Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

Рахметова, Алла Александровна

Диссертации по медицине → Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Рахметова, Алла Александровна Москва 2011 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.04.02

Автореферат диссертации по медицине на тему Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

На правах рукописи

РАХМЕТОВА АЛЛА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НАНОЧАСТИЦ МЕДИ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ДИСПЕРСНОСТИ И ФАЗОВОМУ

СОСТАВУ

Специальность 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2011

005005086

Работа выполнена в Институте Энергетических проблем Химической Физики РАН и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Богословская Ольга Александровна Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Снткин Сергей Павлович доктор фармацевтических наук, профессор Саломатин Евгений Михайлович

Ведущая организация: Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова факультет фундаментальной медицины

Защита диссертации состоится 21 октября 2011 года в 14:30 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.8/2.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.6.

Автореферат разослан 19 сентября 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук у / / Лукашева Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы:

Актуальной проблемой фармации является создание и стандартизация лекарственных средств для лечения раневых повреждений различной этиологии. Эффективность и безопасность используемых фармацевтических препаратов обеспечивает благоприятное течение раневого процесса и быстрое восстановление трудоспособности пациентов. Происходящие глобальные негативные изменения природной среды не могут не влиять на биологические свойства раневой микрофлоры и иммунную защиту человека, что оказывает воздействие на заживление ран [Абаев Ю.К., 2006].

В настоящее время продолжается поиск оптимальных методов стимуляции заживления рак, ожогов, трофических язв. Местное консервативное лечение с использованием мазей, гелей, повязок, линиментов, играет важную роль в комплексной терапии поражений кожи и сокращает сроки заживления ран [Кузин М.И., Костюченок Б. М., 1990].

Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств, в том числе, и обладающих ранозаживляющим действием, является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. Установлено, что наночастицы металлов, обладают физико-химическими свойствами, отличающимися, как от свойств массивных металлических объектов, так и от свойств отдельных атомов. При попадании в живые организмы наноразмерные частицы металлов вызывают биологический ответ, отличающийся от действия традиционной ионной формы элементов [Глущенко H.H., 1982-2011]. Показано, что наночастицы d-элементов при парэнтеральном введении в 7-50 раз менее токсичны, чем металлы в ионной форме. Наночастицы легко проникают во все органы и ткани и обладают пролонгированным действием. В биотических дозах они стимулируют обменные процессы и проявляют многофункциональное действие [Глущенко H.H., 1982-2011].

В США для лечении ран, ожогов, трофических язв, экземы, угревой сыпи широко используют повязки торговых марок Acticoat, Nucryst, в состав которых входят наночастицы серебра [Wright J.B., 2004; Burreil R.E., 2005]. В то же время в практике лечения ран разной этиологии сохраняется высокая потребность в мягких лекарственных формах. В связи с этим наши разработки направлены на создание мягких лекарственных форм, включающих наночастицы металлов, в частности, наночастицы меди. Функция меди в организме хорошо изучена и доказана абсолютная её необходимость на всех стадиях течения раневого процесса.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, для создания мягкой лекарственной формы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить антибактериальную активность наночастиц меди с разной дисперсностью и фазовым составом на тест-культурах клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

2. Определить показатели острой токсичности наночастиц меди, отличающихся по дисперсности и фазовому составу.

3. Разработать состав мази с наночастиц меди и лабораторно-технологическую схему ее получения.

4. Оценить антибактериальную активность разработанной нами мази с наночастицами меди на тест-культурах клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

5. Изучить влияние созданной нами мази с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, на процесс ранозаживления в модельных экспериментах.

6. Разработать оптимальный метод контроля качества мазей с наночастицами меди по показателю «определение подлинности».

Положения, выносимые на защиту:

1. Способность наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, оказывать антибактериальное действие в зависимости от их концентрации и вида микроорганизма.

2. Основные токсикологические характеристики наночастиц меди, отличающихся по дисперсности и фазовому составу.

3. Состав разработанной мягкой лекарственной формы и лабораторно-технологическая схема ее получения.

4. Ранозаживляющие свойства мазей с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, в модельных экспериментах.

5. Антимикробная активность мази с наночастицами меди.

6. Контроль качества мазей с наночастицами меди по показателю «определение подлинности».

Научная новизна:

Впервые показано, что наночастицы меди с различной дисперсностью и фазовым составом проявляют антимикробную активность в отношении тест-культур клеток грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Впервые показано, что наночастицы меди, обладающие различной дисперсностью и фазовым составом имеют разные токсикологические характеристики.

Впервые создана мягкая лекарственная форма - мазь с каночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, и разработана лабораторная технологическая схема её получения.

Впервые установлено, что наночастицы меди, отличающиеся дисперсностью и фазовым составом, оказывают разное стимулирующее действие на процесс ранозаживления.

Впервые показано, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробными свойствами.

Впервые для контроля качества мягких лекарственных средств, содержащих наночастицы меди, предложена сканирующая электронная микроскопия образцов мази.

Практическая значимость работы:

Предложенная лабораторная схема получения мази с наночастицами меди может быть положена в основу заводской технологии приготовления мягких лекарственных форм с наночастицами меди.

Обнаруженная антимикробная активность наночастиц меди является основанием для использования их в качестве антимикробных агентов при создании антисептических медицинских и технических материалов, лаков, красок и т.д.

Полученные результаты о ранозаживляющей активности мазей, содержащих наночастицы меди различной дисперсности и фазового состава, свидетельствуют о необходимости проведения материаловедческой аттестации используемых наночастиц металлов для медицинских целей.

Метод сканирующей электронной микроскопии образцов мази может быть рекомендован для доказательства подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами меди на фармацевтических предприятиях.

Полученные результаты расширяют теоретические представления о механизмах действия наночастиц металлов на биологические системы организма.

Результаты исследования могут быть включены в учебные программы дисциплин медицинских и ветеринарных специальностей при изучении разделов по микро- и макроэлементозам.

Приняты к утверждению два патента на изобретение: «Антимикробные агенты» per. № 2010127540/15(039207) дата поступления 06.07.2010; «Препарат, ускоряющий ранозаживление» per. № 2011116961/15(025153) дата поступления 28.04.2011. Получено положительное решение о выдаче патента

на изобретение «Препарат, ускоряющий заживление ран» рег. № 2010126761/15(038118) 14.07.2011

Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики РАН в Лаборатории биологического воздействия наноструктур в соответствии с планами научно-исследовательских работ -Гос. регистрация № 01120 807829 (2008-2012). Работа поддержана Грантами РФФИ № 07-08-00376, № 07-04-12200, № 09-04-13625.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции студентов и молодых ученых "Клинические и теоретические аспекты современной медицины" (Москва, РУДН, 2008 г.), VII международной научной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии" (Москва, 2008), на X Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2009), XIV Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), XXII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2010).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них 3 в журналах списка ВАК и 1 патент.

Объем и структура диссертации:

Диссертационная работа изложена на 125 страницах, содержит 15 таблиц, 20 рисунков. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, список литературы, включающий 112 источников (в том числе 64 на иностранном языке) и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объекты, материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись наночастицы меди, полученные методом высокотемпературной конденсации, разработанным М.Я. Геном [Ген М.Я., 1981] в ИХФ РАН им. Н.Н. Семенова, на установке Миген-3 [Жигач А.Н., 2000].

Для исследования было отобрано 5 образцов наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Основные физико-химические характеристики наночастиц меди приведены в таблице 1.

Таблица 1

Физико-химические характеристики наночастиц меди

№ образца Размер наночастиц меди, нм Фазовый состав Толщина оксидной пленки, нм

Содержание кристаллической меди, % Другие формы меди

Форма меди Содержание, %

1 103,0 ±2,0 96,0 ± 4,5 СиО 4,0 ± 0,4 6

2 47,0 ± 0,6 84,0 ± 4,2 СиО 16,0 + 1,6 6

3 86,8 ±0,9 94,0 ± 4,3 СиО 6,0 ± 0,6 10

4 119,0 ± 1,0 0,50 ± 0,02 СиО Си20 90,45 ±6,15 9,05 ± 0,85 **

5 103,0 ±2,0 71,4 ±4,0 СиО 28,6 + 0,8 6

«**» - наночастицы полностью окислены, за исключением ядра, содержащего (0,50 ± 0,02) % кристаллической меди.

