Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток

ъг

На правах рукописи

/

ПРОНКИНА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

Изменение показателей пролиферации и апоптоза в условиях лимфопении и восстановления Т-клеточного пула после аутологичной трансплантации стволовых кроветворных

клеток

14 00 36 - аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ

диссерт ации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2007

□ОЗОВОУЭО

003060790

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Кожевников Владимир Сергеевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Аугеншлюс Александр Исаевич

кандидат биологических наук Силков Александр Николаевич

Ведущая организация:

Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН

Защита состоится «¿43» 2007 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 001 001 01 ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу 630099, г Новосибирск, ул Ядринцевская,14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_20071

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук - Кудаева Ольга

Тимофеевна

ОБДИЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Постоянство численности клеток лимфоидных популяций обеспечивается балансом их образования (за счет пролиферации) и гибели (как правило, по механизму апоптоза) (Freitas А , et al 2000) Баланс между двумя этими процессами определяет Т-клеточный гомеостаз в организме Интенсивность пролиферации наивных Т-лимфоцитов (C.D45RA4) у взрослых людей минимальная С помощью определения маркера пролиферирующих клеток Ki-67 установлено, что m vivo пролиферирует около 1% наивных Т-клеток - в равной степени CD4+ и CD8+ (Hazenberg M D, 2003, Sachsenberg N ,1998) Количество наивных Т-клеток определяется выработкой IL-7 и содержанием дендритных клеток, несущих молекулы МНС классов I и II, а соотношение последних определяет баланс наивных Т-клеток CD8+ и CD4+ (Fry Т J, et al 2001, Vivien L , et al 2001, Mackall CrL,etal 2001, Kirberg J, et al 2001) Гомеостаз CD8+- клеток памяти реализуется с участием цитокинов, среди которых основная роль принадлежит IL-15, а вспомогательная IL-7 (Melchionda F , et al 2005, Alpdogan О , et al 2005) Гомеостаз клеток памяти (CD45RO+) минимально зависит от молекул МНС (Tanchot С , et al 1997, Cho В К , et al 2000) Механизмы гомеостатического контроля СШ+-клеток памяти мало изучены В условиях Т-лимфопении механизмы пополнения наивных Т-клеток отличаются от таковых при нормальном содержании Т-клеток Они проявляются в форме гомеостатической пролиферации, которая сопровождается сменой мембранного и функционального фенотипа на фенотип клеток памяти без промежуточного этапа активации и без дифференцировки в эффекторные клетки (Tough D F , et al 1994, Wu Z , et al 2003, Mahajan V S , et al 2005)

Численность ежедневных мигрантов из тимуса и Т-клеток, новообразованных в результате периферической экспансии, должна уравновешиваться числом Т-клеток, подвергающихся апоптозу (Tanchot С , et al 1997, Romanyukha А А , et al 2003) Зрелые Т-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в покоящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора и экспрессируют протоокоген Вс1-2, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза (Karawajew L, et al 2000) Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при различных воздействиях -повторной стимуляции через перекрестное сшивание рецепторов или недостатке факторов роста (IL-2) и т д (Dooms H , et al 2004, Karas M, et al 1999) Апоптоз может развиться и в процессе активации - например, в случае предварительного связывания молекул CD4, при отсутствии костимуляции Т-клеток через CD28 (Prlic M, et al 2001) После дифференцировки Т-лимфоцитов в эффекторные клетки и Т-клетки памяти в них также экспрессируется Вс1-2, и они временно приобретают устойчивость к индукторам апоптоза В реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы и от его осуществления зависят многие важные процессы, реализуемые на уровне организма (Badley A D, et al 2000)

Изучению процессов, поддерживающих клеточный гомеостаз, посвящено много отечественных и зарубежных исследований, что в значительной степени определяется потребностью в точных знаниях о закономерностях восстановления популяций и субпопуляций лимфоцитов, что находит отражение в их функциональном состоянии, включая и соотношение Т1/Т2-отвеюв (Jameson S С 2002, Guimond M, et al 2005, Yusuf I, et al 2003) Это характерно при

заболеваниях (СПИД), после действия повреждающих факторов (облучение, химиопрепараты), а также после пересадки костного мозга При патологии изменяется процент клеток, подвергшихся апоптозу и процент клеток, вступивших в периферическую экспансию, а также изменяются взаимосвязи этих двух процессов Большой интерес вызывают процессы восстановления Т-клеток после их деплеции По данным литературы на апоптоз Т-клеток при ВИЧ-инфекции могут влиять моноциты (Oyaizu N, et al 1993, Sperber К, et al 2003), поэтому вызывает интерес параллельное исследование процессов гомеостаза моноцитов и Т-лимфоцитов Кроме того, интенсивно изучаются механизмы восстановления субпопуляций Т-лимфоцитов CD4+- и СВ8+-клеток, которые отличаются по скорости восстановления Как известно, С04+-клетки восстанавливаются через год и более после трансплантации костного мозга, а С08+-клетки - уже через 6 месяцев (Guillaume Т, et al 1998, Mackall Cr L et al 1997) Восстановление клеточного пула после ТКМ происходит в основном за счет клеток памяти, а они, как известно, более подвержены апоптозу, чем наивные клетки (Porrata L F , et al 2001, Mackall Cr L et al 2005) Являясь наиболее радикальным способом лечения гемобластозов, АТПСКК, тем не менее, не всегда приводит к излечению, и уже в течение первого года в 22 — 40% случаев возникает рецидив заболевания Возникновение рецидива связано со многими причинами Совокупность факторов, таких как, статус заболевания (полная, частичная ремиссия или резистентное течение) на момент трансплантации, его стадия, предлеченность, нозология заболевания и возраст больного имеет определенное прогностическое значение в исходе трансплантации (Cortelazzo S , et al 1999) В доступной нам литературе, тем не менее, нет данных о зависимости процессов восстановления Т-клеточного пула с исходом трансплантации, однако в литературе есть данные о разной репопулирующей способности С034+-клеток в зависимости от стадии клеточного цикла (Uchida N, et al 1997, VoermansC ,etal 2001)

Изучение взаимосвязей между пролиферацией и апоптозом CD4+- и CD8+-клеток у больных гемобластозами до и после АТПСКК (в разных временных точках восстановления гемопоэза), а также у ВИЧ-инфицированных пациентов, актуально для понимания процессов восстановления Т-клеточного гомеостаза Цель исследования Исследовать взаимосвязь апоптоза и пролиферации CD4+- и СБ8+-клеток периферической крови с процессами восстановления количественных и функциональных характеристик Т-лимфоцитов при лимфопении различного генеза и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток

Задачи исследования

1 Исследовать показатели апоптоза и фаз клеточного цикла CD4+- и CD8-- клеток и моноцитов у больных гемобластозами до и после АТПСКК и у ВИЧ-инфицированных пациентов

2 Оценить особенности показателей апоптоза и фаз клеточного цикла CD4+- и CD8+-клеток у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК

3 Исследовать показатели фаз клеточного цикла стволовых кроветворных клеток продукта сепарации у больных гемобластозами с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК

4 Исследовать показатели наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в периферической крови у больных гемобластозами до и после АТПСКК

