Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности, обусловленные Aspergillus Flavus

На правах рукописи

УГЛИНА Олы а Александровна

ИЗМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО, ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА И НЕСПЕЦИФМЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ, ОБУСЛОВЛЕННЫЕ ASPERGILLUS FLAVUS (клиннко-эксперимеш альное исследование)

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2007

003060549

Работа выполнена в Военно-Медицинской академии имени С М Кирова

г Санкт-Петербург

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Митнн Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Емелышов Александр Викторович

Ведущее учреждение

Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России

Защита диссертации состоится «__» июня 2001 г в 13 00 часов на заседании

диссертационного совета Д 215 002 08 при Военно-медицинской академии имени С М Кирова (194044, Санкт-ГЬпербург, ул Академика Лебедева, д 6)

С диссертацией можно ояткомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии имени С М Кирова

доктор медицинских наук

Степанов Александр Валентинович

Автореферат разослан «_» мая 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Владимир Леонидович Пастушенков

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Заболевания, в патогенезе которых ведущую роль играют изменения иммунной системы, в настоящий момент представляют серьезную проблему для щравоохранения во всем мире

Воздействие различных компонентов грибов на иммунную систему разнообразно Так, например, у Aspergillus flavus быто выявлено более 300 антигенных компонентов, среди которых наиболее значимыми являются антигены мицелия [Nittner-Marszalska М et al, 2001] Ваетация, а затем споруляция грибов в окружающей среде, делают неюбежным контакт спор грибов с органами дыхания человека Важно отметить, что небольшие размеры спор позволяют им 1лубоко проникать в гкани легких, достигая альвеол

В иммунной системе под действие м антигенов, выделяемых грибами рода Aspergillus, стимулируется синтез иммуноглобулина Е и могут развиваться как реакции 1 типа, так и He-IgE-аллергия, реализующиеся в форме экзогенного ал-тергического альвеолита, например «легкого фермера», при сенсибилизации к антигенам грибов рода Aspergillus или «болезни лесорубов», обусловленной грибами рода Trichoderm

Большинство ранее проведенных исследований посвящено особенностям клинического течения и сенсибилизации при микозах [Белозеров ЕС и соавт, 1990, Потатуркина-Нестерова Н И , 1998, Bukovjan К et al, 1999], в то же время недостает сведений об изменениях клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности при колонизации кишечника грибами, в частности рода Aspergillus.npn других кишечных инфекциях, например дизентерии

В литературе имеются данные [Антипенко В П и соавт, 1992, Васильева ОС 1996, Bukovjan К et al, 1999] о влиянии продуктов жизнедеятельности гриба A flavus на иммунную систему, но результаты этих исследований разрозненны, часто носят противоречивый характер В то же время изучение этого вопроса важно для понимания механизмов сенсибилизации к продуктам жизнедеятельности грибов и изменений иммунной системы, на фоне которых могут возникать заболевания, вызванные услог но-патогенными микроорганизмами

Цель работы. Оценит!, воздействие антигенов A flavus на клеточный, гуморальный иммунитет и неспецифическую резистентность

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Изучить изменения меточного л гуморального звена иммунной системы при длительном воздействии на организм экспериментальных животных антигенов грибов A flavus

2 Изучить изменение неспецифической резистентности при длительном воздействии на организм эксперимешальных животных антигенов грибов A flavus

3 Охарактеризовать воспалительные изменения тканей кишечника, возникающие у экспериментальных животных при местном воздействии антигенов грибов A flavus

4 Оценить особенности изменений клеточного, гуморального иммунитета, неспсцифической резистентности и клинического течения заболевания у детей, больных острой дизентерией средней степени тяжести, имеющих колонизацию кишечника грибами А Лауш

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

1 Впервые в экспериментальном исследовании установлены изменения кишечника у животных, возникающие в результате местного воздействия антигенов А.Пауия Показано, что реакция тканей тонкой кишки характеризуется развитием воспаления, прояшшющегося гиперемией и дилатацией сегментов, в сочетании с инфильтрацией стромы лейкоцитами и лимфоцитами, а толстой кишки - гиперемией верхушек складок с увеличением числа бокаловидных клеток слизистой оболочки и нарушением микроциркуляции

2 Впервые в экспериментальном исследовании выявлено ингибирующее действие антигенов грибов А Пауив на процесс миелопоэза, проявляющееся снижением индекса созревания нейтрофилов костного мозга