Для исследования ранозаживляющих и токсических свойств наночастиц меди использовали взрослых мышей-самок линии SHK, массой 18-20 г. Экспериментальные исследования на животных проводили в соответствии с международными требованиями [«The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals», 1996].

Для определения токсикологических характеристик наночастиц меди опытным животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл суспензии, содержащей наночастицы меди в различных концентрациях. Для приготовления суспензий точную навеску наночастиц меди помещали в дистиллированную воду и диспергировали на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т в режиме 0.5 А, 44 кГц при охлаждении по следующей схеме: 20 сек. диспергирования - 1 мин. охлаждения (3 цикла). Наблюдение за опытными животными проводили в течение 4-х недель. Критериями оценки острой токсичности служила выживаемость животных.

Антибактериальное действие наночастиц меди изучали на тест-культурах грамотрицательных бактерий - Escherihia coli ABl 157 (Е. coli ABl 157) госпитальный штамм раневых инфекций, полученный из музея НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; Escherihia coli К12

(E. coli К12) дикий тип из коллекции проф. Фредерика (США) и грамположительных бактерий - Staphylococcus albus (St. albus), полученный из музея кафедры микробиологии МГУ им М.В. Ломоносова.

Антибактериальную активность мазей, содержащих наночастицы меди, определяли на твердой питательной среде диффузионно-дисковым методом по зоне задержки роста клеток вокруг дисков с нанесенными на них наночастицами меди [Ruparelia J.P. et al„ 2008; Marius S. et al, 2011]. Фотографии чашек Петри обрабатывали на компьютере с использованием программы ImageJ для оценки диаметра зон задержки роста.

Изучение антимикробной активности наночастиц меди в жидкой питательной среде «М-9» оценивали по отношению абсорбции суспензии клеток в опытных образцах (с добавлением наночастиц меди) к абсорбции суспензии клеток в контроле (рост клеток без добавления суспензии наночастиц) [Биргер М.О., 1973]. Измерения проводили на спектрофотометре Hitachi Model 200-20 (Япония) при длине волны бЗОнм.

Параллельно с оценкой антимикробной активности наночастиц в жидкой питательной среде «М-9» проводили потенциометрическое измерение рН среды роста микробных клеток [ГФ XII, 2007]. Измерение проводили на рН-метре фирмы «Metrohm» модель 692 pH/Ion Meter (Германия).

Измерение рН мазей проводили потенциометрически. Для этого готовили водную вытяжку (1:10) [ГФ XII, 2007].

Микроскопические исследования образцов мази, содержащей наночастицы меди проводили на растровом электронном микроскопе Philips-515 (Голландия).

Для электроно-микроскопических исследований мази навеску мази растворяли в смеси толуола и этилового спирта (1:1). Отобранную пробу помещали на предметное стекло, после испарения растворителя исследуемый образец со стекла переносили на углеродный пластырь.

Оценку ранозаживляющего действия наночастиц меди в составе мази проводили на модели экспериментальных полнослойных ран. Под эфирным наркозом на спине у мышей выстригали шерсть, по трафарету наносили контуры раны (круг площадью 60 мм2), и вырезали полнослойный лоскут кожи. Все раны оставались открытыми вплоть до окончания опыта.

Мышам опытной группы сразу же после операции (а в дальнейшем ежедневно) на поверхность раны наносили 0,2 г мази с наночастицами меди. Мышам контрольных групп наносили 0,2 г мазевой основы без наночастиц металла или 0,2 г заводской мази «Солкосерил».

Контуры раны 1 раз в сутки переносили на прозрачные плёнки и сканировали на сканере HP Scanjet 3970 (Китай). Площадь раны рассчитывали с помощью компьютерной программы ImageJ 1.30 v.

Для формализации биологического ответа были рассчитаны площади ран в % по отношению к первоначальной ране [Gul N.Y., 2008]:

S раны е день п

S раны в день п е % ---WÜ

S раны в день операции

Для оценки эффективности лечения ран рассчитывали ежесуточное уменьшение площади ран в % [Кузин М.И., Костюченок Б. М.,1990].

(S-SJ-100

s'=

где: 9, - ежесуточное уменьшение площади ран, %/сутки;

S - величина площади раны при предшествующем измерении; S„ - величина площади раны в настоящий момент; t - число дней между первым и последующим измерением

Полученные результаты обрабатывали общепринятыми статистическими методами с помощью пакета статистических программ STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Определение антибактериальной активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

Антибактериальное действие меди и её соединений известно с древних времён [Родимин Е.М., 2003]. В фармации меди сульфат используют в качестве антисептического и вяжущего средства [Машковский М.Д., 2006]. Развитие современных нанотехнологий позволяет получать наноразмерные структуры, в том числе, и наночастицы металлов. Сравнительное исследование антимикробной активности наночастиц серебра, меди, цинка и алюминия показало, что металлы тормозят рост клеток Е. Coli В, и ряд токсичности элементов по мере убывания следующий: Cu>Ag>Zn>Al [Федоров Ю.И., Лебедев B.C., 1983]. Немногочисленные работы свидетельствуют о значении физико-химических характеристик наночастиц в проявлении антибактериальных свойств. Так, установлено, что при нагревании наночастиц серебра происходит их агрегация, уменьшение общего количества кислорода и снижение антибактериальной активности [Taylor P.L., et al, 2005]. Показано также, что наибольшее антибактериальное действие

оказывают наночастицы серебра в форме усечённого треугольника в отличие от других кристаллических форм частиц [Pal S., et al, 2007].

Наши исследования были направлены на изучение антимикробных свойств наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Изучение антибактериального действия наночастиц диффузионно-дисковым методом показало, что все изученные образцы обладают антибактериальной активностью в отношении клеток тест-культур как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов (рис. 1). Нами установлено, что существуют различия в эффективности действия наночастиц на рост микробных клеток. Показано, что наночастицы меди проявляют более выраженное антибактериальное действие в отношении грамположительных бактериальных клеток St. albus по сравнению с грамотрицательными клетками Е. coli ABl 157. Так, площадь зон задержки роста клеток тест-культур Г+ микроорганизмов St. albus при действии изученных образцов наночастиц меди на 11-31% больше, чем зона задержки роста клеток тест-культур Г" микроорганизмов Е. coli ABl 157. Видно, что наночастицы меди образцов № 1, 3, 4 (см. рис.1) практически одинаково воздействуют на клетки Е. coli AB 1157. В то же время ответ клеток St. albus на действие наночастиц разных образцов отличается. Так, зона задержки роста микробных клеток при действии наночастиц образца №3 на 16% больше, чем зона задержки роста при использовании наночастиц образца №1, и на 9% эффективнее, чем наночастицы меди образца №4.

1300,0

1200,0 .............................................. mm ....................................................

£ 1100,0

№ образца наночастиц меди

Рисунок 1. Площади зон задержки роста (мм2) клеток тест - культур St. albus и Е. coli ABl 157 при действии наночастиц образцов №1, №3, №4.

Нами изучено антимикробное действие наночастиц образца №1 в зависимости от их содержания в жидкой среде (М-9) на рост культуры клеток Е. coli К12.

Установлено, что при добавлении к культуре клеток Е. coli К12 наночастиц образца №1 в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл, через 48 часов инкубации не происходит изменения биомассы бактериальных клеток по сравнению с первоначальным уровнем (рис. 2). При добавлении наночастиц образца №1 в концентрации 0,5 мкг/мл, объем биомассы микробных клеток через 48 часов инкубации увеличивается на 24% по сравнению с первоначальным уровнем, что свидетельствует о бактериостатическом действии наночастиц образца №1 в данной концентрации. Показано, что наночастицы меди образца №1, введенные в культуральную среду в концентрации 0,1 мкг/мл, не изменяют уровень биомассы в опытной группе по сравнению с контролем.

Рисунок 2. Изменение биомассы Е. coli Kl2 (А630, О/К, %) через 48 часов при добавлении наночастиц меди образца №1 в различных концентрациях в питательной среде (М-9).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что антимикробное действие наночастиц меди зависит от их содержания: в концентрациях от 1 до 10 мкг/мл наночастицы меди образца №1 оказывают бактерицидное действие, в концентрации 0,5 мкг/мл - бактериостатическое, а при концентрации наночастиц 0,1 мкг/мл антимикробное действие не проявляется.