5 Определить относительное количество CD4+ и CD8" Т-лимфоцитов периферической крови, продуцирующих IFN-y и IL-4 в ответ на неспецифическую поликлональную стимуляцию у больных гемобластозами до и после АТПСКК и относительно здоровых доноров Научная новизна В работе впервые показано, что как в норме, так и у больных гемобластозами после химиотерапии и у ВИЧ-инфицированных пациентов количество имму некомпетентных клеток (CD4 -, CD8 -клеток и моноцитов) в S,G2/M фазах клеточного цикла прямо взаимосвязаны между собой При этом положительная корреляционная взаимосвязь между показателями апоптоза и пролиферации CD4+-t0ieT0K характерна только для группы здоровых лиц Показано, что пролиферативная активность СЕМ+-клеток прямо зависит от выраженности лимфопении как у ВИЧ-инфицированных больных, так и у больных гемобластозами до АТПСКК

Впервые показано, что у больных с ранним рецидивом основного заболевания после АТПСКК, по сравнению с больными о благоприятным течением, при исследовании до курса мобилизации более выражена CD4+-лимфопения, повышено количество С04+-клеток в 8,02/М-фазах клеточного цикла, повышено количество CD4+CD45RA+-joieTOK, а также количество CD34+-клеток в S,G2/M-фазах клеточного цикла среди трансплантируемых клеток Показано также, что для этих больных характерно прогрессирующее снижение количества наивных CD4+CD45RA+-iaieTOK после АТПСКК

Научно-практическая значимость работы Полученные данные продемонстрировали однотипность изменения взаимосвязей апоптоза и пролиферации С1Э4+-клеток в условиях лимфопении различного генеза Важным итогом работы явилось также положение о разном соотношении механизмов восстановления Т-клеточного пула (гомеос гатической пролиферации, лимфопоэза, тимопоэза) при благоприятном исходе АТПСКК и при развитии раннего рецидива заболевания, которому предшествует недостаточное (по сравнению с благоприятным течением) восстановтение Т-клеток в количественном и функциональном плане

Результаты исследования обосновывают важность проведения у больных гемобластозами на этапах подготовки к АТПСКК дополнительных лабораторных исследований, включая показатели апоптоза и клеточного цикла субпопуляций иммунокомпетентных клеток Выявление различий механизмов восстановления Т-клеточного пула у больных гемобластозами с разным исходом трансплантации дает возможность прогноза эффективности АТПСКК и риска развития инфекционных осложнений в период восстановления кроветворения

Основные положения, выносимые на защиту

1 Повышение показателей апоптоза и S,G2/M фаз клеточного цикла Т-лимфоцитов периферической крови отражает активацию пролиферации клеток в процессе восстановления Т-клеточного пула как при лимфопении (при ВИЧ-инфекциии и после ПХТ при гемобластозах), так и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток

2 Благоприятный исход АТПСКК при гемобластозах характеризуется восстановлением Т-клеточного пула с участием наивных клеток и характеризуется возрастанием количества Т1-клеток (Th и Тс), тогда как развитие рецидива основного заболевания после АТПСКК происходит на фоне

прогрессирующего снижения количества наивных CD4+-клеток и срыва восстановления количества Т1-клеток (Th и Тс) 3 Различия механизмов восстановления Т-клеточного пула после АТПСБСК ассоциированы с его состоянием до трансплантации и с пролиферативной активностью трансплантируемых СБ34+-клеток Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск 2005), на 7-ой отчетной конференции ГУ НИЙКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике» (Новосибирск 2006) Апробация диссертации состоялась 3 апреля 2001т на семинаре клинического отдела ГУ НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов работ соискателей ученой степени кандидата биологических наук

Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов Материал изложен на 129 страницах машинописного текста, включающего 15 рисунков и 23 таблицы Прилагаемая библиография содержит ссылки на 156 литературных источников, из них 139 зарубежных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования Клинико-иммунологические исследования проведены в 3-х группах - в группе здоровых лиц, в группе больных гемобластозами и в группе ВИЧ-инфицированных пациентов Клинико-иммунологические исследования проведены у 40 больных гемобластозами, наблюдавшихся в период с 08 2003 по 05 2006 в отделении гематологии и ТКМ клиники ИКИ СО РАМН Группа обследованных больных включала 27 мужчин и 13 женщин, возрастной диапазон которых был от 7 до 55 лет (в среднем 31,5 лет) Морфологический вариант опухоли устанавливался на основании гистологического, цитологического и иммуноцито-(гисто)-химического исследования биоптатов опухоли в соответствии с ВОЗ-классификацией лимфопролиферативных заболеваний (Harns N L , 1997) Диагноз лимфомы Ходжкина (ЛХ) был установлен у 6 больных (15%), агрессивные варианты неходжкинских лимфом (НХЛ) были диагностированы у 13 (32,5%) больных, множественная миелома у 7 человек (17,5%) и у 14 человек (35%) был установлен острый лейкоз, из них 10 человек (25%) с острым лимфобластным лейкозом и 4 человека (10%) с острым миелобластным лейкозом Всем обследованным пациентам проводилась аутологичная трансплантация периферических стволовых кроветворных клеток (АТПСКК) На момент АТПСКК у 23 человек (57,5%) регистрировалась полная ремиссия, у 10 (25%) - частичная ремиссия, у 4 (10%) - не было ремиссии и 3 человека (7,5%) имели резистентное течение заболевания Обследование больных проводилось в 6 временных точках (2 точки до АТПСКК и 4 точки восстановления после АТПСКК) Первый забор крови производился у больных до начала курса мобилизации После курса мобилизации производилось сепарирование периферических стволовых кроветворных клиок Второй забор крови производился до режима кондиционирования, третий забор

крови был в момент восстановления кроветворения (примерно через 1 месяц после АТПСКК), четвертый - через 3 месяца после АТПСКК, пятый - через 6 месяцев после АТПСКК и шестой - через 9 месяцев после АТПСКК Также было обследовано 64 ВИЧ-инфицированных пациента, наблюдавшихся в период с 06 2003 по 12 2004 в Центре профилактики и борьбы со СПИД г Новосибирска Группа обследованных больных включала 47 мужчин и 17 женщин, возрастной диапазон которых был от 20 до 35 лет (в среднем 27,5 лет) Обследование ВИЧ-пациентов проводилось до начала курса антиретровирусной терапии В качестве группы сравнения обследовано 40 здоровых доноров Забор крови у доноров производился на станции переливании крови МКБ №1

Методы исследования. Определение относительного количества CD4+CP45RO+-. CD4+CD45RA+-. CD8*CD4SRO+- и СР8*СР45КА*-лимФопитов

Анализ содержания клеток (%), несущих маркеры (CD4+CD45RO+, CD4+CD45RA+, CD8+CD45RO+,CD8+CD45RA+) в лейковзвези проводилось методом лазерной проточной цитометрии на автоматическом счетчике FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest1*0 (Becton Dickinson, США) Данный метод выполняли в соответствии с описаниями, представленными в инструкциях производителя антител и рекомендациями к проточному цитометру

Определение клеточного пикла в Т-лимфоцитах, моноцитах и СР34+-клетках.

