Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Разработка и испытание усовершенствованных лекарственных форм инсулина

РГ6 од

На правах рукописи

ивасько елена павловна разработка и испытание усовершенствованных лекарственных

аорм инсулина

15.00. 01. - технология лекарств и организация фармацевтического дела

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Мэсква - 1997

- г -

Работа выполнена в Государственном институте кровезаменителей и гормональных препаратов и в Московской медицинской академии им. И. Е Сеченова

Научные руководители: член. -корр. АМН РФ, профессор А. И. Тенцова

член. -корр. АТН РФ, профессор А. С. Новохатский

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Т. С. Кондратьева

кандидат химических наук С. К Яроцкий

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт фармации - НИИФ

Защита состоится "_" _1997г. в " " часов на

заседании диссертационного Совета Д 074. 05.06. при Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (г. Москва, Никитский бульвар, д. 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии (Зубовский бульвар, д.37/1)

Автореферат разослан "_" _' 1997г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета Д 074.05.06,

кандидат фармацевтических наук, доцент Е П. Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. История изучения диабета, инсулина, его антагонистов, а также регуляции обмена веществ в организме отражает по существу историю современной биологии и медицины. Инсулин, необходимый для синтеза углеводов, жиров и белков, служит одновременно и мощным терапевтическим средством; он неизменно привлекает внимание исследователей.

В 1956 году Sanger F. , определил первичную структуру молекулы инсулина

Установление первичной структуры инсулина - значительное событие в биологии. Оно сыграло решающую роль в разработке радиолигандных методов, перевооруживших современную эндокринологию. Открытие проинсу-лина можно считать важной вехой в исследовании биосинтеза белка. Позднее с помощью технологии рекомбинантных ДНК осуществлен синтез инсулина человека в Е.coli.

В начале 80-х годов ведущие фармацевтические фирмы (Эли Лилли, Ново Нордиск) значительно усовершенствовали технологию лекарственных форм инсулина, в то время как в СССР с 1989 года прекращено производство устарелых препаратов инсулина из-за их недостаточной очистки, низкой стабильности и высокой иммуногенности. В препаратах использовали субстанцию инсулина крупного рогатого скота.

Создание и внесение принципиальных изменений в технологию отечественных лекарственных форм инсулина на основе отечественной субстанции свиного и человеческого инсулинов и изучение их физико-химических показателей, биологических, фармакологических, иммунизирующих и аллергизирующих свойств, стало одной из важнейших и актуальных задач.

Анализ перспективных направлений в исследованиях по инсулину сви-

детельствует, что наряду с инъекционным путем введения актуальным является и неинъекционный, в частности интраназальный, поскольку обеспечивает более быстрое поступление инсулина в кровь больного.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ явилась разработка и изучение усовершенствованных лекарственных форм инсулина на основе отечественной монокомпонентной субстанции свиного и человеческого инсулинов, отвечающих требованиям международных стандартов, а так же поиск путей создания лекарственной формы инсулина интраназального применения.

В соответствии с поставленной целью конкретные ЗАДАЧИ исследования состояли в следующем:

- усовершенствовать имеющиеся технологии производства инъекционных лекарственных форм инсулина: раствор инсулина, инсулин семилонг, инсулин-лонг и инсулин-ультралонг с концентрацией инсулина 40 ЕД/мл на основе монокомпонентного свиного инсулина;

- разработать технологию высококонцентрированных 100 ЕД/мл лекарственных форм инсулина и лекарственных форм инсулина быстрого действия на основе субстанции инсулина человека;

- разработать подходы к технологии приготовления лекарственных форм инсулина в виде раствора для назального применения и подобрать промоторы, обеспечивающие лучшее проникновение инсулина через слизистую носа;

- изучить физико-химические показатели высококонцентрированных (100 ЕД/мл) и усовершенствованных препаратов инсулина, показатели стабильности инсулина для назального применения;

- изучить фармакологическое действие усовершенствованных и термостабильных препаратов инсулина, их иммуногенность и аллергенность на интактных животных и животных с аллоксановым диабетом;

- изучить фармакологическое действие назального инсулина на ин-

тактных животных и животных с аллоксановым диабетом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА состоит в том, что впервые разработана технология отечественных высококонцентрированных препаратов и препаратов быстрого действия из субстанции инсулина человека.

Усовершенствование технологии инъекционных лекарственных форм инсулина проводилось на основе отечественной субстанции монокомпонентного (МК) свиного и высокоочищенного человеческого инсулинов.

Принципиальные изменения, внесенные в технологическую схему препаратов инсулина быстрого, короткого, среднего и длительного действия позволили получить препараты отвечающие мировым стандартам качества

Установлено, что в качестве консерванта в препаратах инсулина можно использовать отечественный нипагин без предварительной перекристаллизации, причем вводить его возможно двумя способами как растворяя в горячей воде, так и путем растворения в 0,1 Н ИаОН. Путь введения нипагина не оказывает влияния на качество препаратов инсулина в процессе хранения.

