Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение фармакологических свойств высокоочищенного инсулина, полученного по усовершенствованной технологии

Р Г 3 СД

2 7 МАЙ, 1997

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ПО БЕЗОПАСНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

На правах рукописи

ШОЛИНСКИЙ Валентин Станиславович

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ИНСУЛИНА, ПОЛУЧЕННОГО ПО УСОВЕРШЕНСТВОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Специальность Л? 14.00.25 - фармакология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 1997

■Работа выполнена в Государственном институте кровезаменителей и медицинских препаратов (ГИК и МП), г.Москва

Научные руководители:

доктор фармакологических наук, профессор Евтушенко Николай Савельевич

доктор медицинских наук, профессор.

академик РЛТН

Хлябич Георгий Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Китлчскпй Александр Сергеевич

доктор химических 1нук, ирофессоо Швачкин Юрий Петрович

Ведущая организация: Московский медицинский стоматологический институт им.Н.А.Семашко

Защита диссертации состоится "о?? " М&З_1997 г.

в часов на заседании специализированного учёного совета

ВНЦ БАВ (142450, Московская обл., Ногинский р-н, пос.Старая Купавна, ул.Кирова, 23).

С диссертацией можно ознакомиться в учёном совете ВНЦ БАВ. Автореферат разослан' " Шьре-АЯ__1997 г.

Учёный секретарь спецшшшированного совета

Робакидзе Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Медико-социальное значение сахарного диабета определяется не только его большой распространённостью, но и сохраняющейся тенденцией к дальнейшему увеличению числа больных. По данным Всемирной организации здравоохранения количество больных в мире увеличивается ежегодно на 5-7%. При этом, лекарственные препараты инсулина являются единственным средством в ежедневной замещающей терапии больных инсулинозависимой (первой) формой сахарного диабета.

В связи с этим, актуальной проблемой является создание новых, более эффективных лекарственных препаратов инсулина не обладающих побочными действиями при использовании их в медицинской практике. Именно поэтому всестороннее изучение фармакологических свойств разрабатываемых препаратов приобретает особо важное значение.

В настоящее время основная часть лекарственных препаратов инсулина выпускается четырьмя зарубежными фирмами "Eli Lilly" (США), "Novo Nordisk" (Дания), "Hoechst" (Германия) и "Biobraz" (Бразилия). В основном, они ориентируются на лекарственные формы получаемые на базе инсулина человека.

Исследованиями последних лет в области эндокринологии и клинической иммунологии было установлено, что препараты инсулина, содержащие даже незначительные количества белковых примесей, обладают выраженными антигенными свойствами. Длительное применение таких препаратов больными сахарным диабетом вызывает ряд побочных эффектов: аллергию, липодистро-фию, инсулинорезистентность (Andreani D., Federlin K.F., 1984). При изучении иммунологических свойств препаратов инсулина различной степени очистки было отмечено снижение их антигенных свойств с повышением чистоты (Heding L.G., 1972). Для создания высококонцентрированных лекарственных форм инсулина также необходима высокая степень его очистки.

Для очистки субстанции инсулина широкое распространение получили сорбционные методы. Из-за отсутствия отечественшлх сорбентов и носителей,

используемых в технологии получения высокоочпшенного инсулина, разработчикам и производителям субстанции приходится применять дорогостоящие импортные реагенты.

В связи с этим, разработка технологии получения высокоочншеннои субстанции инсулина с применением методов хроматографии на отечественных сорбентах и нос!гтелях является, в настоящее время, приоритетной задачей.

В последние годы в мировой практике лечения диабета с применением дифференцировано продотированных форм инсулина, так называемых профилен. получили распространение препараты, с использованием в качестве пролонгатора протамннов в изофановом соотношении с инсулином. Дня получения лекарственного препарата инсулина среднего по длительности действия на сегодняшний день в мировой клинической практике и в ведущих фармацевтических фирмах мира наибольшее распространение получача стабильная модификация протамин-цинк инсулина Neutral Protamine Hagedorn (NPH). впервые полученная Krayenbuhl и Rosenberg ещё в 1946 году.

Создание отечественных лекарственных препаратов инсулина пролонгированного действия, отвечающих требованиям ведущих фармакопеи, продолжает оставаться важной и актуальной задачей.

В Государственном институте кровезаменителей н медицинских препаратов (ГИК и МП). г.Москва. был разработан новый лекарственный препарат "Суспензия инсулин-протамин свиной монокомпанентный (СМК)", 100 ЕД/мл на базе субстанции инсулина монокомпонентного (МК), полученной с применением технологии очистки на отечественных сорбентах и носителях, который подвергся всестороннему исследованию его фармакологических свойств.

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось экспериментальное (доклтшческое) изучение фармакологических свойств нового лекарственного препарата ннсулнна пролонгированного действия "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл, на основе высокоочшценной субстанции, полученной по усовершенствованной технологии, изучение фармакологических свойств субстанции ннсулнна МК, а также, в соответствии с концепцией системного

подхода к проблеме, усовершенствование технологической схемы производства субстанции и определение оптимальных параметров проведения процессов хро-матографической очистки инсулина путем замены импортных носителей и сорбентов на отечественные без снижения качественных показателей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Получить субстанцию инсулина МК с использованием отечественных сорбентов и носителей методами фронтальной хроматографш! на модифицированном варианте ионита КУ-23И, гель-проннкающей хроматографии на гидрофильном носителе Гефил-1 и анионообменной хроматографии на ионите АВ-171-40/100.

