Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Изучение гиполипидемического действия цветочной пыльцы-обножки

Актуальность темы. В настоящее время в условиях возрастающих неблагоприятных внешних воздействий на организм, сочетающихся с нарушением принципов сбалансированного питания, отмечается рост числа заболеваний, сопровождающихся развитием гиперлипидемии [73]. В первую очередь это относится к заболеваниям сердечно-сосудистой системы. Эти заболевания остаются наиболее распространенной причиной снижения трудоспособности, инвалидизации и смертности населения в экономически развитых странах. По данным ВОЗ [56] на долю этих заболеваний приходится 21% от общей смертности.

В последние годы много внимания уделяется исследованиям природных биомодуляторов, в том числе продуктам пчеловодства, которые характеризуются широким спектром биологической активности [113]. В отличие от синтетических препаратов они лучше усваиваются и не вызывают прооксидативных реакций [2]. При этом они сочетают достаточную эффективность, широту терапевтического действия и относительную безвредность, а также часто оказывают положительное влияние на течение сопутствующей патологии.

Особый интерес вызывает пыльца-обножка, состав и известная биологическая активность которой предполагает возможность создания на ее основе высокоэффективных профилактических гиполипидемических средств [6,7].

Цель работы. Установить состав пыльцы-обножки, собранной на территории Ставропольского края и экспериментально обосновать ее гиполипидемическое действие.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических показателей пыльцы-обножки различного ботанического происхождения (белой акации и разнотравья), собранной на территории Ставропольского края.

2. Изучить токсичность и гиполипидемическую активность пыльцы-обножки у интактных животных.

3. Изучить степень аллергенности пыльцы-обножки при ее приеме путем определения гематологических показателей и уровня гистамина.

4. Изучить сравнительное влияние пыльцы-обножки различного ботанического происхождения (белой акации и разнотравья) на показатели липидного обмена в крови и печени белых крыс на модели "острой" гиперлипидемии.

5. Изучить влияние пыльцы-обножки на показатели липидного обмена в крови и печени белых крыс на модели "хронической" гиперлипидемии в сравнении с официнальным лекарственным препаратом Липанор.

6. Выяснить некоторые стороны механизма действия пыльцы-обножки на липидный обмен и адаптационные процессы.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение химического состава и физико-химических показателей пыльцы-обножки белой акации и разнотравья, собранной на территории Ставропольского края и дополнительно к показателям ГОСТа 28887-90 определены сумма свободных аминокислот и каротиноидов.

В опытах на белых крысах впервые установлено гиполипидемическое действие пыльцы-обножки при «острой» и «хронической» гиперлипидемии, по эффективности приближающееся к действию официнального лекарственного препарата Липанор. Впервые установлено, что пыльца-обножка снижает интенсивность перекисного окисления липидов - уровень диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов и повышает активность антиоксидантного фермента каталазы при «острой» и «хронической» гиперлипидемии.

В механизме гиполипидемического действия пыльцы-обножки основную роль играет задержка всасывания холестерина и ускорение его метаболизации в желчные кислоты, сочетающееся со снижением пероксидации и с усилением адаптивно-анаболических и мембраностабилизирующих реакций.

Практическая значимость работы. Установлены дополнительные показатели для стандартизации пыльцы-обножки — сумма свободных аминокислот и каротиноидов. Выявлено наличие выраженной гиполипидемической активности пыльцы-обножки при «острой» и «хронической» гиперлипидемии, приближающейся по действию к лекарственному препарату Липанор, что служит экспериментальным обоснованием возможного использования пыльцы-обножки для создания средств лечебно-профилактического применения при различных заболеваниях, связанных с развитием гиперлипидемии.

Внедрение результатов исследования.