Предложенная методика определения уровня антител в сыворотках мышей методом иммуноферментного анализа показала, что существует достоверная разница в интенсивности выработки антител к инсулину в зависимости от агрегатного состояния, в котором находится инсулин в лекарственной форме.

Разработаны подходы к созданию назальной лекарственной формы инсулина и изучена ее биодоступность.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Па основе проведенной работы утверждена следующая нормативно-техническая документация: ВФС 42-2195 на моносу-инсулин СМК 40 ЕД/мл, ВФС 42-2152-95 на суспензию семилонг СМК 40 ЕД/мл.

На основе опытно-промышленных регламентов на моносуинсулин

МК 40 ЕД/мл и инсулин-семилонг МК 40 ЕД/мл налажено производство на Н1Ю "Белмедпрепараты" (Минск, Беларусь) и Каунасском эндокринном заводе (Каунасс, Литва).

Утверждены 4 опытно - промышленных и 2 лабораторных регламента.

ПУБЛИКАЦИЯ По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Государственного института кровезаменителей и гормональных препаратов (ГИК и МП) и проблеме 10.06. Фармация, РАМН.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ принципиальные изменения внесенные в технологическую схему производства инсулинов короткого, быстрого, среднего и длительного действия;

- результаты исследований по теоретическому обоснованию и разработке составов и технологии высококонцентрированных (100 ЕД/мл) препаратов инсулина, а также лекарственных форм инсулина для назального применения;

- данные по изучению влияния видовой принадлежности, степени очистки и агрегатного состояния инсулина на его биологические, аллер-гизирующие и иммунизирующие свойства;

- результаты исследования специфической активности, биологического действия и биодоступности назальных форм инсулина с различным составом промоторов на интактных крысах и крысах с аллоксановым диабетом.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: Международном семинаре "Инсулин: получение, производство, применение" (Минск, 1995), Всесоюзной научно-технической конференции "Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фотохимических препаратов" (Харьков, 1990), IV научно-технической конференции Всесоюзного научно-исследовательского инс-

титута кровезаменителей и гормональных препаратов (ЕНИИТКГП) (Мэсква, 1991), III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения экспериментальной части (2-7 главы), заключений по главам, выводов, литературного указателя, приложения. Диссертация напечатана на страницах. Иллюстративный материал

представлен 54 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 216 источников, из которых 35 на русском языке.

Структура диссертационной работы основана на логической последовательности раскрытия цели и оптимальном изложении полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФЭРМ ИНСУЛИНА БЫСТРОГО И КОРОТКОГО ДЕЙСТВИЯ.

Анализ состояния производства препаратов инсулина быстрого (раствор) и короткого (суспензия инсулина семилонг) действия свидетельствует о недостатках технологии и качества данных препаратов. Для создания подходов к усовершенствованию технологии необходимо было определить как состав буферного раствора, pH, количество ионов цинка влияют на качество препаратов и, исходя из этого, определить какие изменения необходимо внести в технологию, чтобы получить препараты быстрого и короткого действия, отвечающие международным требованиям качества

Для оценки влияния состава буферного агента, в частности, хлорида натрия на скорость образования кристаллов в растворах инсулина были проведены модельные опыты в которых использовался хлорид натрия в концентрациях 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 и 0,7% (см. табл. N1).

Таблица N1.

Время начала формирования кристаллов из растворов инсулина, не содержащих ионов цинка (концентрация белка 0,17%)

N п/п Концентрация ЫаС1, % Время образования кристаллов инсулина час

1. 0,7 1,0

2. 0,6 1,0

3. 0,5 5,0

4. 0,4 10,0

5. 0,3 20,0

Данные опыты показали, что в препаратах инсулина короткого и быстрого действия нельзя использовать в качестве буферного агента хлорид натрия, поскольку присутствие последнего способствует образованию ромбоэдральных кристаллов, скорость образования которых зависит от концентрации хлорида натрия.

Изучение возможности введения в качестве буферного агента в препараты инсулина ацетата натрия показало, что он не вызывает образование и рост кристаллов инсулина. В лекарственные формы ацетат натрия вводили двумя путями: непосредственно в виде соли и в виде смеси уксусной кислоты и гидроокиси натрия.

При изучении влияния рН раствора оказалось, что наиболее устойчивыми при хранении оказались препараты инсулина с рН 7,4.

Известно,что качественные лекарственные формы инсулина можно по-

лучить если концентрация ионов цинка не превышает 0,04 мг/мл для препаратов короткого и 0,22 мг/мл для препаратов средней продолжительности действия.