2. Изучить фармакологические свойства субстанции инсулина МК, полученной после проведения масштабирования технологического процесса на опытно-промышленном производстве, и проанализировать её на соответствие ВФС 42-2150-95.

3. Разработать оптимальный состав и технологическую схему производства лекарственного препарата "Суспензия шгсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл на базе отечественного инсулина МК и изучить её физико-химические свойства.

4. Изучить специфическую фармакологическую активность и фарма-кокинетнку указанного лекарственного препарата на животных моделях.

5. Провести оценку аллергенных свойств и иммуномодулнругощего действия суспензии инсулин-протамив СМК, 100 ЕД/мл.

Научная новизпа работы. Впервые изучены фармакологические свойства субстанции 1шсул1ша МК, очищенной с применением отечественных сорбентов и носителей.

Впервые разработан оптимальный состав и технологическая схема производства нового лекарственного препарата "Суспензия инсулин-проташга СМК", 100 ЕД/мл, изготавливаемого на основе отечественного инсулина МК, и изучены его физико-химические и фармакологические свойства.

Впервые определены закономерности проявления специфической активности нового препарата, полученного по оригинальной технологии и из>гчена его фармакокинетика.

В материалах исследования наглядно показано, что по общему и специфическом}. фармакологическому действию исследуемый препарат сопоставим с препаратом сравнения "МопоНп" производства фирмы "ВюЬгаг" (Бразилия).

Впервые проведена оценка аллергенных свойств и иммуномодулирующе-го действия суспензии инсулин-протамин СМК. 100 ЕД/мл.

Практическая значимость работы. Результаты исследования физико-химических и фармакологических свойств субстанции инсулина МК показали, что она характеризуется высокими качественными показателями, высокой удельной фармакологической активностью и практическим отсутствием индукции образования антител к инсулину.

Результаты проведённого доклинического «зрения физико-химшеских и фармакологических свойств нового препарата "Суспензия ннсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл. а также его эффект1,вн0сти и безвредности, послужили основанием для получения разрешения Фармакологического комитета на проведение его клинических испытаний в качестве нового фармакологического средства.

На основе проведённых исследований разработан опытно-промышленный регламент на производство указанного лекарственного препарата, изготовленного на базе инсулина МК, очищенного с применением методов хроматографш! на отечественных сорбентах и носителях.

Разработана фармакопейная статья на новый лекарственный препарат "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл.

Усовершенствованные на примере суспензии методические подходы к изучению физико-химических и фармакологических свойств новых лекарственных препаратов инсулина могут быть использованы при доклиническом исследовании других предназначенных для этих целей новых фармакологических средств.

На базе экспериментального производства IHK и МП созданы технолопиче-ские схемы протводства cj-бстаншш 1шсулнна МК. суспензии инсулнн-протамин СМК, 100 ЕД/мл и выпущено пять установочных парий лекарственной формы.

Показано, что при организации промышленного выпуска отечественных нейтрального носителя Гефнл-1 н анионита AB—171—40/100, они могут быть использованы вместо импортных в технологии получения инсулина МК.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Субстанция кристаллического инсулина МК полученного по усовершенствованной технологии по своим фармакологическим и физико-химическим свойствам удовлетворяет требованиям ВФС 42-2150-95.

2. Суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл. изготовленная на основе инсулина МК, очищенного с применением методов хроматографш! на отечественных сорбентах и носителях, обладает специфическим птогликеми-ческнм действием и по своим фармакологическим, аллергизиругащим и иммуногенным свойствам соответствует требованиям предъявляемым к современным лекарственным препаратам инсулина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийском симпозиуме "Биосепарация-96", г.Санкт-Петербург, 1996; международном симпозиуме "Аминокислоты и их производные", г.Гродно, 1996; втором съезде Биохимического общества при Российской Акадешш наук, г.Москва, 1997.

Публикации. По основным материалам диссертащш опубликовано четыре научные работы и получено положительное решение на авторскую заявку.

Объём п структура работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 132 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц, 28 рисунков и список цитируемой лтгтературы го 156 наименовашш.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1 и 2), экспериментальной части, описания материалов и методов исследования (глава 3), результатов собственных исследований и их обсуждения (главы 4-6), выводов и списка литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с поставленными задачами в исследованиях использоваш субстанцию инсулина МК, очищенную с применением методов хроматографии на отечественных сорбентах и носителях, лекарственный препарат "Суспензия инсу-лин-протамин СМК". 100 ЕД/мл, изготоатенньш на основе высокоочищенного свшого инсулина. Лекарственная форма представляет собой суспензию, при микроскопическом исследовании которой видны палочкообразные кристаллы тетрагональной формы, характертующие оптимальность её пролонгации.

Физико-химические характеристики суспензии изучались с целью разработки временной фармакопейной статьи на суспензию инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл. а субстанции инсулина МК в соответствии с требованиями ВФС 42-2150-95.