Для установления различий в проявлении антимикробной активности наночастиц, различающихся по дисперсности и фазовому составу проведены

сравнительные исследования наночастиц образцов №2 и №3. Показано, что в концентрации 0,2 мкг/мл через 48 часов инкубации с микробными клетками наночастицы образца №2 подавляют рост клеток Е. coli Kl2 на 65%, а образца №3 - на 45%.

Следовательно, наночастицы меди с разной дисперсностью и фазовым составом обладают различной антимикробной активностью по отношению клеток тест-культур Г+ и Г' микроорганизмов.

2. Определение токсикологических характеристик наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

Исследования, проведенные в нашей лаборатории, свидетельствуют о меньшей токсичности наночастиц металлов, в том числе и меди, введенных внутрибрюшинно, по сравнению с солями (Глущенко H.H., 1989, Богословская O.A., 2008]. При сравнительном изучении острой токсичности меди в виде наночастиц, размером 23,5 нм, и меди хлорида, введенных перорально, также установлено, что токсичность наночастиц по показателю ЛД50 в 3,7 раза меньше, чем токсичность соли. [Chen Z., 2006].

Изучение особенностей токсического действия наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, проводили с образцами №1, №2, №3. Кроме того, параллельно исследовали токсикологические характеристики меди сульфата. Критериями оценки острой токсичности служили показатели: МПД, ЛД50 и ЛДюо (таблица 2).

Таблица 2

Токсикологические показатели образцов наночастиц медн и меди сульфата

Дозы****

Образец меди МПД* ЛД50" ЛДюо""

мг/кг ммоль/кг мг/кг ммоль/кг мг/кг ммоль/кг

№ 1 10,0±1,2 0,157±0,019 15,0±1,0 0,236±0,016 30,0±2,5 0,472±0,039

№2 7,5±0,2 0,118±0,003 11,0±0,8 0,173±0,013 20,0±1,0 0,315±0,016

№3 5,0±1,0 0,079±0,016 13,0±0,8 0,205±0,013 20,0±1,0 0,315±0,016

C11SO4 •5Н20 1,5±0,2 0,024±0,003 3,5±0,6 0,055±0,009 7,0±0,7 0,110±0,0П

*МПД - максимально переносимая доза, максимальная доза, которая не вызывает гибель животных

**ЛД50 - доза, вызывающая 50 % гибель животных ***ЛД100 - доза, вызывающая 100 % гибель животных **** Дозы приведены в пересчете на металл.

Установлено, что изученные образцы наночастиц отличаются между собой по показателям токсичности. Например, МПД образца №3 в 2 раза ниже, чем МИД образца №1.

Установлено, что токсичность меди сульфата превосходит токсичность исследованных образцов наночастиц. Так, МПД для соли меди в 7 раз ниже, чем МПД образца №1, а ЛД50 и ЛД100 меди сульфата в 4,3 раза меньше данных показателей для образца №1, что свидетельствует о более высокой токсичности ионной формы меди.

Следует также отметить, что в рамках проведенных нами исследований наблюдается тенденция в увеличении токсичности по мере уменьшения размеров наночастиц. Так, ЛД50 образца №2 размером 47 нм на 15,4% ниже, чем ЛД50 образца №3 размером 86 нм, и на 26,7 % ниже ЛД50 образца №1 размером 103 нм (рис.3).

11 ■ ЩШж ■<ящ

13 ■ s

11 JJII

11 ; ■ ||

10 ■HB

У Р л"'

103 86 47

Размер наночастиц, нм

Рисунок 3. Диаграмма зависимости ЛД50 образцов наночастиц меди от их

размера.

3. Лабораторная технологическая схема получения мази с наночастицами меди, её состав и доказательство подлинности

Одной из актуальных проблем современной технологии, учитывая постоянный рост резистентности бактерий к действию сульфаниламидных препаратов, антибиотиков, антисептиков, является поиск агентов, компонентов или факторов, обеспечивающих антимикробное действие. В настоящее время в качестве антимикробных агентов могут выступать различные вещества органической и неорганической природы. Однако использование антимикробных агентов той или иной природы в медицине и фармации ограничено их безопасностью. В этом отношении более предпочтительны неорганические соединения, особенно эссенциапьные металлы и их композиции, к которым относится медь. Исследования, представленные выше, показали, что наночастицы меди, с одной стороны, обладают слабой токсичностью, с другой стороны, проявляют высокий

антимикробный эффект по отношению к клеткам тест-культур Г+ и Г микроорганизмов, что создает предпосылки для использования их в составе ранозаживляющих препаратов.

В связи с этим, при проведении дальнейших разработок мягких лекарственных форм с наночастицами меди нами был проведен выбор компонентов мази с учетом особенностей реакционной способности наночастиц металлов и разработана лабораторная технологическая схема получения мази.

Основная идея, положенная в основу создания мягкой лекарственной формы с наночастицами меди, является формирование двухфазной системы, состоящей из гидрофильной части (для лучшей сорбции мази на поверхности ран) и гидрофобной, в которой распределены наночастицы меди. В качестве гидрофильной основы выбран 4% гель метилцеллюлозы, который способствует полному и равномерному высвобождению лекарственных веществ, адсорбирует раневой экссудат, обладает низкой токсичностью и является гипоаллергенным [Блатун Л.А., 2002; Панкрушева Т.А., 1995; Тенцова А.Н., Алюшин М.Т., 1985]. В качестве гидрофобной фазы использовано вазелиновое масло, благодаря которому достигается равномерное распределение наночастиц металла, предотвращается агрегация частиц, их растворение, окисление и взаимодействие с другими компонентами мази. Это позволяет сохранить высокую реакционную способность наночастиц меди в составе мази.

Учитывая вышеописанные подходы в создании мази с наночастицами меди, была разработана лабораторная технологическая схема приготовления мази, представленная на рис. 4. Технология получения мази включает три этапа: 1-й этап - приготовление геля метилцеллюлозы; 2-й этап -приготовление вазелиновой суспензии наночастиц меди и 3-й этап - введение вазелиновой суспензии наночастиц в гель метилцеллюлозы.

Рисунок 4. Лабораторная технологическая схема производства мази на метилцеллюлозе с накочастицами меди.

На основании разработанной нами лабораторной технологической схемы были получены мази, состав которых представлен в таблице 3.

Таблица 3

Состав мазей на метилцеллюлозе с наночастицами меди

Компонент Масса, г

Наночастицы меди 0,02-0,0002

Вазелиновое масло 15,0

МЦ-100 4,0

Твин-80 3,0

Нипагин од

Вода 77,9

Конечный продукт представляет собой мазь белого цвета со слабым специфическим запахом. Для контроля качества мази определяли её однородность и рН. Установлено, что приготовленная мазь однородна по составу и не содержит механических включений. рН полученной мази находится в пределах 6,5 - 6,9, что близко к физиологическому значению рН кожи. Через год хранения органолептические показатели мази не изменились, рН мази составлял 6,8-6,9.

Для дальнейших исследований ранозаживляющих свойств разработанной нами мази, необходимо было убедиться в присутствии наночастиц меди в ее составе. Для этого мы использовали метод сканирующей электронной микроскопии. Исследования, проведенные методом сканирующей электронной микроскопии, позволили установить присутствие наночастиц меди в составе мази. На рисунке 5 представлено СЭМ-изображение наночастиц меди образца №1 до введения в состав мази (А) и наночастицы меди в составе мази (В) - видны агломераты компонентов мази с наночастицами меди на переднем плане. Проведенные исследования свидетельствуют о возможности использования метода сканирующей электронной микроскопии для доказательства подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами металлов.

Рисунок 5. СЭМ-изображение наночастиц меди в образце №1 (А) и их распределение в мази (В).

4. Исследование антимикробной активности мази, содержащей наночастицы меди

Приготовленная мазь по разработанной нами схеме, содержащая наночастицы меди, была исследована на антимикробную активность диффузионно-дисковым методом. Результаты представлены в таблице 4.

Показано, что мазь, содержащая наночастицы меди образца №5 обладает антимикробной активностью в отношении клеток тест-культур Г и Г" микроорганизмов. При этом мазь, содержащая наночастицы меди, также как и сами наночастицы меди, оказывают наиболее выраженное антибактериальное действие в отношении клеток тест-культуры St. albus.