Для определения клеточного цикла предварительно производилось поверхностное маркирование клеток моноклональными aHWi-CD4, анти-С08, анти-CD14, анти-С034 антителами Затем клетки фиксировались 1% раствором параформальдегида, пермеабилизировались 0,02$£, ..раствором _Твин-20 и инкубировались с РНКазой (20 мкг/мл) После этого производилась фиксация 5% формалином, содержащим пропидиум иодид (PI) в конечной концентрации 50 мкг/мл или 7-актиноаминомицин D (7-AAD) в конечной концентрации 20 мкг/мл Образцы анализировали на проточном цитометре FACS Cahbur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest^10 (Becton Dickinson, США) Относительное содержание клеток с гипердиплоидным (кл'е'гки в S-M фазах клеточного цикла) и с гиподиплоидным (апоптотичсские клетки) набором ДНК определяли по степени флуоресценции внутриядерного красителя PI или 7-AAD Результаты выражали в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству лимфоцитов (не менее 10000) в исследуемой области (Philpott NJ.etal 1996,Nicoletti I et al 1991,Fruenauf S ,et al 1998) Определение внутриклеточных дитокинов в субпопуляпих Т-лимФопитов.

МБК периферической крови культивировали в течение 4 часов в присутствии стимулятора РМА (30 нгр/мл), кальциевого ионофора иономицина (1 мкгр/мл) и ингибитора белковой секреции брефелдина А (10мкгр/мл) при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02 После окончания культивационного периода производилось поверхностное маркирование клеток моноклональными aHTH-CD4-PerCP или анти-CD8-PerCP антителами Затем клетки фиксировались 1% раствором параформальдегида, и пермеабилизировались 0,02% раствором Твин-20 Далее производилось внутриклеточное маркирование моноклональными анти-IFN-y-FITC и анти-1Ь-4-РЕ антителами Фиксация производилась 5% раствором формалина Относительное количество цитокин-продуцирующих клеток определяли методом трехцветной проточной цитометрии

Статистические исследования проводили по общепринятым математический алгоритмам, с использованием пакетов программ "SUslisliea V, 6.0'* (Боровиков B.U., Боровиков И.П.. 1997), "Snedccor V. 4.0"( Южаков Л.И., Сорокин ОД., 2000; Сорокин О.Д., 2004), "Иммунотитг (Гсльфгзт Е.Л. и др., 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ I. Количественная характеристика I-клеток в группа больных гомобластозами до АТПСКК и и группе ВИЧ-инфицированных пациентов.

Для того, чтобы проанализировать особенности восстановления Т-кж-точного пула при разном исходе АТПСКК, мы разделили группу больных гемобластозами па две подгруппы: 1- группа пациентов с рецидивом основного заболевания в течение года после АТПСКК и 2 - группа пациентов в длительной ремиссии. IIa первом этапе работы .мы определяли абсолютное количество Т-хлетак и периферической крови у ¡зольных гемобластоза.чи ДО АТПСКК и > ВИ'Ч-инфицированных пациен тов.

Рис.! Абсолютное количество СШ*-(Меток. Pucj2 Абсолютное количество СПЯ-кзизток

воо

700 600 500 . 400 300 • 200 10С С -

Примечание: * - р<0.01 различия с группой доноров; ti - р<0.01 различия между Подгруппами больных гемобластозами

Обследованные больные характеризовались выраженной лимфопепией субпопулхпии С1УГ-лиифоци юн. Абсолютное содержание СD-клеток у больных гемоблас! очам и не отличалось, а в группе R ИЧ - и 11 ф и 11, и ро ва иных было достоверно повышено по сравнению с группой допоров, lio данным литературы, одним из Главных условий запуска Гомеосштк легкой пролиферации лштяегея наличие лимфопении. Значительна» димфопепия Г-клеток в группе больных гемо бластоза ми и ВИЧ-инфицированных пациентов теоретически позволяе! судить о наличии процесса периферической пролиферации, поэтому на следующем этапе был проанализирован процент Т-клеток. находящихся в S,G2.M фазах клеточного цикла и процент спонтанного апоптоза Т-.клеток в периферической крови.

2. Показатели фаз клеточного цикла и апоптоза Т-клеток в группе болшых гемобласюзами до АТПСКК и ВИЧ-инфициропапиых.

Рис. 3 Относительное количество Рис.4 Относительное количество

CD4 "-клеток в S,G2'M фалах клеточного цикла

СП8*-клеток в S.G2M ¡{max кле точного цикла

го

15 10 5

о

DJIH^íl □ Р Opív^CfH.i ■ Ен-

|__

Примечание: + - р<0.01 различия е (руиной доноров; И - р<0.01 различия между НОШ руппами больных гемобластогамн

Было установлено, что у больных гемоблаетозами до АТПСКК и у ВИЧ-инфицированных пациентов относи ¡ельиое количество Т-клеток (как С Г)*)- так и Ш58+-клеток) н .Ч,(.т2/М фазах клеточного цикла значительно нышс по сравнению с группой доноров При атом самый высокий показатель смотанной С1Н-кл сточной пролиферации регистрируется в группе больных гемобяа етозами с послед; нчпнм ранним рецидивом основного заболевания после АТПСКК.

Рис. 5 Относительное количество Рис. б Относительное количество

СШ+-К леток и аиоптозе. С08~-клсток в ал™нож

1 П^при и fdlpgut ■ г^чло

О l. .:"

Примечание: * - р<0.01 различия к i рунной доноров

Тенденция к увеличению показателя аиолгоза Т-клеток наблюдается но пссх Исследуемых группах пациентов. Достоверное повышение уровня апоптоза CD4 -клеток до АТПСКК по сравнению с группой доноров было установлено в группе больных revi облает о за ми с длительной ремиссией после трансплантации, Досгонерное повышение уровня апоптоза CDS -клеток но Сравнению с группой доноров выявлено* н группе ВИЧ-инфицированных пациентов.

После проведение корреляционного анализа было выявлено, что группа доноров характеризуется положительной корреляционной взаимосвязью между процентом С1)4+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла и процентом этих клеток в апоптозе (R=0 906, р=0 005) Этот факт, по-видимому, отражает механизмы равновесия продукции и гибели Т-клеток в норме В группах больных с наличием лимфопении не обнаружено аналогичной корреляционной взаимосвязи Но в этих группах пациентов была обнаружена другая отрицательная корреляционная взаимосвязь между процентом СШ+-клеток в S,G2/M фазах клеточного цикла и процентной долей этих клеток в периферической крови (для группы гемобластозов - R- -0 486, р=0 006 для группы ВИЧ-инфицированных - R=-0 251, р=0 039) 3 Различия показателей в подгруппах больных гемобластозами до АТПСКК При сравнении средних величин показателей пролиферации Т-клеток и трансплантируемых стволовых кроветворных клеток, а также уровня наивных Т-клеток в подгруппах больных гемобластозами с разным исходом трансплантации, были установлены следующие различия этих показателей до АТПСКК (Рис 7)

Рисунок 7

Примечание представлены достоверные различия р<0 01 между подгруппами больных гемобластозами

До АТПСКК подгруппа больных гемобластозами с последующим ранним рецидивом основного заболевания после АТПСКК отличалась от подгруппы больных гемобластозами с благоприятным исходом трансплантации более выраженной лимфопенией СШ+-клеток, при этом процент этих клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла и уровень наивных СМ+-клеток был повышен Также в продукте сепарации относительное количество СГ>34;-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла было достоверно выше, чем в подгруппе больных в длительной ремиссии после АТПСКК

4 Количественная характеристика Т-клеток в группе больных гемобластозами после АТПСКК