Разработано информационное письмо «Изучение гиполипидемического действия пыльцы-обножки», на основании которого получены акты внедрения материалов диссертации в план работы кафедры технологии лекарств ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (акт внедрения от 17 мая 2006г.) и в лечебно-профилактическую деятельность пятигорского санатория им. М.Ю. Лермонтова (акт внедрения от 20 мая 2006г.), а также зарегистрирована приоритетная справка за № 2006112936 от 19 апреля 2006г. на патент на изобретение «Композиция на основе перги и пыльцы-обножки, обладающая гипогликемической и гиполипидемической активностью».

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ Пятигорской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01200204765).

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Дополнительно для стандартизации пыльцы-обножки предлагаются -общая сумма аминокислот и каротиноидов.

2. Пыльца-обножка нетоксична и не вызывает аллергических реакций.

3. Пыльца-обножка обладает гиполипидемической активностью, связанной с задержкой всасывания холестерина, усилением метаболизации холестерина в желчные кислоты и по своей выраженности приближается к действию лекарственного препарата Липанор.

4. Пыльца-обножка снижает уровень перекисного окисления липидов и оказывает адаптивно-анаболическое, мембраностабилизирующее и антистрессорное действие.

Апробации и публикации. Основные положения диссертационной работы изложены на 59-й и 61-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2004, 2006 гг.). По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 в центральной печати, одна из которых в журнале, рекомендованном ВАК.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 129 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), материалов и методов исследования (1 глава), экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 19 рисунками. Список литературы включает 157 источника, из которых 23 публикации иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Предложены методики количественного определения суммы свободных аминокислот и каротиноидов, которые могут быть рекомендованы для стандартизации пыльцы-обножки.

2. Пыльца-обножка является практически нетоксичным веществом и не оказывает аллергизирующего влияния на организм.

3. Пыльца-обножка оказывает гиполипидемическое действие у интактных белых крыс, снижая в крови содержание холестерина и триглицеридов.

4. Два вида пыльцы-обножки (белая акация и разнотравье) у животных с «острой» гиперлипидемией в равной степени повышают уровень холестерина а-липопротеидов и снижают уровень холестерина, триглицеридов, (3- и пре-(3-липопротеидов в крови и содержание холестерина в печени.

5. Пыльца-обножка оказывает выраженное гиполипидемическое действие у животных с «хронической» гиперлипидемией, повышая уровень холестерина а-липопротеидов и снижая содержание холестерина, триглицеридов, (3- и пре-(3-липопротеидов в сыворотке крови и холестерина в печени. Гиполипидемическое действие пыльцы-обножки приближается по эффективности к действию официнального лекарственного препарата Липанор.

6. Пыльца-обножка при гиперлипидемии снижает процессы пероксидации, активирует адаптивно-анаболические реакции, оказывает мембранностабилизирующее и антистрессорное действие.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Существенным моментом в оценке перспективности фармпрепаратов является степень их токсичности [12].

Исследование острой токсичности пыльцы-обножки №1 и №2, проведенное на крысах, показало, что после введения максимально возможной дозы (5000мг/кг), все животные остались живы. Таким образом, показатель LD5o определить не удалось, но можно утверждать, что LD5o выше, чем доза 5000 мг/кг. Таким образом, по классификации К.К. Сидорова пыльца-обножка относится к IV классу опасности - малоопасные вещества с LD50 более 5000 мг/кг при пероральном введении [107]. Следовательно, исследованная пыльца-обножка практически нетоксична.

Детоксицирующую функцию печени под влиянием пыльцы-обножки №1 и №2 определяли по продолжительности этаминал-натриевого сна [30,106]. Наименьшая продолжительность сна наблюдалась у животных, получавших пыльцу-обножку в дозе 100 мг/кг, хотя существенной разницы в действии исследованных доз не отмечалось. Исходя из этих результатов и данных литературы [74,115] для дальнейших исследований фармакологической активности пыльцы-обножки была выбрана доза 100 мг/кг.

Принимая во внимание, что многие продукты пчеловодства обладают аллергизирующим влиянием на организм [67], нами изучено влияние пыльцы-обножки №1 и №2 на показатели аллергизации. При этом выявлено, что она достоверно не влияет на изученные показатели: не менялось содержание гистамина (рк>0,5). Отсутствовали также существенные сдвиги в гематологических показателях - общем количестве лейкоцитов и лейкоцитарной формуле. Исключение составило статистически достоверное увеличение гемоглобина (рк<0,05) у животных, получавших пыльцу-обножку.