Следует отметить, что величины зон задержки роста клеток тест-культуры St. albus при действии мази с наночастицами меди меньше по сравнению с зонами задержки роста при воздействии образцов нанопорошков меди. Это связано не с потерей активности наночастиц в составе мази, а с разницей действующей концентрации наночастиц в составе образца мази и самого порошка, помещенных на чашку Петри. Сравнение

антимикробной активности разработанной нами мази с наночастицами меди с антимикробным действием эталона сравнения - заводской мази «Солкосерил», показало сопоставимые результаты (табл. 4).

Таблица 4

Площади зон задержки роста (мм2) тест-культур St. albus и E.coli AB 1157 при действии мази с наночастицами меди образца №5

Образцы Зона задержки роста St. albus, мм2 Зона задержки роста E.coli AB 1157, мм2

Мазь с наночастицами меди 72,8 ± 19,8 28,5 ±0,9

Эталон сравнения - мазь «Солкосерил» 120,5 ±5,2 125,7 ±8,4

Следовательно, разработанная и созданная нами мазь с наночастицами меди проявляет антибактериальную активность, сопоставимую с действием заводской мази «Солкосерил».

5. Ранозаживляющее действие мазей с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу

Оценку ранозаживляющего действия наночастиц меди в составе мази проводили на модели экспериментальных полнослойных ран.

Для определения концентрации, оптимально влияющей на процессы ранозаживления, нами были приготовлены мази с различным содержанием наночастиц образца №5 (0,02%, 0,002%, 0,0002%). Установлено, что мазь, содержащая наночастицы меди в концентрации 0,002%, проявляет наиболее выраженную контракцию раны в первые двое суток после операции по сравнению с контролем и другими исследуемыми концентрациями. Поэтому при исследовании ранозаживляющих свойств мазей, содержащих наночастицы меди с разной дисперсностью и фазовым составом, нами была выбрана концентрация 0.002%. Контролем служили животные, леченные мазевой основой, и животные, леченные заводской мазью «Солкосерил».

Нами установлено, что мази с наночастицами меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу проявляют ранозаживляющие свойства, эффективность которых разная (рис. 6).

Сутки

Рисунок 6. Кривые изменения площади ран животных в процессе ранозаживления при лечении мазевой основой (♦), мазью с наночастицами меди образца № 1 (■), мазью с наночастицами меди образца № 4 заводской мазью «Солкосерил» (•).

Видно, что наиболее эффективное действие на процесс заживление ран оказывают мази с наночастицами меди образцов №1 и №4 по сравнению с мазевой основой (без наночастиц металла) и заводской мазью «Солкосерил».

При сравнении эффективности ранозаживления исследуемых мазей с заводской мазью «Солкосерил» показано, что в группе животных, леченных мазью, содержащей наночастицы образца №1, происходит статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки; а в группе животных, леченных мазью с наночастицами образца №4, на 1-е, 9-е и 11-е сутки. По сравнению с мазью «Солкосерил» мази с наночастицами образцов №1 и №4 на 1-е сутки уменьшают площадь ран в среднем на 15%. Мазь с наночастицами образца №1 сокращает площадь раневой поверхности на 5-е сутки на 17,5%, а на 7-е сутки на 14,7% по сравнению с «Солкосерилом». На 9-е сутки площади ран при лечении мазями с наночастицами образцов №1 и №4 -на 15,6% и 14,5% меньше, чем в группе животных, леченных мазью «Солкосерил» соответственно. На 11-ые сутки раны животных, леченных мазями с наночастицами образцов №1 и №4, полностью зажили в отличие от животных, леченых мазью «Солкосерил», у которых на эти сроки течения раневого процесса площадь раневой поверхности составляла 6,3%.

При сравнении площадей ран животных, леченных мазью с наночастицами образца №1 и мазевой основой (без наночастиц металла), установлено статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е , 9-е и 11-е сутки по сравнению с группой животных, леченных мазевой основой.

Лечение ран мазью с наночастицами меди образца №4 вызывает статистически достоверное уменьшение площади раневой поверхности на 1-е, 3-е, 5-е, 9-е и 11-е сутки - по сравнению с группой животных, леченных мазевой основой.

При лечении животных мазями с наночастицами меди образца №2 и №3 статистически достоверно уменьшаются площади ран на 1-е и 9-е сутки по сравнению с животными, леченными мазевой основой.

Для оценки эффективности лечения нами было рассчитано ежесуточное уменьшение площадей ран (в %) при воздействии мазей с наночастицами меди образцов №1 и №4 и заводской мази «Солкосерил» [Кузин М.И., Костюченок Б. М.,1990]. Результаты приведены на рисунке 7.

Рисунок 7. Ежесуточное уменьшение площади ран (в %) при лечении мазями с наночастицами меди образцов №1 и №4 и заводской мазью «Солкосерил».

Видно, что для всех мазей наибольшее ежесуточное уменьшение площади ран наблюдается на 1-е сутки, меньшее на 9-е и 11-е сутки, наименьшее - на 5-е сутки.

Несмотря на общую тенденцию в ежесуточном снижении площадей ран, этот показатель при лечении мазями с наночастицами металлов выше, чем при лечении заводской мазью «Солкосерил». Проведенная нами оценка также подтверждает большую эффективность ранозаживляющего действия мазей с наночастицами меди образцов №1 и №4 по сравнению с заводской мазью «Солкосерил».

Анализ показателя полного заживления ран показал, что полное заживление ран в группах, леченных заводской мазью «Солкосерил» и мазью с наночастицами меди образца №5 происходит на 15-е сутки. В группах животных, леченных мазями с наночастицами меди образцов №2 и №3 полное заживление ран происходит на 14-е сутки, также как в контрольной группе не леченых животных и в группе животных, леченных мазевой основой. В группах животных, леченых наночастицами меди образцов №1 и №4, полное заживление ран происходит на 11-е сутки (рис.8).

15 (

U К

11 10

1 2 3

Рисунок 8. Время (сут.) полного заживления ран животных при лечении: (1) мазями с наночастицами меди образца №1 и №4;

(2) мазевой основой и мазями с наночастицами образца №2 и №3;

(3) мазью «Солкосерил» и мазью с наночастицами образца №5.

Следовательно, созданные нами мази, содержащие наночастицы меди, помимо антимикробных свойств, проявляют ранозаживляющую активность. Ранозаживляющая активность мазей с наночастицами меди образцов №1 и №4 превосходит по эффективности мази с наночастицами меди образцов №2, №3 и мазь заводского изготовления «Солкосерил». Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования наночастиц меди в составе ранозаживляющих мягких лекарственных форм.

9§Щ И

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. В настоящей работе показана возможность создания мягких лекарственных форм с наночастицами металлов на примере меди с сохранением их высокореакционной активности в составе мази. Предложен метод подтверждения подлинности мягких лекарственных средств с наночастицами металлов - метод сканирующей электронной микроскопии. Проведенные модельные эксперименты показали, что разработанные нами мази с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, обладают ранозаживляющим и антибактериальным действием, проявляя разную эффективность. Установлено, что токсичность всех исследованных наночастиц ниже токсичности меди в ионной форме.

Изложены теоретические и практические подходы к созданию мягкой лекарственной формы наночастицами меди - мази, обладающей антимикробными и ранозаживляющими свойствами. Методом сканирующей электронной микроскопии подтверждено наличие наночастиц меди в составе созданных нами мазей.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что наночастицы меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу, обладают антимикробной активностью в отношении клеток тест-культур грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

2. Показано, что по показателям острой токсичности наночастицы меди с разной дисперсностью и фазовым составом различаются между собой и менее токсичны по сравнению с меди сульфатом.

3. Разработан состав мягкой лекарственной формы - мази с наночастицами меди с различной дисперсностью и фазовым составом и создана лабораторная технологическая схема её получения.

4. Установлено, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробной активностью.

5. Показано, что образцы наночастиц меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу, обладают разной ранозаживляющей активностью.

6. Предложено для доказательства подлинности мягких лекарственных средств с наночастицами меди использовать сканирующую электронную микроскопию образцов мази.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ранозаживляющие свойства наночастиц меди. Рахметова A.A., Алексеева Т.П. // Итоговая конференция студенческого научного общества медицинского факультета Российского Университета дружбы народов "Клинические и теоретические аспекты современной медицины": Материалы конференции. - Москва, 2008. - С. 100-101.

2. Изучение биологической активности наночастиц меди. Рахметова A.A.. Алексеева Т.П., Байтукалов Т.А., Богословская O.A. // VII международная научная конференция студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии": Материалы конференции. - Москва, 2008. - С. 33.

