исследуемой субстанции обнаружены остаточные органические растворители, подобраны оптимальные условия их ГЖХ-определенля с использованием насадочной колонки. Обоснованы нормы качества субстанции РГПУ-195, методом «ускоренного старения» изучена стабильность и определены сроки годности.

Разработаны условия количественного определения РГПУ-195 титриметрическими методиками: неводное титрование в среде муравьиной и уксусной кислот, аргентометрия, метод Серенсена. Из физико-химических методов предложены методики ВЭЖХ и УФС.

Выбраны условия изолирования РГПУ-195 из биологических жидкостей, для определения исследуемого вещества в извлечении использован метод капиллярного электрофореза (предел количественного определения составляет 69%), изучены фармакокинетические параметры РГПУ-195 (период полувыведения 3,2 ч; площадь под кривой 47,90).

Практическая значимость работы. Предложены способы идентификации исследуемого вещества физико-химическими методами (УФ и ИК-спектрофоторметрия, ЯМР - спектроскопия).

Разработаны и валидированы методики определения примесей методами ГЖХ (остаточные органические растворители) и ВЭЖХ, ТСХ (посторонние примеси) и количественного определения РГПУ-195 химическими и физико-химическими методами. В результате валидационной оценки установлена пригодность разработанных методик, которые отличаются высокой чувствительностью, отсутствием систематической погрешности и позволяют достоверно оценивать качество субстанции РГПУ-195.

Разработан проект фарм?"" '¡ной статьи предприятия и пояснительная записка к проекту ФСЛ.

Внедрение результатов в практику. Получен акт апробации включенных в проект ФСП методик анализа РГПУ-195 от ОАО «Валента Фармацевтика», г. Щелково.

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты экспериментов по установлению УФ, ИК и ЯМР характеристик РГПУ-195, разработка способов его идентификации физико-химическими методами.

2. Результаты количественного определения РГПУ-195 титриметрическими и физико-химическими методами анализа, сравнительная оценка разработанных методик.

3. Итоги исследований по разработке методик определения посторонних примесей в РГПУ-195 методами ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ.

4. Результаты исследований по разработке методик определения РГПУ-195 в плазме крови и фармакокинетические характеристики РГПУ-195.

5. Нормы качества, результаты изучения стабильности РГПУ-195.

Связь задач с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-

исследовательских работ ГБОУ ВПО Пятигорской ГФА Минздравсоцравития РФ, номер государственной регистрации 01.200101060.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на межрегиональных конференциях по разработке, исследованию и маркетингу новой фармацевтической продукции Пятигорской государственной фармацевтической академии (Пятигорск, 2009, 2010 гг.), на 4-ой Всероссийской с международным участием, научно-методической конференции «Фармобразование - 2010», (Воронеж, 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, выполненного с помощью компьютерного набора, содержит 52 таблицы, 26 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка

литературы, включающего 128 источников, в том числе 18 иностранных, и 2 приложений.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследований явились пять образцов субстанции 4-амино-З-(пиридил-З)-бутановой кислоты дигидрохлорид (РГПУ-195), синтезированных на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) и любезно предоставленных нам проф. В.М. Берестовицкой.

Идентификация 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида

В рамках исследований по установлению методов идентификации РГПУ-195 была изучена возможность использования УФ-спектрофотометрии. Установлено, что исследуемое вещество хорошо растворимо в воде, растворимо в спирте этиловом 96% и практически не растворимо в липофильных растворителях. В связи с этим, спектрофотометрическое исследование проводили в водной среде. УФ спектр 0,002% раствора РГПУ-195 характеризуется наличием одной полосы поглощения с максимумом при 260±2 нм (рисунок 1), по-видимому, обусловленный тг-^я переходами пиридинового цикла. Линейный диапазон концентраций РГПУ-195 составил от 0,001 до 0,0045%.

Рисунок 1 - УФ -спектр поглощения п <"'02% водного раствора РГПУ-195 Исследуемая субстанция га изучена методами ИК-

спектрофотометрии и ЯМР-спектроскопии. На рисунке 2 приведен ИК -спектр исследуемого вещества.