Испытание субстанции инсулина МК и лекарственного препарата "Суспензия инсулнн-протамин СМК". 100 ЕД/мл на пирогенность проводили по содержаншо бактериального эндотоксина с использованием LAL-теет и оборудования фирмы "Altas Bioscan", (Великобритания). В 2 пробирки, содержащие по 0.1 мл раствора LAL. приливали по 0,1 мл испытуемого препарата, осторожно перемешивали и раствор помещали в водяную баню при температуре 37°С на 1 час. После этого визуально проводили анализ. Для количественного определения эндотоксина препарат разводили в 1000, 2000. 4000 и 8000 раз (Limulus amebocyte lysate tests. 1987).

Для исследования выбрали лекарственный препарат "Суспензия инсу-лин-проташш СМК", 100 ЕД/мл во вкладышах для игольных шгьекторов типа "Ново-пен" CNovo Nordisk", Дания), "Опти-пен" ("Hoechst", Германия), "Биошгьектор" (Россия). При проведении сравнительного аналгоа во всех методах исследования его фармакологических свойств в качестве образца использовали препарат "Monolin" - изофан, инсулиновая суспензия свиного монокомпонентного инсулина производства фирмы "Biobraz" (Бразилия) и Государственный стандартный образец инсулина.

Лечение фармакологической активности субстанции инсулина МК и лекарственного препарата "Суспензия инсу.иш-протамт! СМК". 100 ЕД/мл проводили на здоровых кроликах. самцах, весом 2.8-3.2 кг, пород>.1 Шишннлла (ГФ XI. вып. 2, с. 176) при сравнешш с Государственным стандартным образцом инсулина свиною МК (ВФС 42-2153-95). За 18 часов до опыта отобранных кроликов лишали корма (доступ к воде был). Животных распределяли на 2 группы способом случайного выбора. В каждой группе было по 18 животных. Непосредствешто перед введением кроликов взвешивали и определяли исходную концентрацию сахара в кропи. Кроликам одной группы вводили подкожно по 0,5 ЕД стандартного образна инсулина на 1 кт массы тела, кроликам второй группы такую же дозу испытываемых препаратов инсулина. Через 1,5 и 2,5 часа после введения инсулина у животных снова определяли концеетрацшо сахара в крови.

Через 3-5 суток на этих же кроликах проводили повторное испытание с той разницей, что животным т группы, получавшей стандартный образец инсул1ша. вводили испытуемый препарат, а животным другой группы - стандартный образец инсулина.

Сравнительное изучение антигенных свойств образцов инсулина МК. полученных по двум различным технологиям, проводились в экспериментах на 18 кроликах самцах, весом 2.8-3.2 кг, породы Шиншилла. Каждый образец инсулина МК вводами 9 животным три раза в течение 70 дней в дозе 0,5 мг в 0,5 мл физиологического раствора.

Инсулиносвязываюшую способность сыворотки крови (титр антител) определяли методом РИА (Nakagawa S., Nakayama Н., Sasaki S.. 1973) используя КИТ-системы производства ГИК и МП, проводя коррекцию на неспецифическое связывание меченого инсулина нормальной кроличьей сывороткой. Титр интител вычисляли как отношение связанного инсулина к общей исходной активности, принятой за 100%.

Экспериментальный материал, изложенный в настоящей работе, для оценки фармакологических свойств опытных серий суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл получен в острых и хронических опытах на 3 раз-

личных видах животных: 160 мышах, самцах, массой 19-21 г: 36 кроликах, самцах, весом 2.8-3,2 кг, породы Шиншилла; 60 морских свинках, альбиносах, самцах, весом 250-300 г: 160 мышах Р1 (СВАхС57131_). массой 18-20 г. Характеристика исследовании и распределение животных даны в таблице 1.

Таблица 1

Обьём исследований н распределение животных

№ П11 Содержание исследований Вид животных Количество животных

Субстанция инсулина МК

1 Изучение фармакологических свойств субстанции инсулина МК

- фармакологическая активность кролики 36

- антигенные свойства кролики 18

Суспензия пнсулин-прогамин СМК. 100 ЕД/мл

2 Исследование фармакологической активности и фармакокннетики кролики 36

3 Изучение аллергизируюших свойств

- оценка анафидактогеннон активности морские свинки 60

- реакция гиперчувствнтельности "замедленного" типа мыши 80

- непрямая реакция дегрануляции тучных клеток мыши 80

4 Исследование иммуномодулнрующих свойств

- оценка влияния препарата на клеточный иммунитет мыши F1 (CBAxC57BL) 80

- оценка влияния препарата на гуморальный нммуный ответ мыши F1 (CBAxC57BL) 80

Для определения фармакокннетики испытуемых препаратов использовали

кроликов, которых за 18 часов до опыта отсаживали от корма со свободным доступ к воде и вводили в область холки подкожно препараты "Суспензия ин-сулин-протамин СМК", "Monolin" и Государственный стандартный образец инсулина из расчета 0.8 ЕД/кг массы. Пробы крови брали из краевой вены уха кролика до введения и через 1,5; 3,0; 4,5 и 6 часов после введения инсулина (ГФ XI. вып. 2, с. 181)- Концентрацию инсулина в сыворотке крови кроликов определяли методом РИА (Parker Ch.W., 1976) используя КИТ-системы про-

нзволства ПП\ и МП. Концентрацию глюкозы в крови определяли на глюко-зоанантаторе "Экзан-Г", (Литва).