3. Новый класс ранозаживляющих препаратов на основе наночастиц меди. Рахметова A.A., Алексеева Т.П., Богословская O.A., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Лейпунский И.О., Глущенко H.H. // II Международная научная конференция "Физико-химические основы формирования и модификации микро- и наноструктур": Материалы конференции. - Харьков, 2008. - Т.2, С. 366.

4. Исследование ранозаживляющей активности наночастиц меди. Рахметова A.A.. Алексеева Т.П., Богословская O.A., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Лейпунский И.О., Глущенко H.H. И V Международный междисциплинарный симпозиум "ФиПС-08 Прикладная синергетика в нанотехнологиях": Материалы симпозиума. - Москва, 2008. - С. 388.

5. Наночастицы меди - антимикробные агенты. Рахметова A.A.. Богословская O.A., Овсянникова И.П., Лейпунский И.О., Байтукалов Т.А., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Глущенко H.H. // II Санкт-Петербургский Международный экологический форум "Окружающая среда и здоровье человека": Материалы форума. - Санкт-Петербург, - 2008 - с.24.

6. Ранозаживляющая активность наночастиц меди с разными физико-химическими характеристиками O.A. Богословская, A.A. Рахметова, Т.П. Алексеева, Т.А. Байтукалов, И.П. Ольховская , H.H. Глущенко, И.О. Лейпунский, А.Н. Жигач, Е.С. Зотова, О.М. Жигалина, В.В.Артемов // Материалы VIII Всероссийской конференции «Физико-химия ультрадисперсных (нано-) систем. (10-14 ноября г. Белгород). М.МИФИ.с.267-268.

7. Токсичность наночастиц меди с различными физико-химическими характеристиками. Богословская O.A., Алексеева Т.П., Рахметова A.A.. Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Глущенко H.H. // Материалы Всероссийского совещания судебно-медицинских экспертов по применению правил и медицинских критериев определения степени тяжести вреда, причиненного здоровью человека и Итоговой научно-практической конференции Российского центра судебно-медицинской экспертизы. -Москва, 2008. - С. 256.

8. Наночастицы меди - адаптогенный фактор при заживлении экспериментальных ран. Рахметова A.A., Алексеева Т.П., Богословская O.A., Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Глущенко H.H. // Материалы XIV Международного симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации". - Москва, 2009 г.

9. Регенерирующее действие мази с наночастицами меди. Рахметова A.A.. Алексеева Т.П., Богословская O.A., Жигач А.Н., Лейпунский И.О.,

Ольховская И.П., Глушенко H.H. // Материалы XVI Российского национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2009 г. - С. 724.

10. Влияние модификации наночастиц меди на их антибактериальную активность и электростатические свойства внешней мембраны клеток E.coli. Володина Л.А., Богословская O.A., Рахметова A.A.. Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Алексеева Т.П., Овсянникова М.Н., Ольховская И.П., Глущенко H.H. // Аннотации докладов XXI симпозиума «Современная химическая физика». -Туапсе, 2009 г.-С. 58.

11. Новые ранозаживляющие средства на основе наночастиц меди. Рахметова A.A.. Богословская O.A., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Лейпунскии И.О., Глущенко H.H. // Материалы международной научной конференции по вопросам состояния и перспективам развития медицины в спорте высших достижений «СпортМед- 2009». - Москва, 2009 г.С.196-197.

12. Ранозаживляющие свойства нового поколения на основе наночастиц меди Рахметова A.A.. Богословская O.A., Ольховская И.П., Алексеева Т.П., Лейпунскии И.О., Глущенко H.H. // Сборник трудов X Международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке: инновационные технологии в биологии и медицине 2009». - Москва, 2009 г, С.299-300.

13. Влияние наночастиц меди- компонентов твердых частиц дымовых уносов тепловых электростанций на бактериальные клетки. Богословская O.A., Володина Л.А., Лейпунский И.О., Жигач А.Н., Алексеева Т.П., Рахметова A.A.. Овсянникова М.Н., Ольховская И.П., Глущенко H.H. // Известия АН. Энергетика. - 2010. - №2. - С. 105-112.

14. Изучение распределения наночастиц металлов в тканях и мазях методами сканирующей электронной микроскопии. Богословская O.A., Рахметова A.A., Глущенко H.H., Галашина В.Н., Жигач А.Н., Березкина Н.Г., Зотова Е.С., Пшеченков П.А., Лейпунский И.О. // IX Всероссийская конференция «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем»: Сборник трудов. -Ижевск.-2010,-С.167-168.

15. Влияние одного из компонентов твердых частиц дымовых уносов тепловых электростанций (наночастиц меди) на рост бактериальных клеток. Богословская O.A., Овсянникова М.Н., Рахметова A.A., Глущенко H.H. // Сборник материалов конференции «XXIV Любищевские чтения». -Ульяновск. - 2010.-С. 282-286.

16. Ранозаживляющие препараты на основе наноструктурных материалов органической и неорганической природы. Алексеева Т.П., Богословская O.A., Рахметова A.A.. Левов А.Н., Ильина A.B., Варламов В.П., Глущенко H.H. // IV Международная научная конференция «Физико-химические основы формирования и модификации микро- и наноструктур» ФМНН2010: Материалы конференции. - Харьков. - 2010. С.270-273.

17. Ранозаживляющие свойства наночастиц меди в зависимости от их физико-химических характеристик. Рахметова A.A. Алексеева Т.П., Богословская O.A., Лейпунский И.О., Ольховская И.П., Жигач А.Н., Глущенко H.H. // Российские нанотехнологии. -2010. - Т.5. - № 3-4. - С. 102-107.

18. Патент «Препарат, ускоряющий заживление ран» per. № 2010126761/15(038118). - положительное решение о выдаче патента на изобретение 14.07.2011

Рахметова Алла Александровна (Россия) Изучение биологической активности ианочастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

В работе представлены результаты исследования биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу. Показано, что наночастицы меди обладают антибактериальной активностью в отношении клеток тест-культур Г* и Г микроорганизмов, эффективность которой зависит от вида клеток, от концентрации наночастиц меди и их физико-химических характеристик. На модели острой токсичности установлено, что наночастицы меди, различающиеся по дисперсности и фазовому составу имеют различные токсикологические характеристики, токсичность всех исследованных наночастиц ниже токсичности меди в ионной форме. Изложены теоретические и практические подходы создания мягкой лекарственной формы - мази, содержащей наночастицы меди. В модельных экспериментах доказано, что созданные мази с наночастицами меди обладают антибактериальной и ранозаживляющей активностью. Метод сканирующей электронной микроскопии предложен для определения подлинности мягких лекарственных форм с наночастицами металлов.

Alia A. Rakhmetova (Russia) Studying of biological activity of copper nanoparticles of various dispersion and phase structure

In the present work results of research of biological activity of copper nanoparticles of various dispersion and phase structure are presented. It was shown, that copper nanoparticles manifest antibacterial activity against gram-positive and gram-negative microorganisms, which efficiency depends on the microbial species, concentrations of copper nanoparticles and their physicochemical characteristics. On model of acute toxicity it was demonstrated, that copper nanoparticles of various dispersion and phase structure have the various toxicological characteristics, toxicity of all examined copper nanoparticles are less then toxicity of copper ionic form (CuS04-5H20). The theoretical and practical approaches of the creation of soft medicinal form - the ointment, containing copper nanoparticles are stated. In modeling experiments it is proved, that the created ointments with copper nanoparticles manifest antibacterial and wound healing activity. The method of scanning electronic microscopy is offered for definition of authenticity of soft medicinal forms with the metal nanoparticles.

