Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение взаимодействия фенибута с салициловой кислотой и стандартизация нового биологически активного соединения салифен

На правах рукописи

ЛАРСКИЙ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕНИБУТА С САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ САЛИФЕН

1 i All _AonwoireDTiiun^b"oa vn»*iia ibiimtoi'Arumiia

VIVM upiiiu^vui >• (vviiuji Дшипл) >|<u|jiitu»ui пил¡и>

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

0Ü345001Т

ПЯТИГОРСК 2008

003450017

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентва по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

заслуженный деятель науки РФ, профессор Беликов Владимир Георгиевич

Официальные оппоненты. доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович

кандидат фармацевтических наук Кичее Дмитрий Геннадъевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агетства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «11» ноября 2008 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208 069 01 при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятшорск, пр Калинина, И)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава

Автореферат разослан « /0 » октября 2008 :

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

Компапцева Е В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств играют важнейшую роль в обеспечении населения эффективными и безопасными лекарственными препаратами Это в ббльшей степени относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения больных с нарушениями мозгового кровообращения Поэтому наряду с поисками новых средств для лечения указанных заболеваний, необходимо решать вопросы разработки методов их анализа

К числу таких лекарственных препаратов относятся производные у-аминомасляной кислоты (ГАМК) Они показали свою эффективность при терапии различных форм ишемии головного мозга ГАМК-ергические лекарственные вещества, к числу которых относится фенибут (-у-амино-Р-фенилмасляной кислоты гидрохлорид), способны сохранять высокие показатели кардио- и гемодинамики в условиях ишемии мота и миокарда Однако имеются возможности повышения эффективности фенибута путем его сочетания с другими биологически активными соединениями С этой целью на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им А И Герцена (г Санкт-Петербург) был синтезирован ряд биологически активных соединений, одним из которых является салифен - аддукт у-амино-р-фенилмасляной кислоты (АФМК) и кислоты салициловой в молярном соотношении 2 1 Предварительные доклинические исследования салифена, проведенные на базе Волгоградского государственного медицинского университета, показывают перспективность его применения в медицинской практике в качестве нейропротекторного и противоишемического лекарственного средства В то же время для его внедрения в медицинскую практику необходимы объективные и надежные методы контроля качества До настоящего времени разработкой методов анализа салифена не занимались Необходимость их разработки связана также и с тем, что неизвестен характер взаимодействия фенибута и салициловой кислоты в салифене, а, следовательно, не выяснены вопросы взаимного влияния компонентов на результаты определения каждого из них ,

Поэтому разработка методов стандартизации и контроля качества салифена является актуальным вопросом для фармацевтической науки и практики

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение взаимодействия АФМК с кислотой салициловой и стандартизация нового биологически активно1 о соединения салифен

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 Изучить взаимодействие АФМК и кислоты салициловой с помощью термических и спектральных методов

2 Исследовать возможность использования химических и физико-химических методов анализа для подтверждения подлинности салифена в субстанции

3 Изучить возможность применения хроматографических, оптических и химических методов для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена

4 Обосновать условия применения хроматографического анализа для контроля чистоты субстанции салифена

5 Изучить факторы, обусловливающие стабильность и установить срок годности субстанции салифена

6 Разработать нормы качества и подготовить проект ФСП на субстанцию салифена

Научная новизна. Проведено изучение характера взаимодействия фенибута с салициловой кислотой с помощью ПМР- и ИК-спектрометрии, а также термических методов Показано, что взаимодействие между компонентами происходит за счет аминогруппы фенибута и карбоксильной группы салициловой кислоты Установлено, что в ИК-спектре салифена отсутствует полоса поглощения неионизированной карбоксильной группы, в спектре ПМР также не регистрируется сигнал протона карбоксильной группы В связи с этим высказано предположение об образовании водородной связи между карбоксильной группой фенибута и фенольным гидроксилом салициловой кислоты На основании изучения физико-химических свойств салифена и его составных частей обоснованы методики

4

качественного и количественного определения салифена В результате валидационнои оценки доказана приемлемость методик количественного определения салифена с помощью физико-химических и химических методов Обоснована методика количественного определения фенибута и кислоты салициловой в субстанции салифена, позволяющая проводить анализ в одной навеске без разделения Осуществлен выбор условий конгроля чистоты субстанции салифена с помощью ТСХ и ВЭЖХ Методом ускоренного старения изучена стабильность субстанции салифена и установлен срок годности

Практическая значимость результатов исследования. Разработаны и валидированы методики испытаний на подлинность чистоту и количестренного определения салифена химическими и физико-химическими методами Валидационная оценка предлагаемых методик показала, что они отличаются простотой выполнения, высокой чувствительностью, отсутствием систематической погрешности и позволяют достоверно оценивать качество суостанции салифена Разработанные методики анализа и нормы качества включены в проект ФСП

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка на субстанцию салифен Получен акт апробации предлагаемых методик анализа салифена от ОАО «Щелковский витаминный завод», г Щелково Положения, выносимые на защиту:

1 Результаты изучения взаимодействия между фенибутом и кислотой салициловой с помощью термических и спектральных методов

2 Результаты качественного и количественного определения у-амино-р-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена, а также сравнительная оценка разработанных методик

3 Результаты использования тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения потенциальных примесных соединений в субстанции салифена

4 Нормы качества, стабильность и срок годности субстанция салифена

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положени диссертационной работы доложены на региональных конференциях (Пятигорск 2007 и 2008 гг, Владикавказ, 2007 г, Воронеж, 2007 г) По теме диссертацш опубликовано 6 научных работ

