Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Изучение биологически активных веществ листьев лука медвежьего (Allium ursinum L.) и создание лекарственного средства на их основе

На правах рукописи

МАНУКЯН КАРИНА АРТУРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЛИСТЬЕВ ЛУКА МЕДВЕЖЬЕГО (ALLIUM URSINUM L.) И СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ИХ ОСНОВЕ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

11 СЕН 2014

Пятигорск - 2014

005552418

Работа выполнена в Пятигорском медико-фармацевтическом институте-филиале государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор,

Компанцева Евгения Владимировна

Официальные

оппоненты: Авдеева Елена Владимировна,

доктор фармацевтических наук, доцент, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии

Кусова Раиса Дзиппоевна,

кандидат фармацевтических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинский государственный университет им. КЛ. Хетагурова», доцент кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова

Минздрава России

Защита состоится «24» октября 2014 года в 10е® на заседании диссертационного совета Д 208.008.09 при ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздрава России по адресу: 357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздрава РФ (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11) и на сайте http://www.prnedpharm.ru

Автореферат разослан « 5 » сентября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Ремезова Ирина Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Нарастающая неблагоприятная экологическая обстановка практически во всех странах мира предопределила развитие ряда факторов (экологическое неблагополучие, стрессовые перегрузки, повышенный радиоактивный фон и др.), повышающих концентрацию свободных радикалов в организме. Это способствует возникновению патологических процессов, лежащих в основе ряда онкологических заболеваний, атеросклероза, ишемической болезни сердца, артериальной гипертонии, а также появлению устойчивых штаммов возбудителей различных инфекционных заболеваний. В связи с этим, для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в настоящее время широкую популярность получают лекарственные средства (JIC) - антиоксиданты, блокирующие вредное действие свободных радикалов, позволяющие повысить адаптационные резервы и иммунный статус организма человека в сложившихся современных условиях [Макарова М.Н. и др., 2003]. В последнее время все больший интерес исследователей привлекают не химически чистые и синтетические лекарственные средства, а экологически безопасные растительные экстракты, оказывающее свое действие за счет комплекса биологически активных соединений, синтезировать который практически невозможно. Поэтому приоритетным и актуальным остается выявление и изучение новых эффективных, экологически безопасных средств растительного происхождения. Проведенные в американском медицинском государственном центре сравнительные исследования более 40 видов растительных объектов показали, что одно из ведущих мест по эффективности среди антиоксидантов растительного происхождения занимает растение семейства луковых (Alliaceae) - лук медвежий (черемша) (Allium ursinum L.), в связи с содержанием таких серосодержащих веществ, как аллицин, аллиин и аджоены. В США, Канаде, Австралии, Англии в медицинской практике используют капсулы с порошком высушенной травы лука медвежьего, которые проявляют антиоксидантные, гипотензивные, гипогликемические, спазмолитические свойства. Установлено их влияние на сердечно-сосудистую систему, ингибируя агрегацию

тромбоцитов. Известно, что на развитие постмиокардических воспалительных процессов (аритмогенных, кардиомиопатий, атеросклеротических поражений сосудов) влияют хронические внутриклеточные инфекции [Юлиш Е.И. и др., 2007]. Во Франции выпускается спиртовый экстракт травы лука медвежьего в качестве антибактериального, противогрибкового средства, для поддержания иммунной системы. В России лук медвежий издавна применялся в народной медицине как антицинготное средство, при различных инфекционных и простудных заболеваниях, ревматизме, гнойных воспалениях. Настои, спиртовые настойки и сок способны понижать кровяное давление и препятствовать образованию бляшек холестерина Из луковиц лука медвежьего в России был получен лекарственный препарат «Урзалл» (для лечения трихомонадных кольпитов) и эфирное масло «Урзалин» (для лечения гнойных ран и пролежней), которые в настоящее время не выпускаются.

Степень разработанности темы. Несмотря на большой спектр биологической активности соединений лука медвежьего и его широкой популярности за рубежом, в России в настоящее время растение не нашло широкого применения, не создано лекарственных средств (ЛС) на его основе. С целью сохранения данного вида представляет интерес в качестве объекта исследования выбрать надземную часть (листья) лука медвежьего. Для включения в номенклатуру ЛС листьев лука медвежьего, произрастающего на территории России, и в частности на территории Северного Кавказа, необходимы широкие исследования по изучению их химического состава.

Использование современных методов качественного и количественного анализа основных биологически активных веществ (БАВ) позволит дать научное обоснование возможности использования листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе, в медицинской практике и послужит основой для обоснования включения основных БАВ как критерия нормирования качества изучаемого сырья.

Цель настоящей работы — изучить химический состав листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе, установить

фармакологическую - активность, провести исследования по стандартизации и созданию JIC на их основе.