Рисунок 2 - Ж- спектр РГПУ-195 Приведенный ИК-спектр (рис. 2) позволил составить таблицу отнесения полос поглощения к функциональным группам.

Таблица 1 - Отнесение полос поглощения к структурным фрагментам _ молекулы_

Положение полосы, см"1 Отнесение

3209 - 2404 щ.с. v([-NH3f)

2943 с. v (С - Н пиридинового кольца)

1720 оч.с. v (С=0 в группе СООН)

1632 сл. Р as(NH3); Vas (COO")

1585 с. у пиридиновое кольцо

1537 ср. у пиридиновое кольцо

1462 ср. Р - ножничные С - Н (СН2); vs (COO")

1187 оч.с. у (О-Н в группе СООН)

1125 ср. v (С - 0 в группе СООН)

813 ср. 5([-NH3]+)

777 ср. у (С - Н - цикл)

Примечание: у-симметричные валентные, у-внеплоскостные деформационные, р - плоскостные деформационные, 6 - деформационные колебания; полосы: ш. с. - широкая сильная, оч. с. — очень сильная, с. - сильная, ср. - средняя, сл. - слабая.

На рисунке 3 приведен спектр ЯМР РГПУ-195.

\

Рисунок 3 - Спектр ЯМР РГПУ-195 в ДМСО - ¿6 Полученный спектр ЯМР (рисунок 3) позволяет идентифицировать РГПУ-195 по структуре вещества.

Результаты отнесения полос к водородсодержащим функциональным группам молекул исследуемого вещества представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты анализа протонных ЯМР спектров РГПУ-195

Вещество Группа атомов 8, м.д Отнесение сигналов

4-амино-3-(пиридил-3)-б\тановой кислоты днгидрохлорид -СН- 8,9 т протон пиридиния

-сн- 8,8 т протон пиридиния

-сн- 8,6 т протон пиридиния

-сн- 8,0 т протон пиридиния

■Ш3 8,35 с протон аминогруппы

-н- 3,7 с при -N113

-он- 2,9 д при СООН

-сн- 3,1 к метановый протон

-он- 2,8 д при СООН

— 2,5 ДМСО-ёб

— 3,2 молекула воды

Обозначения: т - триплет, с - синглет, д - дуплет, к - квартет.

Разработанные методики идентификации РГПУ-195 методами УФ и ИК спекгрофотометрии, ЯМР а «копии включены в проект ФСП. Основываясь на химической структуре РГПУ-195, также предложены химические реакции идентификации. Наличие первичной алифатической аминогруппы обусловливает использование реакции с нингидрином.

Идентифицировать третичную аминогруппу пиридинового цикла позволяют реакции с общеалкалоидными реактивами. Наличие пиридинового цикла можно идентифицировать по реакции образования глутаконового альдегида (реакции Цинке).

Определение посторонних примесей в 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлориде

Как в любой субстанции, так и в РГПУ-195, в процессе длительного или неправильного хранения могут образовываться примеси. Кроме того, в качестве посторонних примесей в субстанциях изначально могут присутствовать промежуточные продукты синтеза. Для определения посторонних примесей в РГПУ-195 нами были использованы хроматографические методы анализа (ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ). При разработке ТСХ-методики анализа РГПУ-195 в работе использовали: исследуемый образец РГПУ-195, полученный по стандартной схеме синтеза; химически чистый образец (ХЧО) РГПУ-195, (Для разработки хроматографических методик нами была проведена очистка образца РГПУ-195. Очистку, проводили методами перекристаллизации. Перекристаллизацию проводили многократно до тех пор пока температура плавления образца после последней пререкристаллизации отличалась от предыдущей не более чем на ± 1°С. Такой образец на ТСХ и ВЭЖХ имел только одно пятно и один пик. Такой образец можно считать химически чистым.) образец РГПУ-195, подвергнутый термодеструкции и полупродукт синтеза пиридил-у-пирролидон. Была изучена хроматографическая подвижность исследуемых веществ в различных растворителях. По результатам эксперимента было определено, что оптимальной системой растворителей является спирт этиловый 96% - вода (7:3), в которой РГПУ-195 имеет значение Яг =0,45±0,05, а пиридил-у-пирролидон - значение !*<=(),20±0,02. Выбран наиболее чувствительный проявитель - раствор нингидрина в спирте 96% (1 мкг/мкл) по сравнению с другими проявителями: реактив Драгендорфа (20 мкг/мкл), облучение УФ-светом с Д=254 нм (10 мкг/мкл).