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтически наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская государственна фармацевтическая академия Росздрава (номер государственной регистраци 01 2 00101060)

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страница, машинописного текста, выполненного с помощью компьютерного набора, содержи 40 таблиц, 30 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4-х гла собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 13 источник, в том числе 33 иностранных, и приложений

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Изучение взаимодействия фенибута с салициловой кислотой Проведенный анализ данных литературы показал, что лекарственные веществ при взаимном влиянии могут существенно изменять стабильность, биодоступност и физико-химические свойства друг друга Поэтому первым этапом наш исследований стало изучение характера взаимного влияния фенибута и кислоть салициловой Определение проводили термическими и спектральными методами Объектами исследования являлись субстанции салифена, фенибута, кислоть салициловой, а также физическая смесь фенибута гидрохлорида с кислото' салициловой 2 1 Субстанции салифена различных серий синтезированы на кафедр органической химии Российского государственного педагогического университе < им А И Герцена (г Санкт-Петербург) и были любезно предоставлены на разработчиками

В результате дифференциального термического анализа (ДТА) в сочетании дифференциальной термогравиметрией (ДТГ) были установлены тепловы эффекты, возникающие при нагревании образцов исследуемых соединений Данны

представлены в таблице 1 Таблица 1 - Результаты ДТА и ДТГ фенибута, кислоты салициловой, салифена и модельной смеси фенибута с кислотой салициловой в молярном соотношении 2 1

Образец Эффекты ДТА, начало -максимум — окончание, °С ДТГ, начало тсрмодесгрукции, "С

в области плавчения вне области плавления

Фенибут (ФБ) 192-200-220, погл >220, т о дестр, выд 196

Кислота салициловая (КС) 154-159-164, погл 190-194-210, погл 158

Физическая смесь ФБ + КС 2 1 195-200-208, погл >260, слабые эффекты, т о дестр, выд «ступенчатые» эффекты потери в массе 105, исп вл, 2UU, плавление, 260 то дестр

Салифен 119-122-1.28, погл 98-102, иш вл, слабый эффект, погл >300, слабые 'иЬгТ\"!П1.Т Ш1Т сстуренчатый» эффект 108, исп вл 120то дестр

Примечания Погл - поглощение тепла, выд - выделение тепла, т о дестр - термоокислительная деструм^йч, разл — разлиженис, иш в а — ИнТарскИс вд<и и

Сравнительный анализ полученных результатов показывает, что тепловые эффекты салифена как в области плавления, так и вне ее резко отличаются от таковых у физической смеси и индивидуальных веществ Известно, что изменения температур начала или максимума пика плавления веществ могут наблюдаться из-за различных физических и химических эффектов, обусловленных взаимодействием между компонентами

Для более детального изучения природы взаимодействия, возникающего между фенибутом и кислотой салициловой, были изучены спектры протонно-магнитного резонанса (ПМР) салифена, основания фенибута (АФМК), кислоты салициловой и физической смеси фенибута гидрохлорида с кислотой салициловой Определяющее значение при изучении взаимодействия отводилось установлению поведения первичной алифатической аминогруппы фенибута и карбоксильных групп фенибута и кислоты салициловой

Важнейшей характеристикой спектра ПМР является химический сдвиг, зависящий от структуры молекулы Электронная плотность протонов в молекулах

определяется характером химической связи и индукционными эффектам! окружающих групп, вследствие чего экранирование прогонов становтс различным и их сигналы проявляются в разных областях спектра Результать отнесения полос спектров ПМР к водородсодержащим функциональным группал молекул исследуемых соединений представлены в таблице 2

Таблица 2 - Результаты анализа спектров ПМР салифена, АФМК, кисло п

салициловой и модельной смеси фенибута и кислоты салициловой (2 ])

Вещество 8, мл Функциональная группа Примечание

2,4 - 3,6 -СН2-

АФМК (основание фенибута) 7,18-7,22 -с6н5 мультиплет

- -CQQH |!л проявляется

7,5 - NH;

11,23 - соон

Кислота салициловая - -он нс проявляется

6,78-7,8 — СбН| мульпшлет

2,4-3,6 -сн2-

Физическая смесь фенибута гидрохлорида с кислотой салициловои2 1 с о п с \J,U — t ,v/ — г\д

12,2 -соон

7,8-7,9 - NH;

- -он не проявляется

24-3,6 -сн7-

7,05 - 7,3 -Аг

Салифен - -СООН не проявляется

7,6-7,7 - NH;

- -он не проявляется

На спектре ПМР АФМК не регистрируется сигнал протона карбоксильно

группы и обнаруживается характерная полоса протона ионизированно аминогруппы Данный факт можно объяснить тем, что основание фенибут находится в виде цвиттер-иона

Спектр ПМР кислоты салициловой имеет четкую полосу протон неионизированной карбоксильной группы с величиной химического сдвига 11.2 миллионных долей, сигнал протона фенолъного гидроксила из-за экранирующи эффектов на спектре не регистрируется

Спектр ПМР физической смеси фенибута гидрохлорида и кислот салициловой характеризуется наличием полос с величинами химического сдви 12,2 и 7.9 миллионных долей, характерных соответственно для протоно

неионизированной карбоксильной группы и ионизированной первичной алифатической аминогруппы Это свидетельствует о том, что в физической смеси аминогруппа фенибута протонирована кислотой хлороводородной, а не за счет водорода карбоксильной группы кислоты салициловой На спектре ПМР салифена из указанных групп регистрируется только сигнал протона ионизированной первичной алифатической аминогруппы, а протон карбоксильной группы кислоты салициловой в отличие от спектров физической смеси и кислоты салициловой не регистрируется Это может свидетельствовать о юм, что данная группа находится в ионизированном состоянии и именно она участвует в протонировании аминогруппы основания салифена Для проверки этого предположения были исследованы спектры поглощения этих же соединений в ИК-областн