Нами изучено две возможности поддержания концентрации цинка на необходимом уровне: путем использования субстанции с содержанием ионов цинка менее 0,04 мг/мл или 0,22 мг/мл и с корректировкой концентрации ионов цинка до 0,04 мг/мл или 0,22 мг/мл, но не более. В последнем случае расчеты проводились для каждой серии субстанции. Корректировку содержания ионов цинка проводили 8% раствором цинка уксуснокислого.

Поскольку известно, что консервант фенол способствует образованию и росту ромбоэдральных кристаллов, которые в препаратах короткого и быстрого действия должны отсутствовать, изучалась возможность введения в качестве консерванта нипагина отечественнного производства

Исходя из того факта, что нипагин плохо растворим в холодной воде, но хорошо растворим в горячей воде (+95° С), а также щелочи. Нипагин в лекарственную форму вводили путем растворения в горячей воде, по схеме где в качестве буферного агента используется ацетат натрия, или в виде раствора в щелочи при использовании смеси уксусной кислоты с гидроокисью натрия.

Проведен анализ физико-химических и биологических показателей препаратов инсулина короткого и быстрого действия в процессе хранения. Тестированию подвергались препараты хранившиеся в течение 27 месяцев при температуре +8° С. Контроль качества препаратов проводили органо-лептически (внешний вид), pH-метрически, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Биологическую активность препаратов определяли по ГФ XI, ч. 2, стр.176. Эффект пролонгации по ГФ XI, ч. 2, стр.178. Содержание проинсулина - методом радиоиммунного анализа (РИА).

Совокупность полученных данных позволила сделать заключение о

Таблица №2

Результаты анализа моносуинсулина МК на момент выпуска и через 27 месяцев хранения

Серия образцов Описание Подлинность рН Нипагин, % Цинк, мг Стериль- Пирогенностъ ность Биологическая активность Проинсу- Глкжа-лин гон

Требования Бесцветная 1. По гипогли- 7.0-7.8 0.09-0,12 Не более Препарат Тест-доза 1.0 ЕД 30-44 ЕД/мл Не более Не более

в соответствии с В ФС-42-21-95 прозрачная жидкость кемическому действию 2.ВЭЖХ 0,04 мг на 100 ЕД инсулина должен инсулина в 1 мл бытьсте- 0.9% р-ра N801 на рильным 1 кг массы кролика 10 п.п м. 0,1 П.П.М.

Серия 1. На момент Бесцветная прозрачная Выдерживает 7.32 0.12 0,015 Стерипен Апирогенен 42,5 ЕД/мп Соответ-т Соответ-т

выпуска жидкость

Серия 1. 27 месяцев хранения Бесцветная прозрачная жидкость Выдерживает 7.41 0,12 0.015 Стерилен Апирогенен 42.0 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

Серия 2. Бесцветная Выдерживает 7.32 0,12 0,015 Стерилен Апирогенен 40.5 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

На момент прозрачная

выпуска жидкость

Серия 2. Бесцветная Выдерживает 7.41 0,12 0.015 Стерилен Апирогенен 40.0 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

27 месяцев хранения прозрачная жидкость

Серия 3. Бесцветная Выдерживает 7,32 0,12 0.015 Стерилен Апирогенен 42.0 ЕД/мп Соответ-т Соответ-т

На момент выпуска прозрачная жидкость

Серия 3. Бесцветная Выдерживает 7.41 0,12 0.015 Стерилен Апирогенен 41,5 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

27 месяцев хранения прозрачная жидкость

Серия 4. На момент Бесцветная прозрачная Выдерживает 7.32 0,12 0,015 Стерипен Апирогенен 42,0 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

выпуска жидкость

Серия 4. Бесцветная Выдерживает 7.41 0.12 0.015 Стерилен Апирогенен 41.0 ЕД/мп Соответ-т Соответ-т

27 месяцев хранения прозрачная жидкость •

Серия 5. Бесцветная - Выдерживает 7.32 0.12 0.015 Стерилен Апирогенен 41.0 ЕД/мл. Соотвег-т Соогеет-т

На момент выпуска прозрачная жидкость

Серия 5. 27 месяцев Бесцветная прозрачная Выдерживает 7.41 0.12 0,015 Стерилен Апирогенен 40.3 ЕД/мл Соответ-т Соответ-т

хранения жидкость

стабильности данных препаратов в течение 27 месяцев хранения и гарантировать неизменность их качества в течение указанного срока при температуре +8° С (см. табл. N2).

Таким образом, принципиальные изменения, внесенные в технологическую схему препаратов короткого и быстрого действия коснулись: состава буферного раствора, вида консерванта и способа введения его в препараты, норм содержания ионов цинка в препаратах инсулина короткого и быстрого действия и способов его введения.