На следующем этапе исследования была проведена апробация выбранных условий ТСХ хроматографирования для определения

потенциальных продуктов деструкции РГПУ-195. Хроматограмма, полученная в разработанных условиях, представлена на рисунке 4.

О ООО

о О °

1- образец РГПУ-195, (200 мкг) подвергнутый деструкции;

2- продукт полусинтеза гшридил-у-пирролидон (200 мкг);

3- химически чистый РГПУ-195 (200 мкг), подвергнутый деструкции:

4-химически чистый РГПУ-195 (200 мкг);

5- образец РГПУ-195, (200 мкг).

Рисунок 4 - Хроматограмма в системе спирт этиловый 96% - вода (7:3)

На хроматограмме РГПУ-195, подвергнутого деструкции, проявляется пятна, с Я(=0,45±0,05 и Ыг=0,20±0,02, которые соответствуют таковым для химически чистого образца и пиридил-у-пирролидона, это позволяет предположить, что основным продуктом термодеструкции РГПУ-195 является пиридил-у-пирролидон. Был установлен предел количественного определения примеси с помощью разработанной методики, который составляет 0,2%.

В разработанных условиях были проведены исследования по выбору сорбента на пластинках «БПийэ!» и «Сорбфил» с алюминиевой подложкой по параметрам: величина время хроматографирования. Оптимальным

сорбентом по определяемым параметрам является «81Мо1». На основании проведенных исследований была разработана методика контроля чистоты субстанции РГПУ-195, которая а в проект ФСП.

Для контроля чистоты установлена также принципиальная возможность использования ВЭЖХ. Была разработана методика обращено-

фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Стайер» для количественного определения РГПУ-195 и полупродукта синтеза пиридил-у-пирролидона.

Таблица 3 - Условия хроматографирования РГПУ-195

Прибор Жидкостный хроматограф «Стайер» фирмы Аквилон с УФ-детектором

Колонка Luna С8 размером 450*4,6 мм (размер 5 мкм)

Подвижная фаза элюент А - ацетонитрил, элюент В - фосфатный буферный раствор (3,56 моль/л раствор натрия дигидрофосфата двуводного и кислота ортофосфорная до рН 3,0-3,3)

УФ-детектирование Длина волны 258 нм

Скорость потока 1,0 мл/мин

Объем пробы 10 мкл

Время записи хроматограммы 20 мин

Градиент От 20 % до 30 % ацетонитрила

В разработанных условиях проводили хроматографирование исследуемого и химически чистого образцов РГПУ-195. Хроматограммы

представлены на рисунке 5. а) б)

«V «V

1- Í А »- 1 1

1 ) I £ 1 И И 1 1i 15 1 1? якк 1 i 3 4 S 6 * t U 1 13 14 1S 1С 17 Ю

Рисунок 5 - Хроматограммы РГПУ-195: а- исследуемого образца и б - химически чистого образца

Время удерживания первого пика совпадает со временем удерживания раствора - ХЧО РГПУ-195. Дополнительный пик предположительно относится к специфической примеси РГПУ-195 — пиридил-у-пирролидон.