Измерения проводили в дисках калия бромида на спектрометре ИКС-40 в режиме пошагового сканирования в диапазоне от 4000 до 400 см 1 По результатам изучения спектров была составлена таблица отнесения полос поглощения к некоторым структурным фрагментам молекул

Таблица 3 - Отнесение полос поглощения ИК-спектров фенибута гидрохлорада, салифена, кислоты салициловой и физической смеси фенибута гидрохлорида с

кислотой салициловой

Положение полосы см' Отнесение

фенибута гидрохлорид (ФБ) салифен физическая смесь ФБ + КС 2 1 кислота салициловая (КС)

3600-3550, широкая V о-н (фен.) ассоциированная водородной связью

3380-2800, широкая 3050-2800, широкая 3100-2880, широкая VacNH+ j

2147, средняя VNHÍ j

1712, очень сильные 1712, 1656, сильные 1668,сильная VCOOH

1620, очень сильная Vcoo

Примечания V - симметричные валентные колебания, - асимметричные валентные колебания,

В спектрах фенибута гидрохлорида, салифена и физической смеси фенибута гидрохлорида с кислотой салициловой валентные симметричные колебания

первичной алифатической аминогруппы наблюдаются при 3050-2800 см"' Следус особо подчеркнуть, что в этих соединениях она находится в протонированно\ состоянии, что коррелирует с результатами спектроскопии ПМР Валентны колебания карбонильной группы неоинизированного карбоксила в спектре фенибут< гидрохлорида проявляются в виде полосы очень сильной интенсивности пр 1712 см'1 В спектре кислоты салициловой имеется интенсивная полоса пр1 1668 см"', что характерно для валентных колебаний связи С-0 неионизированно) карбоксильной группы, ассоциированной внутримолекулярной водородной связь В спектре физической смеси также наблюдаются обе эти полосы - при 1712 1656 см"', а в салифене полоса поглощения карбонильной группы карбоксил смещена в область 1620 см*1. Из данных литературы известно, что подобно смещение полосы происходит при переходе карбоксильной группы ионизированное состояние

Таким образом использование термических методов анализа дало основанп предположить наличие физико-химического взаимодействия между фенибутом кислотой салициловой в субстанции салифена. С помощью ИК-ПМР-спектроскопии установлено, что наиболее вероятным механизмо взаимодействия является образование ионной связи за счет протонирован первичной алифатической аминогруппы фенибута карбоксильной группой кисло салициловой

Определение подлинности субстанции салифена

В процессе изучения взаимодействия между фенибутом и кислото салициловой в субстанции салифена было установлено, что ИК-спектр поглощени салифена, измеренный в дисках калия бромида, является специфичным Кроме тог на спектре проявляются полосы поглощения с характеристическими частотам позволяющими достоверно обнаруживать основные структурные фрагмент молекулы салифена Это дало основание рекомендовать ИК-спектроскопию дисках калия бромида для идентификации субстанции салифена

Для подтверждения подлинности была изучена возможность использовани УФ-спектрофотометрии В результате установлено, что УФ-спектр поглощени

салифена не является специфичным, так как имеет те же экстремумы, что и УФ-спектр поглощения кислоты салициловой

Для включения в проект ФСП были рекомендованы наиболее чувствительные химические реакции с 1% спиртовым раствором нингидрина (АФМК) и 3% раствором железа (III) хлорида (кислота салициловая)

Определение посторонних примесей в субстанции салифена Для определения посторонних примесей в субстанции салифена изучена возможность использования тонкослойной хроматографии для идентификации и контроля стабильности салифена Исследование выполняли на готовых пластинках Сарбфил УФ-254 Установлено, что детектирование пятен фенибута и кислоты салициловой целесообразно проводить путем последовательного опрыскивания пластинки 1% спиртовым раствор нингидрина и 3% раствором железа (III) хлорида В первую очередь была изучена хроматографическая подвижность АФМК и кислоты салициловой в растворителях различной полярности

Выявлено, что АФМК обладает наибольшей хроматографической подвижностью при использовании полярных растворителей - воды и спирта 95% В малополярных растворителях значения его Rf близки к нулю Кислота салициловая обладает подвижностью в элюентах различной полярности, однако наибольшие значения Rf также достигаются при использовании воды и спирта этилового 95% Следует подчеркнуть, что использование в качестве элюента только спирта ведет к получению размытых зон АФМК и, как следствие, к затруднениям в определении величины Rf Поэтому, с целью устранения указанного недостатка, в подвижную фазу вводили компонент основного характера - 25% раствор аммиака

В ходе предварительных испытаний установлено, что в субстанции салифена вначале деструкции подвергается АФМК Поскольку продукт деструкции - 4-фенилпирролидон имеет сходство с АФМК по физико-химическим свойствам, мы посчитали возможным использовать в качестве вещества-свидетеля раствор АФМК

Путем сравнительного анализа был установлен оптимальный состав подвилчкой фазы спирт 95% - раствор аммиака 25% (18 1) Использование указанной подвижной фазы адекватно отвечало задаче достоверного определения

фенибута и кислоты салициловой в салифене, а также потенциального продукта деструкции - 4-фенидпирродидока-2. Величины АФМК, кислоты салициловой и потенциального примесного соединения составили 0,22±0,03; 0,56±0,03 и 0,65±0,03 соответственно.