3 Впервые установлены изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности, возникающие при длительном перо-ральном введении антигенов грибов А,Аауи5 экспериментальным животным Показано, что изменения клеточного иммунитета в динамике эксперимента характеризуются закономерными изменениями содержания в периферической крови общего количества лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов, в том числе Т-лимфоцитов, увеличением содержания теофиллинчувстви-тетьных Т-лимфоцитов, снижением содержания Т-лимфоцитов со средне- и высокоаффинными Е-рецепторами, увеличением уровня РБТЛ, гуморального иммунитета - повышением уровней В-лимфоцитов, иммуноглобулинов всех классов и ЦИК, неспецифической резистентности - снижением уровней ба-зального и стимулированного фагоцитоза

4 Впервые установлена взаимосвязь между длительным воздействием на организм экспериментальных животных антигенов А Пауи&, изменениями им-муннои системы и нарушениями микрофлоры кишечника в виде снижения концентрации бесспоровых облигатных анаэробов (бактероидов и бифидобакте-рий), кишечной палочки, наличием спороносных анаэробных бактерий и спор плесневых грибов

5 Впервые дана оценка изменений клеточного и гуморального иммунитета у больных острой дизентерией детей при колонизации кишечника грибами А Пауив Показано, что изменения иммунной системы характеризуются достоверным снижением соотношения СП4+ и СЭ8+ субпопуляций Т-лимфоцитов и концентрации СЗ компонента комплемента, повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов, ^ М и ^ С в периферической крови

6 Впервые установлены изменения микрофлоры толстой кишки у детей больных острой дизентерией при котонизации кишечника грибами А Пауив, которые характеризуются снижением концентрации бифидобактерий, лактобакте-рий и бактероидов, увеличением содержания лактозонегативных и гемолитиче-

ских форм эшерихий, повышением концентрации условнопатогенной микрофлоры (клебсиелты, энтеробактер, золотистый стафилококк, иротей, грибы рода Aspergillus и Candida), а также замедлением нормализации количественного и качественного состава микрофлоры кишечника в динамике заболевания

7 При колонизации кишечника грибами A flavus у детей, больных острой дизентерией средней степени тяжести, впервые установлены особенности течения заболевания, клинически проявляющиеся удлинением продолжительноеги острого периода, в т ч синдромов инфекционного токсикоза и диареи

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1 Больным острой дизентерией детям при выявлении колонизации кишечника грибами A flavus рекомендуется проведение иммунологического обследования, включающего исследование Т- и В - систем иммунитета, и неспецифической резистентности

2 С целью выявления изменений Т-системы, связанных с воздействием антигенов грибов A. flavus, у больных острой дизентерией показано определение уровней CD3+, CD4+, CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови

3 С целью выявления изменений гуморальной системы иммунитета, связанных с воздействием антигенов A flavus, показано определение В-лимфоцитов с фенотипом CD20+ в периферической крови, определение в сыворотке крови СЗ и С4 компонентов комплемента, уровня циркулирующих иммунных комплексов, концентрации иммуноглобулинов класса А, М и G

4 Для выявления изменений неспецифической резистентности, связанных с воздействием антигенов гриба A flavus, показано исследование базаль-ного и стимулированного фагоцитоза

5 Изменения микрофлоры кишечника, обусловленные A flavus, целесообразно выявлять и корректировать в ранние сроки (на 2-3 день болезни) развития острой дизентерии у детей

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1 Длительное поступление в желудочно-кишечный тракт экспериментальных животных антигенов A flavus вызывает изменения клеточного и гуморального иммунитета и неспецифической резистентности, проявляющиеся снижением содержания лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови, индекса созревания нейтрофильных гранулоцитов костного мозга, уровней базального и стимулированного фагоцитоза, содержания и функциональной активности Т-лимфоцитов, повышением в периферической крови уровней B-лимфоцитов, циркулирующих иммунных комплексов, иммуноглобулинов классов М, G, А, сочетающиеся с нарушениями качественною и количественного состава кишечной микрофлоры

2 У животных при экспериментам,ном местном воздействии антигенов А ЯауиБ развивается выраженная воспалительны реакция тканей тонкой и толстой кишки

3 Колонизация кишечника грибами рода А. Пауш при острой дизентерии средней степени тяжести у детей сопровождается достоверными изменениями иммунной системы - снижением соотношения СЕ>4+ и С08+ субпопутяций Т-лимфоцитов концентрации СЗ и С4 компонентов комплемента, повышением уровня циркулирующих иммунных комплексов и юнцентрации % М и 1ц С н периферической крови

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы исследований доложены на заседании областного общества аллергологов и иммунологов (Ростов-на-Дону, 2004), на городской конференции молодых ученых (Ростов-на-Дону, 20041