Подписано в печать: 17.09.11

Объем: 1,5 усл.пл. Тираж: 100 экз. Заказ № 477 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул.Рождественка, 5/7,стр.1 (495)978-43-34; www.reglet.ru

Оглавление диссертации Рахметова, Алла Александровна :: 2011 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Нанотехнологии и наномедицина

1.2. Наночастицы - переносчики лекарств

1.3. Использование наночастиц в медицинской диагностике

1.4. Биологическая активность наночастиц металлов

1.5. Роль меди в организме

1.6. Медьсодержащие лекарственные средства, используемые в медицине

1.7. Токсичность наночастиц

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Биологические объекты

2.4. Методы исследования

2.4.1. Определение токсикологических характеристик наночастиц меди

2.4.2. Оценка антимикробной активности наночастиц меди и мазей с наночастицами меди на твёрдой питательной среде диффузионно-дисковым методом

2.4.3. Микробиологический метод оценки антимикробной активности наночастиц меди в жидкой питательной среде «М-9»

2.4.4. Определение рН жидкой питательной среды роста микробных клеток «М-9» при введении наночастиц меди

2.4.5. Определение рН мазей

2.4.6. Электронно-микроскопическое исследование мази, содержащей наночастицы меди

2.4.7. Метод изучения ранозаживляющего действия наночастиц меди в составе мази на модели экспериментальных полнослойных ран

2.4.8. Статистическая обработка экспериментальных данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

3.1. Определение токсикологических характеристик наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

3.2. Определение антибактериальной активности ■ наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу

3.3. Лабораторная технологическая схема получения мази с наночастицами меди, её состав и доказательство подлинности

3.4. Исследование антимикробной активности мазей, содержащих наночастицы меди в различных концентрациях

3.5. Ранозаживляющее действие мазей с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Рахметова, Алла Александровна, автореферат

Актуальность работы:

В "настоящее время продолжается поиск оптимальных методов стимуляции заживления ран, ожогов, трофических язв. Местное консервативное лечение с использованием мазей, гелей, повязок, линиментов, играет важную роль в комплексной терапии поражений кожи и сокращает сроки заживления ран [39].

Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств, в том числе, и обладающих ранозаживляющим действием, является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. Установлено, что наночастицы металлов, обладают физико-химическими свойствами, отличающимися, как от свойств массивных металлических объектов, так и от свойств отдельных атомов. При попадании в живые организмы наноразмерные частицы металлов вызывают биологический ответ, отличающийся от действия традиционной ионной формы элементов. Показано, что наночастицы d-элементов при парентеральном введении в 7-50 раз менее токсичны, чем металлы в ионной форме. Наночастицы легко проникают во все органы и ткани и обладают пролонгированным действием. В биотических дозах они стимулируют обменные процессы и проявляют многофункциональное действие [13,14,15].

В США для лечения ран, ожогов, трофических язв, экземы, угревой сыпи широко используют повязки торговых марок Асйсоаі:, ІЧисгузІ, в состав которых входят наночастицы серебра [35,36]. В то же время в практике лечения ран разной этиологии сохраняется высокая потребность в мягких лекарственных формах. В связи с этим наши разработки направлены на создание мягких лекарственных форм, включающих наночастицы металлов, в частности, наночастицы меди. Функция меди в организме хорошо изучена и доказана абсолютная её необходимость на всех стадиях течения раневого процесса.

В связи с этим целью настоящего исследования изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу, для создания мягкой лекарственной формы.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

3. Разработать состав мази с наночастицами меди и лабораторно-технологическую схему ее получения.

Положения, выносимые на защиту:

3. Состав разработанной мягкой лекарственной формы и лабораторно-технологическая схема ее получения.

5. Антимикробная активность мази с наночастицами меди.

6. Контроль качества мазей с наночастицами меди по показателю «определение подлинности».

Научная новизна:

Впервые создана мягкая лекарственная форма - мазь с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу, и разработана лабораторная технологическая схема её получения.

Впервые показано, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробными свойствами.

Практическая значимость работы:

Приняты к утверждению два патента на изобретение:

Антимикробные агенты» per. № 2010127540/15(039207) дата поступления 06.07.2010; «Препарат, ускоряющий ранозаживление» per. № 2011116961/15(025153) дата поступления 28.04.2011. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Препарат, ускоряющий заживление ран» per. № 2010126761/15(038118) 14.07.2011

Диссертационная работа выполнена в Институте энергетических проблем химической физики РАН в Лаборатории биологического v воздействия наноструктур в соответствии с планами научно-исследовательских работ - Гос. регистрация № 01120 807829 (2008-2012). Работа поддержана Грантами РФФИ № 07-08-00376, № 07-04-12200, № 0904-13625.

Апробация работы:

2009), XIV Международном симпозиуме "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 2009), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), XXII симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2010).

Публикации:

По материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ, из них З в журналах списка ВАК и 1 патент.

Объем и структура диссертации:

Заключение диссертационного исследования на тему "Изучение биологической активности наночастиц меди, различающихся по дисперсности и фазовому составу"

выводы

4. Установлено, что мазь с наночастицами меди обладает антимикробной активностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из перспективных направлений создания новых лекарственных средств является использование наноматериалов в составе лекарственных форм. В настоящей работе показана возможность создания мягких лекарственных форм с наночастицами металлов на примере меди с сохранением их высокореакционной активности в составе мази. Предложен метод подтверждения подлинности мягких лекарственных средств с наночастицами металлов - метод сканирующей электронной микроскопии. Проведенные модельные эксперименты показали, что разработанные нами мази с наночастицами меди, различающимися по дисперсности и фазовому составу обладают ранозаживляющим и антибактериальным действием, проявляя разную эффективность. Установлено, что токсичность всех исследованных наночастиц ниже токсичности меди в ионной форме.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2011 года, Рахметова, Алла Александровна

1. Абаев Ю.К. Справочник хирурга. Раны и раневая инфекция. Ростов н/Д: Феникс. 2006. 427 с.

2. Алфимов М.В., Гохберг Л.М., Фурсов К.С. Нанотехнологии: определения и классификация // Российские нанотехнологии. 2010. №7-8. С. 8-16.

3. Арсентьева И.П., Зотова Е.С., Фолманис Г.Э., и др. Аттестация наночастиц металлов, используемых в качестве биологически активных препаратов // Нанотехника. 2007. № 2. С. 72-76.

4. Бабушкина И.В., Бородулин В.Б., Коршунов Г.В., Пучиньян Д.М. Изучение антибактериального действия наночастиц меди и железа на клинические штаммы Staphylococcus aureus // Саратовский научно-медицинский журнал. 2010. Том 6. №1. С.11-14.

5. Байтукалов Т.А., Лобаева Т.А., Глущенко Н.Н., и др. Исследование регенерирующей активности ультрадисперсного порошка магния в составе лекарственных форм // Вестник РУДН, серия Медицина, 2004. №1(25). С. 20-26.

6. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.: Изд-во иностранной литературы. 1962. 260 с.

7. Блатун Л.А. Возможности современных мазей в лечении гнойных ран, пролежней, трофических язв // Фармацевтический вестник. 2002. № 3. С. 18-19.

8. Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств. Том 1. М.: Ремедиум. 2001. 354 с.

9. Ващенко В.И., Ващенко Т.Н. Церулоплазмин от метаболита до лекарственного средства // Психофармакология и биологическая наркология. 2006. Т.6. №.3. С. 1254-12691

10. Ю.Водовозова Е.Л., Кузнецова Н.Р., Кадыков В.А., и др. Липосомы как нано-носители липидных конъюгатов противоопухолевых агентовмелфалана и метотрексата // Российские нанотехнологии. 2008. Т.З. №3-4. С. 162-172.

11. П.Ген М.Я., Миллер A.B. // Авторское свидетельство СССР №814432. Бюллетень изобретений. 1981. №11. С.25.

12. Глушкова A.B., Радилов A.C., Рембовский В.Р. Нанотехнологии и нанотоксикология взгляд на проблему // Токсикологический вестник. 2007. № 6. С. 4-8.

13. Глущенко H.H. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов: Дисс. . докт. биол. Наук / Институт химической физики АН СССР. М., 1988. 464 с.

14. Глущенко H.H., Богословская O.A., Ольховская И.П. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Химическая физика. 2002. Т. 21(4). С. 79-85.

15. Глущенко H.H., Ольховская И.П., Плетенева Т.В., и др. Биологическое действие высокодисперсных порошков металлов // Изв. АН СССР. Серия биологическая. 1989. № 3. С. 415-422.

16. Глущенко H.H., Скальный A.B. Токсичность наночастиц цинка и его биологические свойства // Актуальные проблемы транспортной медицины. 2010. №3(21). С. 118-121.Технология лекарственных форм / под ред. Т.С. Кондратьевой. М.: Медицина. 1991.496 с.

17. XII Государственная Фармакопея Российской Федерации. Часть 1. М. 2007. 684 с.

18. ГОСТ 3164-78 «Масло вазелиновое медицинское».