Задачи исследования:

• изучить литературу по фармакогностическим признакам, химическому составу, методам анализа и биологической активности лука медвежьего;

• установить морфолого-анатомические признаки изучаемого сырья;

• с помощью современных методов определить качественный состав БАВ и их количественное содержание в исследуемом сырье;

• подтвердить безопасность, изучить фармакологическую активность листьев лука медвежьего (антиоксидантную, гиполипидемическую, спазмолитическую, антимикробную);

• провести исследования по разработке проекта фармакопейной статьи (ФСП) «Лука медвежьего листья (Allium ursinum L.)»;

• научно обосновать и разработать состав капсул с порошком листьев лука медвежьего, разработать проект ФСП «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г».

Решение задач осуществлялось путем обобщения данных литературы и проведения экспериментальных исследований.

Научная новизна. Изучен химический состав листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе. Проведена идентификация и количественное определение суммы серосодержащих соединений методом спектрофотометрии. Оптимизированы условия выполнения методики. Разработана методика анализа аллиина (основного серосодержащего соединения лука медвежьего) методом капиллярного электрофореза. Химическими и физико-химическими методами показано наличие и установлено содержание других групп БАВ - флавоноидов, аскорбиновой кислоты, аминокислот, жирных кислот, каротиноидов, макро- и микроэлементов. Определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в образцах сырья.

На основании физико-химических, химических и фармакологических исследований подтверждена возможность использования надземной части листьев лука медвежьего в качестве растительного сырья. Изучена острая токсичность и

фармакологическая эффективность извлечений из листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе. Установлена их антиоксидантная (в сравнении с таблетками «Алисат»), гиполипидемическая (в сравнении с препаратом «Трайкор»), спазмолитическая.

Научно обоснована и разработана технология твердых желатиновых капсул с порошком листьев лука медвежьего. Разработаны проекты ФСП «Лука медвежьего листья» и «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г».

Теоретическая и практическая значимость. Теоретическая значимость. На основании проведенных исследований установлено, что лук медвежий, произрастающий на Северном Кавказе является источником ценного комплекса БАВ - антиоксидантов. Проведенные фармакологические исследования листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе, свидетельствуют о возможности их использования в качестве лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Практическая значимость. Полученные результаты по изучению химического состава и фармакологические исследования показали, что листья лука медвежьего являются перспективным безопасным лекарственным сырьем с антиоксидантной, гиполипидемической, спазмолитической, антимикробной активностью. Комплекс выполненных химических и фармакогностических исследований позволил составить проекты ФСП «Лука медвежьего листья» и «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г». Методики анализа БАВ, включенные в разработанные проекты ФСП «Лука медвежьего листья» и «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г», прошли апробацию в испытательной лаборатории ГБУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» МЗ Республики Северная Осетия-Алания. Получены акты апробации с положительными отзывами.

Методология и методы исследования. В работе использована общая методология изучения лекарственного растительного сырья. Идентификацию и количественное определение БАВ проводили с использованием методов капиллярного электрофореза, спектрофотометрии, газовой хроматографии,

высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ), атомно-спектральных методов. Исследования острой токсичности и фармакологические исследования построены на методологии классической фармакологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования БАВ листьев лука медвежьего;

2. Данные по изучению фармакологической активности и безопасности листьев лука медвежьего;

3. Показатели и нормы качества листьев лука медвежьего;

4. Получение и анализ капсул с порошком листьев лука медвежьего, нормы их качества.

Степень достоверности и апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы доложены и обсуждены на 66, 67 и 68 региональных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2011 г., 2012 г., 2013 г.). Материалы диссертации были представлены на конкурсе исследовательских проектов и научно-технических разработок молодых изобретателей: Ставрополь, 2010 г., проект «Золотой век инноваций»; на конкурсе «У.М.Н.И.К.» (конференция молодых ученых «Инновационные идеи молодёжи Северного Кавказа - развитию экономики России», Пятигорск, 2011 г.) и удостоены дипломов.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК; получено положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение «Способ получения антимикробного средства из надземной части черемши» от 15.06.2012 г.

Объем и crpyicrypa диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, списка литературы, включающего 185 источников, в том числе 56 иностранных; содержит 4 приложения, 31 таблицу, 34 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В качестве объектов исследования были использованы образцы листьев лука медвежьего, заготовленные в апреле месяце до начала цветения растения в различных регионах Северного Кавказа (таблица 1).

Таблица 1 - Изучаемые образцы листьев лука медвежьего

№ образца Место и год сбора

1 Республика Дагестан, Чародинский район, 2010 г.

2 Северная Осетия, Цейское ущелье, 2010 г

3 Чеченская республика, Ачхой-Мартановский район, 2010 г.