Кроме того нами была изучена возможность определения продуктов деструкции и потенциальных примесных соединений РГПУ-195 методом ВЭЖХ. В работе использовали субстанции РГПУ-195, подвергнутые термической деструкции при 105 °С в течение 10 суток. Для хроматографирования использовали ранее разработанные условия

градиентного режима. Хроматограмма испытуемого образца РГПУ-195, подвергшегося термодеструкции, представлена на рисунке 6.

хо хх XI хз 14 II к IV х'а „

Рисунок 6 - Хроматограмма 0,05% раствора РГПУ-195, подвергшегося

термодеструкции

На хроматограмме обнаруживается полупродукт синтеза - пиридил-у-пирролидон (время удерживания 6 мин) и продукты термодеструции со временем удерживания от 10 до 18 минут. РГПУ-195 и продукты деструкции хорошо отделяются друг от друга, что позволяет проводить идентификацию и количественное определение примесей РГПУ-195. Хроматограмма раствора ХЧО пиридил-у-пирролидона представлена на рисунке 7.

Рисунок 7 - Хроматограмма раствора ХЧО пиридил-у-пирролидона Полученные результаты шести параллельных определений примесей в растворе РГПУ-195, подвергнутого термодеструкции, представлены в таблице 4. Содержание примесей в ^-танции составляет 0,0336±0,0014%. Из данных таблицы следует, что разработанных условиях возможно количественное определение примеси пиридил-у-пирролидона родственных ему соединений. Относительная погрешность определения составила ±4,21%.

Таблица 4 - Результаты определения пиридил-у-пирролидона и родственных ему соединений в РГПУ-195, подвергшегося термодеструкции

£&, тУ*сек юУ*сек X, % Метрологические характеристики

314,06 0,03348

310,30 0,03308 Х=0,0336%

308,70 375,15 0,03291 8=0,0013

301,88 0,03218 8 - =0,0006

338,26 0,03606 Д Х=0.0014

320,15 0,03413 е=±4,21%

Разработанную методику ВЭЖХ можно также использовать с целью количественного определения РГПУ-195. Для установления её пригодности была проведена валидационная оценка. Результата представлены и таблице 5. Таблица 5 - Результаты валидационной оценки методики ВЭЖХ

Валидациониые параметры

Критерии валвдности

Результаты испытаний

Специфичность

Хроматограмма раствора ХЧО РГПУ-195; Ц, = 4,78

Хроматограмма раствора

исследуемого РГПУ-195;

V* 4,77 ; примесь 1:1=5,75

Пригодность

хроматографической

системы:

Сходимость

инжекций

Эффективность

колонки

Коэффициент

ассиметрии пика

Критерий

разделения пика

Я80< 3,0%

Не более 2

,>1,5

Б180< 0,74% N не менее 1700 т.т. 1,85

Я5 = 1,9-2,5

Воспроизводимость

1ШЗ<2,0%

КЯО- 1,07%

Правильность

^4=1,47;^ (95%,5)=2,57

Линейность результатов

Ы > 0,990

у=507,88х-37,64

Данные таблицы методики.

5 свидетельствуют о пригодности предложенной

В процессе синтеза РГПУ-195 используются органические растворители (спирт этиловый и ацетон), которые также являются примесями. Для их определения использовали метод ГЖХ. Исследования проводили на газовом хроматографе марки «Кристалл-2000М» (Россия), с пламенно-ионизационным детектором, кварцевой капиллярной колонкой. Идентификация остаточных органических растворителей осуществлялась путем сравнения по времени удерживания соответствующих стандартных образцов. На рисунке 8 представлены хроматограммы остаточных органических растворителей, обнаруженных в РГПУ-195 (этанол и ацетон, а также ацетальдегид, который является специфической примесью в этаноле). На хроматограммах наблюдаются симметричные пики, что свидетельствует об адекватности предложенного способа хроматографирования.

13Д' ■

¿2.

1- ацетальдегид, 2- этанол, 3- ацетон Рисунок 8 - ПКХ-хромагофамма остаточных растворителей в субстанции РГПУ-195: В таблице 6 представлены параметры хроматографирования, которые

были получены при определении остаточных органических растворителей в субстанции РГПУ-195.