Хроматограмма салифена, полученная в указанных условиях, представлена на|

I

рисунке 1. I

о

О О |

0 О 0 ° I

...........!.....^..........I- ......

1 2 3 4 5

Рисунок I - Хроматограмма салифена в системе спирт этиловый 95% - раствор аммиака 25% (18:1)

1 - раствор салифена (100 мкг) |

2 - раствор 1 СОВС у-амино-Р-фенилмасляной кислоты (70 мкг) |

3 - раствор СОВС кислоты салициловой (30 мкг) 1

4 - раствор 2 СОВС у-амино-р-фенилмасляной кислоты (0,35 мкг) |

5 - раствор 2 СОВС у-амино-р-фенилмасляной кислоты (0,1 мкг) } Исходя из допустимого содержания 4-фенилпирролидона-2 в фенибуте.'

установлено его предельно допустимое содержание в салифене, которое составился 0,35%. На основании проведенных исследований была разработана методика Коп I НИС1 Ы иу ОСТаНЦИИ С ¿иI Ср С Н ¡х, К\)Юр3.л ВКЛЮ^ГСпЙ. в проект Ф СП. I

Для контроля чистоты установлена также принципиальная возможности

использования обращенно-фазового варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии. В результате подобран оптимальный сорбент - алкилсиликагель хромасорб С8, а также состав и рН подвижной фазы. Детектирование проводили спектрофотометрически при 258 нм. Хроматографирование осуществляли в градиентном режиме. Выбор условий проведен методом пробного градиента (таблица 4).

Таблица 4 - Условия хроматографического определения салифена

Состав буферного раствора Время, мин Режим элюировзния

U,j56 % раствор NaH2PU4 и Н3Р04 до рН 2,7-2,8 Ацетонитрил, % Буферный раствор, %

0 13 87

5 13 87

10 30 70

20 м 70

Хроматограмма салифена, полученная в указанных условиях, представлена на рисунке 2.

-I

--- \

п л

1 2 II

JJJ- -i-1-1 —i— —i— — —i— — — — -1- -1—

С 1 2 3 4 5 É 7 8 9 1С 11 1Î 13 14 15 16 17 п

Рисунок 2 - Хроматограмма раствора салифена

1 - фенибут

2 - потенциальное примесное соединение (4-фенилпирролидон-2)

3 - кислота салициловая

Как СЛёДусТ ИЗ приведем 111010 риСуНКи, дОСТй!'Ну 1 и ДиС 1^)ьёрнОс рио,ДслскИс

пиков фенибута, кислоты салициловой и потенциального продукта деструкции

(4-фенилпирролидона-2)

Количественное определение АФМК и кислоты салициловой в субстанции

салифена

При количественном определении адцуктов последовательно устанавливают содержание каждого из компонентов Для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена использовали титриметрические и фотометрические методы Для определения кислоты салициловой предложены методики обратного броматометрического титрования и фотометрического определения по реакции с железа (III) хлоридом в среде трис-буферного раствора с pH 2.5 Результаты количественного определения салициловой кислоты в 0,1 г субстанции салифена с помощью указанных методик представлены в таблице 5 Таблица 5 - Результаты количественного определения кислоты салициловой в

субстанции салифена

Обратное броматометрическое 1игро»<шие ччпимздрические определение ни реакций С железа (III) хлоридом

Объем титранта, мч Найдено кислоты салициловой,% Метрологические характеристики Оптическая плотность испытуемого раствора Найдено кислоты салициловой, % Метрологически характеристики

12,50 28,75 Хер = 28,77% S = 0,1216 S- = 0,049643 Ах, =±0,31 Ах =±0,13 £,=±1,09% с = ±0,44% 28,75±0,15% 0 652 27,55 Хср = 28,18% S =0,612753 S-, =0,250156 Ах, =±1,57 Ах =±0,64 £,=±5,59% £ = ±2,28% 28,2±0,6%

12,54 28,66 0,664 28,06

12,46 28,84 0,680 28,73

12,50 28,75 0,673 28,44

12,54 28,66 0,649 27,42

12,40 28,98 0,684 28,9

Примечание - VK = 25,0 мл (среднее значение из 6 параллельных определений) Примечание - Оптическая плотность ирод' взаимодействия 0,006% раствора стандартно образца кислоты салициловой с железа (И хлоридом (среднее значение из ше параллельных определений) составляла 0,71

Как следует из представленных результатов, методами обратной

броматометрии и фотометрии на основе реакции с железа (Ш) хлоридом найдено

среднее содержание кислоты салициловой в образцах субстанции салифена, которое составило 28,75*0,15% и 28,2±0,6%, при относительных погрешностях определения ±0,44% и ±2,28% соответственно

Предлагаемые методики были валидированы согласно рекомендациям ICH по показателям линейность, сходимость, правильность Результаты установления указанных валидационных характеристик представлены в таблице 6 Таблица 6 - Основные валидационные характеристики методик количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена

Показатель Методика обратного броматометрического титоооапия Фотометрическая методика по реакции с железа (III) хлоридом

Линейность 0,015-0,04 г у =-447,43 х +25,00 г-0,9999 удовлетворительная 0,001-0,012% у = 118,09 х +0,0026 г = 0,9958 удовлетворительная

Сходимость RSD = 0,454% удовлетворительная RSD - 1,69% удовлетворительная

Правильность К = 99,73-100,18% RSD = 0,23 -0,37% W = l,79-2,13<tnl6„ удовлетворительная R = 98,52- 101,90% RSD = 2,26-4,89% W, = 0,44- 1,60 MTi6lI удов четворительная