4 Ставропольский край, Нефтекумский район, 2011 г.

Морфолого-анатомическое изучение листьев лука медвежьего

С целью установления показателей качества исследуемого сырья проводился макро- и микроскопический анализ. Были определены основные морфологические характеристики, установлена совокупность микродиагностических признаков, необходимых для идентификации цельного, измельченного сырья и порошка.

Внешние признаки. Цельное сырьё. Листья цельные, реже изломанные, гладкие, плоские, ланцетной, овальной или эллиптической формы на верхушке заостренные, при основании постепенно суженные в узкий черешок, почти равный по длине листовой пластинке. Край листа цельный. Жилкование дуговое. Главная жилка выступает с нижней стороны листа. Листовая пластинка тонкая, ломкая. Длина листьев до 20 см, ширина 3-8 см. Цвет листьев зелёный, реже буровато-зелёный. Запах сильный, чесночный. Вкус сладковато-острый.

Анатомическое исследование. Цельное сырье. Лук медвежий имеет инвертированные листья (обратнобифациальные), когда анатомически верхняя часть листа обращена к почве. Лист дорзовентрального типа. Диагностическим признаком является расположение палисадного мезофилла, который располагается только под нижней эпидермой в один слой. В мезофилле наблюдается присутствие кристаллов

оксапата кальция в виде мелких рафид. Проводящие пучки жилок закрытые, коллатеральные, мелкие (рисунок 1). Сосуды кольчатые.

1

1 - Проводящие пучки жилок Рисунок 1 - Поперечный срез листа (увеличение 8x10)

Верхняя эпидерма представлена вытянутыми клетками с прямыми антиклинальными стенками, трихом и устьиц не обнаружено. Имеется складчатость кутикулы (рисунок 2).

Рисунок 2 - Верхняя эпидерма (увеличение 20x10)

Нижняя эпидерма представлена вытянутыми клетками с извилистыми антиклинальными стенками, устьичные аппараты тетрацитного типа. Устьица диагностируются только на нижней стороне (анатомически верхней). Наблюдается

их обилие, расположены рядами (диагностический признак) (рис. 3); в мезофилле встречаются мелкие рафиды оксалата кальция. Эпидерма содержит слизистые вещества.

1 - устьичные аппараты, расположенные рядами Рисунок 3 - Нижняя эпидерма (увеличение 20x10)

Комплекс морфолого-анатомических характеристик позволяет подтвердить подлинность цельного, измельченного сырья и порошка листьев лука медвежьего.

Изучение биологически активных веществ листьев лука медвежьего По данным зарубежной литературы известно, что основными биологически активными соединениями семейства Alliaceae, в том числе лука медвежьего, является разнообразная группа серосодержащих соединений [Block et а1.,1992]. Для установления содержания органической серы по сульфид-иону после минерализации в сырье использовали способность сульфид-иона взаимодействовать с п-амино-ЫЛЧ-диэтиланилина сульфатом в присутствии ионов Fe (III). В результате реакции образуется голубое окрашивание 2,7-бис (N, N-диэтиламинофеназтиония) (W=675 нм) (рисунок 4). Для разработки методики анализа подбирали оптимальные условия экстракции серосодержащих соединений при степени измельчения сырья 1 мм: экстрагент - вода, продолжительность экстракции (двукратная) на кипящей водяной бане - 30 минут, соотношение сырья и экстрагента

- 1:50, температура минерализации - 200±2 °С, последовательность добавления реактивов (п-амино-Ы,Ы-диэтиланилина сульфат, затем квасцы железоаммониевые). В качестве стандартного образца (СО) использовали СО Ь-цистеина гидрохлорид (Sigma-Aldrich, Германия). Установленные валидационные характеристики методики (линейность (коэффициент корреляции 0,9965), правильность (Я= 100,3%) и прецизионность (ИБО =4,44%)), явились приемлемыми. Установлено содержание органической серы в образцах, которое составило от 0,42 % до 0,63% (таблица 3).

Среди огромного разнообразия серосодержащих соединений (более 100) [Ва§ш й а1., 2002, 8ако е1 а1., 2004] основным соединением является серосодержащая аминокислота аллиин (Б-аллил-Ь-цистеин-З-оксид). Наличие в образцах аллиина подтверждали методом ТСХ на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) после обработки хроматограмм раствором нингидрина по ярко-красным зонам адсорбции, соответствующим по окраске и значению ЯГ стандартному образцу (СО) аллиина.