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 139 страницах Состоит из введения, 4 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы Библиография содержит 251 источник, из них 94 отечественных и 157 иностранных Работа иллюстрирована 35 табчицами и 35 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Работа выполнена в Военно-Медицинской академии имени С М Кирова г Санкт-Петербург

В детском инфекционном отделении Центральной Городской Больницы г Ростова-на-Дону было обследовано 212 детей (возрастной группы 7-14 лет), больных острой дизентерией средней степени тяжести, вызванной преимущественно Э Псхпеп (серовар 2а)

Контрольную группу составили 50 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту с детьми опытной группы, имевших отрицательные результаты лабораторных исследований на 8 Яехпа I, 8 5оппе1, А Пау'Нй

В экспериментальных исследованиях был использован штамм А ПауиБ Р-1118, выделенный в лаборатории живых культур грибов Российского центра по глубоким микозам г Санкт-Петербурга Грибы выращивали в жидкой среде Са-буродо 7-го дня роста, чтобы исключить воздействие на экспериментальных

животных токсических метаболитов, в первую очередь афлатоксинов, которые выделяются, начиная с 8-10 суток роста на жидкой среде

Экспериментальные исследования были проведены на 92 кроликах, породы Шиншилла массой 2,8-3,0 кг

Методы исследований

Обследование детей включало сбор анамнеза, клинический осмотр, лабораторные методы исследования Этиопогический диагноз дизентерии устанавливался на основании клиыико-эпидемиолошческих и лабораторных данных результатов бактериологических и серологических исследований и посева испражнений с определением состава микрофлоры

Всем больным выполнены клинический анализ крови и мочи, копроцито-логическое исследование кала, посевы кала с целью выделения возбудителя Контрольные посевы кала выполнялись на 4, 6, 8 и 9 сутки от начала антибактериальной терапии Исследование иммунной системы у больных острой дизентерией детей проводили на высоте клинических проявлений заболевания

Маркеры субпопуляций лимфоцитов определяли с помощью монокло-нальных антилимфоцитарных антител к дифференцировочным антигенам (CD -Claster Differentiation) поверхности клеток (МКАТ) в реакции непрямой мембранной иммунофлюоресценции на поли-Д-лизине (Sigma, Германия) в модификации М Metha et al [1983]

Нефелометрическим методом на приборе "ELICA" определяли активность СЗ и С4 компонентов юмплемента по W R Kobb [1979] в модификации В И Шкурка и Е И Емец [1990]

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли по М Digeoni et al (1977) Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов классов М, G, Апроводили по В В Меньшикову (1987)

Для определения Т-лимфоцитов у животных использовали тест спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана Определение теофиллинчув-ствительных и теофиллинрезистентных Т-лимфоцитов периферической крови у животных проводили методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами мыши, до и после обработки Г-лимфоцитов теофиллином

Функциональную активность Т-лимфоцитов периферической крови у животных оценивали в реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с КонА Для оценки цитопатогенного действия лимфоцитов использовали тест деструкции монослоя аплогенных фибробластов по Труновой и соавт (1966) Показатели фагоцитарной реакции полиморфноядерных леикоцитов (ПМЯЛ) крови определяли, используя тест-систему, производства НПКО «Реакомплекс»

Изучали миелограмму и определяли индекс созревания нейтрофилов, за который принимали соотношение молодых незрелых форм (миелобластов, про-миелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) к зрелым клеточным элементам (па-лочкоядерным и сегментоядерным)

Для определения степени интоксикации организма кроликов использовали методику, предложенную ТФ Шевченко [1983]

Выделение грибов из испражнений детей, больных острой дизентерией, проводили до начала антибиотикотерапии В целях идентификации родовой принадлежности, чистую культуру гриба выделяли на чашках со средой Сабуро, содержащей антибиотики Результаты роста оценивали макро - и микроскопически на 2-3 и 7-8 день роста

В работе использовали 5 штаммов А.ПаУия, выделенных у здоровых детей и 40 - выделенных у больных острой дизентерией детей

Для выявления антигенной активности микромицетов А Лаучя в изолированные сегменты тонкой кишки кроликов вводили взвесь грибов А Аауш, а также фильтрат грибов А Пауив, который получали фильтрованием среды Сабуро с выросшими на ней А ЯауиБ

Результаты экспериментального воздействия А ПауЧБ на тонкую кишку оценивали через 24 часа по внешнему виду изолированных участков кишки и характеру экссудата, объему жидкости и длине сегментов, вычисляя индекс ди-татации - отношение объема экссудата к длине сегмента Реакцию считали по-тожительной, при индексе дилатации более единицы