Таблица 6 - Хроматографические параметры разделения остаточных

Исслед. вещество Время удерж т(сек) Диапазон конц.эксп разбавл. мг/см3 Фактор отклик. Ф.о. □ 10'5 Конц. в водном растворе (введено/обн), мг/мл Коэф. раса. Коэф разделен.

Ацетальдегид 5,90 - о - 0,00054 - 1,44X1,74

Ацетон 6,70 0,0004-0,0021 0,08752/0,0024 36,47 0,875X5,74

Этанол 7,40 0,0008 - 0,0042 4,0 0,08794/0,00117 75,16 0,875X5,74

Как следует из рисунка 8 и таблицы 6, пики исследуемых веществ хорошо разделимы, симметричны, коэффициент разделения 0,74. ^го свидетельствует о том, что разработанная методика позволяет хорошо разделить пики исследуемых остаточных органических растворителей. Результаты валидационной оценки представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Валидационные характеристики определения остаточных количеств растворителей

Исследуемое веществ Воспроизводимость (в) п=<5 Открываемо сть с мг/мл пгф/водн. С™, мг/мл пгф/водн Чувств Б, А*С/мг Линейный диапазон конц. мг/мл Коэфф. асимметр А,ш

Ацетальд егид 0,31% 94±0,31 2,74* 10"6 2,47*10"' 7,49*10"7 1,8*10"5-247*10"' 1,553

Ацетон 0,56% 98,57*0,98 2,68*107 3,557* Ю-4 3,15* 10°/ 0,334 1,63*10-' 1,7*10"'-0,334 1,5<3

Этанол 1,9% 97,5±0,55 I 1,22*10"5/ 1 11.07*10° 9*10 V 1,576 1,21*10"7 8,8*10"' 1,576 2,0<3

Как следует из таблицы 7, разработанная методика обладает высокой воспроизводимостью, степень дисперсии не больше допустимого значения 5%. Методика обладает высокой чувствительностью, нижний порог детектирования 2,74-Ю"6 мг/мл. Линейность соблюдается в диапазоне концентраций от 10"5 до коэффициент асимметрии соответствует нормативам 1,5<3. Коэффициент распределения для ацегальдегида не определялся ввиду его высокой летучести.

В таблице 8 представлены результаты количественного определения остаточных органических растворителей в 5 сериях РГПУ-195, синтезированных с использованием различных растворителей.

Таблица 8 - Содержание остаточных количеств растворителей в

Наименование пробы __^ """ИЩПЧ 3. 1 Ш Летучие вещества, мг/г

Растворители для синтеза Ацетальдегид Ацетон Этанол

1.РГПУ-195 Этанол 0,0035 Не обнаружен 2,64

2.Р111У-195 Этанол 0,0094 Не обнаружен 3 10

З.РГПУ-195 Этанол 0,0041 Не обнаружен 3 37

4.РГПУ-195 5.РГПУ-195 Ацетон Не обнаружен 0,62 Не обнаружен

Не обнаружен 3,68

По результатам, представленным в таблице 8, видно, что количественное содержание этанола в субстанции РГПУ-195 больше, чем остальных органических растворителей. Отсутствие ацетальдегида в серии, синтезированной с использованием ацетона, подтверждает, что ацетальдегид является примесью в использованном для синтеза этаноле. Методика определения остаточных растворителей включена в проект ФСП.

Количественный анализ РГПУ-195 в субстанции

Наличие в фармакологически активной части молекулы исследуемого вещества алифатической аминогруппы и атома азота в пиридиновом цикле обусловливает возможность применения кислотно-основного титрования в среде неводных растворителей. На первом этапе были проведены исследования по выбору условий количественного определения. Установлено, по таким показателям как растворимость, значение рК, что оптимальными протогенными растворителями, потенцирующим основные свойства РГПУ-195, являются муравьиная и уксусная кислота. Наличие в структуре исследуемого вещества двух молекул гидрохлорида обусловливает применение ацетата ртути (II).