Количественное определение аллиина проводили методом капиллярного электрофореза, широко применяемого для анализа низкомолекулярных структур, в том числе и аминокислот. При разработке методики подбирали состав и концентрации ведущего электролита, изменение напряжения, температуры, а также внутренний диаметр капилляра. В результате подобраны условия проведения анализа - кварцевый термостатируемый капилляр с диаметром 50 мкм, общей длиной 75 см и рабочей длиной 65 см. Электролит: раствор натрия тетрабората-декагидрата (0,02 моль/л) с добавкой Р-циклодекстрина. Определение аллиина проводили при 200 нм в катодной области капилляра при 20 кВ и температуре 50 °С. На рисунке 5 показано, что пик аллиина полностью разделен с сопутствующими компонентами сырья, время миграции аллиина в сырье совпадает с. временем миграции СО аллиина (Sigma-Aldr¡ch, Германия). Кроме того, было изучено влияние условий экстракции на выход аллиина (в сумме с другими БАВ) из листьев лука медвежьего. Установлены оптимальные условия экстракции аллиина при степени измельчения сырья 1 мм: экстрагент - вода, длительность экстракции - 20 минут дробной экстракцией (двукратно), соотношение сырья и экстрагента - 1:50, температура экстракции - 20 °С.

X.

/

Экстрагенгы: 1-вода; 3- спирт этиловый 40%; 4- спирт этиловый 70%; 5 - спирт этиловый 96%;

2-СО Ь-цистеина гидрохлорида.

Рисунок 4 - Спектры поглощения продукта реакции сульфидов СО Ь-цистеина гидрохлорида и листьев лука медвежьего с п-амино-1Ч,1Ч-диэтиланилина сульфатом с использованием различных экстрагентов

1Ш1

СО аллиина (1) и извлечения из листьев лука медвежьего (2) Рисунок 5 - Электрофореграммы

Для методики определения содержания аллиина проведена валидационная—.

оценка, результаты которой можно считать приемлемыми (таблица 2).

Таблица 2 — Результаты валидациоиной оценки методики количественного

определения аллиина

Показатель Норматив Результат

Специфичность Однородность пика Пик аллиина однороден, площадь его возрастет пропорционально количеству добавленного стандарта, при этом сохраняется его асимметрия и эффективность

Линейность Коэффициент корреляции <0,99 0,9997

Правильность 11=97-103% для содержания вещества<1% 99,81

Прецизионность Относительное стандартное отклонение 1150 < 3% 2,8%

Разработанная методика позволила установить содержание аллиина в образцах сырья, которое составило от 0,89 до 1,50% (таблица 3).

Кроме того, в листьях лука медвежьего было проведено определение флавоноидов, каротиноидов, жирных кислот, аминокислот и аскорбиновой кислоты, макро- и микроэлементов, установлено содержание водорастворимых антиоксидантов (таблица 3).

Наличие флавоноидов в образцах устанавливали с помощью цианидиновой пробы и раствора аммиака. Качественный анализ флавоноидов проводили после их очистки от липофильных веществ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) после кислотного гидролиза в системе растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2). Для обнаружения веществ на хроматограмме использовали детекцию в УФ-свете (360 нм), обработку раствором алюминия хлорида. Наблюдали появление 6 пятен, три из которых соответствовали по окраске и значению ЯГ СО кемпферола, кверцетина, лютеолина. Количественное определение флавоноидов в образцах проводили методом дифференциальной спектрофотометрии в извлечениях, полученных с использованием спирта этилового 70%.

•Таблица 3 - Результаты определения БАВ в различных образцах

БАВ Результаты количественного определения БАВ в исследуемых обоазиах

Метод определения I 2 3 4

Органически связанная сера после минерализации по сульфид иону, % Спектрофотометрия с п-амино-М,1\[-диэтиланилина сульфатом 0,44±0,02 0,63±0,03 0,42±0,02 0,45±0,02

Аллиин, % Капиллярный электрофорез 1,12±0,03 1,50±0,04 0,84±0,02 1,08±0,03

Флавоноиды, % Дифференциальная спектрофотометрия с алюминия (III) хлоридом, 407±2 нм 1,74±0,06 2,05±0,06 1,91 ±0,06 2,14±0,05

Каротиноиды, мг% Спектрофотометрия Х,шх= 450±2 нм 2,91±0,12 3,39±0,13 4,17±0,10 4,51±0,11

Нейтральные липиды (НЛ), % Сумма ненасыщенных жирных кислот, % (по отношению к массе НЛ) Гравиметрия 1,29±0,05 1,77±0,05 0,91 ±0,02 1,08±0,05

Газожидкостная хроматография (метод внутренней нормализации) 66,54±1,89 59,24±1,80 71,26±1,89 63,36±1,87

Аскорбиновая кислота, % Титриметрия с раствором 2,6-дихлорфенолиндофе-нолята натрия 0,133± 0,002 0,172± 0,002 0,083± 0,001 0,164± 0,002