Изучение макро- и микроскопических гистологических изменений толстой кишки было проведено на кроликах после ежедневного (в течение 1 месяца) введения фильтрата А Пауиз в ротовую полость животных

Объем проведенных иммунологических исследований представлен в

габл 1

Таблица 1

Объем иммунологических исследований у детей, больных острой дизентерией___

Название исследования объем Методика и реактивы

Исследование мембранных маркеров субпопуляций лимфоцитов 193 Реакция непрямой мембранной иммунофлюоресцепции [по МеЛа й а1, 1989]

Исследование иммуноглобулинов А М, в 193 Метод простой радиальной имму-нодиффузии в геле [по в Малаш 19651

Исследование ЦИК 188 по ОО^еоп, 1976

Оценка В-звена иммунного статуса 193 Реакция непрямой мембранной иммунофлюоресцепции [по МеЛа ег а! ,1989]

Определение активности СЗ и С4 компонентов комплемента 126 Нефелометрический метод [по КоЬЬ XV, 1979]

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с правилами вариационной статистики, графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Excel 2ООО В тексте, таблицах и на рисунках представлены средние значения исследуемых показателей и средняя квадратическая ошибка Определение значимости различия показателей между сравниваемыми выборками проводили с использовани-

ем параметрического критерия I Стыодента Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (р<0,05)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Нами изучены изменения абсолютного содержания лейкоцитов, нейтро-филов, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и их субпопуляций в периферической крови экспериментальных животных (47 опытных и 29 контрольных кроликов), подвергшихся воздействию антигенов А Пауцв

При этом установлено, что через одну неделю после начала перорллыюго введения в организм животных антигенов А Аауив развивалась абсолютная лейкопения, с четвертой по двенадцатую недели - абсолютный лейкоцитоз, к 16-и неделе вновь сменившийся лейкопенией (табл 2)

Таблица 2

Динамика содержания абсолютного количества лейкоцитов в периферической

крови у животных опытной и контрольной групп

Сроки наблюдения (в неделях) Содержание лейкоцитов в периферической крови, х10 /л Р

Контрольная группа (N=47) М ± ш Опытная группа (N=29) М ± т

1 7,9 ±0,11 2,7 ±0,10 <0,05

4 7,8 ±0,12 8,2 ±0,90 >0,05

8 8,5 ±0,16 11,8 ±0,15 <0,05

12 8,3 ±0,16 13,1 ±0,22 <0,05

16 8,4 ±0,17 6,7 ±0,31 <0,05

Примечание р - достоверность различий между группами

Исследования выявили достоверное снижение абсолютного числа поли-морфноядерных нейтрофилов, особенно выраженное через неделю от начала введения антигенов (табл 3), а также достоверное снижение индекса созревания нейтрофилов на протяжении всего эксперимента (табл 4)

Таблица 3

Динамика содержания абсолютною количества полиморфноядерных нейтрофилов у животных опытной и контрольной групп__

Сроки наблюдения (в неделях) Содержание ПМЯЛ в периферической крови, \ 109/л Р

Контрольная группа (N=47) М ± ш Опытная группа (N=29) М ± ш

1 29,6 + 0,36 4,4 ±0,18 <0,05

4 28,3 ±0,38 8,6 ±0,37 <0,05

8 30,2 ±0,51 12,2 ± 0,53 <0,05

12 29,8 ±0,46 8,7 ± 0,34 <0,05

16 31,7 ±0,48 8,11 ±0,36 <0,05

Примечание р-достоверность различий между группами

Таблица 4

Изменение индекса созревания нсйтрофилов у животных опытной и контрольной групп______

Сроки наблюдения (в месяцах) Индекс созревания нейтрофилов, уе Р

Контрольная группа (N=47) М ± ш Опытная группа (N=29) М ± ш

1 0,70 ± 0,04 0,39 ±0,05 <0,05

2 0,72+0,04 0,56 ± 0,04 <0,05

3 0,68 ±0,04 0,37 ± 0,05 <0,05

4 0,76 ± 0,04 0,42+0,04 <0,05

Примечание р - достоверность различий ме.кду группами

Уровень базального фагоцитоза у животных опытной группы к исходу 2 недели эксперимента был достоверно ниже показателей контроля, к 8 неделе он достигал уровня контроля и к концу эксперимента вновь снижался Активность стимулированною фагоцитоза была достоверно ниже контроля на протяжении всего эксперимента (табл 5)