Рисунок 8

Абсолютное содержание С04+-клеток после АТПСКК

800 -| 700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 -0 -

-Доноры -Рецидив - Ремиссия

через 1 месяц через 3 месяца через 6 месяцев через 9 месяцев

Как видно из рисунка 8, достоверно сниженное содержание СЕ)4+-клеток у больных гемобластозами сохраняется в течение всего периода наблюдения В группе больных гемобластозами с благоприятным исходом трансплантации наблюдается постепенное увеличение количества С134+-клеток (173±22,2, 211±32Д, 245±35,7, 307±63,8, по методу Фишера р=0,001) В группе больных гемобластозами с последующим ранним рецидивом такой тенденции не наблюдается Абсолютное содержание СШ+-клегок достоверно не отличалось от донорских значений на всех сроках исследования после АТПСКК в группах больных гемобластозами

4 Относительное количество СВ4 -клеток в 8,02/'М фазах клеточного цикла и в апоптозе у больных гемобластозами после АТПСКК

Рисунок 9

Рисунок 10

Относительное количество СМ+-клеток в S.G2/M фазах клеточного цикла после АТПСКК

л_Й_js-&—а_

й

Относительное количество CW+-клеток в апоптозе после АТПСКК

* * Ä

черев 1 месяц черв Э юсшр через 8 иесяцга чЕрез 9 месяц»

Примечание * - р<0 01 различия с группой доноров,

■ группа больных гемобластозами с последующим ранним рецидивом после АТПСКК □группа больных гемобластозами в длительной ремиссии после АТПСКК

Как видно из рисунка 8 достоверное увеличение относительного количества СВ4--клеток в 8Д2/М фазах клеточного цикла сохраняется на всех сроках исследования после АТПСКК В группе больных с последующим рецидивом

заболевания относительное количество СБ4+-клеток в апоптозе было достоверно повышено через 1,3 и 6 месяцев после АТПСКК по сравнению с группой доноров В группе больных в длительной ремиссии после трансплантации через 1 месяц после АТПСКК относительное количество СМ+-клеток в апоптозе достоверно не отличалось от группы доноров Но через 3, б, и 9 месяцев после АТПСКК уровень апоптоза СБ4+-клеток был достоверно выше донорского уровня (рис 10)

5 Относительное количество СГ)8+-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла и в апоптозе у больных гемобластозами после АТПСКК

Рисунок 11 Рисунок 12

Относительное количество С08*~клеток в б,С32ЛМ фазах клеточного цикла после АТПСКК

Ч1рю 1 месяц чврм Эмкяр чарм £ ыкяцщ шрм 9

Относительно« количество Сй8+-клеток в апоптозе после АТПСКК

4

3,5 3 2,5 2 1,5

1 4— 0 5 — О -

Ш

Примечание * - р<0 01 различия с группой доноров, # - р<0 01 различия между подгруппами больных гемобластозами

В - группа больных гемобластозами с последующим ранним рецидивом после АТПСКК СИ - группа больных гемобластозами в длительной ремиссии после АТПСКК

В группе пациентов с последующим рецидивом заболевания через 1 месяц после АТПСКК уровень СВ8+-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла был достоверно выше по сравнению с группой доноров В последующие месяцы исследования мы наблюдали тенденцию к снижению уровня С08+-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла в этой группе больных В группе пациентов в длительной ремиссии через месяц после АТПСКК уровень СБ8+-клеток в 8Д2/М фазах клеточного цикла также был достоверно выше по сравнению с группой доноров Через 3 месяца после АТПСКК в группе пациентов в длительной ремиссии сохраняется достоверно высокий уровень СВ8+-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла по сравнению с группой доноров и с группой пациентов с последующим ранним рецидивом заболевания Через 6 и 9 месяцев после АТПСКК сохраняется достоверно высокий уровень СИ8+-клеток в 8,С2/М фазах клеточного цикла в группе пациентов в длительной ремиссии по сравнению с группой доноров (рис 11) В группе больных с последующим рецидивом заболевания уровень апоптоза СБЗ-клеток после АТПСКК не отличался от группы доноров в течение всего

периода исследования В группе больных в длительной ремиссии через 1 месяц после АТПСКК уровень апоптоза С08+-клеток также достоверно не отличался от донорского уровня Через 3 месяца после АТПСКК показатель апоптоза CD8 -клеток в группе больных в длительной ремиссии был достоверно выше донорского показателя и показателя апоптоза СВ8+-клеток в группе больных с последующим ранним рецидивом заболевания Через 6 и 9 месяцев после АТПСКК в группе больных в длительной ремиссии апоптоз СБ8+-клеток не отличался от группы доноров(рис 12)

Таким образом, после АТПСКК были установлены различия в восстановлении субпопуляции CD8 -клеток в подгруппах больных с разным исходом трансплантации Через 3 месяца после АТПСКК в группе больных с последующим ранним рецидивом заболевания было выявлено резкое снижение показателей пролиферации и апоптоза CD8+-kttctok по сравнению с группой больных в длительной ремиссии после АТПСКК

Так как процесс гомеостатической пролиферации сопровождается изменением соотношения наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в периферической крови, далее прослежены изменения соотношений субпопуляций наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в подгруппах больных гемобластозами с разным исходом трансплантации

6 Соотношение наивных Т-клеток и Т-клеток памяти у больных гемобластозами до и после АТПСКК

Рисунок 13 Рисунок 14

Относительное количество CD4+CD45RA+

клетокдо и после АТПСКК

60 60

40 i *

30 •О

20

10

1 . 1 1

^Я. -"k

<3 ■ S' а- с

ч. X * ъ % ч

ч

— ■ Доноры — Рецидив — ■ Ремиссия" |

Относительное количество CD4 CD45RO "-клеток до ипосле АТПСКК

90 80 -1 70 60 50 40 30 20 10 о

%

ч

■ Доноры -

Примечание * - рО 01 различия между подгруппами больных гемобластозами У больных гемобластозами наблюдается дисбаланс показателей относительного количества наивных Т-клеток и Т-клеток памяти Уровень наивных СЛ>Г-клеток в подгруппах больных гемобластозами был меньше донорского уровня, а уровень С1Э4+-клеток памяти - выше До режима мобилизации подгруппы пациентов

достоверно различаются между собой по соотношению наивных С])4+-клеток и СБ4 '-клеток памяти Через 6 месяцев после АТПСКК в группе больных с последующим рецидивом заболевания уровень наивных С04+-клеток был достоверно ниже, а уровень С1Э4+-клеток памяти - достоверно выше по сравнению с группой больных в длительной ремиссии (рис 13 и рис 14) Повышение уровня Т-клеток памяти у больных гемобластозами, возможно, отражает наличие гомеостатической пролиферации Следует отметить, что в группе больных с последующим ранним рецидивом наблюдается постепенное снижение уровня наивных С04+-клеток (по методу Фишера р=0,00292), при этом в группе больных в длительной ремиссии после трансплантации уровень наивных С04+-клеток постепенно возрастает (по методу Фишера р=0,03854) Вероятно, это связано с разной степенью поражения тимуса (после предшествующих курсов ПХГ) в подгруппах больных гемобластозами

7 Относительное количество Т-клеток, продуцирующих ШБу в периферической

крови больных гемобластозами до и после АТПСКК

Рисунок 15 Рисунок 16

Примечание * - р<0 01 различия с группой доноров

Через 3 месяца после АТПСКК в подгруппе больных с последующим ранним рецидивом резко возрастает процент Т-хелперов 1 типа, в подгруппе больных в длительной ремиссии после АТПСКК наблюдается тенденция к увеличению этого показателя (рис 15) Также через 3 месяца после АТПСКК в группе больных с последующим ранним рецидивом происходит увеличение количества Т-цитотоксических клеток 1 типа в сравнении с группой доноров В группе больных в длительной ремиссии после АТПСКК количество Т-цитотоксических клеток 1 типа достоверно повышается через 6 месяцев после АТПСКК (рис 16) Было установлено, что наиболее выраженное изменение в соотношении Т-клеток, продуцирующих цитокины 1 типа, происходит через 3 месяца после АТПСКК в двух группах больных гемобластозами При этом наблюдаются выраженные

различия в количестве 'Г-клеток 1 типа у больных гшобластозами с разным исходом трансплантации В группе больных с благоприятным исходом трансплантации наблюдается тенденция увеличении Т-клеток, продуцирующих цитикины 1 типа, в га время как н группе больных с последующим рецидивом Основного заболевания через 6 месяцев после трансплантации происходит резкое снижение количества этих клеток.