Изучение аллергизирующих свойств суспензии инсулин-протамин СМК. ] 00 НД/мл проводили на мышах и морских свинках.

Оценку анафилактогенной активности определяли по реакшш обшей анафилаксии. В опыте использовались морские сшшки, которым вводили исследуемый препарат в эффектной терапевтической дозе - 0.59 ЕД на животное и в дозе в десять раз превышающей терапевтическую - 5.9 ЕД на животное. Разрешающую инъекцию в дозе 17.7 ЕД на животное вводили внутривенно на 14-й день после последней сенсибилизирующей инъекции. Контролем служили морские свинки, которым вводили только растворитель.

Опыты по определению реакции птерчувствительности "замедленного" типа проводили на нелинейных мышах, которых сенсибилизировали однократно. вн\трикожно в основание хвоста 100 мкл эмульсин суспензии инсулин-протамин СМК в ПАФ, в соотношении 1:1, в 3-х дозах по 1,2 ЕД. 0,12 ЕД и 0,012 ЕД на животное. Для выявления сенсибилизации, через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводили 12 ЕД на животное суспензш1 инсу-лнн-протамин СМК, в объеме 50 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией ПАФ с физиологическим раствором.

Также, для изучения аллергизирующих свойств препарат исследовали методом непрямой реакции дегрануляции тучных клеток (Алексеева О.Г., Дуева JI.A., 1978).

Оценку влияния препарата на клеточный иммунитет определяли по ре-акщш гиперчувствительности '■замедленного''' типа на мышах. Мышей иммунизировали однократно внутрибрюшинно эритроцитами барана в дозе 2x10 в 0,05 мл физиологического раствора. Для выявления сенсибилизации мышам на пятые сутки вводили 1x10 эритроцитов барана в объеме 0.05 мл в подушечку задней лапы (разрешающая инъекция). Контролем служили интактные мыши не иммугапированные, но получившие разрешающую дозу.

Оценку влияния препарата на гуморальный иммуный ответ определяли методом определения антителообразующих клеток в селезенке (метод Ерне и Нордин) по его способности изменять количество антителообразующих клеток на эритроциты барана. Опыты проводили на мышах, которых иммунизировали внутрибрюшинно введением эритроцитов барана в дозе 2x10 в объеме 0,05 мл. Одновременно с иммунизацией животным внутрибрюшинно вводили инсулин-протамин СМК в объеме 0,5 мл и дозах: 1 группа - 1,2 Д/мышь; 2 группа-0,12 Д/мышь; 3 группа - 0,012 Д/мышь; в качестве контроля использовали физиологический раствор в объеме 0,5 мл.

При рассмотрении хроматографических процессов получения субстанции высокоочишенного инсулина объектами исследования служили отечественные сорбенты и носители. Предварительная очистка субстанции инсулина проводилась методом фронтальной хроматографии на модифицированном варианте ионита КУ-23И. Для получение субстанции хроматографически чистого инсулина с использованием метода гель-проникающей хроматографии применяли отечественный гидрофильный носитель Гефил-1. Выделение субстанции высокоочишенного инсулина из полупродуктов хроматографически чистого инсулина методом анионообменной хроматографии проводили на отечественном ион из с А В— 17! —40/100.

Количественные данные, полученные в экспериментах, обрабатывали стандартными методами вариационной статистики, используя таблицы 11.Н.Самойлова (1970). Достоверность различий сравниваемых величин оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (В.В.Гублер, А.А.Генкин, 1973) и критерию Стыодента (П.В.Терентьев, П.С.Ростов, 1973). Различия между группами считали статистически значимыми со степенью вероятности Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Очистка субстанции инсулина методом фронтальной хроматографии на ионите КУ-23И.

В работе изучено взаимодействие белков, входящих в состав кристаллического инсулина, с модифицированным вариантом сульфокатионита КУ-23Й. Показана эффективность разделения указанных компонентов проведением очистки натриевых солей инсулина методом фронтальной хроматографии с использованием буферного раствора 0,2М СНзСООМН* с рН 7,0 с последующим элюированием белков в соответствии с величиной их удельного заряда 0,05М ЫН4С1 - буферным раствором, рН 8,5. Указанные параметры являются наиболее оптимальными с точки зрения чистоты получаемых цинковых солей инсулина и технологических параметров проведения процесса.

Полученные экспериментальные данные (табл. 2) позволяют сделать вывод, что выбранный вариант однократной фронтальной хроматографии позволяет значительно снизить в цинковых солях инсулина содержание производных проинсу-лина. Однако для очистки полученных образцов инсулина от остаточных количеств производных проинсулина и получения высокоочишенной субстанции необходимо использовать методы гель-проникающей и анионообменной хроматографии.

Таблица 2

Фракционный состав образцов кристаллического инсулина очищенного методом фронтальной хроматографии на сульфокатионите КУ-23И.