19. Додонов М. Апологетика парабенов (Зачем нужны парабены?) // Профилактика today. 2010. №12. С.22-24.

20. Жигач А.Н., Лейпунский И.О., Кусков M.JT., и др. Установка для получения и исследования физико-химических свойств наночастицметаллов // Приборы и техника эксперимента. 2000. №6. С. 122-129.106

21. Кобаяси Н. Введение в нанотехнологию. М.: Бином. Лаборатория знаний. 2008. 134 с.

22. Коваленко Л.В., Павлов Г.В., Фолманис Г.Э. и др. Биологическое действие ультрадисперсных порошков железа низкотемпературного водородного восстановления //Перспективные материалы. 1998. № 3. С. 62-67.

23. Куракина B.C., Медведева О.М., Дмитриенко С.Г., Шпигун O.A. Определение парабенов в косметической продукции методом капиллярного зонного электрофореза // Вестник Московского Университета, серия химия. 2004. Т.45. №2. С. 124-130.

24. Кухтина E.H., Глущенко H.H., Федоров Ю.И., и др. Влияние мелкодисперсного порошка железа на физико-химические характеристики липидов печени мышей // Биохимия. 1982. Т. 47(4). С. 678-685.

25. Лебедев B.C., Володина Л.А., Дейнега Е.Ю., Федоров Ю.И. Структурные изменения поверхности бактерий Escherichia coli и медьиндуцированная проницаемость плазматической мембраны // Биофизика. 2005. №1. С. 107-113.

26. Мартынова С.Н., Зовский В.Н. Метаболические эффекты меди и кобальта//Експериментальна i юишчна медицина. 2010. №2. С. 4249.

27. Михайлов Г. А., Васильева О.С. Технология будущего: использование магнитных наночастиц в онкологии // Бюллетень СО РАМН. 2008. №3 (131). С.18-22.

28. Пальцев М.А. Нанотехнологии в медицине и фармации // Ремедиум. 2008. №9. С. 6-12.

29. Панкрушева Т.А. Экспериментально-теоретическое обоснование создание мягких ЛФ на полимерных основах производных целлюлозы: Дисс. . докт. фарм. наук. Курск. 1995. 432 с.

30. Патент WO 2004/037187 МПК 7 А61К 9/00, 9/14, 31/28, 33/38. Metal-containing materials, compositions and methods / J.B. Wright, K. Lam, H.Q. Yin et al. // 06.05.2004.

31. Патент USA 6939568 МПК 7 A6K 33/00, 33/24. Treatment of inflammatory skin conditions / R.E. Burrell, H.Q. Yin // 06.09.2005.

32. Полимеры в фармации / под редакцией Тенцовой А.Н., Алюшина М.Т. М.: Медицина. 1985. 256 с.

33. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Об утверждении и внедрении методических рекомендаций «Оценка безопасности наноматериалов»» №280 от 12.10.2007.

34. Раны и раневая инфекция: Руководство для врачей / Под ред. М. И. Кузина, Б. М. Костюченок. М.: Медицина. 1990. 592 с.t

35. Рахметова A.A., Алексеева Т.П., Богословская O.A., и др. Ранозаживляющие свойства наночастиц меди в зависимости от их физико-химических характеристик // Российские нанотехнологии. 2010. Т.5. №3-4. С. 102-107.

36. Родимин Е.М. Приготовление целебных медно-серебряных растворов и металлоионотерапия. М.:Рем. 2003. 144 с.

37. Синяева M.JI., Васильченко С.Ю., Волкова А.И., и др. Использование наночастиц фталоцианина алюминия для детектирования микроповреждений эмали зубов // Российские нанотехнологии. 2007. Т.2, №11-12. С.58-63.

38. Тенцова А.И., Грецкий В.М. Современные аспекты исследования и производства мазей. М.: Медицина. 1980. 192 с.

39. Фадеев В.В. Редакционные материалы // Проблемы эндокринологии. 2002. Т. 48. № 3. С. 47-48.

40. Фаткуллина Л.Д.,. Глущенко Н.Н, Коссова Г.В., и др. Стимуляция синтеза ДНК и белка высокодисперсным порошком цинка // Изв. АН СССР. Серия биологическая. 1984. №1. С. 130-133.

41. Федоров Ю.И., Бурлакова Е.Б., Ольховская И.П. К вопросу о возможности применения высокодисперсных порошков металлов для введения в организм животных // Докл. АН СССР. 1979. Т. 248. №5. С. 1277.

42. Федоров Ю.И., Глущенко H.H., Дупин A.M., и др. Изучение влияния высокодисперсного порошка железа на процесс регенерации печении после частичной гепатэктомии // Изв. АН СССР. Серия биологическая. 1982. №6. С. 948-951.

43. Федоров Ю.И., Володина Л.А., Кузовникова Т.А., Лебедев B.C. Сравнительное изучение влияния металлов Ag, Си, Zn, AI в виде высоко дисперсного порошка и соли на рост Escherichia coli // Известия АН СССР, серия биологическая. 1983. № 6. С. 948-950.

44. Филатов Л.Б. Дефицит меди как гематологическая проблема // Клиническая онкогематология. 2010. №1. С. 1-11.

45. Химический энциклопедический словарь / Гл. ред. И.Л. Кнунянц. М.: Советская энциклопедия, 1983.

46. Azzazy Н.М., Mansour М.М., Kazmierczak S.C. From diagnostics to therapy: prospects of quantum dots // Clin Biochem. 2007; V. 40. P. 917927.

47. Bawarski W.E., Chidlowsky E., Bharali D.J., Mousa S.A. Emerging nanopharmaceuticals // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2008. V. 4, Issue 4. P. 273-282.

48. Canapp S.O., Farese J.P., Schultz G.S. The effect of topical tripeptide-copper complex on healing of ischemic open wounds // Vet Surg. 2003. V.32(6). P. 515-23.

49. Chang H., Leung H. Evaluation of Antibacterial Activities of Zinc Oxide-Titanium Dioxide Nanocomposites Prepared by Sol-Gel Method // Nanotech. 2008.

50. Chen Z., Meng H., Yuan H. et al. Identificatio of target organs of copper nanoparticles with ICP-MS technique // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2007. Vol. 272. №3. P. 599-603.

51. Chen Z., Meng H., Xing G. et al. Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo // The journal of physical chemistry. Toxicology letter. 2006. V. 163. P.109-120.

52. Cheng Y., Wang J., Rao T. et al. Pharmaceutical applications of dendrimers: promising nanocarriers for drug delivery // Front Biosci. 2008. V.13. P. 1447-1471.

53. Chithrani B.D., Ghazani A.A., Chan W. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells // Nano Lett. 2006. V. 6. P. 662-668.

54. Chithrani B.D, Chan W. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes // Nano Lett. 2007. V. 7. P. 1542-1550.;

55. Cioffi N., Torsi L., Ditaranto N., et al. Copper Nanoparticle/Polymer Composites with Antifungal and Bacteriostatic Properties // Chemistry of Materials. 2005. Vol.17. №21. P. 5255 -5262.

56. Elechiguerra J.L., Burt J.L., Morones .JR., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV-1 // Journal of Nanobiotechnology. 2005. V.3. №6.

57. Esteban-Cubillo A., Pecharroman C., Aguilar E., Santaren J., Moya J.S. Antibacterial activity of copper monodispersed nanoparticles into sepiolite // Journal of Materials Science. 2006. Vol. 41. № 16. P. 52085212.

58. Fenske D.B., Chonn A., Cullis P.R. Liposomal nanomedicines: an emerging field // Toxicol Pathol. 2008. V.36(l). P. 21-29.

59. Fu H.L., Cheng S.X., Zhang X.Z., Zhuo R.X. Dendrimer/DNA complexes encapsulated in a water soluble polymer and supported on fast degrading star poly(DL-lactide) for localized gene delivery // J Control Release. 2007. V.124. P. 181-188.

60. Gharbi N., Pressac M., Hadchouel M., et al. 60.fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity // Nano Lett. 2005. V. 5(12). P. 2578-85.

61. Gul N.Y., Topal A., Cangul T., Yanik K. The effects of topical tripeptide copper complex and helium-neon laser on wound healing in rabbits // Vet Dermatol. 2008. V. 19(1). P.7-14.

62. Hanaki K., Momo A., Oku T. et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long—life and highly photostable endosome marker // Biochem Biophys Res Commun. 2003. V.302(3). P. 496-501.