Разработана методика формольного титрования, которая основана на связывании аминогруппы с формальдегидом до образования ТЧ-метилиденового производного (азомепгина) и демаскировании кислотных свойств аминокислоты. На предварительном этапе исследований методом ИК-спектрофотометрии было выявлено, что карбоксильная и аминогруппа РГПУ-195 взаимодействуют между собой и образуют цвитгер-ион. Наличие двух молекул гидрохлорида обусловливает возможность применения аргентометрического титрования. Для количественного определения использованы также методы ВЭЖУ 1 УФ-спектрофотометрии (УФС). Сравнительная оценка титриметрич^-.лх и физико-химических методов количественного определения РГПУ-195 в субстанции представлена в таблице 9.

Таблица 9 - Сравнительная оценка разработанных методик количественного

определения РГПУ-195

Методы Метрологические характеристики

Кол. сод.% Относ, погрешность Линейность результатов % Наличие СО

Неводное титрование 99,40 0,18 Я2=0,9995 у=1,9329х+0,1938 0,55 не требуется

Метод Серенсена 99,65 0,27 ^=0,998 у=1,0671х+2,2543 0,75 не требуется

Аргентометрия 99,26 0,20 ^=0,9989 у=0,85б6х+3,8653 0,72 не требуется

УФС 98,91 2,15 ЯЧ),9996 у=0,0496х+0,3023 0,74 требуется

ВЭЖХ 98,72 1,36 1^=0,9991 у=507,88х-37,464 2,19 требуется

Полученные результаты показывают, что физико-химические методы дают несколько заниженные результаты. Титриметрические методы позволяют получить более правильные результаты. Следует также сказать, что титриметрические методы (титрование в неводной среди и метод Серенсена) более точно отражают содержание фармакологически активной части РГПУ-195. При сравнении двух методик титриметрического анализа следует отдать предпочтение методу титрования в неводной среде, т.к. она дает более воспроизводимые результаты.

Нормы качества субстанции РГПУ-195

Установленные с использованием разработанных методик нормы качества субстанции РГПУ-195 представлены в таблице 10.

С учетом определенных норм качества методом «ускоренного старения» изучена стабильность исследуемого вещества, установлено, что срок годности РГПУ-195 составляет 5 лет. Таким образом, на основе изучения физико-химических свойств РГПУ-195 и выбора оптимальных методик анализа предложены способы стандартизации, которые позволили подготовить проект ФСП.

Таблица 10 - Нормы качества субстанции РГПУ-195

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Белый кристаллический порошок с кремовым оттенком, без запаха

Растворимость ГФХП Легко растворим в воде и спирте этиловом, растворим в растворах едких щелочей, в ацетонитриле

Подлинность ИК-спектроскопия ЯМР'Н-спектроскопия Уф. спектрофотометрия ИК-спектр в области от 4000 до 400 см'1 должен соответствовать прилагаемому спектру. ЯМР спектр, измеренный в (ДМСО-Ds) при рабочей частоте 400 МГц в диапазоне от 5=0,00 до 8=9,00 м.д., должен быть идентичен по положению и интенсивности сигналов протонов, прилагаемому спектру. УФ- спектр 0,002% водного раствора субстанции должен иметь максимум поглощения при 260±2нм

Температура плавления ГФ Х1Г, вып. 1, метод I 205 - 207°С (начало разложения)

Прозрачность раствора ГФХП 1% раствор должен выдерживать сравнение с эталонным раствором I

Цветность раствора ГФХП 1% раствор должен выдерживать сравнение с эталоном Кя Y7

рН (1 % раствор) Потенциометрически, ГФХП 2,2-2,4

Посторонние примеси ТСХ Не более 0,5%

Потеря в массе при высушивании ГФХП Не более 0,5%

Сульфатная зола ГФХП Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФХП Не более 0,001%

Остаточные органические растворители (спирт этиловый, ацетон) ГФХП Спирт этиловый не более 0,5% ацетон не более 0,5%

