Автореферат и диссертация по медицине (14.00.05) на тему:Изменение экспрессии и активности CD38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда

На правах рукописи

Бахметьева Ольга Сергеевна

ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И АКТИВНОСТИ СЭ38/АДФ-РИБОЗИЛЦИКЛАЗЫ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

14.00.05 - внутренние болезни 14.00.16 - патологическая физиология, медицинские науки

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Красноярск - 2009

003460704

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук, профессор

Петрова Марина Михайловна Салмина Алла Борисовна

Гоголашвили Николай Гамлетович Котловский Юрий Васильевич

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится "_"_2009 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.037.01 при ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ» (660022,Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ»

Автореферат разослан "_"_200 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций кандидат медицинских наук, доцент

Штарик С.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Одной из основных медико-социальных проблем Российской Федерации является низкая продолжительность жизни: мужчин - 58,9 года, а женщин- 72,4 года. Такие показатели связаны с высоким уровнем смертности, в первую очередь, от неинфекционных заболеваний. Лидирующую позицию занимают болезни системы кровообращения- 56,1%, из них летальность от ишемической болезни сердца, в том числе инфаркта миокарда, составляет 26,7 % , а 20,4% - от болезней сосудов головного мозга, в том числе инсультов. В России ежегодно острое коронарное событие развивается у 3-5 человек на 1000 населения. Артериальная гипертония является ведущей причиной сердечно-сосудистых расстройств.

До сих пор остаются до конца не изученными механизмы повреждения клеток при острой ишемии миокарда. В последнее время уделяется много внимания оценке роли эндотелиальной дисфункции и апоптоза клеток (эндотелйоцитов, гладкомышечных клеток сосудов, клеток тканей) в развитии гипертонической болезни и ее осложненных форм. Следовательно, определение маркеров эндотелиальной дисфункции может дать представление о степени повреждения органа, а также служить предпосылкой к выбору нужного метода лечения5'[Preston R.A. et al., 2003].

Прогрессирование эндотелиальной дисфункции, происходящее в условиях гипоксии, обусловленное изменением эластичности сосудистой стенки при гипертонической болезни и остром инфаркте миокарда, сопровождается повышением концентрации маркеров дисфункции и повреждения эндотелия. Следует отметить, что до настоящего времени не определена связь между содержанием маркеров эндотелиальной дисфункции в периферической крови и степенью тяжести состояния больных острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни.

До сих пор не установлено, что является предопределяющим фактором прогрессирования эндотелиальной дисфункции и обусловленных ею осложнений.

Важным этапом в развитии эндотелиальной дисфункции является изменение физико-химических свойств мембран клеток, за счет экспрессии рецепторов клеточной активации и адгезии, характер которой остается не изученной. Однако остается не уточненной роль неклассических молекул клеточной адгезии в формировании молекулярно-клеточных механизмов нарушения функции эндотелия.

Молекула CD38 - это бифункциональный рецептор-фермент с молекулярной массой 46 кД, участвующий в передаче внутриклеточной сигнальной информации, а так же в межклеточной коммуникации в клетках различной природы [Lee, Н.С et al., 2000]. Основным продуктом каталитической активности CD38 является циклическая АДФ-рибоза, выполняющая функцию мобилизатора кальция из внутриклеточного депо в цитозоль. Спектр экспрессии CD38 достаточно широк и включает в себя клетки крови, центральной нервной системы, поджелудочной железы, кардиомиоциты [Ferrero Е. et al., 2000; Flora A. et al., 2004; Okamoto H. et al., 2002]. Показано, что взаимодействие CD38, экспрессированного на клетках лимфоцитарно-лейкоцитарного звена, и CD31, экспрессированного на эндотелиоцитах, представляет собой один из механизмов роллинга лейкоцитов, сопровождающего физиологические и патологические события на поверхности эндотелия [Franco, L. et al., 1998]. Последние годы появились данные о роли С038/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности ряда клеток, в том числе нейтрофилов, однако данные об особенностях экспрессии и проявления активности CD38 в этих клетках при остром инфаркте миокарда отсутствуют.

До настоящего времени не установлены отличия по воздействию на уровень маркеров эндотелиальной дисфункции многих фармакологических препаратов, в том числе тромболитических препаратов, ингибиторов АПФ.

С учетом ведущей роли эндотелиальной дисфункции в развитии острого инфаркта миокарда на фоне прогрессирования гипертонической болезни, перспективным является изучение динамики содержания маркеров эндотелиальной дисфункции у больных ОИМ, а также возможность фармакологической коррекции степени дисфункции эндотелия при проведении системного тромболизиса.

Цель исследования.

Изучить особенности экспрессии и активности С038/АДФ-рибозил цикл азы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда при использовании тромболитических препаратов и ингибиторов АПФ для расширения патогенетического обоснования их применения.

Задачи исследования.

1. Определить характер экспрессии СБ38 и активность АДФ-рибозилциклазы в нейтрофилах периферической крови у больных острым инфарктом миокарда на первые и четырнадцатые сутки развития заболевания.

2. Оценить вклад экспрессии С038 на нейтрофилах периферической крови в их повреждающее действие на эндотелий у больных инфарктом миокарда. -

3. Оценить особенности клинического течения острого инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии СЭ38 на нейтрофилах периферической крови.

4. Оценить эффективность фармакологической коррекции острого-инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии СЭ38 на нейтрофилах периферической крови.

Научная новизна.

Впервые выявлена зависимость между уровнем эндотелиальной дисфункции и характером экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови, что позволяет рассматривать СЭ38 в качестве маркера эндотелиальной дисфункции.

Впервые изучено влияние ингибитора АПФ (эналаприла малеата), и тромболитика (стрептокиназы) на уровень экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда.

Впервые показана зависимость между выраженностью изменения экспрессии и активности СБЗ 8/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови и степенью тяжести больных острым инфарктом миокарда.

Практическая значимость работы.

Изменение уровня экспрессии и активности СЭЗ 8/А ДФ-рибозилциклазы нейтрофилов является адекватным показателем интенсивности патологического процесса (эндотелиальной дисфункции) и эффективности проводимой терапии. Уровень экспрессии СЭ38 на нейтрофилах периферической крови в первые сутки острого инфаркта миокарда коррелирует со степенью тяжести состояния пациентов на четырнадцатые сутки развития заболевания.

Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на коррекцию эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда и, значит, каждый терапевтический подход, целесообразен в своем применении.

Дано новое патогенетическое обоснование применения системного тромболизиса у больных острым инфарктом миокарда.