63. Harris E.D., Rayton J.K., Balthrop J.E., et al. Copper and the synthesis ofelastin and collagen // Ciba Found Symp. 1980. V.79. P.l63-82.1.l

64. Ito A., Tanaka K., Honda H. et al. Complete Regression of Mouse Mammary Carcinoma with a Size Greater than 15 mm by Frequent Repeated Hyperthermia Using Magnetite Nanoparticles // J. Biosci. Bioeng. 2003. V. 96(4). P.364-369.

65. Jin H., Kang K.A. Application of novel metal nanoparticles as optical/thermal agents in optical mammography and hyperthermic treatment for breast cancer // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. V. 599. P. 4552.

66. Johannsen M., Gneveckow U., Taymoorian K., et al Thermal therapy of prostate cancer using magnetic nanoparticles // Actas Urol Esp. 2007. V. 31(6). P. 660-667.

67. Jones N., Ray B., Ranjit K.T., Manna A.C. Antibacterial activity of ZnO nanoparticle suspensions on a broad spectrum of microorganisms // FEMS Microbiol Lett. 2008. V. 279(1). P. 71-76.

68. Karak N., Maiti S. Dendritic polymers: a class of novel material // J. Polym. Mater. 1997. V. 14. P. 105.

69. Kim J.S., Kuk E., Yu K.N., et al. Antimicrobial effects of silver nanoparticles // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 2007. V.3. P. 95-101.

70. Kim B.E., Nevitt T., Thiele DJ. Mechanisms for copper acquisition, distribution and regulation // Nature Chemical Biology. 2008. V. 4. P. 176 -185.

71. Kobayashi H., Kawamoto S., Jo S.K. et al. Macromolecular MRI contrast agents with small dendrimers: pharmacokinetic differences between sizes and cores // Bioconjug Chem. 2003. V.14. P. 388—394.

72. Kojima C., Kono K., Maruyama K., Takagishi T. Synthesis of polyamidoamine dendrimers having poly (ethylene glycol) grafts and their ability to encapsulate anticancer drugs // Bioconjug Chem. 2000. V.ll. P. 910-917.

73. Kwon G.S. Polymeric micelles for delivery of poorly water—soluble compounds // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2003. V.20. P. 7—47.

74. Lansdown A.B., Sampson B., Rowe A. Sequential changes in trace metal, metallothionein and calmodulin concentrations in healing skin wounds // J Anat. 1999. V.195. P. 375-386.

75. Laus S., Ruloff, E., Toth et al. Gdlll complexes with fast water exchange and high thermodynamic stability: potential building blocks for high-relaxivity MRI contrast agents // Chemistry. 2003. V. 9. P. 3555-3566.

76. Lim Y.T, Kim S., Nakayama A., et al. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging // Mol Imaging. 2003. V. 2(1). P. 50—64.

77. Marius S., Lucian H., Marius M., et al. Enhanced antibacterial effect of silver nanoparticles obtained by electrochemical synthesis in poly(amide-hydroxyurethane) media // J Mater Sci: Mater Med. 2011. V. 22. P.789-796.

78. Mecke A., Uppuluri S., Sassanella T.M. et al. Direct observation of lipid bilayer disruption by poly (amidoamine) dendrimers // Chem Phys Lipids. 2004. V. 132. P. 3-14.

79. Mori T., Takada H., Ito S., et al. Preclinical studies on safety of fullerene upon acute oral administration and evaluation for no mutagenesis // Toxicology. 2006. V. 225(1). P. 48-54.

80. Maquart F.X., Pickart L., Laurent M., et al. Stimulation of collagen synthesis in fibroblast cultures by the tripeptide-copper complex glycyl-Lhistidyl-L-lysine-Cu2+ // FEBS Lett. 1988. V. 238. P. 343-349.

81. Meng H., Chen Z., Xing G. et al. Ultrahigh reactivity and grave nanotoxicity of copper nanoparticles // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2007. V. 272. №3. P. 595-598.

82. Olson M.E., Wright J.B., Lam K. et al. Healing of porcine donor sites covered with silver-coated dressings // Eur. J. Surg. 2000. V. 166(6). P. 486-489.

83. Pal S., Yu K., Song J.M. Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of nanoparticle? A study of the gramnegative bacterium E.coli. // Appl. Envir.microbiology. 2007. V. 73. №6. P.1712-1720.

84. Pan Y., Neuss S., Leifert A., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles // Small. 2007. V. 3. P. 1941-1949. '

85. Raffi M., Hussain F., Bhatti T.M., et al. Antibacterial Characterization of Silver Nanoparticles against E. Coli ATCC-15224 // J. Mater. Sci. Technol. 2008. V.24. №2. P. 192-196.

86. Ruparelia J.P., Chatterjee A.K., Duttagupta S.P., et al. Strain specificity in antimicrobial activity of silver and copper nanoparticles // Acta Biomaterialia. 2008. V.4. Issue 3. P. 707-716.

87. Sayes C.M., Fortner J.D., Guo W., et al. The Differential Cytotoxicity of Water-Soluble Fullerenes // Nano Letters. 2004. V. 4(10). P. 1881-1887.

88. Sayes C.M., Gobin A.M., Ausman K.D., et al. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation // Biomaterials. 2005. V. 26(36). P. 7587-7595.

89. Schmid G. The relevance of shape and size of Au55 clusters // Chem. Soc. Rev. 2008. V. 337. P. 1909-1930.

90. Sen C.K., Khanna S., Venojarvi M., et al. Copper-induced vascular endothelial growth factor expression and wound healing // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002. V.282. P. 1821-1827.

91. Soni IvLG., Carabin LG., Burdock G.A. Safety assessment of esters of p-hydroxybenzoic acid (parabens) // Food and Chemical Toxicology. V. 43 (7). P. 985-1015.

92. Taylor P.L., Omotoso O., Wiskel J.B. et al. Impact of heat on nanocrystalline silver dressings. Part II: Physical properties // Biomaterials. 2005. V. 26(35). P.7230-7240.

93. Taylor P.L., Ussher A.L., Burrell R.E. Impact of heat on nanocrystalline silver dressings. Part I: Chemical and biological properties // Biomaterials. 2005. V. 26(35). P.7221-7229.

94. Tenaud I., Sainte-Marie I., Jumbou O., et al. In vitro modulation of keratinocyte wound healing integrins by zinc, copper and manganese // Br J Dermatol. 1999. V.140(l). P. 26-34.

95. The guide for the care and use of laboratory animals / Eds Clark D. et al. Washington: National Acad. Press. 1996.140 p.

96. Tian J., Wong K.K., Ho C.M., et al. Topical Delivery of Silver Nanoparticles Promotes Wound Healing // ChemMedChem. 2006. V. 2, № 1. P. 129-136.

97. Tiwari D.K., Behari J., Sen P. Time and dose-dependent antimicrobial potential of Ag nanoparticles synthesized by top-down approach//Current science. 2008. V.95. №.5. P. 647-655.

98. Turski M.L., Thiele D.J. New Roles for Copper Metabolism in Cell Proliferation, Signaling, and Disease // The Journal of biological chemistry. 2009. V. 284. №.2. P. 717-721.

99. Wang S., Lu W., Tovmachenko O., et al. Challenge in understanding size and shape dependent toxicity of gold nanomaterials in human skin keratinocytes // Chem. Phys. Lett. 2008. V. 463. P. 145-149.

100. Wright J.B., Lam K., Buret A.G. et al. Early healing events in a porcine model of contaminated wounds: effects of nanocrystalline silver on matrix metalloproteinases, cell apoptosis, and healing // Wound Repair Regen. 2002. V. 10(3). P. 141-51.

101. Wu W., Wieckowski S., Pastorin G., et al. Targeted delivery of amphotericin B to cells by using functionalized carbon nanotubes // Angew Chem Int Ed Engl. 2005. V. 44. P. 6358-6362.

102. Zhang L., Gu F.X., Chan J.M., et al. Nanoparticles in Medicine: Therapeutic Applications and Developments // Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2008. V.83. P. 761-769.

103. Zhang L., Jiang Y., Ding Y., Povey M., York D. Investigation into the antibacterial behaviour of suspensions of ZnO nanoparticles (ZnO nanofluids) // Journal of Nanoparticle Research. 2007. Vol. 9. № 3. P. 479-489.