Z. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ВЫСОКОКОВДЕНТРИРОВАННЫХ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА КОРОТКОГО ДЕЙСТВИЯ. РАСТВОР ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА (100 ЕД/мл) Согласно Федеральной программе "Сахарный диабет" особого внимания заслуживает организация производства высококонцентрированных форм инсулина.

В настоящее время технология отечественных препаратов инсулина с концентрацией 100 ЕД/мл отсутствует.

Основную сложность при разработке технологии высоконцентрирован-ных препаратов инсулина представляет получение стабильной лекарственной формы, поскольку известно, что с повышением концентрации инсулина стабильность его растворов уменьшается. В литературе отсутствуют данные о влиянии состава и порядка смешивания растворов ингредиентов на качество лекарственных форм с содержанием инсулина 100 ЕД/мл.

Результаты анализов лекарственной формы раствора инсулина человека с активностью 100 ЕД/мл, наработанных с различным составом до и после хранения методом "ускоренного старения" представлены в табл. N3. Результаты фиксировали на 3, 6, 12, 18, 24 и 30 сутки температурного и механического воздействия. Оценивали изменение рН растворов и свето-пропускание.

Таблица № Э

Результаты анализа препаратов раствора инсулина человека 100 ЕДЛлл после ускоренного старения

Состав Содержаще гп++мг/100 ЕД Исходный раствор 5 суток б суток <2 суток 18 суток 24 суток 30 суток

инсулина % пропуска-шя света рН % пропускания света рн % пропускаем света рН % пропускания света РН % пропускает света рН % пропусками! света рН % пропуска ния света рН

1. без цижа 100 7.35 78 7,85 75 7.64 39 7.61 24 7.70 0 7,85 0 7.70

2. 0.025 100 7,35 100 7,38 100 7.37 100 7,35 79 7,39 78 7,32 75 7.М

3. 0,025 100 7,35 9} 7.37 82 7.34 89 7.35 87 7.35 85 7,35 81 7.36

4. 0.04 100 7.35 100 7.37 100 7.35 100 7,35 100 7.34 100 7.35 100 7.35

Состав 1. - инсулин, уксусная кислота, глицерин, нипагин;

Состав 2. - инсулин, уксусная кислота, глицерин, нипагин, цинк уксуснокислый до 0,025 мг/100 ЕД; Состав 3. • инсулин, глицерин, нипагин, натрий уксуснокислый, цинк уксуснокислый до 0,025 мг/100 ЕД; Состав 4. - инсулин, глицерин, нипагин, натрий уксуснокислый, цинк уксуснокислый до 0,04 мг/100 ЕД;

Исследования показали,что по технологической схеме получения препарата, когда инсулин растворяют в уксусной кислоте с последующей нейтрализацией раствором едкого натра с нипагином через 24 дня температурного и механического воздействия инсулин полностью выпадает в осадок (состав 1).

Прибавление ионов цинка до концентрации 0,025 мг на 100 ЕД инсулина несколько замедляет процесс агрегации (состав 2), однако, полностью не исключает его и на 30 сутки светопропускание для состава 2 составляет 75%, а для состава 3 - 81%. Стабильными оказались препараты, полученные растворением инсулина в соляной кислоте и стабилизированные ионами цинка до концентрации последнего 0,04 мг/100 ЕД (состав 4).

На основании полученных данных дальнейшие работы проводились с составом 4.

Определенный интерес с технологической точки зрения представляет изучение влияния порядка смешивания растворов при получении лекарственной формы инсулина короткого действия с концентрацией инсулина 100 ЕД/мл (см. табл. N4).

При последовательном прибавлении к раствору инсулина ( р-р N 1 рН 3,0-3,3) раствора натрия уксуснокислого (р-р N 2) рН полученного раствора 5,0-6,0 лежит в пределах изоточки инсулина и инсулин выпадает в осадок в виде аморфных частиц. При прибавлении раствора глицерина (р-р N 3), инсулин не растворяется т. к. рН раствора сдвигается незначительно. После прибавления раствора нипагина (р-р N4) изменения рН не происходит и инсулин остается в аморфном состоянии. Для растворения инсулина проводили корректировку рН до 7,0-7,8, прибавляя раствор едкого натра, фи таком проведении смешивания растворов не происходило полного растворения инсулина даже в течение 24 часов. Такое же явление на-

Таблица N2 4

Зависимость внешнего вида лекарственной формы раствор инсулина человека 100 ЕДЛил от порядка смешивания ингредиентов

N1 - раствор инсулина + гп++ рН=2,8 (4,23 г субстанции+100 мл Н20+0.77 мл 8% цинка уксуснокислого); N2 - раствор натрия уксуснокислого (1,36 г натрия уксуснокислого + 100 мл Н20); N3 - раствор глицерина (15 г глицерина + 100 мл Н20); N4 - раствор нипагина (1,2 г нипагина + 100 мл Н20);

№ - раствор МаОН; К

N6- Н20. .