Положения, выносимые на защиту.

1.В периферической крови больных острым инфарктом миокарда на первые сутки развития заболевания определяется высокое содержание клеточных маркеров эндотелиальной дисфункции. Высокие корреляционные отношения между уровнем экспрессии С038 и десквамированными эндотелиоцитами позволяют признать их в качестве надежных маркеров дисфункции эндотелия.

2.Уровень экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы на нейтрофилах периферической крови характеризуют степень тяжести состояния пациентов с острым инфарктом миокарда.

3.Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на восстановление функции эндотелия у больных острым инфарктом миокарда.

Внедрение результатов исследования.

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику НИИ патобиохимии и молекулярной медицины ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, используются при чтении лекций и проведении практических занятий и семинаров у студентов ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, врачей-курсантов института последипломного образования.

Получен патент РФ на изобретение по заявке № 2331819 от 20.08.2008 г., приоритет от 09.03.07 г. «Способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом».

Личный вклад соискателя

Диссертантом выполнено лично: определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; составление протоколов исследований; набор экспериментального материала; самостоятельный общеклинический осмотр пациентов и забор материала для анализа; проведение иммуноцитохимических исследований с использованием фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии; флуориметрических исследований АДФ-рибозилциклазной активности СБ38 нейтрофилов периферической крови; статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов; написание автореферата и текста диссертации.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на международной научно-практической конференции по биомедицине (Украина, Херсон, 2007), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины-2008» (Санкт-Петербург, 2008), на научных семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, на заседании кафедры биохимии с курсами медицинской, фармакологической и токсикологической химии (2008), на заседании проблемной комиссии по внутренним болезням и кардиологии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ (2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работы, из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 95 страницах текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 2 фотографии, 7 рисунков, 20 таблиц. Библиографический список включает 128 источника, из которых 49 отечественных и 79 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

В целях решения сформулированных в работе задач было проведено обследование 50 пациентов обоего пола в возрасте от 40 до 65 лет с острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни. Все больные, участвовавшие в исследовании, находились на стационарном лечении в

Красноярской городской клинической больнице № 6 им. Н.С. Карповича в кардиологическом отделении.

В соответствии с поставленными задачами выделено две основные группы пациентов:

• группа 1 - больные острым инфарктом миокарда с гипертонической болезнью в анамнезе, получавшие ранее регулярно ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, с последующим получением эналаприла малеата с первых суток острого инфаркта миокарда (п=35).

• группа 2 - больные острым инфарктом миокарда с гипертонической болезнью в анамнезе, получавшие ранее ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, с последующим получением эналаприла малеата с первых суток острого инфаркта миокарда и дополнительно тромболитическую терапию стрептокиназой 1500 тыс. ЕД с первых суток острого инфаркта миокарда (п=15).

Каждая группа больных, находившихся на стационарном лечении, оценивалась в динамике на первые и четырнадцатые сутки развития острого инфаркта миокарда. Такие временные критерии забора материала для проводимого нами исследования были определены в связи с тем, что с первых суток ОИМ больные получали минимальную дозу эналаприла малеата-5 мг в сутки. Поскольку данный лекарственный препарат относится к ингибиторам АПФ с низким сродством к тканевому АПФ, нами было решено проводить забор на четырнадцатые сутки развития ОИМ.

Группу контроля (п=30) составили пациенты, 14 женщин и 16 мужчин, соответствующего возрастно-полового состава, без сердечно-сосудистой патологии, не страдающие артериальной гипертензией и не имеющие в анамнезе сосудистых катастроф, проходившие дополнительную диспансеризацию в рамках национального проекта «Здоровье» на базе МУЗ ГП №2 г. Красноярск.

Из исследования были исключены: 1) пациенты с острым инфарктом миокарда, имеющие в анамнезе ранее сосудистые катастрофы (острый инфаркт миокарда и/или острое нарушение мозгового кровообращения);

2) пациенты с острым инфарктом миокарда, развившимся на фоне симптоматической артериальной гипертонии или при отсутствии гипертензионного анамнеза;

3) пациенты с острым инфарктом миокарда, развившимся на фоне гипотонии;

4) пациенты с острым инфарктом миокарда, осложненным кардиогенным и аритмогенным шоком, отеком легких;

5) больные, страдающие тяжелой сопутствующей патологией, такой как онкологические заболевания, хроническая обструктивная болезнь легких, хроническая почечная недостаточность, системные заболевания соединительной ткани, хроническая ревматическая болезнь, а так же больные острыми и хроническими инфекционными заболеваниями.

Наибольшее число в основных группах составили пациенты в возрасте от 50 до 60 лет. Средний возраст пациентов основных групп составил 55,4+1,12(М +ш) лет. В контрольной группе средний возраст был 52,9+1,28 лет. Разделение пациентов по половому составу в основных группах было следующим: женщины составили 28% из всех обследованных пациентов основных групп, мужчины — 72%. В контрольной группе так же преобладали мужчины: 53,3% мужчин и 46,7% женщин.

Клинические методы исследования заключались в объективном осмотре пациентов. Учитывались данные анамнеза, наследственность, перенесенные ранее и сопутствующие заболевания, метеочувствительность, вредные привычки, лекарственная переносимость препаратов, приверженность к лечению гипертонической болезни и контроля уровня артериального давления. Изучение состояния сердечно-сосудистой системы включало в себя контроль артериального давления, электрокардиографию, эхокардиографию.

Все больные получали стандартную инфузионную терапию: раствор глюкозы 5%- 200мл и инсулин 4 ЕД, хлорид калия 3%- 30 мл, сульфат магния 25%- 5 мл -

внутривенно капельно 1 раз в сутки. Кроме того, терапия включала в себя нитраты: изокет 0,1%- 10 мл и 100 мл физиологического раствора внутривенно медленно, кардикет, нитроглицерин 0,15 мг под язык ситуационно; антикоагулянты: гепарин 5 тыс. ЕД внутрикожно; дезагреганты: аспирин или кардиомагнил; /3- блокаторы: эгилок; диуретки: гипотиазид; антагонисты Са2+ каналов- кордипин XL или кордафлекс. Комбинированная терапия указанными лекарственными препаратами осуществлялась индивидуально в терапевтических суточных дозах, приемлемых для данного пациента.

Назначение ингибитора АПФ (эналаприла малеата) осуществлялось у всех пациентов с первых суток развития острого инфаркта миокарда, с 5 мг в сутки, с последующим титрованием дозы лекарственного препарата до 40 мг в сутки.