Микробиологическая чистота ГФХП Категория 2.2

Количественное определение Неводное титрование Не менее 99,0%

Упаковка ПоГОСТу

Маркировка Соответствует ФСП

Транспортирование ГОСТ 17768-90

Хранение В сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25°С

Срок годности 5 лет

Определение РГПУ-195 в плазме крови Для определения РГПУ-195 в плазме крови животных на предварительном этапе исследова: ^пользовали ТСХ после удаления балластных веществ. После хроматографирования пластинки просматривали в УФ-свете, поскольку при использовании нингидрина наблюдалась сплошная полоса. Идентифицировали по совпадению значения ХЧО

РГГТУ-195 (0,40) и пятна, обнаруженного в образце плазмы крови с =0,37. Кроме того, обнаружены дополнительные пятна со значениями Яг 0,67 и 0,80 в образце плазмы крови.

При разработке методик изолирования РГПУ-195 из крови использовали плазму крови животных, полученную путем центрифугирования. При выборе оптимальных условий экстракции РГПУ-195 из плазмы изучалось одновременное влияние на степень экстракции природы органического растворителя, рН буферного раствора, наличия электролитов. По результатам эксперимента наибольший суммарный выход РГПУ-195 был получен при использовании экстрагента этилацетата; добавление электролитов повышало степень экстракции РГПУ-195 из плазмы. Методика изолирования заключалась в следующем: к полученной плазме крови добавляли 0,2 моль/л раствор серной кислоты до рН 2-2,5 и перемешивали с небольшим количеством безводного сульфата натрия. Затем добавляли 25% раствора аммиака до рН 9-10 и перемешивали с безводным сульфатом натрия до получения порошкообразной массы. К образовавшейся массе добавляли порциями этилацетат до получения общего объема 20 мл, каждый раз тщательно перемешивали. Затем этилацетатное извлечение делили на две части, помещали в выпарительные чашки, после испарения этилацетата сухие остатки использовали для анализа с помощью ТСХ методики и капиллярного электрофореза.

Определение фармакокинетических характеристик субстанции РГПУ-195 проводили на 54 белых крысах самцах линии \Vistar массой 180-220 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария Пятигорской ГФА. Крысам перорально вводили субстанцию РГПУ-195 в дозе 50 мг/кг однократно. Затем за 15 минут до забора крови (периодичность забора крови: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0 ч.) внутрибрюшинно вводили наркоз (хлоралгидрат) в дозе 300 мг/кг. Пробы крови у животных отбирались из подъязычной вены, центрифугировались.

Количественное определение РГПУ-195 в плазме крови проводили методом капиллярного электрофореза. Данный метод позволяет избежать влияния фона и является наиболее селективным. Испытания проводили с

использованием системы Капель 105 (Люмэкс, Санкт-Петербург). Условия анализа представлены в таблице 11.

Таблица 11 - Условия проведения капиллярной хроматографии при определении РГПУ-195 в плазме крови

Капилляр:

Буферный раствор:

Длина волны:

Рабочее напряжение:

Ввод пробы:

длина 65 см, эффективная длина 60 см; диаметр 75 мкм

0,6% раствор натрия тетрабората десятиводного

254 нм

20кВ положительной полярности

150 мбар/с в течении 5 с

По полученным данным была построена фармакокинетическая кривая субстанции РГПУ-195.

В ? -

к -

/ V

я • / \

/ \ \

^_V _

о «

0 °'5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ю ч 12 время, ч Рисунок 9 - Фармакокинетическая кривая субстанции РГПУ-195 Из рисунка 9 следует, что концентрация субстанции РГПУ-195 достигает максимума через 3 часа. Рассчитанные параметры фармако-кинетики субстанции РГПУ-195 в плазме крови животных после пероралыюго введения представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Параметры фармакокинетики РГПУ-195 в плазме крови после