№ опыта Порядок смешивания компонентов рН конечного раствора Описание полученного раствора

1. N1 + N2 +N3 +N4+ N5+ N8 7,6 Растворение медленное,раствор мутный, сильно опалесцирующий

2. N1 + N2 + (N3 + N4) + N5 + N6 7,5 Растворение медленное, раствор мутный

3. N1 + N4 + N5 + (N2 + N3) + N6 7,7 Растворение медленное, раствор мутный опалесцирующий

4. N1 + (N2 + N3 + N4) + N5 + N6 7,7 Раствор сразу стал прозрачным

5. N1 + (N4 + N2) + N5 + N3 + N6 7,5 Растворение в течение 1 ч,раствор прозрачный

б. N1 +(N4 +N3) +N5+ N2+ N6 7,6 Растворение в течение 1 ч, раствор прозрачный

блюдалось и при порядках смешивания 2 и 3.

Полное растворение инсулина при рН 7,0-7,8 происходило только при прибавлении к раствору инсулина раствора нипагина или его смеси с раствором натрия уксуснокислого и раствором глицерина (пункты 4,5,6 табл. 4).

Анализ физико-химических и биологических показателей раствора инсулина человека (100 ЕД/мл) проводили на момент выпуска и через 27 месяцев хранения при температуре +8° С и +37° С.

Результаты исследований показали, что в течение всего срока наблюдений при указанных температурах раствор инсулина сохранял стерильность. Значения рН и биологическая активность изменялись в пределах ошибки метода. В растворе не выпадал осадок. Полученные данные свидетельствуют о стабильности исследуемого раствора инсулина человека (100 ЕД/мл) в процессе указанных сроков хранения. Срок годности препарата составил 2 года.

3. лекарственные формы инсулина среднего и длительного действия.

Качество и размер кристаллов инсулина определяют стабильность и пролонгирующий эффект препаратов среднего и длительного действия.

Для получения постоянного и узкого распределения по размерам кристаллов инсулина нами использовалась затравочная техника.

Наши исследования показали, что если в процессе кристаллизации инсулина использовали затравочную технику, то 90% полученных кристаллов имели размер в пределах 20-30 мкм,' что соответствует современным требованиям качества на препараты инсулина.

Если техника затравки не использовалась, то 90% кристаллов имели размер от 10 до 25 мкм, что не соответствует современным требованиям качества

Установлено, что присутствие и концентрация хлористого натрия является важным фактором, определяющим форму кристаллов. По нашей технологии концентрация хлорида натрия в препаратах среднего и длительного действия составила 7%.

С целью получения качественной и стабильной при хранении кристаллической суспензии , дополнительно вводили ионы цинка параллельно с регулированием рЕ Количество общего цинка в препаратах среднего и длительного действия не превышало 0,22 мг/мл. Количество ионов цинка вносимого в препарат рассчитывалось для каждой серии препаратов с учетом цинка в субстанции. Кристаллизацию инсулина проводили при рН-5,5, затем кристаллы переносили в среду с рН=7,4, осадок оставался кристаллическим.

На основании проведенных экспериментов, которые позволили получить качественные кристаллическую и аморфную суспензии инсулина получен препарат средней продолжительности действия - суспензия инсулина лонг, представляющий собой смесь 7 частей кристаллической суспензии и 3 частей аморфной суспензии инсулина

Анализ физико-химических показателей препаратов среднего и длительного действия проводили по следующим параметрам: описание, подлинность, рН, содержание: нипагина, цинка в надосадочной жидкости, цинка общего, инсулина аморфного, инсулина в растворе, проинсулина; стерильность, пирогенность, биологическая активность, пролонгация как на момент выпуска, так и через 27 месяцев хранения при температуре +8° С.

Результаты исследований показали, что в течение всего срока наблюдения при указанной выше температуре большинство кристаллов в препаратах среднего и длительного действия имели правильную ромбоэдраль-ную форму и их размер не превышал 40 мкм. Остальные показатели изменялись в пределах ошибки метода Срок годности препаратов среднего и

длительного действия составил 2 года при температуре не выше +8° С.

4. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И АЛЛЕРГИЗИРУЩИХ СВОЙСТВ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА В РАЗЛИЧНЫХ АГРЕГАТНЫХ СОСТОЯНИЯХ, РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ И ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ. В настоящее время в мировой диабетологии используют лекарственные формы инсулина, приготовленные из субстанций разной степени очистки и видовой принадлежности: монокомпонентные препараты инсулина человека (ДНК рекомбинантная технология или полусинтетические), монокомпонентные препараты свиного и говяжьего происхождения, монокомпонентные смешанные (свино-говяжьи) препараты инсулина, монопиковые (животные), "традиционные" инсулины самой худшей очистки.