Наименование образца Фракционный состав образцов кристаллического инсулина

Проинсу- лин, р.р.м. Моноинсулин, % Дезамидиро-ванный инсулин, % Неидентифи-цированные примеси, % Высокомолекулярные белки, %

Исходный инсулин 36 000 92,0 1,7 6,3 3,4

Полученный инсулин* 1280 96,1 1,0 2,9 3,6

* - среднестатистические данные по 5 сериям.

4.2. Хромагографическая очистка инсулина с использованием гель-проникающей хроматографии на отечественном гццрофильном носителе Гефип-1.

В работе проведены исследования использования в технологии получения вы-сокоочищенного инсулина отечественного опытного образца нейтрального носителя Гефил-1, разработанного ГИК и МП и ИБХ АН России (ТУ 6-09-20-207-91).

Проведение очистки инсулина методом ГПХ с использованием отечественного носителя Гефил-1 позволяет производить очистку промышленных образцов инсулина от высокомолекулярных белков и достичь высокой степени разделения инсулинопо-добных белков от проинсулина и его производных (табл. 3) и получать высокоочи-шенный инсулин МК с содержанием проинсулина не более 10 р.р.м. с достаточно высоким, до 80%, выходом, причем, нагрузка инсулина на колонну может бьт> увеличена в несколько раз, по сравнению с широко используемыми импортными носителями.

При изучении стабильности работы носителей в технологическом процессе было обнаружено, что Гефил-1 даже после проведения 20-ти хроматографических циклов не меняет своих качественных характеристик по отделению проинсулина и его производных.

Таблица 3

Фракционный состав образцов кристаллического инсулина очищенного мето-

дом гель-проникающей хроматографии.

Наименование образца Фракционный состав образцов кристаллического инсулина

Проинсу- лин, р.р.м. Моноинсулин, % Дезамиди-рованный инсулин, % Неидентифи циро ванные примеси, % Высокомолекулярные белки,%

Исходный инсулин* 1280 96,1 1,0 2,9 3,6

Сефадекс 0-50бГ^

11олученный инсулин** 9,5 97,4 1,3 1,3 0,7

Гефил-1

Полученный инсулин** 2,3 97,7 1,1 1,2 0,2

* - получен после фронтальной хроматографии.

** - среднестатистические данные по 5 сериям.

Однако метод ГПХ не приводит к полной очистке инсулина от сопутствующих ему белков таких как: дезамвдированные формы инсулина, арганининсулин и другие, вследствие небольших различий белковых молекул по м.м. и их высокого межмолекулярного взаимодействия в растворах, которое, вероятно, приводит к образованию прочных поли-эяекгрсштньк комплексов. Поэтому, доя окончательной очистки инсулина от перечисленных белков, необходимо проведение анионообменной хроматографии.

4.3. Хроматографическая очистка инсулина методом анионообменной хроматографии на отечественном ионите АВ-171-40/100.

Для получения высокоочищенного кристаллического инсулина необходимо производить заключительную стадию очистки гормона от примесных белков и белков инсулиновой природы. В связи с этим, нами на последней стадии очистки был использован метод анионообменной хроматографии полупродуктов инсулина, полученных гель-проникающей хроматографией.

В качестве сорбента для исследования метода анионообменной хроматографии был выбран отечественный сильнонабухающий гелевый анионит АВ-171-40/100 (с размером зёрен 0,02-^0,05 см), т.к. для него характерна высокая ёмкость к молекулам белка. В качестве элюента использовали 0,1М ЫНдС1— аммонийный буферный раствор с рН 7,4, содержащий 40% изопропанола.

В работе изучено влияние концентрации изопропанола, ионной силы и рН раствора на взаимодействие хроматографически очищенного инсулина с макропористым сильноосновным анионитом АВ-171-40/100 и на эффективность процесса хроматографической очистки образцов инсулина от примесей производных проинсулина и дезамидированных форм инсулина.

Результаты исследования показали, что достаточно высокий выход высокоочищенного инсулина и эффективное разделение моноинсулина от его производных, сравнительно низкое содержание производных проинсулина при ионообменной хроматографии на анионите АВ-171-40/100 (табл. 4), осмотическая стабильность и механическая прочность матрицы позволяют использовать его на заключительном этапе технологического процесса очистки полупродуктов натриевых солей инсулина свиней.

Таблица 4

Результаты очистки натриевых солей инсулина методами ионообменной хроматографии на сильноосновных анионитах гелевой и макропористой структуры

Суммарн ый выход белка, % Содержание производные проин-сулина, р.р.м. Белковый состав основной фракции, % Коэффиц иенг разделения Выход основной фракции, %

моноинсулин дезамидо инсулин неиценти-фицирован-ные примеси

Исходный инсулин*

2,3 97,7 | 1,1 1,2

ОАЕСефадексА-25**

68,0 1,5 98,7 0,3 1,0 2,2 54

АВ—171—40/100**

91,0 | 1,0 98,5 0,6 0,9 1,9 81

* - получен после гель-проникающей хроматографии. ** - среднестатистические данные по 5 сериям.

4.4. Выделение инсулина из растворов в кристаллическом виде.