8 Ассоциация показателен иммунного статуса с разлитием раннего рецидива, в течение года после АТПСКК у больных гемобпастозами.

Для нахождения критических значений показателей иммунного статуса, ассоциированных с достоверно повышенным/сниженным риском развития рецидива в течение года у больных гемоблаетозами после АТПСКК, были проанализированы 11 диапазонов каждого признака, па которые каждый из показателей был предварительно разбит с использованием алгоритма квантиль наго анализа по Моетеллеру и Тькжи. Для оценки прогностической значимости признаков вычислялась информативное гь каждою диапазона признака по соотношению двух вероятностей (Р(Хц/ А]) и £Р{Ху' А2). где А] и Л 2 -соответственно группы пациентов в ремиссии и с ранним рецидивом после АТПСКК. Данные оценки информативности лабораторных признаков для распознавания пациентов с риском развития раннего рецидива после АТПСКК представлены к таблице I -

Таблица 1

Диагностические признаки разви тия рецидива в течение года у больных

гемоблаетозами после АТПСКК _

Признак 1 Днлннлш ДК ... , Ш ■ SP :

■ : 1 : ..;кк; КО!ИЧ".;1П(> CD4-K.K: |Х>К ь S,( фазах клеточного ЦИК'¡' до АТПГ.КК >21.4% 10,2*» 50,0 % «,24 %

Отноонтельное количество СШ~-кттегок в S.G2/M фазах клеточного цикла '¡срез 3 месяца ггооле АТПСКК: <3,1 % 8,0** 62,5 % 90.0 %

ОШОСЯ KML}i(*J KC.lH'UCIl«i РЛОЛТОТЙЧЦСКЮЕ CDK-юи; шК iepC; 3 1'1 Vi [locjru ДТ14СКК: < Qf22 % 7.0* 50,0 % 90.0 %

Относительное количество СС4~СП451Ю~-клеток до АТПСКК: < 11.1% В. 1 * 40,0 % 93,8 %

Относительное количество CD8'CD45RO -клеток до АТПСКК: > 9,41 5,3® 63,64 % 81,25 %

Содержащие сыпорогэчлото lgM до ЛТПСКК <0,59 г/л 3,8* 63,64 % 73 ,(¡8 %

CDS "71,4* через 1 Meemi после ATTTCKK : % ■1.4* 83,33 % 70,0 %

Примечание: **. - достоверность различий соответственно р<0,05; р<0,01; ДК -диагностический коэффициент, .SN чувствительность; SP специфичность

Как видно из таблицы 1. большинство исследуемых нами показателей имели большую ипформатакпость и специфичность для прогноза развития раннего рецидива после АТПСКК. Положительное значение диагностического коэффициента отмечалось и случае преобладания вероятности Аз (наличие

рецидива). Ранний рецидив после АТПСКК чаще встречается у пациентов, имеющие до трансплантации показатель фаз клеточного цикла СП4 -

клеток более 21,4 % (ДК - 10,2), показатель Я.С+2/М фаз клеточного цикла СП8-клеток через 3 месяца после АТПСКК менее 3,1 % (ДК = 8,0).

Таблица 2

Диагностические признаки благоприятного исхода А'П 1СКК > больных __гемобластозами

Признак / Диапазон ДК КР

Относительное количество япоптотических С04+-клеток через 1 месяц после АТПСКК: < 0}08% -7,2* 43,75 % 91,67 %

Абсолютное количество СП! 6+ -клеток до АТПСКК >151 клмкл -2,5+ 811,1! % Я. 53%

Примечание: * - достоверность различий рО.ОЗ; ДК диагностический коэффициент, ЙЫ чу ист в иге ль I гость; 5Р - специфичность

Отрицательное значение диагностического коэффициента было в случае преобладания состояния А[ (пациенты в ремиссии). Например, относительное количество алсщтотичсских СИ4 -клеток через I месяц после АТПСКК менее 0,08 % (ДК=-7,2) и абсолютное количество СБ 16*"-клеток более 151 кл/мкл. (ДК--2,5) свидетельствуют в пользу благоприятного исхода АТПСКК у пациентов Гемобластозами с той или иной степенью вероятности.

Благоприятный исход трансплантации может также зависеть от отсутствия осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК, поэтому далее, мы .установили. диагностические коэффициенты исследуемых показателей для возможности прогноза ряска развития тяжелых осложнений в этот период после АТПСКК.

9. Ассоциация показателей иммунного статуса с развитием осложнений на этапе восстановления кроне творении после АТПСКК у больных гемобластозами.

На следующем этапе работы мы разделили общую группу больных гемобластозами па подгруппы; А! - группа пациентов у которых восстановление кроветворения после АТПСКК происходило с осложнениями и А2 группа пациентов, у которых не наблюдалось тяжелых осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК

Д.тя оценки прогностической значимости признаков вычислялась информативноеть каждого диапазона признака по соотношению двух вероятностей (Р(Ху/ Л]) и (Р(Ху/ А2), где А] и А2 соответственно группы пациентов с осложнениями и без осложнений. Данные оценки информативности лабораторных признаков для прогноза осложнений в процессе восстановления кроветворения у больных гемобластозами после АТПСКК представлены в таблице 3

Таблица 3.

Информативность параметров иммунного статуса для прогноза разьн тия осложнений в процессе восстановления кроветворения у больных гемобластозами

после АТПСКК

Признак / Диапазон признака Час" 1Ч(Х1 гота /Ак) Частота Р(Хц/Ак) ДК ем БР

А2 А1 а2 А1

Абсолютное количество СЛЭ4+-клеток >412 кл/мкл 8 1 42,1 7,7* -7,4 42,1% 92,3% 2,45

Относительное количество СБ8'-клеток в 8,02/М фазах клеточного цикла <6,85% >7,1% 13 6 2 10 68,4 31,6 16,7** 83,3** -6,1 4,2 68,4% 83,3% 83,3% 68,4% 2,04 1,4

Относительное количество апоптотических С08+-клеток >1,4% 11 3 55,0 20,0* -4,4 55,0% 80,0% 1,46

Относительное количество фагоцитирующих гранулоцитов <60 % >76% 8 4 1 8 40 20 6,7* 53,3* -7,8 4,3 40,0% 53,3% 93,3% 80,0% 1,3 1,42