У всех исследуемых пациентов производился забор периферической венозной крови в объеме 5 мл на первые и четырнадцатые сутки развития острого' инфаркта миокарда в период госпитализации на маркеры эндотелиальной дисфункции.

Для выделения нейтрофилов га периферической венозной крови использовали градиент плотности фиколл-верографин-1,142 и 1,062 г/см2 [Хейфиц Л.Б. и др., 1973]. После центрифугирования на границе раздела фаз пастеровской' пипеткой собирали нейтрофильное кольцо в две микропробирки по 500 мкл, а на предварительно обезжиренные два предметных стекла наносили 50 мкл клеток с целью приготовления клеточных мазков.

Определение активности АДФ-рибозилциклазы осуществлялось методом флуориметрического анализа, основаном на оценке конверсии НГД+ во флуоресцентный продукт - циклическую ГДФ-рибозу [Graeff R.M. et al., 1994]. Суспензию клеток из первой микропробирки использовали для определения белка методом Лоури [Wall К.A. et al, 1998], а из второй - для определения АДФ-рибозилциклазной активности, путем добавления 15 мкл НГД+ к полученному объему белка в условиях темной комнаты. Ферментативный анализ проводился с использованием спектрофлуориметра (SOLAR SM2203). Фиксировались не только максимальные и минимальные значения активности фермента, но и время в минутах, соответствующее этой активности. Единицы измерения: ед/мин/мкг белка.

Детекция СП38 на нейтрофжах осуществлялась с помощью иммуноцитохимического метода согласно стандартному протоколу прямого метода иммуноцитохимии с использованием антител к С038 (Сака§, США), с помощью люминесцентной микроскопии оценивалось количество СБ38+ нейтрофилов. Расчет проводился по нескольким полям зрения на 100 нейтрофилов.

Выделение и идентификация десквамированных эндотелиоцитов осуществлялись вместе с нейтрофильной фракцией периферической крови, полученной на градиенте плотности фиколл-верографина, с помощью иммуноцитохимического метода согласно стандартному протоколу прямого метода иммуноцитохимии с использованием антител к СБЗ1 (Caltag, США). В поле зрения микроскопа методом фазово-контрастной микроскопией регистрировались нейтрофилы и десквамированные эндотелиоциты. Затем с помощью флуоресцентной микроскопии дифференцировались следующие виды десквамированных эндотелиоцитов (ДЭ): СОЗ1 -иммунопозитивные ДЭ со свечением клеточной мембраны; СЭЗ 1-иммунонегативные ДЭ - клетки, не экспрессирующие С031. Идентификацию и подсчет десквамированных эндотелиоцитов производили из расчета на 100 клеток нейтрофильной фракции.

Статистическая обработка результатов включала методы описательной статистики, при использовании параметрических методов анализа предварительно определялось соответствие выборок закону нормального распределения с учетом теста Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса. При соответствии данных нормальному распределению для их сравнения использовали критерий Стьюдента-Фишера. В случае отклонения выборок от нормального распределения в сравнительном анализе использовали критерий Уилкоксона, критерий Т Манна-Уитни, критерий Краскел-Уоллес. Для исследования взаимосвязи нормально распределенных количественных признаков использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона; для непараметрических - коэффициент ранговой корреляции Спирмена [Гланц С.А., 1998]. Ошибка показателей равных нулю определялась по методике Л.С.Каминского [Каминский Л.С., 1964].

Результаты исследования и обсуждение результатов

Для выявления уровня артериального давления, на фоне которого наиболее часто развивается острый инфаркт миокарда у больных гипертонической болезнью, все пациенты были разделены на 3 подгруппы по уровню артериального давления, определенного на момент поступления в стационар: I степень (мягкая) - САД 140159 мм рт. ст., ДАД 90-99 мм рт. ст.;11 степень (умеренная) - САД 160-179 мм рт. ст., ДАД 100-109 мм рт. ст.; III степень (тяжелая) - САД >180 мм рт. ст., ДАД >110 мм рт. ст.

Согласно этой шкале распределение больных основных групп было следующим: со II степенью повышения АД больные составили наибольшую подгруппу обследованных - 31 человек. Пациентов с I степенью повышения артериального давления было 11 человек, с III степенью повышения артериального давления - 8 человек. Наибольший процент исследованных больных составили пациенты с длительностью течения гипертонической болезни от 6 до 10 лет (40%) и больные с гипертоническим анамнезом более 10 лет (50%).

С целью определения стадии гипертонической болезни до возникновения инфаркта миокарда были изучены амбулаторные карты больных. Все больные ежегодно проходили амбулаторный осмотр, и, согласно записи в амбулаторных картах, распределение пациентов по стадиям гипертонической болезни по ВОЗ, было следующим: больные с III стадией гипертонической болезни до возникновения ОИМ в первой группе составили 57,2% и во второй-53,3%, при этом, пациентов с I стадией гипертонической болезни не отмечалось. Следует отметить, что III стадия гипертонической болезни в догоспитальный период была выставлена у пациентов, ведущим диагнозом которых являлась ишемической болезни сердца: стенокардия 2 функционального класса. При этом в анамнезе были исключены сосудистые катастрофы (острое нарушение мозгового кровообращения, острый инфаркт миокарда).

При электрокардиографической диагностике острого инфаркта миокарда подъем сегмента ST отмечался у 92 % больных, а острый Q-инфаркт - почти у 80%

госпитализированных пациентов в кардиологическое отделение. Острый инфаркт миокарда преимущественно локализовался по передней стенке в 79%. Дислипидемия, гиперхолестеринемия диагностировались в среднем у 76% обследуемых пациентов основных групп; нарушение в системе гемостаза с гиперкоагуляцией и гиперфибриногенемией - в среднем у 49% пациентов.

Возможность наследственного характера развития дисфункции эндотелия подтверждается высоким процентом пациентов, имеющих отягощенный сердечнососудистый анамнез-73,5%.

Одним из основных факторов, приводящих к повышению артериального давления и возрастанию риска развития острого инфаркта миокарда, является активация ренин-ангиотензиновой системы [Гороховская Г.Н. и др., 2005], это подтверждает тот факт, что у 47% больных острый инфаркт миокарда развился на фоне гипертонического криза. При развившейся сосудистой катастрофе в миокарде, подвергшемуся острому окислительному стрессу, выделяются свободные радикалы кислорода и фактор некроза опухоли альфа, что усугубляет гиперэкспрессию молекул клеточной адгезии на эндотелиоцитах и приводит к повышенной миграции нейтрофилов в очаг поражения. Повышенное образование молекул межклеточной адгезии и участие их в патогенезе инфаркта миокарда, присутствие в крови повышенного количества десквамированных эндотелиоцитов, позволяет многим авторам рассматривать молекулы клеточной адгезии и десквамированные эндотелиоциты как клеточно-гумаральные маркеры эндотелиальной дисфункции [Гомазков, O.A., 1999; Lind L.et al., 2002]. Тем не менее, на современном этапе мало работ, рассматривающих в совокупности эндотелиальную дисфункцию как причину развития острого инфаркта миокарда [Dignat-George F. et al., 2004].