В действующей технологии получения кристаллического инсулина на стадиях экстракции, депротеионизации и селективного выделения конечного продукта из растворов в кристаллическом виде в качестве растворителей обычно используются водно-спиртовые или водно-ацетоновые смеси.

Нами был поставлен ряд экспериментов по переочистке кристаллов цинковых солей инсулина МК в водной среде без включения в кристаллизационную смесь вышеперечисленных инградиентов. Были получены кристаллы гексагональной структуры размером от 10 до 30 мк.

Анализ качества субстанции кристаллического инсулина МК по данным ВЭЖХ показал, что на градиентном участке кривой хроматограммы практически отсутствуют неидентифицированные белковые примеси и их содержание не превышает 1,0%.

Глава 5. Внедрение технологической схемы производства инсулина МК и изучение его фармакологических свойств.

На основе проведённых исследований разработан опытно-промышленный регламент на получение кристаллического инсулина МК, на базе экспериментального производства ГИК и МП создана технологическая схема производства и выпушено пять установочных партий. В таблице 5 приведены показатели качества опытно-промышленных образцов субстанции инсулина МК, включая данные об их биологической активности. По всем показателям субстанция соответствует ВФС 42-2150-95.

Для получения более полного представления о качественных характеристиках и использовании полученной субстанции в качестве исходного сырья для получения лекарственных форм инсулина пролонгированного действия, таких как, например, "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл, требуется изучение её фармакологических свойств.

Исследование фармакологических свойств проводили на субстанции инсулина МК, полученной по технологии с применением отечественных носителей и, для сравнительного анализа, в качестве эталона, на инсулине прошедшем очистку с использованием методов хроматографии на импортных носителях.

Как показали результаты иммунологических исследований, в течение всего срока наблюдения максимальный уровень антител для образцов субстанции свиного инсулина МК не превышал, в среднем, 0,5±0,1%. Причиной возникновения антител к инсулину у животных при введении им инсулина МК является влияние примесных белков неинсулиновой природы, входящих в его состав (БсНсЫкгиИ ]., Вгагще 1., 1972).

Исследование на пирогенность субстанции инсулина МК методом "ЬАЬ-тест" показали апирогенность препарата. Количественное определение содержания эндотоксина в инсулине МК представлено в таблице 7.

Таблица 5

Основные показатели качества кристаллической субстанции инсулина

Наименование пока- Требования по Серия образцов инсулина

зателей ВФС 42-2150-95 130595 170595 130695 191095 251095

Описание Белый мелкокристал-

лический порошок Белый мелкокристаллический порошок

Растворимость Мало растворим в

0,0IM HCl 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100

0,0IM NaOH 1:100 1:100 1:100 1:100 1:100

Содержание цинка От 0,25 до 1,0% 0,43 0,44 0,44 0,44 0,43

Определение фрак- ВЭЖХ. Содержание дез-

ционного состава и амидированной формы инсу-

видовой однородности лина менее 1,0%, содержание

Инсулин свиной к.р.с. менее 1,0%, содержание 97,9 97,8 97,8 98,9 97,9

Дезамидоинсул ин непдентифицированных при- 1,0 0,8 0,9 - 0,9

Инсулин к.р.с. месей не должно превы- 0,6 0,7 0,7 0,5 0,3

Прочие примечи шать 1,0%. 0,5 0,7 0,6 0,6 0,9

Высокомолекулярные Сумма площадей пиков до ос-

белки новного пика не должна пре- 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2

вышать 1,0% от общей площади

пиков на хроматограмме

Содержание проинсулина Не более 10 р.р.м. 1,3 2,0 1,7 5,8 5,7

Активность Не менее 26 ЕД/мг в перес-

чете на сухое вещество 27,7 27,1 27,4 26,9 26,6

Таблица 6

Результаты анализов на соотвествие требованиям проекта ВФС на лекарственный препарат "Суспензия инсулин-

протамин СМК", 100 ЕД/мл

Наименование показателей Требования по проекту ВФС Серия образцов 200695 171095 021195 191195 251195

Описание Суспензия белого цвета Суспензия белого цвета

Подлинность Удовлетворяет требованиям

РН От 7,0 до 7,8 7,5 7,4 7,55 7,5 7,5

Фенол От 0,52 до 0,72 мг/мл 0,55 0,61 0,60 0,58 0,65

Метакрезол От 1,28 до 1,76 мг/мл 1,43 1,52 1,30 1,48 1,60

Цинк общий От 0,01 до 0,04 мг на 100 ед. 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

Инсулин в растворе Не более 2,5 % от общей активности Менее 2,5% Менее 2,5% Менее 2,5% Менее 2,5% Менее 2,5%

Испытание на пролонгированное действие Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует

Содержание проинсулина Не более 10 р.р.м. 1,7 2,3 2,9 1,9 2,2

Определение номинального объема. Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует Соответствует

Испытание на стерильность Препарат должен быть стерильным Стерильно Стерильно Стерильно Стерильно Стерильно

Испытание на пиро-генность Препарат должен быть апирогенным. Апирогенный Агтирогатый Апирогенный Апирогенный Апирогенный

Количественное определение От 90 до 110% от указанного на этикетке 98 100 102 99 100

Таблица 7

Количественное определение содержания эндотоксина в инсулине МК

№ пп Образец ЬАЬ-тест, содержание эндотоксина (Еи на 1 ЕД инсулина) Полученные результаты

1 серия 5 менее 1,5

от 0,1 до 0,2 апирогенный

от 0,02 до 0,2

менее 0,2

2 серия б менее 1,44

более 0,04 апирогенный

от 0,02 до 0,1

менее 0,2

Таким образом, экспериментальное изучение физико-химических и фармакологических свойств субстанции инсулина МК, полученной по усовершенствованной технологии, в сравнении с инсулином прошедшим очистку с использованием методов хроматографии на импортных носителях, показало, что она характеризуется высокими качественными показателями, высокой удельной фармакологической активностью и с антигенными свойствами, соответствующими свойствам эталонного препарата.