Как следует из полученных результатов, методики являются валидными по основным критериям

Химические свойства позволили использовать для количественного определения АФМК в сапифене ацидиметрическое титрование в среде неводного растворителя - кислоты уксусной безводной В разработанной методике титрантом является 0,1 моль/л раствор кислоты хлорной, точку эквивалентности определяли с помощью индикатора - кристаллического фиолетового Определить содержание АФМК можно также фотометрическим методом по реакции с нингидрином С помощью симплексного планирования эксперимента были установлены оптимальные условия проведения реакции - количество и рН фосфатного буферного раствора, время нагревания, количество 0,05% раствора кислоты аскорбиновой, добавляемой для увеличения чувствительность реакции Результаты

ч-г\ ппиалтп дттплппвгтвтто»»ип Л п А 1 г /ч йгтоипиы РОПи^РГЮ Л

1ии1 11IV 1 и ии^^ильшк/! I и и^ 1 1 V» V ни «V ки,и «

указанных методик приведены в таблице 7

Таблица 7 - Результаты количественного определения АФМК в субстанции салифена

Ацидиметричсское титрование в среде неводного растворителя Фотометрическое определение по реакци нингидрином

Объем титранта, мл Найдено АФМК,% Метрологические характеристики Оптическая плотность испытуемого раствора Найдено АФМК,% Метрологические характеристики

12,16 71,68 х™ = 71 82% 8 = 0,176635 =0072111 Ах, =±0,45 Ах =±0,19 е, = ±0,63% £ = ±0,26% 71,80±0,20% 0,800 72,73 Хер =77,3 5% 0,961603 .V, = 0,392573 Ах, = 12,47 Ах =±1,00 с, = ±3,42% — — 1 1 -то/ с. " /о 72,4±1,0%

12,20 7192 Л V, / и / 71,55

12,20 71,92 0,809 73,55

12,14 71,56 0,804 73,09

12,18 71,80 0,794 72,18

12,22 72.04 0,781 71,00

Примечание - V,, = 0,16 мл (среднее значение из 6 параллельных определений) Примечание - Оптическая плотность продук взаимодействия 0,0006% раствора стандартпог образца ЛФМК с нингидрином составляла 0 6 (среднее значите из шести параллельны определений)

Таким образом, с помощью ацидиметрии в среде неводного растворителя и фотометрической методики на основе реакции с нингидрином установлено среднее содержание АФМК в субстанции салифена, которое составило 71,80±0,20% и 72,4±1.0%, при относительных погрешностях определения ±0,26% и ±1,39% соответственно Результаты валидационной оценки методик показали, что они характеризуются удовлетворительными линейностью, сходимостью и правильностью, то есть являются валидными по основным критериям

Недостаток разработанных методик заключался в необходимости определять каждый из двух компонентов разными методами Поэтому была предпринята попытка найти условия определения обоих компонентов гя гтифеиа с помощью единой методики С этой целью использовали потенциометрическое

алкалиметрическое титрование В качестве гитра(гга использовали 0,1 моль/л раствор калия гидроксида, точки эквивалентности фиксировали потенциометрически В результате установлено, что оптимальной средой, позволяющей дифференцировать кислотные свойства АФМК и кислоты салициловой, является смешанная водно-органическая система вода-диметилсульфоксид (ДМСО) в соотношении 1 1 Для повышения кислотных свойств АФМК в реакционную смесь по достижении первого скачка потенциала добавили раствор формалина и после перемешивания в течение 5-6 минут титрование возобновляли Параллельно проводили контрольный опыт Кривые титрования салифена, полученные в таких условиях, представлены на рисунке 3

Рисунок 3 - Кривая титрования салифена в среде вода - ДМСО (11), титрант- 0,1 моль/л раствор калия гидроксида (момент добавления формалина показан стрелкой) Как следует из представленного рисунка, в выбранных условиях проведения титрования ясно различимы кривые титрования раствора формалина (1. контрольный опыт), кислот ы салициловой (2) и АФМК (3) Объемы титранта, израсходованные на титрование кислоты салициловой и АФМК, соответствуют отрезкам АВ и ВС Объем титранта, расходуемый на титрование контрольного опыта, равен отрезку ОА

В выбранных условиях анализа проводили количественное определение АФМК и кислоты салициловой Статистически обработанные результаты

количественного определения АФМК и кислоты салициловой в 0,3 г салифена представлены в таблице 8

Таблица 8 - Результаты количественного определения АФМК и кислоты салициловой в салифене методом потенциометрического алкалиметрического титрования

V], мл Уг, мл Найдено КС, % Найдено АФМК, % Метрологические характеристики

Кислота салициловая АФМК

6,20 18,9 27,97 72,00 Хер = 27,86% 5 = 0,125976 ^ =0,05143 Д*, =±0,32 Ах =±0,13 с, = ±1,16% £ = ±0,47% 27 85±0 15% ХсР =71,91% Б = 0,24 = 0,098 Ах, =±0,62 Ах =±0,25 £| - ±0,86% £=±0,35% 71,9±0 3%

6,15 18,9 27,74 72,30

6,15 18,85 27,74 72,00

6,20 18,85 27,97 71,71

6,15 18,80 27,74 71,71

с пп и^-и 1 о ос 1*7 Г)1 ^ / 1 11 Т1 1 1, / 1

Примечание - V,«, равен 0,40 мл (средний результат из 5 параллельных определений), поправочный коэффициент раствора титр гита равен 0,98