Обращает на себя внимание тот факт, что нейтрофилы являются активным звеном иммунной системы, циркулирующим в крови и обладающим набором рецепторов, позволяющих контактировать с эндотелиоцитами, а так же с другими биологически активными веществами, выделяемыми как эндотелием, так и другими клетками крови. Взаимодействие CD38 с лигандом CD31 приводит к возрастанию

подвижности этих рецепторов в билипидном слое мембраны и возрастанию количества их кластеров, что потенцирует восприятие сигнала клеткой.

Приняв нейтрофилы периферической крови, в нашем исследовании, в качестве модели для изучения воздействия острой ишемии у больных инфарктом миокарда, мы обнаружили, в сравнении с контрольной группой пациентов, высокий процент экспрессии С038 (27,4 %) на первые сутки развития заболевания и С038 (18,5%) на четырнадцатые сутки в исследуемой группе пациентов, получавших терапию эналаприлом и стрептокиназой (табл.1). В связи с тем, что активация нейтрофилов во время респираторного взрыва, осуществляется при непосредственном участии трансмембранного гликопротеина СЭ38, который, с одной стороны, фигурирует в синтезе циклической АДФ-рибозы, критической для регуляции внутриклеточного Са2+; а с другой - ответственен за генерацию и распад вторичного посредника цАДФР, уровень его экспрессии может быть отражением как клеточной активации, так и эндотелиальной дисфункции.

Таблица 1

Экспрессия и активность С038/ АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда

Исследуемый показатель группа 1 (п=35) группа 2 (п=15) контрольная группа (п=30)

СИ38+ 1 сутки (%) 27,4±0,43*. 24,5±0,7*. 6,8±0,3

СБ38+ 14 сутки (%) 18,5±0,61*. 17,3±0,7*. 6,5±0,5

Активность АДФ-рибозилциклазы 1 сутки (ед/мин/мкг белка) 311,26±16,36*# 25,3±2,6*# 121,0±2,4

Активность АДФ-рибозилциклазы 14 сутки (ед/мин/мкг белка) 227,27±4,28*# 197,7±10,1*# 116,1±2,1

* - между исследуемым показателем в каждой группе в динамике (Уилкоксона р=0,02) # - мевду группами и контролем (Манна-Уитни, Краскел - Уоллес р<0,05)

•- только с контролем (Манна-Уитни, Краскел - Уоллес р<0,05)

Очевидным становится предположение, что для взаимодействия нейтрофила с эндотелиоцитом или другой клеткой должна произойти его клеточная активация

[МийоБ Р. ег а1., 2003; УапШук МЛ. е1 а1., 2003]. При этом, экспрессия СЭ38-рецептора необходима для связывания с молекулой адгезии СБ31(РЕСАМ-1), что также характеризует степень выраженности эндотелиальной дисфункции.

Таким образом, один из механизмов активации нейтрофилов периферической крови реализуется путем увеличения экспрессии С038-рецептора с последующей его адгезией за счет взаимодействия с СЭ31 (РЕСАМ-1) на поверхности эндотелиальной клетки, что позволяет рассматривать уровень экспрессии С038 нейтрофилами периферической крови и уровень экспрессии СЭЗ1 эндотелиоцитами в качестве маркеров эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда.

Поскольку молекула СЭ38 представляет собой фермент, выбранная фармакологическая тактика, как мы предположили, могла отразиться на АДФ-рибозилциклазной активности нейтрофилов периферической крови. Так, на первые сутки развития острого инфаркта миокарда активность АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных, получавших ИАПФ (эналаприл), составляла 311,3+16,4 ед/мин/мг белка, а при проведении системного тромболизиса - 27,6+0,89 ед/мин/мг белка (табл.1).

Следует отметить, что достоверных различий активности фермента у пациентов контрольной группы на первые и четырнадцатые сутки забора венозной крови получено не было. Введение тромболитического препарата (стрептокиназы) не только привело к достоверному снижению активности фермента, но и вызвало смещение пика максимальной его активности (0,17 мин) на первые сутки развития заболевания с последующим возрастанием активности фермента к четырнадцатым суткам заболевания - (227,3+4,28 ед/мин/мг белка) (рис.1).

При этом к четырнадцатым суткам ОИМ достоверные различия АДФ-рибозилциклазной активности нейтрофилов периферической крови у пациентов исследуемых групп с разными терапевтическими подходами получены не были. В ходе нашего эксперимента обнаружен факт снижения функциональной активности фермента АДФ-рибозилциклазы при использовании системного тромболизиса почти в 10 раз, что на наш взгляд, может быть связано с изменением конформационных

свойств молекулы и/или механизмов ее активации на фоне введения стрептокиназы и активации нейтрофилов, необходимой для их хемотаксиса (табл.1). Такой механизм, вероятно, играет существенную роль в генезе эндотелиальной дисфункции у больных с острым инфарктом миокарда.

О? 1 сутки ОИМ 14 сутки ОИМ

- ♦ - группа! ИАПФ • группа2 TJ1T —М - контроль-

Рис. 1. Динамика смещения пика максимальной активности АДФ-рибозилциклазы "

нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда in vitro

Ряд авторов выявили высокое содержание десквамированных эндотелиоцитов в крови периферических сосудов при различной сердечно-сосудистой патологии [А.Ю. Иванов с соавт., патент РФ № 2239835; Dignat-George F. et al., 2004]. В нашей работе мы выявили преобладание в 5 раз содержания десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови больных острым инфарктом миокарда на первые сутки заболевания в сравнении с контрольной группой пациентов (табл.2). Так, количество десквамированных эндотелиоцитов на первые сутки развития острого инфаркта составляло от 5,9 до 6,3 %, что убедительно превышало значения ДЭ в группе контроля -1,6%. При этом отмечалась тенденция к уменьшению содержания ДЭ к четырнадцатым суткам развития острого инфаркта миокарда как у пациентов, терапия которых включала ингибитор ангиотензин-превращающего фермента (эналаприл), так и у больных ОИМ, получавших системный тромболизис. Это, на наш взгляд, может свидетельствовать о репарации раневого дефекта сосудистой стенки. Важно отметить, что нами была подтверждена эндотелиальная природа десквамированных клеток в периферической крови посредством оценки их

морфологии при фазово-контрастной микроскопии и оценки экспрессии на их мембране молекулы СОЗ1.