Аминокислоты, %, в том числе незаменимые Высокоэффективная жидкостная хроматография 1,38±0,06 0,92 1,56±0,06 1,10 1,28±0,05 0,75 1,73±0,06 1,06

Элементный состав, мг/1000г: Фосфор Кальций Магний Калий Железо Никель Хром Ванадий Молибден Селен, мкг/1000г Спектральный атомно-эмиссионный Флуориметрия 9600±2900 2700±800 2200±700 30000± 12000 150±40 3,20±1,10 0,79±0,16 0,29 0,90±0,30 80±7 5700±1800 5900±1800 2800±800 36000± 16000 260±70 1,30±0,50 1,31±0,26 0,58±0,14 2,11±0,81 111±8 9800±2900 2400±700 2000±600 28000± 11000 310±90 4,40±1,50 1,80±0,40 0,74±0Д9 4,21±1,70 94±8 9300±2800 3100±900 2200±700 33000± 13000 150±40 6,20±2,30 0,79±0,16 0,29 1,01 ±0,42 95±8

Сумма антиоксидантов, мг/г Инжекционно-проточная система 50,63±1,34 56,05±1,36 41,86±1,05 48,20±1,38

В качестве СО использовали рутин, т.к. максимумы спектров поглощения флавоноидов сырья и СО рутина с алюминия хлоридом находились в области 407±2нм.

Сумму аминокислот после гидролиза определяли на аминокислотном анализаторе с использованием градиентного метода элюирования. Обнаружено 15 аминокислот, среди которых 9 - незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, треонин, гистидин и лизин).

Жирнокислотный состав нейтральных липидов, полученных трехкратной экстракцией н-гексаном при температуре 20 °С, определяли газожидкостной хроматографией методом внутренней нормализации.

Анализ метиловых эфиров позволил идентифицировать во всех образцах ненасыщенные высшие жирные кислоты - олеиновую, линоленовую и линолевую, с преобладанием последней.

Полученную фракцию исследовали на наличие каротиноидов. Все извлечения имели характерный максимум в области 450±2 нм. Для расчета содержания использовали удельный показатель поглощения р-каротина.

При исследовании микро- и макроэлементов в образцах установлено наличие ряда биогенных металлов и практическое отсутствие токсичных и тяжелых элементов. Примечательно высокое содержание во всех образцах сырья природного антиоксиданта селена (80 - 111 мг/кг).

В связи с разнообразным составом и относительно высоким содержание веществ-антиоксидантов в сырье, было проведено определение суммы водорастворимых антиоксидантов в образцах. Содержание антиоксидантов в образцах в пересчете на кверцетин составило от 41,86 до 56,05 мг/г.

Результаты анализов БАВ листьев лука медвежьего представлены в таблице 3.

Фармакологическое изучение листьев лука медвежьего

По данным зарубежной литературы, лук медвежий обладает широким спектром фармакологической активности: антиоксидантной, гиполипидемической, гипотензивной, антиагрегантной, антиаритмической и др. Фармакологическое

изучение листьев лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе^ ранее не проводилось. Поэтому одной из задач исследования явилось подтверждение эффективности и безопасности использования растительного сырья. В связи с этим, было проведено изучение гиполипидемического, антиоксидантного, спазмолитического и антимикробного действия порошка листьев лука медвежьего.

Достоверность расчетных результатов оценивали параметрически по Ь критерию Стьюдента (объем выборки п=6). Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании составлял 0,05.

В условиях твиновой гиперлипидемии лечебно-профилактическое введение порошка листьев лука медвежьего в дозе 50 мг/кг оказывало нормализующее влияние на состояние показателей липидного обмена (содержание общих липидов, Р-, пре-р-липопротеинов и триглицеридов крови) - таблица 4.

Таблица 4 - Влияние листьев лука медвежьего на состояние показателей

липидного обмена в крови на фоне твиновой гиперлипидемии

Группы животных (п=6) Показатели

Общие липиды крови, г/л Р- и пре-р-липопротеины крови, г/л Триглицериды крови, м моль/л

И1ггактные 1,41±0,31 0,54±0,07 0,90±0,06

Контроль (получающие твин-80) 4,22±0,28 Ри<0,001;+200% 2,65±0,27 Ри<0,01; +391% 2,9б±0,07 Ри<0,01; +229%

Получающие порошок листьев лука медвежьего в дозе 50 мг/кг и твин-80 3,04±0,30 Р«<0,01; -29% Ри<0,01 1,55±0,16 Р„<0,001; -42% Ри>0,1 2,53±0,05 Рк<0,001; -15% Ри<0,01

Получающие препарат «Трайкор» в дозе 12,5 мг/кг и твин-80 2,81±0,32 Р,<0,01; -33% Ри<0,005 1,43±0,36 Рк<0,001; -46% Ри>0,1 1,14±0,10 Р„<0,001; -61% Ри>0,1

Примечание: Ри - уровень достоверной разницы по отношению к интактным животным; Рк -уровень достоверной разницы по отношению к контрольным животным; п - количество животных в группе

Из результатов исследований, представленных в таблице 4, следует, что порошок листьев лука медвежьего проявлял отчетливый гипохолестеринемический эффект, сопоставимый с препаратом сравнения «Трайкор».