При создании препаратов для профилактики и лечения гиперлипидемии и как ее следствия атеросклероза большое внимание уделяется их способности корригировать липидный обмен. Это объясняется тем, что в патогенезе атеросклероза наряду с психическим и эмоциональным стрессом, артериальной гипертонией, генетической предрасположенностью и другими факторами риска [70,73,109] признается существенная роль нарушений со стороны показателей липидного обмена: холестерина, триглицеридов, и пре-(3-липопротеидов [58,117]. В этой связи основное внимание в работе было уделено изучению способности пыльцы-обножки воздействовать на уровень липидных показателей в сыворотке крови и печени.

При пероральном недельном введении пыльцы-обножки №1 интактным животным в дозе 100 мг/кг выявлено снижение в сыворотке крови уровня триглицеридов на 10,9% (рк<0,05), а холестерина на 16,0% (рк<0,05), а пыльцы №2 - 12,8% (рк<0,05) и 17,6% (рк<0,05) соответственно.

Полученные результаты послужили основанием для более углубленного изучения гиполипидемических свойств двух видов пыльцы-обножки на модели "острой" гиперлипидемии, вызываемой введением твина-80 [97] и на модели "хронической" гиперлипидемии, вызываемой пероральным введением холестерина в сочетании с метилтиоурацилом и стрессовым напряжением [16,37].

Опыты показали, что оба вида пыльцы-обножки при «острой» гиперлипидемии обладали по существу равным гиполипидемическим эффектом - различие в их действии практически не было (р>0,1). Если пыльца №1 снижала уровень холестерина в сыворотке крови на 45,0% (рк<0,05), а в печени на 12,1% (рк<0,05), то пыльца №2 соответственно - на 48,3% (рк<0,05) и 9,7% (рк<0,05) соответственно.

Содержание триглицеридов и и пре-(3-липопротеидов в сыворотке крови также понизилось соответственно на 42,1% (рк<0,05) и 16,0% (рк<0,05) при введении пыльцы №1, а пыльцы №2 - на 40,0% (рк<0,001) и 19,0% (рк<0,05).

Важной особенностью гиполипидемического действия пыльцы служила ее способность воздействовать на уровень холестерина а-липопротеидов. Введение пыльцы-обножки №1 увеличило этот показатель на 65,3% (рк <0,05), а пыльцы №2- 69,4% (рк <0,05), по сравнению с контролем, подняв его практически до уровня нормы. При рассмотрении гиполипидемического действия двух видов пыльцы-обножки нами было обращено внимание на механизм возникновения гиперлипидемии, вызванной введением твина - 80.

Твин-80 относится к поверхностно-активным веществам (неионным детергентам). Механизм гиперлипидемического действия неионных детергентов связывают со способностью этих веществ влиять на физико-химические свойства липопротеидов. Образование комплекса липопротеидов с неионным детергентом и задержка их в ретикулоэндотелиальной системе мешает нормальному транспорту липидов и их обмену в органах и тканях и препятствует проявлению действия липопротеидлипаз. Установлено, что однократное введение неионных детергентов вызывает увеличение биосинтеза холестерина в печени, сопровождающееся повышением концентрации холестерина в сыворотке крови в среднем на 60-100% [97].

Иначе говоря, "острая" модель гиперхолестеринемии характеризуется увеличением в крови концентрации эндогенного холестерина.