Таблица 5

Характеристика уровней базального и стимулированного фагоцитоза (фагоцитарный индекс) у животных опытной и контрольной групп_

Сроки наблюдения (в неделях) Контрольная группа (N=47) М ± т Опытная группа (N=29) М ± т

Еазальный фагоцитоз (ФИ-%) Стимулирован-ныГ фагоцитоз (ФИ-%) Базальный фагоцитоз (ФИ-%) Стимулированный фагоцитоз (ФИ-%)

2 30,6+1,4 43,6 ±0,92 13,8 ±1,6* 22,7 ± 1,13*

8 32,0+1,4 43,9 ± 0,25 30,4 ±2,13 29,1 ± 1,23*

16 31,6 ± 1,4 43,7 ± 0,32 9,15 ±0,89* 17,8 ±0,94*

Примечание * - достоверность различий между показателями опытной и контрольной групп животных (р<0,05)

Антигены АПауш вызывали у экспериментальных животных в первые 3 месяца повышение общего уровня циркулирующих в крови Т-лимфоцитов, прежде всего за счет повышения содержания субпопуляции тсофиллинчувстви-тельных Т-лимфоцитов, сопровождавшееся снижением доли теофиллинрези-стентных Т-лимфоцитов В последний месяц эксперимента наблюдалось достоверное снижение абсолютного содержания Т-лимфоцитов (табл 6)

Относительный уровень В-лимфоцитов был достоверно выше контроля на протяжении всего эксперимента (табл 7)

Повышенный уровень ЦИК был выявлен на протяжении всех 12 недель наблюдения за животными

Уровень иммуноглобулинов всех классов на 4 неделе эксперимента повышался, а затем в последнюю неделю достоверно снижался

Таблица 6

Изменение абсолютного содержания Т-лимфоцитов в периферической

Сроки наблюдения (в месяцах) Содержание Т-лимфоцитов, тыс в 1 мкл Р

Контрольная группа (N=47) М ± m Опытная группа (N=29) М ± m

1 2,36 ±0,03 2,86 ±0,08 <0,05

2 2,24 ±0,04 3,44 ±0,06 <0,05

3, 2,56 ±0,04 3,48 ±0,07 <0,05

4 2,52 ± 0,033 1,69 ±0,07 <0,05

Примечание р — достоверность различий между группами

Таблица 7

Динамика относительного содержания В-лимфоцитов периферической крови у животных опытной и контрольной групп__

Сроки наблюдения (в месяцах) Содержание В-лимфоцитов в периферической крови,% Р

Контрольная группа (N=47) М ± ш Опытная группа (N=29) М ± ш

1 16,6 ±0,5 21,2 ±0,6 <0,05

2 16,4 ± 0,5 19,3 ±0,7 <0,05

3 12,5 ±0,5 16,6 ±0,5 <0,05

4 14,1 ±0,7 17,4 ±0,7 <0,05

Примечание р - достоверность различий между группами

С целью изучения изменений морфологии тонкой кишки под действием антигенов грибов А Пауив был использован метод выделения изолированных лигатурами сегментов тонкой кишки кроликов

В первой серии опытов на животных изучали влияние суспензии А Аауив на изолированные участки тонкой кишки, при этом во всех случаях воздействия выявили отрицательную реакцию, для которой было характерно отсутствие гиперемии и дилатации изолированных сегментов тонкой кишки Экссудат, находившийся в просвете кишки, представлял собой серозную жидкость, без примесей крови и слизи

В следующей серии экспериментов в просвет изолированных сегментов тонкой кишки кроликов вводили фильтраты А-Пауив Фильтраты готовили из штаммов А Пауиэ, выделенных у здоровых и больных острой дизентерией детей

При исследовании установлено, что из 5 штаммов А ПауиБ, выделенных у здоровых детей, 2 вызывали положительную реакцию (ИД>1), 3 - отрицательную (ИД<1) Из 40 штаммов, выделенных у больных острой дизентерией детей, 19 вызывали резко выраженную реакцию (ИД>2,0), 14- выраженную реакцию (ИД>1,0), 5 - отрицательную реакцию (ИД<1,0) (табл 8)

Таблица 8

Реакция изолированных сегментов тонкой кишки крочиков на введение суспензии и фичьтратоп А Пауня___

Формы А ПауиБ Штаммы А-йаУив выделенные у больных острой дизентерией (40 штаммов) Штаммы А Пауиз выделенные у детей контрольной группы (5 штаммов)

Положительная реакция Отрицательная реакция ИД<1,0 Положительная реакция Отрицательная реакция ИД<1,()