Таблица 2

Содержание исследуемых маркеров у больных острым инфарктом миокарда

Исследуемый показатель группа 1 (п=35) группа 2 (п=15) контрольная группа (п=30)

ДЭ, 1 сутки (%) 6,11±0,2б*. 6,3±0,4*. 1,6±0,1

ДЭ, 14 сутки (%) 3,5±0,18*. 3,7±0,3*. 1,5±0,1

С031+, 1 сутки % от общего числа клеток нейтрофильной фракции 6,0±0,19*. 5,9±0,2*. 1,5±0,1

С031\ 1 сутки % от общего числа ДЭ 98,2±0,1. 93,7±0,1* 93,8

СБ31+, 14 сутки % от общего числа клеток нейтрофильной фракции 3,3±0,16*. 3,1 ±0,2*. 1,5±0,1

СЭЗГ, 14 сутки % от общего числа ДЭ 94,3±0,1. 83,8±0,1. 100,0±0,0

* - между исследуемым показателем в каждой группе в динамике (Уилкоксона р=0,02) # - между группами и контролем (Манна-Уитни, Краскел - Уоллес р<0,05)

. - только с контролем (Манна-Уитни, Краскел - Уоллес р<0,05)

Таким образом, в первой, во второй группе больных острым инфарктом миокарда на первые и четырнадцатые сутки и у пациентов без сердечно-сосудистой патологии уровень экспрессии С031 десквамированными эндотелиоцитами составил от 83% до 100%.

Проведенный корреляционный анализ полученных результатов показал, что в обеих группах пациентов, получавших ИАПФ (эналаприл) и системный тромболизис, отмечена прямая тесная связь между уровнем экспрессии СОЗ 8 нейтрофилами периферической крови на первые сутки острого инфаркта миокарда и десквамированных эндотелиоцитов на первые сутки (г=0,5). При этом уровень экспрессии СБ38 нейтрофилами на первые сутки ОИМ у пациентов, получавших ингибитор АПФ, коррелировал не только с активностью АДФ-рибозилциклазы на первые сутки развития заболевания, но и определял пик максимальной ферментативной активности фермента, как на первые, так и на четырнадцатые

сутки. Это, по сути, подтверждает тот факт, что существенный вклад в процесс активации нейтрофилов периферической крови осуществляется посредством увеличения экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы с последующей адгезией нейтрофилов и десквамацией эндотелиоцитов, что приводит к формированию раневого дефекта.

Учитывая тесные корреляционные отношения, мы можем утверждать, что уровень экспрессии CD38 нейтрофилов периферической крови характеризует их повреждающие действие на сосудистый эндотелий, и, значит, может являться патогенетически обоснованной мишенью для фармакологической коррекции.

Таким образом, при использовании ИАПФ и системного тромболизиса, достигается коррекция эндотелиальной дисфункции в равной степени и значит, каждый терапевтический подход, целесообразен в своем применении. При этом, уровень маркеров эндотелиальной дисфункции (CD38, CD31+ десквамированные эндотелиоциты), имеет решающее значение в отношении исхода заболевания [Hacke W. et al., 2000], отражает характер действия повреждающих и репаративных механизмов в эндотелии у пациентов с острым инфарктом миокарда.

По результатам динамического наблюдения за больными острым инфарктом миокарда в период их пребывания в кардиологическом отделении, мы обратили внимание, что ранняя постинфарктная стенокардия в первой и во второй группе больных острым инфарктом миокарда наблюдалась у более чем 60 % пациентов. При этом пациентов с синдромом Дресслера не отмечалось. В ходе анализа полученных данных мы обнаружили, что клиническая картина и тяжесть состояния пациентов к четырнадцатым суткам развития заболевания зависела от уровня экспрессии CD38 нейтрофилами периферической крови в первые сутки ОИМ. Так ранняя постинфарктная стенокардия наблюдалась у 73% пациентов с высоким уровнем экспрессии CD38 (27-30%) на первые сутки ОИМ (р<0,05). Резистентная к проводимой терапии артериальная гипертония на четырнадцатые сутки госпитализации в кардиологическое отделение отмечена у 62% пациентов с высоким уровнем экспрессии CD38 (27-30%) на первые сутки острого инфаркта миокарда (р<0,05). Результаты нашего исследования указывают на клиническую

значимость уровня экспрессии С038 нейтрофилами периферической крови на течение острого инфаркта миокарда.

С целью выявления развития повторного острого инфаркта миокарда, острого коронарного синдрома в течение 1 года после стационарного лечения нами были повторно обследованы больные основных групп через один год после госпитализации. Обследовано повторно 50 пациентов основных групп, что составило 100% от всех больных, находившихся на стационарном лечении. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Параметры проспективного наблюдения за больными основных групп через 1 _год после стационарного лечения_

Определяемые параметры Количество пациентов М+ш, %

Группа 1 п=35 Группа 2 п=15

Повторно обследовано 35+6,67 (100) 15+2,01 (100)

Пациенты, имеющие целевой уровень АД 20+3,41(57,14)* 6+3,21 (40)*

Пациенты, имеющие кризовое течение гипертонической болезни на фоне ИБС, постинфарктного кардиосклероза 9+ 4,29 (25,7) 4+1,71(26,7)

Пациенты, принимающие ингибиторы АПФ 23+4,18 (65,7) 11±3,21(73,3)

Пациенты, принимающие эналаприл на амбулаторном этапе (% от всех пациентов, принимающих ингибиторы АПФ) 18+2,27(78,2)* 3+1,95 (20)*

Пациенты с высоким классом стенокардии (ШФК) на фоне постинфарктного кардиосклероза 12+1,18(34,3)* 7+1,02 (46,7)*

Пациенты с высоким классом сердечной недостаточности ХСН ПБ (ШФК по ЫУНА) на фоне постинфарктного кардиосклероза 2+1,01 (5,7) 0+0,02

Пациенты с повторным ОИМ в течение 1 года после данной госпитализации 2+1,01 (5,7) 0+0,02

Пациенты с другой сердечно-сосудистой катастрофой, развившейся в течение 1 года после данной госпитализации (ОНМК, ТИА) 2+1,01 (5,7) 1+1,88 (6,7)

Пациенты с летальным исходом в течение года после данной госпитализации 2+1,01 (5,7) 0+0,02

* - между исследуемым показателем в каждой группе (р<0,05)

Как видно из таблицы 3, ингибиторы АПФ на амбулаторном этапе лечения после стационарного принимали 65,7% больных группы 1 и 73,3% больных группы 2, из них эналаприл - 78,2% и 20% больных групп 1 и 2 соответственно. Отметим, из всех повторно обследованных пациентов никто не принимал блокаторы рецепторов ангиотензина.