Относительное количество фагоцитирующих моноцртов <49% <51% <60% >62% 8 10 12 8 1 2 3 12 40 50 60 40 6,7* 13,3* 20,0* 80,0* -7 8 -5,7 -4,8 3,0 40% 50% 60% 80% 93,3% 86,7% 80,0% 60% 2,58 1,91 1,58 1,0

Показатель активности моноцитов <1,79 у е 1 4 6,67 44,4* 8,2 44,4% 93,3% 2,74

Содержание сывороточного 1ЕА <0,85 г/л 3 7 15,8 58,3* 5,7 58,3% 84,2% 1,89

С04+1Ь4+ клетей < 1 43% >1 45% 10 3 1 7 76 9 23 1 12 5** 87.5** -79 58 76 9% 87 5% 87 5% 76 9% 2 62 1 92

*, **, - достоверность различий соответственно Р<0 05, <0 01, между группами А1 и А2 (точным методом Фишера)

Анализируя информативность параметров иммунного статуса для прогноза развития осложнений в процессе восстановления кроветворения у больных гемобластозами после АТПСКК, мы видим, что к прогностически значимым показателям добавляются параметры гуморального и макрофагального звеньев иммунной системы При этом повышенное количество фагоцитирующих гранулоцитов и моноцитов, но со сниженной продукцией перекиси водорода является риском развития осложнений Группа больных, у которых не было осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК, характеризуется низким процентом фагоцитов, способных захватить чужеродные частицы, но с повышенной продукцией перекиси водорода В то же время больные, у которых процесс восстановления проходил с осложнением, характеризуются более высоким процентом фагоцитирующих клеток, но уровень продукции перекиси водорода снижен Также было установлено, что снижение сывороточного ^А и повышение количества ТЬ2 увеличивают риск развития осложнений в процессе восстановления клеточного пула после АТПСКК

На основании проделанной работы были сделаны следующие выводы

выводы

1 В периферической крови больных гемобластозами' До АТПСКК и • ВИЧ-инфицированных пациентов на фоне лимфопений СЩ^Клбток повышен процент CD4+-клеток в апоптозе и в 8,02/М-фазах клеточного цикла, который находится в обратной зависимости от общего количества СБ4+-клеток Это, наряду с нормальным (при гемобластозах) или повышенным количеством CD8T-icneTOK (при ВИЧ-инфекции, что сопровождается повышением процента СБ8+-клеток в апоптозе и в S,G2/M фазах клеточного цикла), отражает сходство процессов восстановления CD4+-клеток и различия - С08'-клеток в условиях лимфопении различного генеза

2 После АТПСКК у больных гемобластозами с благоприятным исходом трансплантации на фоне повышенного процента CD4+- и CD8+-KJie ioK в S,G2/M-фазах клеточного цикла и в апоптозе наблюдается постепенное увеличение абсолютного количества CD4+- и CD4+CD45RA+-KneTOK, а также повышение CD4+-и CD8+- клеток, продуцирующих INFy, что является проявлением эффективного восстановления количества и функциональных параметров Т-клеток

3 Признаками неэффективного восстановления количественных и функциональных характеристик Т-клеточного пула у больных с рецидивам после АТПСКК являются прогрессирующее снижение количества CD4+CD45RA+-клеток, а также значительное повышение (через 3 месяца после АТПСКК) с последующим резким снижением количества CD4+- и С08+-клеток, продуцирующих INFy - - -

4 Различия процессов восстановления количества и функциональных свойств Т-лимфоцитов у больных с разным течением после АТПСКК 'ассоциированы с исходным (до трансплантации) уровнем лимфоцешщ и" интенсивности пролиферации CD4+- и CD34+-raeTOK развитие рецидива чаще происходит у больных с выраженной лимфопенией, высоким процентом CD4+- и С034+-клеток в S,G2/M-фазах клеточного цикла

5 Повышение показателей апоптоза и 8,С2/М-фаз клеточного цикла CD4+- и CD8+-клеток периферической крови отражает активацию пролиферации этих субпопуляций в процессе восстановления Т-клеточного пула, индуцированного лимфопенией различного генеза, и в процессе восстановления кроветворения после АТПСКК Исследование данных показателей может быть информативным в оценке состояния Т-клеточного гомеостаза и прогнозе исхода АТПСКК при гемобластозах

Практические рекомендации

1 Для оценки риска возникновения рецидива в ранние сроки после АТПСКК у больных гемобластозами рекомендуется определять пролиферативную активность Т-клеток и количество Т-клеток памяти в периферической крови до трансплантации, а также показатели апоптоза и пролиферации Т-клеток в первые месяцы после трансплантации

2 Для оценки риска возникновения тяжелых инфекционных осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК у больных гемобластозами рекомендуется определять абсолютное количество CD4+-ktctok, показатели пролиферации и апоптоза CD8+-KneTOK, а также показатели макрофатального звена иммунной системы до трансплантации

СПИСОК РАБОТ ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ,

1 Пронкина Н В , Кожевников В С , Лисуков И А , Кулагин А Д , Сизикова С А , Крючкова И В , Гилевич А В Изменение показателей клеточного цикла Т-лимфоцитов у пациентов с гемобластозами после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток //Сибирский онкологический журнал - 2005 - №1(13) - С 36-39

2 Покровский А Г , Шинтяпина А Б , Пронкина Н В , Кожевников В С , Плясунова О А, Шульц Э Э, Толстиков Г А Активация апоптоза производными бетулиновой кислоты в опухолевых клетках человека in vitro // Доклады Академии наук - 2006 - Т 407 -№5 - С 697-701

3 Пронкина Н В, Орловский Е В, Орловский В Г, Кожевников В С Изменение показателей апоптоза и клеточного цикла иммунокомпетентных клеток до и после лечения ВИЧ инфекции //Дни иммунологии в Сибири Материалы Всероссийской научно-практической конференции - 2005 -С 141-143

4 Пронкина Н В , Романов В В , Кожевников В С Показатели апоптоза и клеточного цикла моноцитов больных туберкулезом легких в зависимости от продукции TNFa // Цитокины и воспаление - 2005 - Т 4 - №2 - С 97

5 Пронкина Н В , Кожевников В С , Лисуков И А , Кулагин А Д , Сизикова С А , Крючкова И В , Гилевич А В Изменение показателей клеточного цикла Т-лимфоцитов у пациентов с гемобластозами до и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике -Новосибирск, - 2006г -с 194-196

6 Пронкина Н В, Орловский Е В, Орловкий В Г, Кожевников В С Показатели апоптоза и клеточного цикла иммунокомпетентных клеток в динамике комплексной антиретровирусной терапии больных ВИЧ инфекцинй // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике -Новосибирск, - 2006г - с 197-199

7 Пронкина Н В , Романов В В , Кожевников В С Снижение апоптоза в популяции моноцитов, продуцирующих TNFa, у больных туберкулезом легких // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике - Новосибирск, - 2006г - с 199-201

8 Сизикова С А , Кулагин А Д , Крючкова И В , Гилевич А В , Денисова В В , Коненкова Л П, Сизиков А Э , Шевела Е Я, Пронкина Н В , Кожевников В С, Лисуков И А Высокодозная иммуносупрессивная терапия с аутотрансплантацией стволовых кроветворных клеток при аутоиммунных заболеваниях клиническая эффективность и иммунная реконституция // Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека от эксперимента к клинике - Новосибирск, - 2006г -с 278-281