Целью данного раздела работы явилось изучение влияния агрегатного состояния и видовой принадлежности препаратов инсулина на биологические, иммунологические и аллергизирующие свойства инсулина.

Эффект пролонгации лекарственных форм высокоочищенных животных и человеческих инсулинов отсутствует, что,однако, как показали клинические испытания , не влияет на их терапевтическую эффективность и длительность действия у больных сахарным диабетом I типа Эти данные объясняют почему из Фармакопеи США 23 издания и Британской фармакопеи 1993 г исключен этот раздел.

Для изучения аллергизирующих и иммунизирующих свойств использовались стандартные методики, предложенные Государственным фармакологическим комитетом.

Аллергизирующие свойства высокоочищенных инсулинов в реакциях анафилаксии, гиперчувствительности "замедленного" типа и непрямой реакции дегрануляции тучных клеток не выявлены.

Иммуноферментный анализ (использовалась методика разработанная в

ГИКиМП) сывороток крови мышей, полученных после иммунизации их препаратами инсулина разной степени очистки, видовой принадлежности и агрегатного состояния показал, что наименее иммуногенным является раствор, а наиболее - кристаллические формы, аморфная фаза занимает промежуточное положение.

Наиболее иммуногенными оказались "традиционные" говяжьи и свиные инсулины.

5. ПОИСК ПУТЕЙ СОЗДАНИЯ НАЗАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРШ ИНСУЛИНА.

Разработанные в настоящее время препараты инсулина вводятся инъекционным путем. Необходимость инъекций приводит к несоблюдению больными назначенной схемы лечения, уменьшению гибкости в отношении дозировок, возникновению абсцессов в местах введения; низкая скорость всасывания инсулина приводит к возникновению постпрандиальных гипоглике-мий.

Поэтому возникла необходимость разработки новых лекарственных форм инсулина, с тем, чтобы преодолеть указанные ограничения. Такие формы должны быть неинъекционными и простыми для применения.

Среди различных путей введения, интраназальный путь является одним из наиболее привлекательных. Всасывание препарата через слизистую носа представляется более быстрым, т.к. назальный эпителий имеет толщину лишь 30-70 мкм и сильно васкуляризирован. Кроме того, такой путь введения в значительной степени позволяет избежать метаболизма за счет первичного прохождения через печень.

Препараты назального инсулина должны быть высококонцентрированными, чтобы вводимый объем был минимальным. Всасывание можно усилить добавлением к композициям препарата промоторов, которые должны быть не токсичными и не влиять на слизистую носа

Основной упор делался на подбор промоторов, которые должны обеспечить достаточную биодоступность инсулина, и в тоже время не влиять на его стабильность, а также не вызывать раздражения слизистой носа Желчные кислоты и соли желчных кислот в качестве промоторов нами не использовались, поскольку несмотря на то, что они обеспечивают большую биодоступность инсулина, но в то же время при хроническом введении вызывают изъязвление слизистой носа

В основу технологической схемы получения лекарственной формы инсулина для назального применения положены данные, полученные при отработке технологической схемы раствора инсулина с концентрацией 100 ЕД/мл.

В качестве промоторов использовали следующие вещества ПЭГ с М. м. 3000, ПВП с М. м. 8000 и Твин-80 в концентрациях 1% и 5%. В качестве консерванта использовали нипагин, концентрация которого во всех лекарственных формах составляла 1,2%. Изучалась физическая, химическая и биологическая стабильность выбранных составов.

Внешний вид растворов оценивали визуально, и измеряли светопро-пускание при длине волны 320 нм (СФ-26,Ломо). В качестве контроля использовали раствор Государственного стандарта инсулина в концентрации 100 ЕД/мл., рН растворов определяли потенциометрически. Результаты фиксировали на момент приготовления и на 6, 12, 24, 30 сутки температурного и механического воздействия.

Полученные результаты представлены в табл. N5.

Как видно из таблицы составы 1 и 2 оказались нестабильными. При хранении в них образовывался осадок (концентрация ПЭГ 5%), либо они давали мутный опалесцирующий раствор (концентрация ПЭГ 1%).

Составы 3, 4, 5 и 6 оставались стабильны в течение 30 суток механического и температурного воздействия.