Изучение антиоксидантной активности извлечений листьев лука медвежьего проводили методом аскорбатзависимого пероксидного окисления липидов (in vitro), основанном на способности к окислению кислородом воздуха в разбавленных водных растворах остатков олеиновой кислоты в составе твина-80 (в присутствии кофакторов окисления - ионов железа (II) и аскорбиновой кислоты). Показано, что наибольший процент снижения концентрации малонового диальдегида (продукта окисления), определяемого в реакции с тиобарбитуровой кислотой, составил 74,8%, а препарата сравнения - таблеток с порошком чеснока «Алисат» - 43,5%. Это доказывает существенное ингибирующее влияние изучаемого сырья на пероксидное окисление липидов.

Установлено, что водные извлечения порошка листьев лука медвежьего в соотношении 1:50 (сырье-экстрагент), снижают тонус гладкой мускулатуры изолированного участка тонкой кишки крысы в среднем на 41%. Опыты показали, что такой же по выраженности спазмолитический эффект возникает при использовании папаверина гидрохлорида при концентрации его в инкубационной смеси 0,07 мг/мл.

Для подтверждения безопасности сырья по методу Кербера на мышах и крысах обоих полов была определена доза LD50. Она составляет 6833 мг/кг массы тела животного. Это позволяет отнести листья лука медвежьего к классу практически нетоксичных согласно классификации токсичности по К.К. Сидорову.

Поскольку известно, что лекарственные растения, богатые антиоксидантами [Тарасевич A.B., 2004] оказывают антиперсистентное действие на микроорганизмы, также были изучены антимикробные свойства листьев лука медвежьего методом диффузии БАВ в агар. Установлена выраженная антимикробная активность в отношении грамположительных микроорганизмов: St. aureus (209); St. aureus (Type); St. epidermidis Wood - 46; грамотрицательных микроорганизмов: S. gallinarum; E.

coli:055; спорообразующих микроорганизмов: В. anthracoides - 96; В. anthracoides - 2;-В. subtilis, а также Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris.

Исследования по стандартизации листьев лука медвежьего На основе проведенных исследований по изучению морфолого-анатомического строения, химического состава листьев лука медвежьего, товароведческого анализа были предложены нормы качества, показатели и методы контроля качества для составления предварительного проекта ФСП (согласно ОСТ 42-91500.05.001-00), основанного на данных, полученных при изучении лука медвежьего, произрастающего на Северном Кавказе.

Для идентификации сырья в проект ФСП включены качественные реакции (на флавоноиды и аминокислоты), ультрафиолетовый спектр (УФ-спектр) водного извлечения (1:250), время миграции аллиина - основного фармакологически активного серосодержащего вещества. Нормирование качества сырья предложено проводить по количественному содержанию аллиина. Используя образцы, собранные в различных регионах Северного Кавказа, определены необходимые числовые показатели, что позволило обосновать предварительные нормативы, внесенные в проект ФСП. Нормы качества обоснованы и установлены также для измельченного сырья и порошка (таблица 5).

Для листьев лука медвежьего были установлены радиологическая безопасность (таблица 6), микробиологическая чистота и сроки годности сырья - 2 года.

Таблица 6 - Результаты анализа образцов на радионуклиды

Наименование радионуклида Предельно допустимый уровень (не более), Бк/кг Результаты измерений, образцы

1 2 3 4

Цезий-137 400 <3,0 <3,0 <3,0 <3,0

Стронций-90 200 12,0 14,0 11,0 12,0

Примечание: < - меньше порога обнаружения

Таблица 5 - Нормы качества листьев лука медвежьего

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки Визуальный ГФ XI, вып. 1, с. 252267 Соответствие морфологическим признакам

Микроскопия Микроскопический ГФ XI, вып. 1, с. 277 Соответствие анатомическим признакам

Подлинность

Аллинн Капиллярный электрофорез Время миграции аллиина в извлечении листьев лука медвежьего должно совпадать с временем миграции СО аллиина

Качественные реакции:

Флавоноиды Аминокислоты Химическая реакция с 5% раствором аммиака Химическая реакция с раствором нингидрина Интенсивно желтое окрашивание Сине-фиолетовое окрашивание

Ультрафиолетовый спектр Спектрофотометрия Максимумы поглощения извлечения в области 265±2 нм и 335±2 нм (фенольные соединения)