ИД>2,0 ИД >1,0

ИД>2,0 ИД>1,0

Суспензия - - 40 - - 5

Фильтраты 19 16 5 0 2 3

Для положительной реакции на воздействие антигенов А Пауив макроскопически были характерны гиперемия и дилатация изолированных сегментов тонкой кишки Экссудат, находящийся в просвете изолированных участков кишки, представлял собой желтую серозную жидкость, которая при сильно выраженной реакции содержала примеси слизи и крови

При изучении макро- и микроскопических гистологических препаратов стенки толстой кишки у 2/3 опытных животных (67,2%) было выявлено наличие воспалительных и деструктивных изменений слизистой оболочки с наибольшими изменениями в криптах Нарушение морфологического состояния слизистой оболочки толстой кишки проявлялось к ж в отеке тканей кишки, так и умеренной гиперемии верхушек складок слизистой оболочки, увеличении количества бокаловидных клеток

Изменения состава кишечной микрофлоры у экспериментальных животных характеризовались снижением концентрации бесспоропых облигатных анаэробов (бактероидов и бифидобактерий) и кишечной палочки, наличием спороносных анаэробных бактерий и спор плесневых грибов (табл 9)

Таблица 9

Состав микрофлоры толстой кишки у животных опытной и контрольной групп

Микроорганизмы Концентрация микроорганизмов в толстом кишечнике кроликов, КОЕ/г) Р

Контрольная группа (N=47), М ± ш Опытная группа (N=29), М±ш

Бифидобактерии 6,38+0,42 1,7210,54 <0,05

Лактобактерии 2,58±0,57 1,8510,34 >0,05

Бактероиды 8,41 ±0,48 3,3610,58 <0,05

Эшерихии 5,46±0,24 1,4510,42 <0,05

Спорообраз анаэробы 0,4410,12 3,7910,30 <0,05

Примечание р - достоверность риличии ме кду группами

Анализ клинического течения острой дизентерии средней степени тяжести пыявил, что, без колонизации кишечника грибами рода А Паут, заболевание в 93% случаев протекало по типичному кочитическому варианту, в то же время у детей с колонизацией кишечника грибами гастроэнтероколитичсский вариант встречался в 10 раз чаще (табл 10)

Таблица 10

Клинические варианты и характер течения острой дизентерии средней степени тяжести у детей, с колонизацией и без колонизации кишечника I рибами А Пауив

Клинические варианты и характер течения дизентерии Острая дизентерия средней тяжести (N=212)

Без колонизации ь ишечника грибами С колонизацией кишечника грибами

Абс % Абс %

Клинические варианты Колитическии Гастроэнтероколитический 116 8 93 7 28 60 32 68

Характер течения

Острое 122 98,3 75 85,2

Затяжное 2 1,7 13 14,8

При колонизации кишечника грибами рода А Лауш, острая дизентерич у дегей характеризовалась замедлением инвочюции симптомов интоксикации и нормализации частоты и характера стула (табл 11)

Таблица 11

Средняя продолжительность клинических проявчений острой дизентерии средней степени тяжести у .детей с выделением и без выделения из кишечника грибов А ПауИБ_______

Симптомы Продолжительноегь клинических проявлении, дни

Больные острой дизентерией без выявления грибов, (N=20) Больные острой д'изен-тсриеи с выявлением трибов, (N=30)

Инфекционный токсикоз 4,23±0,21 3,49±0,19*

Вялость 2,88+0,22 2,21+0,11*

Снижение аппетита 3,53±0,20 2,25+0,12

Лихорадка 2.75+ОД8 2,18+0,17*

Рвота 1,27+0,12 2,06±0,15

Боли в животе 2,33±0,21 2,14±0,32

Диарейиый синдром 6,37±0,38 4,08±0,26

Примечание * - достоверность различий между группами (р <0,05)

Было установлено, что у больных с колонизацией кишечника грибами наблюдалось достоверно более низкое содержание нормальной микрофлоры кишечника (бифидобактерий, лактобактерий, бактероидов) и увеличение количества условно-патогенных микроорганизмов (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella) (табл 12)

Таблица!2

Содержание и состав микрофлоры то а стой кишки у детей больных проявлений острой дизентерии средней степени тяжести с колонизацией и без колонизации кишечника грибами__1__ ^_

Содержание и состав микрофлоры толстой кишки у детей Больные острой дизентерией без выявления грибов, (п=56) Больные острой дизентерией с выявлением грибов, (п=88) Р