В группе пациентов, получавших эналаприл на стационарном этапе лечения, на амбулаторном этапе поддерживались достигнутые цифры целевого артериального давления у 57% пациентов. При этом высокий функциональный класс стенокардии напряжения отмечался у 34,3% больных 1 группы и 46,7% больных 2 исследуемой группы. Повторно ОИМ и другие сосудистые катастрофы в течение одного года после стационарного лечения преимущественно отмечались в 1 группе пациентов, получавших эналаприл, тогда как в группе пациентов, получавших ТЛТ, повторных инфарктов миокарда не регистрировалось. Важным показателем этиопатогенетического применения ингибиторов АПФ у больных, перенесших острый инфаркт миокарда, с длительным гипертоническим анамнезом, является частота летальных исходов. В нашем исследовании в группе пациентов получавших эналаприл летальность составила 5,7% в течение одного года после перенесенного ОИМ. Однако следует отметить, что полученные клинические результаты проспективного наблюдения за больными основных групп через 1 год после стационарного лечения не коррелировали с уровнем экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови, оцененными как в первые, так и на четырнадцатые сутки развития острого инфаркта миокарда.

Исходя из этого и учитывая высокую значимость нормального функционирования эндотелия в гомеостазе всего организма, что обусловлено множеством физиологических функций эндотелия (в числе которых иммунная, ферментативная, участие в регуляции гемостаза и вазоконстрикции), мы считаем, что степень выраженности эндотелиальной дисфункции, оцениваемой по характеру нейтрофил-эндотелиальных взаимодействий, отражает степень тяжести состояния больного инфарктом миокарда преимущественно в острый период заболевания.

Для оценки прогностической роли эндотелиальной дисфункции применительно к более поздним срокам развития заболевания, очевидно, требуется учет большего количества параметров, отражающих функционирование эндотелия, включая оценку его адгезивных свойств, а также состояния свертывающей системы, липидного обмена и пр. Так, гиперкоагуляция отмечалась нами у более чем 50% больных острым инфарктом миокарда на первые сутки развития заболевания, а дислипидемия и гиперхолестеринемия - у более чем 80% исследуемых больных. Обобщая, следует подчеркнуть, что опираясь на точку зрения о том, что ведущая роль в патогенезе ОИМ принадлежит функционированию эндотелия и сопряженных с ними систем гомеостаза (гемостаз, иммунитет, тонус сосудов и др.), увеличивается значимость исследований экспрессии и активности клеточных молекул, вовлеченных в патогенез эндотелиальной дисфункции, как мишеней для патогенетической коррекции у больных с острым инфарктом миокарда. Наше исследование позволило оценить вклад СБ38+ нейтрофилов периферической крови в повреждение эндотелия у больных острым инфарктом миокарда (рис.2).

Мы полагаем, что острая ишемия кардиомиоцитов приводит к высвобождению продуктов цитолиза и увеличению секреции цитокинов, являющихся мощными хемоагграктантами для нейтрофилов периферической крови. Один из механизмов активации нейтрофилов реализуется посредством увеличения экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы, участвующей в синтезе цАДФР с последующим высвобождением Са2+ из внутриклеточного депо, что необходимо для проявления функциональной, в том числе и миграционной, активности этих клеток. В свою очередь, активный хемотаксис и адгезия нейтрофилов периферической крови к эндотелиоциту осуществляется путем взаимодействия С038-С031 с последующим цитотоксическим действием нейтрофилов на эндотелиоциты, что приводит к их десквамации в просвет кровеносного русла и формированию раневого дефекта. Такое повреждение эндотелия усугубляет предсуществующую хроническую эндотелиальную дисфункцию, присутствующую у этой категории больных, что клинически проявляется резистентностью к гипотензивной терапии и сохранению ангинозного

синдрома у больных острым инфарктом миокарда. Понимание новых аспектов в патогенезе острого инфаркта миокарда диктует необходимость поиска адекватной патогенетической терапии. В связи с этим, изучение механизмов развития эндотелиальной дисфункции и применения препаратов, патогенетически воздействующих на них, представляют перспективное направление современной медицины.

Продукты цитолиза, цитокины

Увеличение экспрессии С038 на нейтрофилах периферической крови

Увеличение активности АДФ-рибозилциклазы и продукции цАДФР

Стимуляция высвобождения кальция из внутриклеточных депо

Активация хемотаксиса и адгезии нейтрофилов к эндотелию

Взаимодействие С038-С031

Цитотоксическое действие.нейтрофилов на эндотелиоциты

Десквамация эндотелия

Резистентность к терапии, сохранение ангинозного синдрома

Рис.2. Патогенетическая схема возможного вклада активности С038+ нейтрофилов

периферической крови в повреждение эндотелия у больных острым инфарктом миокарда.

выводы

1. У больных острым инфарктом миокарда отмечен высокий уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови на первые сутки (25,9%) с последующим снижением до 15,8% к четырнадцатым суткам заболевания (р<0,05 в сравнении с контролем), что соответствует динамике количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови.

2. Уровень экспрессии CD38 нейтрофилами периферической крови на первые сутки развития острого инфаркта миокарда имеет прогностическую значимость в клинической картине и степени тяжести состояния пациентов, оцениваемых на четырнадцатые сутки развития заболевания.

3. Несмотря на то, что в первые сутки развития острого инфаркта миокарда уровень экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови отражает степень выраженности эндотелиальной дисфункции, этот показатель не является прогностически значимым в клинической картине и степени тяжести состояния пациентов в отдаленные сроки развития заболевания (в течение 1 года после перенесенного острого инфаркта миокарда).

4. Выбранная фармакологическая тактика ведения пациентов, применение И АПФ или системного тромболизиса не влияет на уровень экспрессии CD38 нейтрофилами периферической крови. Однако введение стрептокиназы вызывает достоверное снижение активности АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови на первые сутки заболевания и смещение пика максимальной ферментативной активности in vitro на четырнадцатые сутки острого инфаркта миокарда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью оценки выраженности эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда патогенетически оправданным является определение экспрессии и активности CD38 на нейтрофилах периферической крови.