Учитывая тот факт, что пыльца-обножка в наших опытах оказала гипохолестеринемическое действие при "острой" модели гиперлипидемии, можно предположить, что она способна усиливать метаболизацию холестерина в желчные кислоты, ведущую к понижению его содержания в крови. Специально проведенные опыты по изучению изменений в желчи количества холестерина и желчных кислот параллельно с определением холестерина в сыворотке крови при введении пыльцы-обножки показали ее способность усиливать метаболизацию холестерина в желчные кислоты. При недельном введении пыльцы-обножки уровень желчных кислот увеличился на 15,9% (рк<0,05), а холато-холестериновый коэффициент повысился на

34,0% (рк<0,05). Одновременно наблюдалось снижение холестерина в сыворотке крови - на 16,5% (рк<0,05).

Следовательно, пыльца-обножка, понижая содержание холестерина в сыворотке крови, одновременно существенно повышает уровень желчных кислот в желчи, что дает основание говорить об усилении под влиянием пыльцы-обножки метаболизации холестерина в желчные кислоты. Этот эффект может служить важным звеном в механизме гипохолестеринемического действия пыльцы-обножки.

Опыты с "хронической" гиперлипидемией подтвердили выраженное гиполипидемическое действие пыльцы-обножки. В отличие от контрольных опытов, где наблюдался постоянный и значительный в течение двух месяцев рост содержания исследуемых показателей липидного обмена, в опытах с введением пыльцы-обножки отмечался выраженный гиполипидемический эффект.

К концу первого месяца прием пыльцы-обножки приводил к снижению уровня холестерина в сыворотке крови на 25,5% (рк<0,05), триглицеридов - на 35,2% (рк<0,05), р- и пре-р-липопротеидов на 17,9% (рк<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы.

Уровень холестерина а-липопротеидов в сыворотке крови наоборот повысился по сравнению с контролем на 18,1% (рк>0,1). Известно, что в ранний период гиперхолестеринемии специфические адаптационные механизмы проявляются в активировании прямого и обратного транспорта холестерина. Наблюдается увеличение триглицеридов, общего холестерина, концентрация холестерина а-липопротеидов также возрастает. Это свидетельствует о стимуляции акцептирования холестерина с донорных структур и переносе его в печень [36], что и наблюдалось нами в контрольных опытах. Введение пыльцы-обножки задерживало этот процесс.

К концу второго месяца гиполипидемический эффект пыльцы был более выражен. Исследуемые показатели (холестерин, триглицериды и р- и пре-рлипопротеиды) опытной группе снизились на 39,8% (рк<0,05), на 28,2% (рк<0,05) и на 44,8% (рк<0,05) соответственно по сравнению с контролем. Уровень холестерина а-липопротеидов, напротив, еще более увеличился -на 25,2% (рк<0,001). Фармакологическое действие пыльцы нашло свое подтверждение и при определении холестерина в печени: отмечалось его снижение на 22,9% (рк<0,001).

Исследования показали, что пыльца-обножка и препарат сравнения Липанор оказывают однонаправленное гиполипидемическое действие. При введении Липанора к концу 2-месячного опыта уровень холестерина в сыворотке крови снизился на 67,4 % (рк<0,05), а триглицеридов - на 52,6% (рк<0,05), что превышало эффективность действия пыльцы-обножки. Однако различие в величине [3- и пре-(3-липопротеидов и холестерина а-липопротеидов в сыворотке крови и холестерина печени в опытах с Липанором и пыльцой-обножкой было статистически недостоверным, что характеризует пыльцу как достаточно активное гиполипидемическое средство.

Пыльца-обножка содержит различные органические и минеральные компоненты, белки, аминокислоты, углеводы, липиды, флавоноиды, витамины, макро- и микроэлементы и другие соединения [41,42,62], которые, по-видимому, совместно и обуславливают разностороннее биологическое влияние, в том числе выявленное нами гиполипидемическое действие пыльцы.