Бифидобактерии, (^ КОЕ/г) 5,46 ± 0,24 4,16 + 0,28 <0,05

Бактероиды, (1^ КОЕ/г) 6,37 ±0,33 5,24 + 0,23 <0,05

Клостридии.Оя КОЕ/г) 2,50 ±0,29 2,03 ±0,34 >0,05

Лактобактерии, КОЕ/г) 6,24 ±0,28 5,52 ±0,29 <0,05

Кишечная палочка с нормальной ферментативной активностью, (1й КОЕ/г) 6,43 ±0,34 4,14±0,19 <0,05

Кишечная палочка с пониженной ферментативной активностью, (1й КОЕ/г) 5,33 ±0,48 6,03 ±0,24 >0,05

Кишечная палочка лактозонега-тивпая.Ой КОЕ/г) 5,57 ±0,36 6,64 ±0,26 <0,05

Другие условно-патогенные бактерии семейства ШегоЬасЮТасеае, 0Я КОЕ/г) 4,21 ±0,14 5,21 ±0,33 <0,05

Энтерококки,(1й КОЕ/г) 5,90 ±0,27 5,50 ±0,28 >0,05

Общее количество стафилококков, (1й КОЕ/г) 5,30 ±0,29 5,50 ±0,21 >0,05

Золотистый стафилококк, (1й КОЕ/г) 2,33 ±0,40 2,00 ±0,29 >0,05

Примечание р - достоверность различий между группами

Исследования также выявили, что колонизация кишечника грибами рода А Яа\015 сопровождается изменениями иммунной системы детей, больных острой дизентерией

В частности, у больных основной группы (тес колонизацией кишечника грибами), достоверно снижалось соотношение Т-лимфоцитов (С04+/С08+) и уровень В-лимфоцитов с фенотипом СЭ20+, наблюдалось'более выраженное достоверное повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов, сни-

жение концентрации СЗ компонента комплемента в сыворотке крови (табл 13, табл 14)

Таблица 13

Содержание Т-лимфоцитов у больных острой дизентерией детей с колонизацией и без колонизации кишечника грибами рода А Пауш__

Показатели Больные острой дизентерией без колонизации кишечника грибами, (N=48) Больные острой дизентерией с колонизацией кишечника грибами, (N=35) Р

СОЗ+Т-ли'мф , кл/мкл 1181 ±65,4 1079±44,0 >0,05

СОЗ+Т-лимф , % 44,7+2,1 43,7+2,1 >0,05

СБ4ч Т-лимф , кл/мкл 723,5 ± 59,0 623,5±5 6,0 >0,05

С04+Т-лимф , % 32,4+3,5 28,7+3,3 >0,05

С08+Т-лимф , кл/мкл 391,4 ±30,0 365,1±72,0 >0,05

С08+Т-лимф , % 15,6+1,0 15,7±1,1 >0,05

С04/СР8, уе 2,40±0,05 1,89+0,12 <0,05

Примечание р — достоверность различий между группами

Таблица 14

Характеристика гуморального иммунитета у детей, больных острой ди-зенгерией с колонизацией и без колонизации кишечника грибами А.Ааущ._

Показатели Больные острой дизентерией без колонизации кишечника грибами, (N=48) Больные острой дизентерией с колонизацией кишечника грибами, (N=35) Р

С020+В-лимф , % 13,09 ±0,3 14,14±0,6 >0,05

С[)20+В-лимф , кл/мкл 379,2±33,2 361,3±44,7 >0,05

[д А, мг/мл 1,16±0,02 1,19+0,03 >0,05

М, мг/мл 1,14+0,05 1,19±0,07 >0,05

в, мг/мл 15,11±0,31 15,44±0,22 >0,05

СЗкомпон комплемента, мг/100 мл 46,1 ±4,3 32,2 ± 3,3 <0,05

С4компон комплемента, мг/100 мл 16,4 ±5,6 13,8 + 4,1 >0,05

ЦИК, уе 185,0+20,0 360,0+20,0 <0,05

Примечание р - достоверность различий между группами

ВЫВОДЫ

1 Длительное поступление в организм экспериментальных животных пищи, содержащей антигены ААауш, вызывает изменения клеточного и гуморального иммунитета, проявляющиеся достоверным снижением общего числа лимфоцитов, уровня и функциональной активности Т-лимфоцитов, повышением содержания В-лимфоцитов, М, ^ (3, А, а также ЦИК в периферической крови

2 Длительное поступление в организм экспериментальных животных пищи, содержащей антигены A flavus, вызывает изменения неспецифической резистентности, характеризующиеся достоверным снижением общего числа лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и индекса созревания нейтрофиль-ных гранулоцитов костного мозга, уровней базалыюго и стимулированного фагоцитоза