Числовые показатели

Цельное сырье

Количественное определение:

Аллинн Капиллярный электрофорез Не менее 0,8%

Влажность ГФ XI, вып. 1, стр. 285 Не более 10%

Зола общая ГФ XI, вып. 2, стр. 24 Не более 12%

Зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной ГФ XI, вып. 2, стр. 25 Не более 2%

Пожелтевшие и побуревшие листья ГФ XI, вып. 1, стр. 275 Не более 5%

Органическая примесь ГФ XI, вып. 1, стр. 276 Не более 1%

Минеральная примесь ГФ XI, вып. 1, стр. 276 Не более 0,5%

Микробиологическая чистота ГФХП, ч.1,с. 160 ОФС 42-0067-07 Категория 4Б

Срок годности 2 года

Разработка технологии н норм качества капсул с порошком листьев лука

медвежьего

В качестве лекарственной формы для порошка листьев лука медвежьего были выбраны капсулы, имеющие высокую биодоступность, герметичность, изоляцию лабильных компонентов содержимого от различных неблагоприятных факторов внешней среды и др. Для обоснования дозы капсул использовали данные предварительных фармакологических исследований, изучали анализ номенклатуры зарубежных ЛП и БАД, отечественных БАД (разрешенных к применению в РФ) с измельченными высушенными дольками чеснока или травой лука медвежьего. С целью установления состава капсул определяли оптимальные технологические свойства изучаемого сырья - степень измельчения (размер частиц не более 0,5 мм), насыпную плотность (0,86±0,04 г/см3), сыпучесть (9,21±0,28 г/сек), угол естественного наклона (15±1,0°)). Все это позволило обосновать дозу и выбрать оптимальный состав содержимого капсул: порошка листьев лука медвежьего - 300 мг (97,56%); аэросила - 4,5 мг (1,46%); полипласдона СЬ-10 - 3 мг (0,98%).

Для внедрения капсул в медицинскую практику проведены исследования по их стандартизации. С этой целью были предложены методы контроля и обоснованы нормы качества капсул по основным показателям (согласно ОСТ 42-91500.05.00100): описание, подлинность, микробиологическая чистота, количественное определение, средняя масса содержимого и однородность по массе, распадаемость, которые послужили основой для создания проекта нормативной документации -ФСП «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г» В условиях естественного хранения, согласно показателям качества проекта ФСП, был установлен срок годности капсул - 2 года.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным зарубежной литературы, лук медвежий имеет уникальный комплекс биологически активных веществ, основными среди которых являются серосодержащие соединения, а также обладает широким спектром фармакологической активности, что позволяет рассматривать его как перспективный источник для создания ЛС. В результате проведенных исследований была решена актуальная задача по изучению химического состава листьев лука медвежьего,

произрастающего в различных регионах Северного Кавказа, подтверждению наличия фармакологической активности. На основании проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. Анализ данных литературы показал, что, несмотря на широкое применение листьев и травы лука медвежьего в народной медицине и за рубежом, в России, в частности на Северном Кавказе, где он образует многочисленные заросли, не проводились обширные исследования его химического состава, что явилось основанием для изучения качественного состава и содержания основных БАВ, разработки норм качества и стандартизации сырья, с целью создания отечественных JIC на его основе.

2. Установлены и выделены морфолого-анатомические признаки листьев лука медвежьего, необходимые для идентификации цельного, измельченного и порошка сырья.

3. Идентифицированы с помощью химических и физико-химических методов различные группы БАВ, представленные многообразным составом веществ-антиоксидантов. Оптимизирована методика спектрофотометрического определения органической серы листьев лука медвежьего с п-амино-Ы,К-диэтиланилина сульфатом после минерализации по сульфид-иону. Установлены приемлемые параметры валидационной оценки. Содержание органической серы в образцах составило от 0,42% до 0,63%.

4. Разработана методика идентификации и количественного определения аллиина в сырье методом капиллярного электрофореза. Экспериментально обоснованы оптимальные параметры экстракции аллиина из сырья, содержание, которого составило от 0,84 до 1,50 %. Показано, что предлагаемая методика приемлема по показателям специфичность, прецизионность, линейность и правильность.

Проведена идентификация и установлено количественное содержание в листьях лука медвежьего некоторых групп БАВ: флавоноидов - от 1,7 до 2,1%; каротиноидов - от 2,91 до 4,51 мг%; аминокислот - от 1,38 до 1,73%; аскорбиновой кислоты - от 0,08 % до 0,17 %; ненасыщенных жирных кислот (от 60 до 66% по отношению к

массе липидов) с преобладанием линолевой кислоты. Во всех образцах сырья установлено наличие ряда биогенных металлов и природного антиоксиданта селена. Определено суммарное содержание водорастворимых антиоксидантов в пересчете на кверцетин в образцах, которое составило в листьях лука медвежьего от 41,86 до 56,05 мг/г.