Таблица N8 5

Изменение рН, внешнего вида и степени мутности назальных лекарственных форм инсулина после ускоренного старения при +37 С в течение 30 дней

N п/п Состав Показатель С У 7 К И

0 6 12 18 24 30

1. 100 ЕД инсулина + РН 7,40 7,42 7,33 7,34 7,26 7,26

1% ПЭГ + нипагин Наблюдение - + + + + +

Т 320, % 99 90 89 88 86 86

2. 100 ЕД инсулина + РН 7,38 7,38 7,26 7,15 6,93 6,93

5% ПЭГ + нипагин Наблюдение - + + + ++ ++

Т 320, % 100 95 90 89 80 80

3. 100 ЕД инсулина + РН 7,50 7,49 7,49 7,50 7,50 7,49

1% ПВП + нипагин Наблюдение - - - - - -

Т 320, % 100 100 99 99 100 100

4. 100 ЕД инсулина + РН 7,42 7,42 7,41 7,42 7,42 7,41

5% ПВП + нипагин Наблюдение - - - - - -

Т 320, % 99 99 99 100 100 100

5. 100 ЕД инсулина + РН 7,40 7,40 7,40 7,40 7,40 7,40

1% Твин-80 + нипагин Наблюдение - • - - - -

Т 320, % 100 100 100 100 100 100

6. 100 ЕД инсулина + РН 7,42 7,42 7,42 7,42 7,42 7,42

5% Твин-80 + нипагин Наблюдение - - - - - -

Т 320, % 100 100 98 100 100 100

Примечание: - ■ прозрачный раствор;

+ - мутный опалесцирующий раствор;

++ - явный осадок;

Т - светопропускание, %.

Химическую стабильность оценивали методом ВЭЖХ на приборе Vaters system с колонками Vaters С18 Novo Pack. При подсчете результатов площадь каждого пика выражали в процентах по отношению к площади под всей хроматограммой принятой за 100 %.

Инсулин и дезамидоинсулин идентифицировали по стандартам сравнения (Organon). полученные данные представлены в табл. N6.

Как видно из табл. N6 в процессе хранения составов 1 и 2 происходит увеличение количества дезамидоинсулина и числа неидентифицирован-ных примесей, при соответствующем уменьшении пика инсулина.

Количество инсулина, дезамидоинсулина и неидентифицированных примесей в составах 3, 4, 5 и 6 в процессе хранения не изменилось.

Определение биологической активности инсулина проводили согласно Британской Фармакопее. Подбор доз и линий мышей осуществлен в ГИКиМП с учетом качества животных поступающих из питомников. Необходиимость использования этой методики, относительно метода изложенного в Государственной Фармакопее XI издания, связано с ее меньшей трудоемкостью и стоимостью, результат анализа можно получить в тот же день.

Как видно из табл. N6 препараты составов 3, 4, 5 и 6 оказались биологически стабильными.

На основании полученных данных дальнейшие эксперименты проводились только с данными составами.

Изучение специфической активности назальных лекарственных форм показало, что в дозах 5 и 10 ЕД/кг они вызывают достоверное снижение уровня сахара в крови интактных и диабетических крыс при назальном введении. При этом максимальная относительная биодоступность назального инсулина с 5% ПВП в дозе 10 ЕД/кг составила у интактных животных 35%, у диабетических 44%. Максимальная относительная биодоступность назального инсулина с 5% Твин-80 в дозе 10 ЕД/кг у интактных животных

Таблица N 6

Химическая и биологическая ставильность назальных лекарственных форм инсулина.

« на кохент изготовления После 30 суток хранения

Составы Составы

1 2 3 4 ■ 5 ' 6 1 ' 2 .• 3 4 5 6

взкх ш

Пик 1 (инсулин свиной) . 9?,б 37,6 97,6 97,6 97. Б 97.6 82.4 81,8 97.6 97,6 97,6 97.6

Пик 2 (дезамидоинсулин) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 14.3 12.7 0.1 0.1 0.1 0.1

Пик 3 (неиндентифициро-

ванные примеси) 1.3 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 3.3 5.5 1.3 2.0 1.9 1.9

Биологическая. 101 103 ' 115 105 102 ' 101 . 78 75 102 101 104 101

активность (ЕД/кл) (93-109) (96-110) (102-130) (38-113) (95-103) (93-103) (70-85) (67-83) (95-103) (33-109) (96-112) (93-109)

составила 38%, у диабетических 46%.

Изучение влияния ПВП и Твин-80 на слизистую носа интактных животных показало, что данные промоторы при длительном введении не изменяют структуру слизистой носа крыс.

Полученные данные свидетельствуют об эффективности разработанных лекарственных форм инсулина и возможности их применения в клинической практике для предупреждения постпрандиальных гликемий.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Изменен состав и усовершенствована технология препаратов инсулина быстрого и короткого действия. Способ введения консерванта нипагина в препараты не влияет на их качественные характеристики. Содержание общего цинка для препаратов быстрого действия не должно превышать 0,04 мг на 100 ЕД инсулина, для препаратов короткого действия не должно превышать 0,22 мг на 100 ЕД инсулина.