2.Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на коррекцию эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда и, значит, каждый терапевтический подход целесообразен в своем применении.

3. Уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови в первые сутки острого инфаркта миокарда является клинически значимым критерием в развитии ранней постинфарктной стенокардии на четырнадцатые сутки заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Роль экспрессии CD38 в формировании эндотелиальной дисфункции при остром инфаркте миокарда / Е. В. Большакова, А. Б. Салмина, М. М. Петрова, О. С. Бахметьева// Сиб. мед. обозрение. -2007. - №3. -С. 36-38.

2. CD38 как маркер эндотелиальной дисфункции при остром инфаркте миокарда / О. С. Бахметьева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова и др. // Матер, междунар. научн. конф. по биомедицине. - Херсон, 2007. - С.61-64.

3. Бахметьева, О. С. Влияние тромболитической терапии на экспрессию CD38 /АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови / О. С. Бахметьева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова // Вестн. РУДН. Серия Медицина. - 2007. - № 6. - С. 375377.

4. Особенности формирования эндотелиальной дисфункции при инфаркте миокарда / О. С. Бахметьева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова и др. // Сиб. мед. журн - 2007. - Т. 73, №6.-С. 13-15.

5. Бахметьева, О. С. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы на фоне применения различной лекарственной терапии у больных инфарктом миокарда / О. С. Бахметьева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова// Матер, научн.-практ. конф. молодых ученых. - СПб., 2008. - С. 35-36.

6. Бахметьева, О. С. Системный тромболизис и маркеры эндотелиапьной дисфункции при остром инфаркте миокарда / О. С. Бахметьева, А. Б. Салмина, М. М. Петрова// Сиб. мед. обозрение. -2008.-№2. -С.34-37.

7. «Способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом». Патент Российской Федерации на изобретение № 2331819 от 20.08.2008 г., приоритет от 09.03.07 г. (соавт. А.И. Инжутова, А.Б. Салмина, М.М. Петрова, C.B. Михуткина, A.A. Фурсов).

Список основных сокращений

АД - артериальное давление

АДФ - аденозиндифосфат

АДФрц - АДФ-рибозилциклазная активность

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

AT - рецепторы - ангиотензиновые рецепторы

ГДФ - гуанозиндифосфат

ДЭ - десквамированный эндотелиоцит

ЕД - единица действия

ИАПФ - ингибитор ангиотензинпревращающего фермента

НАД+ -никотинамидадениндинуклеотид

НГД+ - никотинамидгуаниндинуклеотид

ОИМ - острый инфаркт миокарда

РААС - ренин-ангиотензин-альдостероновая система

TJIT - тромболитическая терапия

цАДФР (цАДФ-рибоза) - циклическая АДФ-рибоза

цГДФ-рибоза (цГДФ-рибоза) - циклическая ГДФ-рибоза

FITC- флуоресцеинизотиоцианат

PBS - фосфатно-солевой буфер

Лицензия ПДД№ 40-12 от 17.12.1999 г. Сдано в печать 24.12.08 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная №1. Печать офсетная. Объём 1.5 Физ. печ. л. Закал № 1794 Тираж 100 экл. 660049, г. Красноярск, ул. Вейнбаума, 26. ККМИАЦ ОИиПД

Актуальность темы. Одной из основных медико-социальных проблем Российской Федерации является низкая продолжительность жизни: мужчин - 58,9 года, а женщин- 72,4 года. Такие показатели связаны с высоким уровнем смертности, в первую очередь, от неинфекционных заболеваний. Лидирующую позицию занимают болезни системы кровообращения- 56,1%, из них летальность от ишемической болезни сердца, в том числе инфаркта миокарда, составляет 26,7 % , а 20,4% - болезни сосудов головного мозга, в том числе инсульты. В России ежегодно острое коронарное событие развивается у 3-5 человек на 1000 населения. Артериальная гипертония является ведущей причиной сердечно-сосудистых расстройств.

До сих пор остаются до конца не изученными механизмы повреждения клеток при острой ишемии миокарда. В последнее время уделяется много внимания оценке роли эндотелиальной дисфункции и апоптоза клеток (эндотелиоцитов, гладкомышечных клеток сосудов, клеток тканей ) в развитии гипертонической болезни и ее осложненных форм. Следовательно, определение маркеров эндотелиальной дисфункции может дать представление о степени повреждения органа, а также служить предпосылкой к выбору нужного метода лечения [Preston R.A. et al., 2003].

Прогрессирование эндотелиальной дисфункции, происходящее в условиях гипоксии, обусловленное изменением эластичности сосудистой стенки при гипертонической болезни и остром инфаркте миокарда, сопровождается повышением концентрации маркеров дисфункции и повреждения эндотелия. Следует отметить, что до настоящего времени не определена связь между содержанием маркеров эндотелиальной дисфункции в периферической крови и степенью тяжести состояния больных острым инфарктом миокарда на фоне гипертонической болезни.

До сих пор не установлено, что является предопределяющим фактором прогрессирования эндотелиальной дисфункции и обусловленных ею осложнений.

Важным этапом в развитии эндотелиальной дисфункции является изменение физико-химических свойств мембран клеток, за счет экспрессии рецепторов клеточной активации и адгезии, характер которой остается не изученной. Однако остается не уточненной роль неклассических молекул клеточной адгезии в формировании молекулярно-клеточных механизмов нарушения функции эндотелия.

Молекула CD38 — это бифункциональный рецептор-фермент с молекулярной массой 46 кД, участвующий в передаче внутриклеточной сигнальной информации, а так же в межклеточной коммуникации в клетках различной природы [Lee, Н.С et al., 2000]. Основным продуктом каталитической активности CD38 является циклическая АДФ-рибоза, выполняющая функцию мобилизатора кальция из внутриклеточного депо в цитозоль. Спектр экспрессии CD38 достаточно широк и включает в себя клетки крови, центральной нервной системы, поджелудочной железы, кардиомиоциты [Ferrero Е. et al., 2000; Flora A. et al., 2004; Okamoto H. et al., 2002]. Показано, что взаимодействие CD38, экспрессированного на клетках лимфоцитарно-лейкоцитарного звена, и CD31, экспрессированного на эндотелиоцитах, представляет собой один из механизмов роллинга лейкоцитов, сопровождающего физиологические и патологические события на поверхности эндотелия [Franco, L. et al., 1998]. Последние годы появились данные о роли CD3 8/АДФ-рибозилциклазы в регуляции функциональной активности ряда клеток, в том числе нейтрофилов, однако данные об особенностях экспрессии и проявления активности CD38 в этих клетках при остром инфаркте миокарда отсутствуют.