3 Изменения клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности, возникающие при длительном поступлении в организм экспериментальных животных пищи, содержащей антигены A flavus, сопровождаются нарушениями качественного и количественного состава кишечной микрофлоры

4 У животных при экспериментальном местном воздействии антигенов A flavus возникают выраженные воспалительные изменения тканей кишечника, характеризующиеся гиперемией и дилатацией сегментов тонкой кишки, инфильтрацией ее стромы лейкоцитами и лимфоцитами, нарушением процессов микроциркуляции толстой кишки с развитием гиперемии верхушек складок слизистои оболочки и увеличением числа бокаловидных клеток

5 Котонизация грибами рода A flavus кишечника детей, больных острой дизентериси средней степени тяжести, сопровождается достоверными изменениями клеточного, гуморального иммунитета и неспецифической резистентности, характеризующимися снижением соотношения CD4+ и CD8+ субпопуляций 1-лимфоцитов (CD4+/ CD8+), концентрации в периферической крови СЗ и С4 компонентов комплемента, повышением уровней Ig М, Ig G и циркулирующих иммунных комплексов, формированием нарушений состава микрофлоры кишечника, особенностями клинического течения заболевания большей продолжительностью острого периода, в т ч синдромов интоксикации и диареи, замедлением нормализации стула, снижением санирующей эффективности лечения

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Больным острой дизентерией детям при выяплении колонизации кишечника грибами A flavus рекоменд>е1ся проведение иммунотогического обследования, включающего исследование Т- и В - систем иммунитета, и неспецифической резистентности

2 С целью выявления изменении Т-системы, связанных с воздействием аггтигенов грибов A flavus, у больных острой дизентерией показано определение уровней CD3+, CD4+, CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови

3 С целью выявления изменений гуморальной системы иммуншета, связанных с воздействием антигенов A flavus, показано определение В-лимфоцитов с фенотипом CD20+ в периферической крови, определение в сыворотке крови СЗ и С4 компонентов комплемента уровня циркулирующих иммунных комплексов, концентрации иммуноглобулинов класса А, М и G

4 Для выявления изменении неснецифическои резистентности, связанных с воздействием антигенов гриба A flavus, показано исследование базаль-ного и стимулированного фагоцитоза

5 Изменения микрофлоры кишечника, обусловленные A flavus, целесообразно выявлять и корректировгть в ранние сроки (на 2-3 день болезни) развития острой дизентерии у детей

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Митин 10 А Воздействие антигенов [риба A flavus на микрофлору толстого кишечника здоровых и больных иодей / 10 А Митин, OA Углина // Материалы научно-практической конференции, Военно-медицинская академия им С М Кирова-С Петербург-2005

2 Митин Ю А Воздействие антигенов гриба A flavus на изменения в иммунной системе / Ю А Митин, О А Углина //Материалы научно-практической конференции,Военно-медицинская академия им С М Кирова-СГТБ-2005

3 Митин ЮЛ Клинические и экспериментальные данные об изменениях клеточного, гуморального иммунитета и неснецифическои резис!еншости, обусловленных Aspergillus flavus / ЮЛ Митин, О Л Углина // Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Вогнно-медицинской академии им С М Кирова «Инфекционные болезни проблемы здравоохранения и военной медицины» -СПБ-2006

4 Бслозеров Е С Современные проблемы микозов /ЕС Белозсров, О А Углина // Медлайн Экспресс -СПб -№5-'Ю05 - С 44^-5

5 Белозеров Е С Грибы как фактор негладкого течения дизентерии у детей / Е С Белозеров, О А Углина // Медлайн Экспресс -СПб -№8-2005 - С 134

6 Угтона О А Боремся с аллергией / О А Углина // Панацея-СПБ-№2-2005-С 16-17

7 Углина OA Варианты патологии иммуннои системы / О А Углина // Па-нацея-СПБ-№3-2005-С 20 21

8 Митин Ю А Микомицеты как кофактор 1ечения дизентерии у детей / К) А Митин, А С Нестеров, OA Углича//Сибирь-Восток9 - 2006

9 Митин Ю А Влияние микомицетов A flavus па течение дизентерии у детей /ЮЛ Митин, О А Углина //Военно Медицинский журнал-Москва - №4, -2007 - С 64

Подписано в печать 45.Ор.ОУ Формат60x84 '/,

Объем 1 пл_Тираж юо зкз_Заказ № Ч15

Типография ВМедА, 194044, СПб , ул Академика Лебедева, 6