9 Кащенко Э А , Селедцов В И, Ширинская А В , Селедцова Г В , Самарин Д М, Повещенко О В, Фельде М А , Пронкина Н В Изменение соотношения фаз клеточного цикла и пролиферативной активности спленоцитов и опухолевых клеток в результате воздействия физиотерапевтических факторов//Дни иммунологии в Сибири Материалы Всероссийской научно-практической конференции - 2005 -С 78-80

10 Lisukov I, Sizikova S , Kulagin A , Kruchkova I, Gilevich A , Denisova V, Konenkova L , Sentyakova T, Pronkina N, Kozhevmkov V, Chernykh E, Kozlov V Autologous stem cell transplantation for refractory autoimmune diseases clinical effects and immune reconstitution //Bone Marrow Transplantation -2006 -V37 - Supplement 1 -S131

Подписано к печати 18 05 2007 формат 60x84 - 1 печатный лист

Бумага офсетная Печать 1)ир1о ВР-ДЗЭ Тираж 100 экз Номер заказа № 549 Типография ООО "ЮГУС ПРИНТ" г Новосибирск, ул Залесского, 4

Постоянство численности клеток лимфоидных популяций обеспечивается балансом их образования (за счет пролиферации) и гибели (как правило, по механизму апоптоза) (Freitas A., et al. 2000). Баланс между двумя этими процессами определяет Т-клеточный гомеостаз в организме. Интенсивность пролиферации наивных Т-лимфоцитов (CD45RA+) у взрослых людей минимальная. С помощью определения маркера пролиферирующих клеток Ki-67 установлено, что in vivo пролиферирует около 1% наивных Т-клеток - в равной степени CD4+ и CD8+ (Hazenberg M.D., 2003; Sachsenberg N.,1998). Количество наивных Т-клеток определяется выработкой IL-7 и содержанием дендритных клеток, несущих молекулы МНС классов I и II, а соотношение последних определяет баланс наивных Т-клеток CD8+ и CD4+ (Fry T.J., et al. 2001; Vivien L„ et al. 2001; Mackall Cr.L., et al. 2001; Kirberg J., et al. 2001). Гомеостаз С08+-клеток памяти реализуется с участием цитокинов, среди которых основная роль принадлежит IL-15, а вспомогательная IL-7 (Melchionda F,, et al. 2005; Alpdogan О., et al. 2005). Гомеостаз клеток памяти (CD45RO+) минимально зависит от молекул МНС (Tanchot С., et al. 1997; Cho В.К., et al. 2000). Механизмы гомеостатического контроля С04+-клеток памяти мало изучены. В условиях Т-лимфопении механизмы пополнения наивных Т-клеток отличаются от таковых при нормальном содержании Т-клеток. Они проявляются в форме гомеостатической пролиферации, которая сопровождается сменой мембранного и функционального фенотипа на фенотип клеток памяти без промежуточного этапа активации и без дифференцировки в эффекторные клетки (Tough D.F., et al. 1994; Wu Z., et al.2003; Mahajan V.S., et al. 2005).

Численность ежедневных мигрантов из тимуса и Т-клеток, новообразованных в результате периферической экспансии, должна уравновешиваться числом Т-клеток, подвергающихся апоптозу (Tanchot С., et al. 1997; Romanyukha A.A., et al. 2003). Зрелые Т-лимфоциты, подвергшиеся селекции, в покоящемся состоянии лишены мембранного Fas-рецептора и экспрессируют протоокоген Вс1-2, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза (Karawajew L., et al. 2000). Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов соответствующим антигеном или митогеном. Активированные лимфоциты могут подвергнуться апоптозу при различных воздействиях - повторной стимуляции через перекрестное сшивание рецепторов или недостатке факторов роста (IL-2) и т.д. (Dooms Н., et al. 2004; Karas М., et al. 1999). Апоптоз может развиться и в процессе активации - например, в случае предварительного связывания молекул CD4, при отсутствии костимуляции Т-клеток через CD28 (Prlic М., et al. 2001). После дифференцировки Т-лимфоцитов в эффекторные клетки и Т-клетки памяти в них также экспрессируется Вс1-2, и они временно приобретают устойчивость к индукторам апоптоза. В реализации и контроле апоптоза участвуют многочисленные внутриклеточные факторы и от его осуществления зависят многие важные процессы, реализуемые на уровне организма (Badley A.D., et al. 2000).

Изучению процессов, поддерживающих клеточный гомеостаз, посвящено много отечественных и зарубежных исследований, что в значительной степени определяется потребностью в точных знаниях о закономерностях восстановления популяций и субпопуляций лимфоцитов, что находит отражение в их функциональном состоянии, включая и соотношение Т1/Т2-ответов (Jameson S.C. 2002; Guimond М., et al. 2005; Yusuf I., et al. 2003). Это характерно при заболеваниях (СПИД), после действия повреждающих факторов (облучение, химиопрепараты), а также после пересадки костного мозга. При патологии изменяется процент клеток, подвергшихся апоптозу и процент клеток, вступивших в периферическую экспансию, а также изменяются взаимосвязи этих двух процессов. Большой интерес вызывают процессы восстановления Т-клеток после их деплеции. По данным литературы на апоптоз Т-клеток при ВИЧ-инфекции могут влиять моноциты (Oyaizu N., et al. 1993; Sperber K., et al. 2003), поэтому вызывает интерес параллельное исследование процессов гомеостаза моноцитов и Т-лимфоцитов. Кроме того, интенсивно изучаются механизмы восстановления субпопуляций Т-лимфоцитов CD4+- и CD8+-mieTOK, которые отличаются по скорости восстановления. Как известно, СБ4+-клетки восстанавливаются через год и более после трансплантации костного мозга, а С08+-клетки - уже через 6 месяцев (Guillaume Т., et al. 1998; Mackall Cr. L. et al. 1997). Восстановление клеточного пула после ТКМ происходит в основном за счет клеток памяти, а они, как известно, более подвержены апоптозу, чем наивные клетки (Porrata L.F., et al. 2001; Mackall Cr. L. et al. 2005). Являясь наиболее радикальным способом лечения гемобластозов, АТПСКК, тем не менее, не всегда приводит к излечению, и уже в течение первого года в 22 - 40% случаев возникает рецидив заболевания. Возникновение рецидива связано со многими причинами. Совокупность факторов, таких как, статус заболевания (полная, частичная ремиссия или резистентное течение) на момент трансплантации, его стадия, предлеченность, нозология заболевания и возраст больного имеет определенное прогностическое значение в исходе трансплантации (Cortelazzo S., et al. 1999). В доступной нам литературе, тем не менее, нет данных о зависимости процессов восстановления Т-клеточного пула с исходом трансплантации, однако в литературе есть данные о разной репопулирующей способности СБ34+-клеток в зависимости от стадии клеточного цикла (Uchida N., et al. 1997; Voermans С., et al. 2001).

Изучение взаимосвязей между пролиферацией и апоптозом CD4+- и С08+-клеток у больных гемобластозами до и после АТПСКК (в разных временных точках восстановления гемопоэза), а также у ВИЧ-инфицированных пациентов, актуально для понимания процессов восстановления Т-клеточного гомеостаза.