До настоящего времени не установлены отличия по воздействию на уровень маркеров эндотелиальной дисфункции многих фармакологических препаратов, в том числе тромболитических препаратов, ингибиторов АПФ.

С учетом ведущей роли эндотелиальной дисфункции в развитии острого инфаркта миокарда на фоне прогрессирования гипертонической болезни, перспективным является изучение динамики содержания маркеров эндотелиальной дисфункции у больных ОИМ, а также возможность фармакологической коррекции степени дисфункции эндотелия при проведении системного тромболизиса.

Цель исследования. Изучить особенности экспрессии и активности CD3 8/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда при использовании тромболитических препаратов и ингибиторов АПФ для расширения патогенетического обоснования их применения.

Задачи исследования.

1. Определить характер экспрессии CD38 и активность АДФ-рибозилциклазы в нейтрофилах периферической крови у больных острым инфарктом миокарда на первые и четырнадцатые сутки развития заболевания.

2. Оценить вклад экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови в их повреждающее действие на эндотелий у больных инфарктом миокарда.

3. Оценить особенности клинического течения острого инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови.

4. Оценить эффективность фармакологической коррекции острого инфаркта миокарда в зависимости от уровня экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови.

Научная новизна.

Впервые выявлена зависимость между уровнем эндотелиальной дисфункции и характером экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови, что позволяет рассматривать CD38 в качестве маркера эндотелиальной дисфункции.

Впервые изучено влияние ингибитора АПФ (эналаприла малеата), и тромболитика (стрептокиназы) на уровень экспрессии и активности СВ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных острым инфарктом миокарда.

Впервые показана зависимость между выраженностью изменения экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови и степенью тяжести больных острым инфарктом миокарда.

Практическая значимость работы.

Изменение уровня экспрессии и активности CD3 8/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов является адекватным показателем интенсивности патологического процесса (эндотелиальной дисфункции) и эффективности проводимой терапии.

Уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови в первые сутки острого инфаркта миокарда коррелирует со степенью тяжести состояния пациентов на четырнадцатые сутки развития заболевания.

Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на коррекцию эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда, и значит, каждый терапевтический подход, целесообразен в своем применении.

Дано новое патогенетическое обоснование применения системного тромболизиса у больных острым инфарктом миокарда

Положения, выносимые на защиту.

1. В периферической крови больных острым инфарктом миокарда на первые сутки развития заболевания определяется высокое содержание клеточных маркеров эндотелиальной дисфункции. Высокие корреляционные отношения между уровнем экспрессии CD38 и десквамированными эндотелиоцитами позволяют признать их в качестве надежных маркеров дисфункции эндотелия.

2. Уровень экспрессии и активности CD3 8/АДФ-рибозил цикл азы на нейтрофилах периферической крови характеризуют степень тяжести состояния пациентов с острым инфарктом миокарда.

3. Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на восстановление функции эндотелия у больных острым инфарктом миокарда.

Внедрение результатов исследования.

Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в практику НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, используются при чтении лекций и проведении практических занятий и семинаров у студентов ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, врачей-курсантов института последипломного образования.

Личный вклад соискателя

Диссертантом выполнено лично: определение цели, разработка конкретных задач работы и плана их выполнения; составление протоколов исследований; набор экспериментального материала; самостоятельный общеклинический осмотр пациентов и забор материала для анализа; проведение иммуноцитохимических исследований с использованием фазовоконтрастной и люминесцентной микроскопии; флуориметрических исследований АДФ-рибозилциклазной активности CD38 нейтрофилов периферической крови; статистическая обработка материала исследований и интерпретация результатов; написание автореферата и текста диссертации.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на международной научно-практической конференции по биомедицине (Украина, Херсон, 2007), на научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины-2008» (Санкт-Петербург, 2008), на научных семинарах НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, на заседании кафедры биохимии с курсами медицинской, фармакологической и токсикологической химии (2008), на заседании проблемной комиссии по внутренним болезням и кардиологии ГОУ ВПО КрасГМУ имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ (2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работы, из них 3 в издании, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент РФ на изобретение по заявке № 2331819 от 20.08.2008 г., приоритет от 09.03.07 г. «Способ диагностики степени эндотелиальной дисфункции у больных гипертонической болезнью, осложненной ишемическим инсультом».

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 95 страницах текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 2 фотографии, 7 рисунков, 20 таблиц. Библиографический список включает 130 источника, из которых 51 отечественных и 79 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. У больных острым инфарктом миокарда отмечен высокий уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови на первые сутки 25,9% с последующим снижением до 15,8% к четырнадцатым суткам заболевания (р<0,05 в сравнении с контролем), что соответствует динамике количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови.

2. Уровень экспрессии CD38 нейтрофилами периферической крови на первые сутки развития острого инфаркта миокарда имеет прогностическую значимость в клинической картине и степени тяжести состояния пациентов, оцениваемых на четырнадцатые сутки развития заболевания.

3. Несмотря на то, что в первые сутки развития острого инфаркта миокарда уровень экспрессии и активности С038/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови отражает степень выраженности эндотелиальной дисфункции, этот показатель не является прогностически значимым в клинической картине и степени тяжести состояния пациентов в отдаленные сроки развития заболевания (в течение 1 года после перенесенного острого инфаркта миокарда).

4. Выбранная фармакологическая тактика ведения пациентов, применение ИАПФ или системного тромболизиса не влияет на уровень экспрессии CD38 нейтрофилами периферической крови. Однако введение стрептокиназы вызывает достоверное снижение активности АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови на первые сутки заболевания и смещение пика максимальной ферментативной активности in vitro на четырнадцатые сутки острого инфаркта миокарда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью оценки выраженности эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда патогенетически оправданным является определение экспрессии и активности CD38 на нейтрофилах периферической крови.

2. Применение системного тромболизиса оказывает в равной степени с изолированной терапией ингибиторами АПФ положительный эффект на коррекцию эндотелиальной дисфункции у больных острым инфарктом миокарда и значит, каждый терапевтический подход целесообразен в своем применении.

3. Уровень экспрессии CD38 на нейтрофилах периферической крови в первые сутки острого инфаркта миокарда является клинически значимым критерием в развитии ранней постинфарктной стенокардии на четырнадцатые сутки заболевания.