Глава 6. Изучение фармакологических свойств нового лекарственного препарата "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл.

Исследование физико-химических свойств суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл, полученной на базе инсулина МК, очищенного на опытно-промышленном производстве по усовершенствованной технологии показало, что её качественные показатели соответствуют требованиям проекта фармакопейной статьи на указанный лекарственный препарат (табл. 6).

Исследование на пирогенность суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл методом "ЬАЬ-тест" показали апирогенность препарата. Количественное определение содержания эндотоксина в лекарственном препарате представлено в таблице 8.

Таблица 8

Количественное определение содержания эндотоксина в суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл

№ пп Образец ЬАЬ-тест, содержание эндотоксина (Еи на 1 ЕД инсулина) Полученные результаты

1 серия 29 менее 0,8

менее 0,8 апирогенный

менее 0,8

менее 0,8

2 серия 31 менее 0,8

менее 0,8 апирогенный

менее 0,8

менее 0,8

Значение фармакологической активности суспензии составило 101 ЕД/мл.

В связи с тем, что суспензия инсулин-протамин СМК 100 ЕД/мл является инсу-линозамещаюшим лекарственным препаратом пролонгированного времени действия, существенное значение для его полной характеристики имеет профиль действия.

Фармакокинетические кривые (рис. 1) препаратов "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл и "МопоНп" совпадают при подкожном введении этих препаратов кроликам в дозе 0,8 ЕД/кг (табл. 9).

Таблица 9

Содержание глюкозы в крови кроликов получавших препараты инсулина

Препараты Содержание глюкозы в крови (% к исходи. М±т) после инъекции через:

1,5 часа 3,0 часа 4,5 часа 6 часов

Стандартный образец 31,3±2,1 64,5±4,8 95,4±5,1 96,1±5,0

Суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл 50,2±3,0 48,1±2,7 50,2±3,1 51,4±1,1

Monolin 57,0±4,1 52,5±3,1 64,5±3,2 66,6±5,6

Однократное введение кроликам инсулина и определение концентрации глюкозы в крови показало наличие сахароснижающего эффекта в течение 6 часов, по сравнению с введением стандартного образца, в соответствии с профи-

лем действия препарата. Различий между препаратами по сахароснижающему эффекту не отмечено. Максимальная концентрация инсулина в крови и максимальный сахароснижающий эффект у этих препаратов совпадают и приходятся на 3,0 часа после введения.

Время, час

Рис. 1. Фармакологические кривые лекарственных препаратов "Суспензия ин-сулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл и "МопоНп".

Таким образом, препараты "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл и "МопоНп" по своим фармакокинетическим параметрам идентичны.

Изучение безвредности суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл проводили в опытах острой и подострой токсичности. Показано, что при введении исследуемого препарата конвенциальным мышам и крысам в дозах 2,5400 ЕД/кг массы, подкожно в объеме 0,5 мл - мышам и 2,0 мл - крысам погибло 1-2 животных в группах, получавших большие дозы инсулина, причем гибель наступала в течение 1 -2 часов после введения препаратов на фоне сильных ги-погликемических судорог и была, видимо, обусловлена специфическим действием инсулина. У некоторых животных, получавших большие дозы препарата, но выживших, были отмечены легкие судороги и вялость, проходившая через

10-20 минут. Других отклонений от нормы в состоянии и поведении животных не наблюдалось.

Полученные данные позволяют заключить, что исследуемый препарат не токсичен.

При длительном (30-дневном) введении препарата крысам в дозах от 2 до 100 ЕД/кг в объеме 2 мл на животное, которые значительно превосходят терапевтические, масса тела подопытных и контрольных животных возросла за время опыта на 130-150%, причем сколько-нибудь существенной разницы между группами не наблюдалось. Гематологические показатели лежат в пределах физиологических показателей. Статистически достоверных различий нет.

Не обнаружено также существенных различий в уровне глюкозы, общего белка и биллирубина в крови животных. Формол-гелевая проба везде была отрицательной.

Таким образом, введение суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл в течение 30 дней в дозах, значительно превышающих терапевтические, не вызывает сколько-нибудь существенных изменений у животных.

В результате патоморфологического анализа макроскопическое изучение материала показало, что внутренние органы белых крыс, получавших испытуемые препараты, по форме и величине, цвету и характеру рисунка органа на разрезе не отличались от органов контрольных животных. Введение испытуемых препаратов инсулина белым крысам в разных дозах не вызывает нарушения гистологического строения внутренних органов и развития воспалительных и дистрофических процессов.