В результате установлено среднее содержание кислоты салициловой и АФМК в исследуемом образце субстанции салифена, которое составило 27,85±0,15% и 71,9±0,3%, при относительных погрешностях определения ±0,47% и ±0,35% соответственно Проведенная валидационная оценка показала, что предлагаемая методика валидна по критериям линейность, сходимость, правильность

С целью включения в проект ФСП методики количественного определения субстанции салифена провели сравнительную оценку разработанных нами методик При этом учитывали возможность проведения количественного определения АФМК и кислоты салициловой в одной навеске салифена, среднее время анализа, величину относительной погрешности определения, а также требования к наличию стандартного образца Результаты сравнительной оценки разработанных методик по указанным критериям представлены в таблице 9

Таблица 9 - Сравнительная оценка предлагаемых методик количественного

определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена

Обратная броматометрия Фотометрия гго реакции с железа (III) хлоридом Ацидиметрия в среде кислоты уксусной ледяной Фотометрия по реакции с нингидрином Потенциомет-рическое алкал им етри-ческое титрование

Определяемый компонент Кислота салициловая Кислота салициловая АФМК АФМК Кислота салициловая и АФМК

Время анализа, мин 20-25 5-10 5-10 25-30 20-25

Наличие стандартного образца не требуется требуется не требуется требуется не требуется

Относительная погрешность определения ±п 44% ±2,28% ±0,26% ±1,39% ±0,47% (кислота салициловая) ±0,35% (АФМК)

Поскольку методика потснциомстричсского алкалиметрического титрования в среде вода-ДМСО (1 1) дает возможность определять оба компонента салифена в одной навеске, а также позволяет сократить продолжительность анализа, выполнять его без стандартного образца и в результате получить приемлемые значения относительной погрешности, она была нами рекомендована для включения в проект ФСП Другие разработанные методики могут быть использованы в качестве альтернативных или для определения салифена в лекарственных препаратах и биологических жидкостях

Нормы качества, стабильность и срок годности субстанции салифена

Нормы качества субстанции салифена, установленные на 6 сериях на основе разработанных методик, представлены в таблице 10

При определении прозрачности, цветности и рН растворов салифена рекомендовано использование воды очищенной, нагретой до кипения Испытания проводят после охлаждения раствора до комнатной температуры

Таблица 10 - Нормы качества субстанции салифена

Показатель Метод Норма

Описание Визуальный Белый микрокристаллический порошок

Растворимость ГФХ1 Практически нерастворим в воде, мало растворим в спирте 95%, ацетоне практически нерастворим в гексанс, растворим в кипящей воде, легко растворим в растворах едких щелочей

Подлинность ИК-спектроскопия Цветные реакции Соответствует ФСП

Температура плавления ГФ XI, метод 1а 118 - 122°С (начало разложения)

Прозрачность раствора ГФ XI 1% раствор должен выдерживать сравнение с эталонным раствором I

Цветность раствора ГФ XI 1% раствор должен выдерживать сравнение с эталоном № 76

рН Потенциометрически ГФХ1 3,4 - 4,6 (0,5% раствор)

Посторонние примеси тех Не более 0,35%

Потеря в массе при высушивании ГФ XI Не более 0,03%

Сульфатная зола ГФ XI Не более 0,1%

Тяжелые металлы ГФ XI Не более 0,001%

Микробиологическая чистота ГФ XI и изм 3 Категория 1 2 Ь

Количественное определение Потенциометрическое титрование - у-амино-В-фенилмасляной кислоты не менее 71,0 и не более 73,0% - кислоты салициловой не менее 27,0 и не более 29,0%

С учетом выявленных нормативов методом «ускоренного старения» изучен

стабильность исследуемого вещества и установлено, что срок годности субстанци салифена составляет 5 лет

Таким образом, на основе исследования взаимодействия между фенибутом кислотой салициловой в салифене и выбора оптимальных методик анализ предложены способы стандартизации субстанции салифена, которые легли в основ проекта ФСП

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1 Изучено взаимодействие у-амино-р-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена с помощью термических и спектральны методов Установлено, что наиболее вероятным механизмом взаимодействия является образование ионной связи, возникающей между карбоксильной

1 20

группой кислоты салициловой и первичной алифатической аминогруппой у-амнно-(3-фенилмасляной кислоты

2 Исследована возможность использования химических и физико-химических методов для подтверждения подлинности субстанции салифена Для идентификации салифена предложено использование ИК-спектроскопии, а также химических реакций с нингидрином и железа (III) хлоридом

3 Обосновано применение тонкослойной хроматографии для контроля чистоты субстанции салифена Найдены оптимальные условия для определения потенциального примесного соединения в субстанции салифена, установлено его предельно допустимое содержание, равное 0,35%

4 Показана принципиальная возможность использования метода ВЭЖХ для контроля чистоты субстанции салифена Установлены оптимальные условия определения, позволяющие достоверно разделять пики АФМК, кислоты салициловой, а также потенциального примесного соединения

5 Изучены возможности использования фотометрических и титриметрических методов анализа для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена Для количественного определения кислоты салициловой предложены методики обратного броматометрического титрования и фотометрического определения на основе реакции с железа (III) хлоридом Относительные погрешности определения при использовании указанных методик не превышают ±0,44% и ±2,28% соответственно

6 Предложены методики ацидиметрического титрования в среде кислоты уксусной безводной и фотометрического определения на основе реакции с нингидрином для количественного определения АФМК в субстанции салифена Относительные погрешности определения не превышают ±0,26% и ±1,39% соответственно