перорального введения

Определяемые параметры Значения параметров

Время достижения максимальной концентрации,ч 3,0

Максимальная концентрация, мкг/мл 6,80

Кажущийся объём распределения, л/кг 4,85

Константа элиминации, час"1 0,22

Общий клиренс, л/час/кг 1,04

Период полувыведения, час 3,22

Среднее время удерживания, час 5,23

Площадь под фармакокинетической кривой, (мкг/мл)*час 47,90

Из таблицы следует, что РГПУ-195 обладает высокой биодоступностью, максимальная концентрация вещества в плазме крови наблюдается через 3 часа.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование нового соединения РГПУ-195 с помощью физических, физико-химических и химических методов. Доказана возможность использования спектральных (УФС, ИКС, ЯМР спектроскопии), химических методов (реакции с нингидрином, осадительные реакции, реакции на пиридиновое ядро) для качественной характеристики и определения подлинности РГПУ-195.

2. Изучена возможность использования хроматографических методов для характеристики чистоты РГПУ-195. Установлено, что метод ТСХ позволяет достоверно определить основную примесь пиридил-у-пироллидон, при ее содержании до 0,2%.

3. Установлено, что метод ГЖХ позволяет определить наличие и количественное содержание остаточных растворителей в пределах концентраций регламентируемых НД.

4. Изучены условия и разработаны методики определения примесей в РГПУ-195 с помощью ВЭЖХ. Определено содержание основной (пиридил-у-пироллидон) и других примесей.

5. Проведена сравнительная оценка титриметрических и физико-химических методов количественного определения РГПУ-195. Показано, что наименьшую погрешность дает метод титрования в неводных растворителях.

6. Разработана методика изолирования РГПУ-195 из плазмы крови животных, изучены фармакокинетические параметры вещества.

7. Изучена стабильность и установлен срок годности РГПУ-195, который составил 5 лет. По результатам исследования разработан проект ФСП.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Беликов, В.Г. Определение 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида методом неводного титрования / В.Г. Беликов, Б.В. Боровский // Фармация. - 2011. - №3. - С. 8-10.

2. Беликов, В.Г. Определение остаточных органических растворителей 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты в субстанции методом ГЖХ / В.Г. Беликов, Б.В. Боровский, А.Г. Рассказов // Естественные и технические науки. - 2010. - №6. - С. 252-257.

3. Беликов, В.Г. Разработка методик количественного определения РГПУ-195 в субстанции / В.Г. Беликов, Б.В. Боровский // Научное обозрение. - 2010. -№4.-С. 13-16.

4. Боровский, Б.В. Разработка методик количественного определения РГПУ-195 в субстанции методом осадительного аргентометрического титрования / Б.В. Боровский // Научная жизнь. - 2010. - №6. - С. 32-35.

5. Беликов, В.Г. Использование УФ-спектрофотометрии для качественного и количественного анализа нового биологически активного вещества / В.Г. Беликов, Б.В. Аванесов // Человек и лекарство: тез. докл. 17 Рос. нац. конгр. 12-16 апреля 2010 г. - М., 2010. - С. 576.

6. Беликов, В.Г. Использование хроматографии в тонком слое сорбента для контроля чистоты и стабильности 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты / В.Г. Беликов, Б.В. Аванесов, Л.П. Овчаренко, C.B. Клочков // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2010. - Вып. 65. - С. 267-269.

7. Беликов, В.Г. УФ-спектрофотометрический анализ 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида / В.Г. Беликов, Б.В. Аванесов // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2009. - Вып. 64. - С. 247-250.

8. Беликов, В.Г. Титриметрическг_ годы количественного анализа 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты / В.Г. Беликов, Б.В. Боровский // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. - Пятигорск, 2011. - Вып. 66. - С. 355-356.

БОРОВСКИЙ БОРИС ВЛАДИМИРОВИЧ

Изучение физико - химических свойств, разработка методик анализа и стандартизация 4-амино-3-(пиридил-3)-бутановой кислоты дигидрохлорида

14.04.02-фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати « Ж» 2011 г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № Я'??

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИТЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)