Цель исследования: Исследовать взаимосвязь апоптоза и пролиферации CD4+- и CD8+-iaieTOK периферической крови с процессами восстановления количественных и функциональных характеристик Т-лимфоцитов при лимфопении различного генеза и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток. Задачи исследования:

1. Исследовать показатели апоптоза и фаз клеточного цикла CD4+- и CD8+-клеток и моноцитов у больных гемобластозами до и после АТПСКК и у ВИЧ-инфицированных пациентов.

2. Оценить особенности показателей апоптоза и фаз клеточного цикла CD4+- и CD8+-KneTOK у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК.

3. Исследовать показатели фаз клеточного цикла стволовых кроветворных клеток продукта сепарации у больных гемобластозами с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания после АТПСКК.

4. Исследовать показатели наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в периферической крови у больных гемобластозами до и после АТПСКК.

5. Определить относительное количество CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов периферической крови, продуцирующих IFN-y и IL-4 в ответ на неспецифическую поликлональную стимуляцию у больных гемобластозами до и после АТПСКК и относительно здоровых доноров.

Научная новизна: В работе впервые показано, что как в норме, так и у больных гемобластозами после химиотерапии и у ВИЧ-инфицированных пациентов количество иммунокомпетентных клеток (CD4+-, С08+-клеток и моноцитов) в S,G2/M фазах клеточного цикла прямо взаимосвязаны между собой. При этом положительная корреляционная взаимосвязь между показателями апоптоза и пролиферации С04+-ютеток характерна только для группы здоровых лиц. Показано, что пролиферативная активность CD4+-клеток прямо зависит от выраженности лимфопении как у ВИЧ-инфицированных больных, так и у больных гемобластозами до АТПСКК.

Впервые показано, что у больных с ранним рецидивом основного заболевания после АТПСКК, по сравнению с больными с благоприятным течением, при исследовании до курса мобилизации более выражена CD4+лимфопения, повышено количество CD44-клеток в S,G2/M-(j)a3ax клеточного цикла, повышено количество CD4+CD45RA+-MieTOK, а также количество С034+-клеток в 8,02/М-фазах клеточного цикла среди трансплантируемых клеток. Показано также, что для этих больных характерно прогрессирующее снижение наивных CD4+CD45RA+-i0ieT0K после АТПСКК.

Научно-практическая значимость работы: Полученные данные продемонстрировали однотипность изменения взаимосвязей апоптоза и пролиферации С04+-клеток в условиях лимфопении различного генеза. Важным итогом работы явилось также положение о разном соотношении механизмов восстановления Т-клеточного пула (гомеостатической пролиферации, лимфопоэза, тимопоэза) при благоприятном исходе АТПСКК и при развитии раннего рецидива заболевания, которому предшествует недостаточное (по сравнению с благоприятным течением) восстановление Т-клеток в количественном и функциональном плане.

Результаты исследования обосновывают важность проведения у больных гемобластозами на этапах подготовки к АТПСКК дополнительных лабораторных исследований, включая показатели апоптоза и клеточного цикла субпопуляций иммунокомпетентных клеток. Выявление различий механизмов восстановления Т-клеточного пула у больных гемобластозами с разным исходом трансплантации дает возможность прогноза эффективности АТПСКК и риска развития инфекционных осложнений в период восстановления кроветворения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повышение показателей апоптоза и S,G2/M фаз клеточного цикла Т-лимфоцитов периферической крови отражает активацию пролиферации клеток в процессе восстановления Т-клеточного пула как при лимфопении (при ВИЧ-инфекциии и после ПХТ при гемобластозах), так и после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток.

2. Благоприятный исход АТПСКК при гемобластозах характеризуется восстановлением Т-клеточного пула с участием наивных клеток и характеризуется возрастанием количества Т1 -клеток (Th и Тс), тогда как развитие рецидива основного заболевания после АТПСКК происходит на фоне прогрессирующего снижения количества наивных СБ4+-клеток и срыва восстановления количества Т1-клеток (Th и Тс).

3. Различия механизмов восстановления Т-клеточного пула после АТПСКК ассоциированы с его состоянием до трансплантации и с пролиферативной активностью трансплантируемых С034+-клеток.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции посвященной 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск 2005), на 7-ой отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (Новосибирск 2006). Апробация диссертации состоялась 3 апреля 2007г. на семинаре клинического отдела ГУ НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для опубликования результатов работ соискателей ученой степени кандидата биологических наук.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 129 страницах машинописного текста, включающего 15 рисунков и 23 таблицы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 156 литературных источников, из них 139 зарубежных.

ВЫВОДЫ:

1. В периферической крови больных гемобластозами до АТПСКК и ВИЧ-инфицированных пациентов на фоне лимфопении СБ4+-клеток повышен процент СБ4+-клеток в апоптозе и в 8,С2/М-фазах клеточного цикла, который находится в обратной зависимости от общего количества CD4+-клеток. Это, наряду с нормальным (при гемобластозах) или повышенным количеством С08+-клеток (при ВИЧ-инфекции, что сопровождается повышением процента С08+-клеток в апоптозе и в S,G2/M фазах клеточного цикла), отражает сходство процессов восстановления СБ4+-клеток и различия - CD8'-клеток в условиях лимфопении различного генеза.

2. После АТПСКК у больных гемобластозами с благоприятным исходом трансплантации на фоне повышенного процента CD4+- и СБ8+-клеток в 8,02/М-фазах клеточного цикла и в апоптозе наблюдается постепенное увеличение абсолютного количества CD4+- и CD4+CD45RA+-i0ieT0K, а также повышение CD4+- и СБ8+-клеток, продуцирующих INFy, что является проявлением эффективного восстановления количества и функциональных параметров Т-клеток.

3. Признаками неэффективного восстановления количественных и функциональных характеристик Т-клеточного пула у больных с рецидивом после АТПСКК являются: прогрессирующее снижение количества CD4+CD45RA+-iaieTOK, а также значительное повышение (через 3 месяца после АТПСКК) с последующим резким снижением количества CD4+- и С08 -клеток, продуцирующих INFy.

4. Различия процессов восстановления количества и функциональных свойств Т-лимфоцитов у больных с разным течением после АТПСКК ассоциированы с исходным (до трансплантации) уровнем лимфопении и интенсивности пролиферации CD4+- и С034+-клеток: развитие рецидива чаще происходит у больных с выраженной лимфопенией, высоким процентом CD4+- и С034+-клеток в 8,02/М-фазах клеточного цикла.

5. Повышение показателей апоптоза и S,G2/M-<|>a3 клеточного цикла CD4+- и С08+-клеток периферической крови отражает активацию пролиферации этих субпопуляций в процессе восстановления Т-клеточного пула, индуцированного лимфопенией различного генеза, и в процессе восстановления кроветворения после АТПСКК. Исследование данных показателей может быть информативным в оценке состояния Т-клеточного гомеостаза и прогнозе исхода АТПСКК при гемобластозах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки риска возникновения рецидива в ранние сроки после АТПСКК у больных гемобластозами рекомендуется определять пролиферативную активность Т-клеток и количество Т-клеток памяти в периферической крови до трансплантации, а также показатели апоптоза и пролиферации Т-клеток в первые месяцы после трансплантации.

2. Для оценки риска возникновения тяжелых инфекционных осложнений в период восстановления кроветворения после АТПСКК у больных гемобластозами рекомендуется определять абсолютное количество CD4+-клеток, показатели пролиферации и апоптоза С08+-клеток, а также показатели макрофагального звена иммунной системы до трансплантации.