Изучение аллергизирующих свойств лекарственного препарата "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл проводили в опытах по оценке анафилактогенной активности, по определению реакции гиперчуствитель-ности "замедленного" типа на мышах и при исследовании непрямой реакции дегрануляции тучных клеток.

Оценку анафилактогенной активности определяли по реакции общей анафилаксии. При исследовании не было выявлено явлений анафилаксии при внутривенном введении разрешающей дозы суспензии инсулин-протамин

СМК, 100 ЕД/мл и МопоПп морским свинкам сенсибилизированным инсулином в дозе 0,59 ЕД и 5,9 ЕД на животное.

Суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл не проявляет аллергизирую-щих свойств в реакции гиперчувсгвительности "замедленного" типа на мышах.

При изучении реакции дегрануляции тучных клеток проводили следующие контроли: контроль тучных клеток; контроль сыворотки; контроль аллергена.

Оценку теста проводили по отношению количества дегранулированных клеток к общему количеству подсчитанных клеток, выраженному в процентах. Полученные результаты приведены в таблице 10.

Аллергизирующие свойства суспензии инсулин-протамин СМК, 100

ЕД/мл в непрямой реакции дегрануляции тучных клеток не выявлены.

Таблица 10

Образцы Процент измененных клеток

Контроль аллергена 7,4%

Контроль сыворотки (1:1000) 7,5%

Инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл (1:10) 10,2%

МопоПп (1:10) 11,5%

Исследование иммуномодулирующих свойств лекарственного препарата "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл проводили по оценке влияния препарата на клеточный иммунитет и на гуморальный иммунный ответ.

Оценку влияния препарата на клеточный иммунитет определяли по реакции гиперчувствительности "замедленного" типа на мышах. Полученные данные приведены в таблице 11. Из них следует, что препарат не оказывает влияния на клеточный иммунитет.

Таблица 11

Зависимость индекса реакции от количества введённой дозы лекарственного препарата

Препарат Индекс реакции Контроль

1,2 ЕД 0,12 ЕД 0,012 ЕД

Суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл 7,40% 7,33% 7,08% 7,61%

Мопо1ш 8,13% 8,11% 8,60% 8,52%

Оценку влияния препарата на гуморальный иммуный ответ определяли методом определения антителообразующих клеток в селезенке (метод Ерне и Нордин).

Воздействие суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл на гуморальный иммунитет изучали по его способности изменять количество антителообразующих клеток на эритроциты барана.

Результаты экспериментального изучения показали, что лекарственные препараты "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл и "МопоНп" не оказывают влияния на иммунный ответ.

ВЫВОДЫ

1. Проведение процессов очистки инсулина методами хроматографии с применением отечественных сорбентов и носителей позволяет получить субстанцию инсулина МК, которая по своим физико-химическим и фармакологическим свойствам отвечает требованиям ВФС 42-2150-95 и характеризуется высокой удельной биологической активностью и практическим отсутствием индукции образования антител к инсулину.

2. Новый отечественный лекарственный препарат "Суспензия инсулин-протамин СМК", 100 ЕД/мл, обладает высокой специфической активностью, по своей чистоте и профилю гипогликемического действия соответствует проекту ВФС и лучшим зарубежным образцам аналогичных препаратов.

3. При длительном введении в фармакологически эффективных дозах суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл, не нарушает функциональное состояние и гистологическую картину крови и биохимические показатели белкового, углеводного, липидного и пигментного обмена, а также не обладает местно-раждражающим действием.

4. Суспензия инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл не обладает аллергизирую-щей активностью. Реакция гиперчувствительности "замедленного" типа на мышах и метод Ерне и Нордин не выявили влияния препарата на клеточный и гуморальный иммунитет.

5. Создание технологических схем опытно-промышленного производства инсулина МК и суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл, изготовленной на базе субстанции, полученной по усовершенствованной технологии, позволяет производить лекарственный препарат обладающий специфическим гипогли-кемическим действием и по своим фармакологическим, аллергизирующим и иммуногенным свойствам соответствующий требованиям предъявляемым к современным высокоочищенным препаратам инсулина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фармакологические свойства суспензии инсулин-протамин СМК, 100 ЕД/мл, полученной по усовершенствованной технологии. // МЭИНФ, М.: 1996, 35 с.

2. Масштабирование и внедрение технологии получения высокоочищенного инсулина. // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Биосепарация-96", Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия, 1996, Санкт-Петербург, с. 18 (совместно с Хлябичем Г.Н. Донецким И.А.).

3. К вопросу о разработке технологий очистки лекарственных препаратов. II Тезисы докладов международного симпозиума "Аминокислоты и их производные", т.2, институт биохимии АН Беларуси, 1996, Гродно. В печати, (совместно с Ворониным Е.М.).

4. Оптимизация технологии получения высокоочищенного инсулина. // Тезисы докладов ко второму съезду Биохимического общества при Российской Академии наук, институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина, 1997, г.Москва.

5. Кристаллизация инсулина МК в водной среде. И Приоритет по заявке, (совместно с Донецким И.А. Гуляевым В.А.).