5. С помощью фармакологических методов исследования выявлена гиполипидемическая, спазмолитическая и антиоксидантная, выраженнаЯ антимикробная активность листьев лука медвежьего, в связи с чем, листья и капсулы с порошком листьев лука медвежьего, следует рассматривать в качестве эффективных и безопасных ЛС. Показано, что листья лука медвежьего относятся к классу практически нетоксичных веществ.

6. Обоснован состав вспомогательных веществ для улучшения технологических свойств порошка листьев лука медвежьего. Разработана технология твердых желатиновых капсул с порошком листьев по 0,3 г и определены показатели их качества.

7. Проведены комплексные исследования по стандартизации листьев лука медвежьего и капсул с порошком сырья. Подготовлены проекты ФСП «Лука медвежьего листья» и «Лука медвежьего листьев порошок в капсулах по 0,3 г».

Перспективными для проведения дальнейших исследований являются два направления:

- изучение различных групп БАВ листьев лука медвежьего, не нашедших отражения в настоящем исследовании (полисахариды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты, аденозин, стероидные гликозиды, лектины);

- обоснование состава, технологии и норм качества новых лекарственных средств на основе листьев лука медвежьего с различной фармакологической активностью -антитромбической, иммунотропной, антифунгалыюй.

Автор выражает благодарность доценту кафедры ботаники Серебряной Ф.К., доценту Сергеевой Е.О. и старшему преподавателю Мазуриной М.В. (кафедра биохимии и микробиологии), преподавателю кафедры технологии лекарств Шаталовой Т.А., доценту Института биологии Коми научного центра УрО РАН Ширшовой Т.И. за содействие в проведении экспериментов.

Публикации по теме диссертации:

1. Айрапетова, К.А. Микроморфологическое исследование черемши (Allium ursinum L.)/K.A. Айрапетова, М.А Галкин, Ф.К.Серебряная// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.-Пятигорск, 2009. - Вып.64,- С. 7-8.

2. Жирнокислотный состав липидов лука медвежьего (Allium ursinum L.)/ Л.С.Ушакова, Е.В. Компанцева, К.А. Айрапетова, Т.А Шаталова//Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Поиск новых физиологически активных веществ: материалы Всерос. с междунар. участием науч.-метод. конф. «Фармобразование-2010» 4; 20-21 апреля 2010 г.- Воронеж: ВГУ, 2010.-С.383-385.

3. Айрапетова, К.А. Аминокислотный и минеральный состав надземной части лука медвежьего (черемши) {Allium ursinum L.)/ К.А. Айрапетова, Е.В. Компанцева //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр.- Пятигорск, 2011. - Вып.66.- С. 343-345.

4. Изучение гиполипидемического действия экстракта лука медвежьего (черемши) (Allium ursinum L.)/ К.А. Айрапетова, Е.О.Сергеева, Е.В. Компанцева [и др.]// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011.-Т. 13, №1 (4). - С.758-760.

5. Айрапетова, К.А. Получение экстракта лука медвежьего (черемши) (Allium ursinum L.) и изучение его антиоксидантной активности/ К.А. Айрапетова, Е.В. Компанцева, Т.А. Шаталова// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011.-Т.13, №1 (8). - С. 1964-1967.

6. Манукян, К.А. Изучение сорбционной способности пектина из лука медвежьего (черемши) (Allium ursinum L.) по отношению к ионам свинца/ К.А. Манукян, Л.П. Мыкоц, Е.В. Компанцева// Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2012.-Т.14, №1 (9). - С.2263-2265.

7. Манукян, К.А.Определение аллиина в надземной части лука медвежьего (Allium ursinum L.) методом капиллярного электрофореза/К.А. Манукян, С.П. Сенченко, Е.В. Компанцева//Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2013.-Т.15, №3 (2). - С.741-743.

8. Изучение антимикробной активности экстрактов лука медвежьего (Allium ursinum L.) (черемши) [Электронный ресурс]/ К.А. Манукян, Е.В. Компанцева, Т.А.Шаталова [и др.] // Современные проблемы науки и образования.-2013.-№4,-Режим доступа: http://www.science-education.ru/110-9815.

МАНУКЯН КАРИНА АРТУРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЛИСТЬЕВ ЛУКА МЕДВЕЖЬЕГО (ALLIUM URSINUM L.) II СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ИХ ОСНОВЕ

14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати «21» августа2014 г. Формат бумаги 60x84 1/24 Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 80 экз. Заказ № 97.

Отпечатано в Пятигорском медико-фармацевтическом институте - филиале ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)