Химический состав пыльцы не дает прямых оснований полагать, что механизм ее гиполипидемического действия связан со способностью задерживать всасывание холестерина из желудочно-кишечного тракта. Однако проведенные опыты показали, что по сравнению с контролем, где вводился физиологический раствор, в опытах с введением пыльцы переход холестерина в кровь на 1-ми 2-м часу после его введения оказался понижен на 20,0% по сравнению с контрольными опытами. Известно, что холестерин всасывается в виде комплекса с желчными кислотами. Введение пыльцы per os связывает часть желчных кислот в кишечнике и, тем самым, уменьшает всасываемость холестерина, с одной стороны, а с другой - по-видимому, подобно секвестрантам [9,80,130] приводит к усилению синтеза желчных кислот из эндогенного холестерина, что ведет к истощению запасов последнего в печени и снижению его содержания в крови. Такое объяснение согласуется с вышеописанными результатами изучения изменений липидного обмена при применении пыльцы-обножки.

Таким образом, нами установлена способность пыльцы-обножки при введении в дозе 100 мг/кг в процессе развития хронического патологического состояния животных существенно снижать уровень холестерина, триглицеридов, и пре-Р-липопротеидов в крови, а также повышать содержание холестерина а-липопротеидов. Эти данные, равно как и результаты опытов в условиях «острой» гиперлипидемии, позволяют считать пыльцу-обножку эффективным средством коррекции нарушений липидного обмена.

В патогенезе развития длительной гиперлипидемии, и как ее следствия - атеросклероза, немаловажную роль играет психоэмоциональное напряжение [46]. В этой связи мы попытались изучить влияние пыльцы-обножки на адаптогенные процессы в организме в условиях хронического стресса, сопровождающего развитие длительной гиперлипидемии [94].

Считается, что одним из основных проявлений развития стресса в организме являются гипертрофия надпочечников и увеличение продукции адреналина [116]. Поэтому эти показатели были выбраны нами как критерии развития стрессорного состояния.

Следует признать, что моделирование в наших исследованиях "хронической" гиперлипидемии, по существу, является двухмесячным стрессом для животных, поскольку они ежедневно подвергались неадекватным для них механическим, химическим и электрическим воздействиям.

Изменения при атеросклерозе в определенной степени обратимы, причем степень обратимости значительно различается в разных органах. По данным литературы [119] изменения, наблюдающиеся в коре надпочечников животных, получавших холестерин более 2 недель, подвергаются обратному развитию, хотя и неполному. В то же времяя резкие колебания концентрации холестерина в крови оставляют определенный «структурный след» в коре надпочечников. Эти данные могут быть использованы при оценке возможностей регрессии атеросклеротических изменений под влиянием соответствующей терапии.

В наших исследованиях после двух месяцев эксперимента с "хронической" гиперлипидемией у контрольных животных, получавших физиологический раствор, значительно выросла масса надпочечников на 25,7% (ри<0,001) с одновременным увеличением содержания в них адреналина на 57,9% (ри<0,001).

Введение пыльцы снижало стрессорность животных. Об этом говорило уменьшение по сравнению с контрольными животными массы надпочечников на 9,1% (рк<0,05) и содержания в них адреналина на 14,3% (рк<0,05).

Двухмесячное стрессорное состояние животных при "хронической" гиперлипидемии сопровождалось падением в печени общего белка на 7,5% (ри<0,05) и нуклеиновых кислот на 21,7% (ри<0,05), что указывало ослабление анаболических процессов.

Применение в этих условиях пыльцы-обножки обусловило повышение в печени содержания белка, по сравнению с контролем, на 17,8% (рк<0,05), при значительном увеличении содержания нуклеиновых кислот- на 82,7% (рк<0,05), что можно расценить как способность пыльцы оказывать адаптивно-анаболическое воздействие на организм.

Развитие «хронической» гиперлипидемии сопровождается изменением уровня перекисного окисления липидов - ПОЛ [93]. Уровень ПОЛ в организме определяется, с одной стороны, процессами радикало- и перекисеобразования, а с другой - состоянием эндогенных систем антиоксидантной защиты, поэтому оценка антиокислительной активности (АОА) этих систем имеет прогностическое значение.