7 Разработана методика потенциометрического алкалиметрнческого титрования в смешанной водно-органической среде вода-ДМСО (11), позволяющая проводить количественное определение кислоты салициловой и АФМК в

одной навеске субстанции салифена, с относительной погрешностью определения не более ±0,47% и ±0,35% соответственно

8 Проведена валидационная оценка всех предложенных методик количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена В результате установлено, что методики являются валидными по основным критериям линейность, сходимость, правильность

9 В результате сравнительной оценки для включения в проект ФСП рекомендована методика потенциометрического определения салифена в среде смешанного водно-органического растворителя вода-ДМСО (1 1) Указанная методика позволяет проводить количественное определение АФМК и кислоты салициловой в одной навеске субстанции салифена, характеризуется удовлетворительной продолжительностью анализа, приемлемыми величинами относительной погрешности определения, возможностью проводить определение без стандартных образцов

10 Обоснованы нормы качества исследуемого вещества С помощью метода «ускоренного старения» изучена стабильность салифена и установлен срок годности субстанции салифена, который составил 5 лет

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1 Изучение возможности использования ИК-спектроскопии для идентификации нового биологически активного соединения салифен // Научное обозрение -2006 -№5 -С 30-33 (Соавт Беликов В Г )

2 Разработка и валидация фотометрической методики количественного определения кислоты салициловой в субстанции салифена // Разработка, исследование и маркетиш новой фармацевтической продукции сб научн тр Пяшгорской ГФА - Пятигорск, 2007 - Вып 62 - С 250-252 (Соавт Беликов В Г)

3 Разработка методики количественного определения нового биологически активного соединения салифен !! Пути и формы совершенствования фармацевтического образования Создание новых физиологически активных вещее! в материалы 3-й Всеросс науч -метод конф 22-24 марта 2007 г -

uwpwn^yr., ¿uu i — ¿uu-zuz.

4 Разработка методики количественного oí i редел е! км у-амино-р-феншшасляной кислоты в субстанции салифена // Актуальные проблемы фармац сб материалов межрегион науч конф (Владикавказ, 26-27 апреля 2007 г) -Владикавказ, 2007 -С 38-39

5 Использование хроматографии в тонком слое сорбента для контроля чистоты и стабильности салифена // Изв Высш учеб заведений Северо-Кавказ регион Естеств науки Проблемы фармац, фармакол и рациональной терапии Слецвып - 2007 - С 91-92

6 Фотометрическая методика количественного определения у-амино-Р-фенилмасляной кислоты в субстанции салифена // Курский научн-практ весп ник «Человек и его здоровье» - 2008 - №2-С 130-134 (Соавт Беликов В Г)

ЛАРСКИЙ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕНИБУТА С САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НОВОГО БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО СОЕДИНЕНИЯ САЛИФЕН

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ

V А ТПЛ ТТ А Т* А 'К Л ГШ Л I И.'П'Г'ШН.'П/М V I 1 Л V1Г 111/41* 1:1 ч^/и 111 /11-1,1 .и 1 г 1 1 11/1 > 1V

Подписано к печати 2008 г Формат бумаги 60x84 1/16

Бумага книжно-журнальная Печать ротапринтная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ №

Государственное образовательное учреждение высшего профессионально

образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академи Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию) (357532, г Пятигорск, пр Калинина, 11)

Актуальность темы. Стандартизация и контроль качества лекарственных средств играют важнейшую роль в обеспечении населения эффективными и безопасными лекарственными препаратами. Это в большей степени относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения больных с нарушениями мозгового кровообращения. Поэтому наряду с поисками новых средств для лечения указанных заболеваний, необходимо решать вопросы разработки методов их анализа.

К числу таких лекарственных препаратов относятся производные у-аминомасляной кислоты (ГАМК). Они показали свою эффективность при терапии различных форм ишемии головного мозга. ГАМК-ергические лекарственные вещества, к числу которых относится фенибут (у-амино-Р-фенилмасляной кислоты гидрохлорид), способны сохранять высокие показатели кардио- и гемодинамики в условиях ишемии мозга и миокарда. Однако имеются возможности повышения эффективности фенибута путем его сочетания с другими биологически активными соединениями. С этой целью на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена (г. Санкт-Петербург) был синтезирован ряд биологически активных соединений, одним из которых является салифен - аддукт у-амино-Р-фенилмасляной кислоты (АФМК) и кислоты салициловой в молярном соотношении 2:1. Предварительные доклинические исследования салифена, проведенные на базе Волгоградского государственного медицинского университета, показывают перспективность его применения в медицинской практике в качестве нейропротекторного и противоишемического лекарственного средства. В то же время для его внедрения в медицинскую практику необходимы объективные и надежные методы контроля качества. До настоящего времени разработкой методов анализа салифена не занимались. Необходимость их разработки связана также и с тем, что неизвестен характер взаимодействия фенибута и салициловой кислоты в салифене, а, следовательно, не выяснены вопросы взаимного влияния компонентов на результаты определения каждого из них.

Поэтому разработка методов стандартизации и контроля качества салифена является актуальным вопросом для фармацевтической науки и практики.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение взаимодействия АФМК с кислотой салициловой и стандартизация нового биологически активного соединения салифен.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить взаимодействие АФМК и кислоты салициловой с помощью термических и спектральных методов.

2. Исследовать возможность использования химических и физико-химических методов анализа для подтверждения подлинности салифена в субстанции.

3. Изучить возможность применения хроматографических, оптических и химических методов для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена.