2. Усовершенствованы технология и состав препаратов инсулина среднего и длительного действия. Установлено, что внесение кристаллической затравки способствует образованию правильных ромбоэдральных кристаллов, размер которых не превышает 40 мкм. Содержание натрия хлорида в препаратах нормировано на уровне 7%.

3. Разработан состав и технология раствора инсулина человека 100 ЕД/мл. Установлено, что на качество препарата влияет порядок смешивания рабочих растворов, который должен быть следующим: инсулин, нипа-гин, натрий уксуснокислый, глицерин.

4. Препараты инсулина быстрого, короткого, среднего и длительного действия, а также раствор инсулина человека (100 ЕД/мл) стабильны при температуре +8° С в течение двух лет хранения. Качественные и количественные показатели препаратов в процессе хранения изменялись в пре-

делах ошибки метода.

5. Изучено влияние степени очистки, видовой принадлежности и агрегатного состояния препаратов инсулина на их биологические, иммунологические и аллергизирующие свойства.

6. Разработаны составы и технология инсулина для назального применения. Концентрация инсулина в препаратах 100 ЕД/мл. Установлено, что промоторы ПВП и Твин-80 усиливают поглощение назального инсулина Данные промоторы не влияют на слизистую носа при хроническом введении. Биодоступность назального инсулина с 5% ПВП у интактных животных составила 35%, у диабетических 44 %. Биодоступность назального инсулина с 5% Твин-80 38% и 46% соответственно.

7. На основании результатов исследования утверждены ВЕС на моно-суинсулин МК и инсулин семилонг Ж Данные препараты разрешены к медицинскому применению. Проекты BSC и соответствующая нормативная документация на инсулин-лонг СМК, инсулин-ультралонг СМК, раствор инсулина человека ГИЧ (40 ЕД/мл), раствор инсулина человека ГИЧ (100 ЕД/мл) представлены в Государственный фармакологический комитет МЗШ России. Получено разрешение на клинические испытания данных препаратов. Раздел "Пролонгация" в проектах ВФС на препараты инсулин-лонг СМК 40 ЕД/мл и инсулин-ультралонг СМК 40 ЕД/мл дан в новой редакции. Результаты работы легли в основу 4 опытно-промышленных и 2 лабораторных регламентов.

Список опубликованных работ

1. Изучение возможности получения лекарственной формы инсулина интраназального применения/Белова В. R , Шркишева 3. А., Коростин Е И., Ивасько Е. П., Новохатский А. С., Хлябич Г. Е //Тез. докл. Всесоюзной научно-технической конф.: "Состояние и перспективы создания новых готовых лекарственных средств и фотохимических препаратов". -Харьков,1990-с. 96.

2. Получение и характеристика моноклональных антител к инсулину, обладающих различной видовой специфичностью и способностью ингибиро-вать биологическую активность инсулина/Михеева Т. Г., Новохатский А. С., Хлябич Г. Е , Калинин Г. К , Ивасько Е. П., Батрак Е. Е., Кочетова Е. // Проблемы эндокринологии. -1991-Т. 37, вып. 2. -с. 59-62.

3. Создание лекарстенной формы инсулина человека быстрого дей-ствия/Каратеева Р. И., Залесская Е А. , Донецкий И. А., Коростин К И., Андреевичева Т. К1, Ивасько Е. Е , Новохатский А. С., Кирста Е. Ф. //Мат. IV научно-технической конф. ВНИИТКГЕ-Москва, 1991.-с. 156.

4. Создание назальной лекарственной формы инсулина/Коростин В. И., Белова К К , Ивасько Е. Е , Меркишева 3. А., Новохатский А. С. //Мат. IV научно-технической конф. ВНИИТКГЕ-Москва, 1991.-с. 159.

5. Иммунная специфичность и биологическое действие моноклональных антител к инсулину и проинсулину/Новохатский А. С., Михеева Т. Г., Батрак Е. Е., Ивасько Е. Е , Кочетова Е. В. //Мат. IV научно-технической конф. ВНИИТКГЕ-Москва, 1991.-с. 167.

6. Биологические и иммунологические свойства усовершенствованных препаратов инсулина/Ивасько Е. Е , Елисеева И. А., Новохатский А. С. //Мат. IV научно-технической конф. ВНИИТКГЕ -Москва, 1991. -с. 168.

7. Современные физико-химические и биологические методы контроля качества препаратов инсулина/Алексеев К Е , Новохатский А. С., Ивасько Е. Е //Международный семинар "Инсулин: получение, производство, применение". -Минск, 1995. -с. 12.

8. Имеют ли будущее неинъекционные лекарственные формы инсулина?/ Ивасько Е. Е, Новохатский А. С.//Конгресс "Человек и лекарство",-Москва, 1996. -с. 24.

пмп мпс 3.482 т.100 - 97 г, Москва, ново-ьасманная, д.ь