Известно, что АОА плазмы крови обусловлена наличием в ней антиокислителей; ферментных систем обезвреживания перекисей и свободных радикалов, а-токоферола и др. Механизм действия присутствующих в плазме ингибиторов пероксидации липидов и их вклад в общий антиокислительный потенциал плазмы различны. Однако важен не столько вклад того или иного эндогенного антиоксиданта, сколько уровень резервов антиоксидантной защиты крови в целом [93].

В этой связи большой интерес представляют результаты изучения влияния пыльцы-обножки на уровень перекисного окисления липидов.

Уже в опытах на интактных животных удалось установить, что уровень общей антиокислительной активности крови (АОА) при ее введении оказался выше контрольных значений на 31,2% (рк<0,05). Способность пыльцы-обножки повышать общую антиокислительную активность крови получило подтверждение в опытах на животных с «хронической» гиперлипидемией, причем примерно в той же степени (на 28,6%, рк<0,05).

При «острой» гиперлипидемии оба вида пыльцы-обножки обладали по существу равным влиянием на уровень перекисного окисления липидов -различие в их действии было несущественным (р<0,1). Так, если пыльца №1 снижала уровень диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов в сыворотке на 70,8% (рк<0,05) и 18,2% (рк<0,05), то пыльца №2 - на 68,2% (рк<0,05) и 16,7% (рк<0,05) соответственно. Активность антиоксидантного фермента каталазы, наоборот, увеличилась. Причем различия в действии обоих видов пыльцы-обножки на уровень этого фермента в сыворотке крови также не было. Так, пыльца №1 повышала уровень каталазы на 54,1% (рк<0,05), а пыльца №2 на 53,8% (рк<0,05).

Влияние пыльцы-обножки на степень пероксидации подтвердилось и в опытах при «хронической» модели гиперлипидемии.

У опытных животных, получавших пыльцу-обножку, имело место, по сравнению с контролем, снижение уровня диеновых конъюгатов и ТБК-активных продуктов на 43,9% (рк<0,05) и 40,3% (рк<0,05) соответственно, а активность каталазы по сравнению с контролем увеличилась на 43,8% (рк<0,05).

Принимая во внимание связь состояния биомембран с процессами пероксидации [153] и ее роль в нарушении проницаемости стенки сосудов в механизме развития длительной гиперлипидемии [126], мы попытались изучить эти вопросы в опытах с применением пыльцы-обножки путем определения спонтанного гемолиза по Ягеру, вызываемого пероксидным окислением липидов кислородом воздуха и путем определения сорбционной способности ткани аорты.

Опыты показали существенные изменения этих показателей. Гемолиз эритроцитов при хронической гиперлипидемии в контрольной группе увеличился в 2,4 раза (ри<0,05) по сравнению с исходным уровнем. Введение же пыльцы-обножки приводило к снижению данного показателя на 34,5% (рк<0,05) по отношению к контролю. Такой характер спонтанного гемолиза эритроцитов говорил о мембраностабилизирующем действии пыльцы-обножки. Мембраностабилизирующее действие пыльцы подтвердилось при изучении сорбционной способности ткани аорты. В группе животных, получавших пыльцу-обножку, этот показатель оказался ниже контрольного на 15,5% (рк<0,05).

Следовательно, пыльца-обножка, снижая уровень перекисного окисления липидов, способствует стабилизации мембран, сочетающееся с активизацией адаптивно-анаболических процессов в тканях и снижением стрессорности, что в конечном итоге способствует формированию гиполипидемического эффекта пыльцы-обножки, в котором важным

Ill элементом служит задержка всасывания холестерина и ускорение его метаболизации в желчные кислоты.

Установленная способность пыльцы-обножки при введении в дозе 100мг/кг на модели «острой» и «хронической» гиперлипидемии существенно снижать уровень холестерина, триглицеридов, р- и пре-p- липопротеидов крови и повышать содержание холестерина а-липопротеидов, приближаясь по своей эффективности к действию официнального препарата Липанор, позволяет считать пыльцу-обножку эффективным средством коррекции нарушений липидного обмена, что может служить экспериментальным обоснованием для дальнейшей клинической апробации средства и разработке его лекарственных форм.