4. Обосновать условия применения хроматографического анализа для контроля чистоты субстанции салифена.

5. Изучить факторы, обусловливающие стабильность и установить срок годности субстанции салифена.

6. Разработать нормы качества и подготовить проект ФСП на субстанцию салифена.

Научная новизна. Проведено изучение характера взаимодействия фенибута с салициловой кислотой с помощью ПМР- и ИК-спектрометрии, а также термических методов. Показано, что взаимодействие между компонентами происходит за счет аминогруппы фенибута и карбоксильной группы салициловой кислоты. Установлено, что в ИК-спектре салифена отсутствует полоса поглощения неионизированной карбоксильной группы, в спектре ПМР также не регистрируется сигнал протона карбоксильной группы. В связи с этим высказано предположение об образовании водородной связи между карбоксильной группой фенибута и фенольным гидроксилом салициловой кислоты. На основании изучения физико-химических свойств салифена и его составных частей обоснованы методики качественного и количественного определения салифена. В результате валидационной оценки доказана приемлемость методик количественного определения салифена с помощью физико-химических и химических методов. Обоснована методика количественного определения фенибута и кислоты салициловой в субстанции салифена, позволяющая проводить анализ в одной навеске без разделения. Осуществлен выбор условий контроля чистоты субстанции салифена с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Методом ускоренного старения изучена стабильность субстанции салифена и установлен срок годности.

Практическая значимость результатов исследования. Разработаны и валидированы методики испытаний на подлинность, чистоту и количественного определения салифена химическими и физико-химическими методами. Валидационная оценка предлагаемых методик показала, что они отличаются простотой выполнения, высокой чувствительностью, отсутствием систематической погрешности и позволяют достоверно оценивать качество субстанции салифена. Разработанные методики анализа и нормы качества включены в проект ФСП.

Внедрение результатов исследования в практику. Разработаны проект фармакопейной статьи предприятия и пояснительная записка на субстанцию салифен. Получен акт апробации предлагаемых методик анализа салифена от ОАО «Щелковский витаминный завод», г. Щелково.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты изучения взаимодействия между фенибутом и кислотой салициловой с помощью термических и спектральных методов.

2. Результаты качественного и количественного определения у-амино-[3-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена, а также сравнительная оценка разработанных методик.

3. Результаты использования тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения потенциальных примесных соединений в субстанции салифена.

4. Нормы качества, стабильность и срок годности субстанции салифена.

Апробация и публикация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на региональных конференциях (Пятигорск, 2007 и 2008 гг., Владикавказ, 2007 г., Воронеж, 2007 г.). По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия Росздрава (номер государственной регистрации 01.2.00101060).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, выполненного с помощью компьютерного набора, содержит 40 таблиц, 30 рисунков, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4-х глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 131 источник, в том числе 33 иностранных, и приложений.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучено взаимодействие у-амино-Р-фенилмасляной кислоты и кислоты салициловой в субстанции салифена с помощью термических и спектральных методов. Установлено, что наиболее вероятным механизмом взаимодействия является образование ионной связи, возникающей между карбоксильной группой кислоты салициловой и первичной алифатической аминогруппой у-амино-Р-фенилмасляной кислоты.

2. Исследована возможность использования химических и физико-химических методов для подтверждения подлинности субстанции салифена. Для идентификации салифена предложено использование ИК-спектроскопии, а также химических реакций с нингидрином и железа (III) хлоридом.

3. Обосновано применение тонкослойной хроматографии для контроля чистоты субстанции салифена. Найдены оптимальные условия для определения потенциального примесного соединения в субстанции салифена, установлено его предельно допустимое содержание, равное 0,35%.

4. Показана принципиальная возможность использования метода ВЭЖХ для контроля чистоты субстанции салифена. Установлены оптимальные условия определения, позволяющие достоверно разделять пики АФМК, кислоты салициловой, а также потенциального примесного соединения.

5. Изучены возможности использования фотометрических и титриметрических методов анализа для количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена. Для количественного определения кислоты салициловой предложены методики обратного броматометрического титрования и фотометрического определения на основе реакции с железа (III) хлоридом. Относительные погрешности определения при использовании указанных методик не превышают ±0,44% и ±2,28% соответственно.

6. Предложены методики ацидиметрического титрования в среде кислоты уксусной безводной и фотометрического определения на основе реакции с нингидрином для количественного определения АФМК в субстанции салифена. Относительные погрешности определения не превышают ±0,26% и ±1,39% соответственно.

7. Разработана методика потенциометрического алкалиметрического титрования в смешанной водно-органической среде вода-ДМСО (1:1), позволяющая проводить количественное определение кислоты салициловой и АФМК в одной навеске субстанции салифена, с относительной погрешностью определения не более ±0,47% и ±0,35% соответственно.

8. Проведена валидационная оценка всех предложенных методик количественного определения АФМК и кислоты салициловой в субстанции салифена. В результате установлено, что методики являются валидными по основным критериям: линейность, сходимость, правильность.

9. В результате сравнительной оценки для включения в проект ФСП рекомендована методика потенциометрического определения салифена в среде смешанного водно-органического растворителя вода-ДМСО (1:1). Указанная методика позволяет проводить количественное определение АФМК и кислоты салициловой в одной навеске субстанции салифена, характеризуется удовлетворительной продолжительностью анализа, приемлемыми величинами относительной погрешности определения, возможностью проводить определение без стандартных образцов.

10.Обоснованы нормы качества исследуемого вещества. С помощью метода «ускоренного старения» изучена стабильность салифена и установлен срок годности субстанции салифена, который составил 5 лет.