Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Изменение активности Са2+, Mg2-зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени собак при длительной гиповолемической гипотензии и в постреанимационный перод (экспериментальное исследование)

РОССШСКЙЯ ¡.ЕП^ТАШ НАУК

£661 Ш(ГЬ£-^ССЛЕ£0ВАГВЛЬСК1-1:-1 ШСТШТ ОЗЗП ПАТОЛОПШ

ИО 9.1сЗ

ГхАТОсжиоюп::

На правах рукописи

НОСОВА Надежда Владкмировна

ИЗЖНЕНИЕ АКТИВНОСТИ Са2+, Щ2~-ЗШСКЖ ЗНДОНУКЛЕАЗ В КЛЕТОЧНЫХ ЯДРАХ ПЕЧЕНИ СОБАК ПК! ДЛИТЕЛЬНОЙ ШОЗОЖ51ЧБСКОЙ П5ПОТШ31!И И В ПОСТРЕЖИ'ЩКОШйй! ПЕРИОД

(Зкспер;злелтальное исследование) 14.00.16 - патологическая физиология

й з т о р е с, е р а 1 гссертащп! на соискание учено?, стел; кандидата бподогпческ;~>: на\~--.

Работа вкполнена в лаборатории экспериментальной терапии терминальных состояний НИИ общей реаниматологии РАМН и лаборат сегментов обмена нуклекновьз: кислот Института медицинской к би гической химик РАМН

Научный руководитель доктор медицинских наук Б .¿1. Кожура

Официальные оппоненты:

доктор, медицинских наук, профессор А.М.Гурвич доктор биоло гичэских нэук Л. Б.Ребиов

Ведущее учреждение - Военно-медицинская академия им.С.М.К

ь

Защита диссертации состоится " " 1993 ;

часов на заседании специализированного сонета ~иф'Р Д 001.03.С1 при Научно-исследовательском институте сбдей патологии и патофизиологии РАМН

(125315, Москва, ул. Балтийская, 6).

Автореферат разослан " № " 993 г.

С диссертацией ¡/окно ознакомиться в библиотеке Институт;

-тченьм се:-Специзлиз;

СА ^ Э

резанного совета едицинских наук

£. Н .СкутэатоЕска.'

ОБДАЛ ХлРыи ¿Fi'.СШгА PAbCTu

Актуальность проблемы. Несмотря на значительные успех:;,достигнутые з последние годы в реаниматологии, тяжелый гиповолеми-ческий шок среди причин, приводящих к гибели людей при массовых катастрофах, занимает ведущее место / Б.Н.Семенов, 1992, I.:. Klain и др -, 198» /. Частая безуспешность реанимационных мероприятий связана с отсутствием целостной научно обоснованной системы профилактики и терапии терминального процесса и постреанима-циоккой болезни. Это обусловлено все еще недостаточны/, пониманием молекулярных механизмов гипоксического повреждения органов при смертелы.ой крозспотере и после реанимации.

ао данным ряда авторов / К.R.Champion и др . , 1976, R.A. Cowley и др .,1982, G. Schlag с соавт.,1991 и др./,частой причиной гибели Сольных, перенесших критические состояния, яв -ляется печеночная недостаточность, ххрк эюм основным фактором развития патологии печен:: выступает нарушение метаболизма, что приводит к накоплению токсических продуктов , интенсификации деструктивных процессов, затрагивают^ как иитсплазматическнй, так и ядерный аппарат гепатсцпта.

Участие нуклеиновых кислот в поддержании структуры и пункции клеток, тесная связь этих биомакромолекул с функциональны:,, состоянием тканей и органов определяет важность изучения обмена куклзкновнх кислс1 в печени при умирании на ~с-не длительной г;-:-повсле;.:::ческсй гпг.стгкз:::: и в постреаннмаппснный период.

£ литературе до сих пер нет четкого представления : мсл-зку-лярном механизме гибели гепатопита при гипоксии. Ь настоящее зре-:.:я установлено, что важным звене:.: гнпонснческсго повреждения к лет кп печени при оазл::чнь:х патологических сососяннгх является нарушение кальциевого гомеостаза ,/-.?.Jones и др Itci-, b.J.lru:

I.3erezesky , I•zzj /. имеются убедительнее доказательства того, что массивное поступление ионов кальция в ыитозоль клетки вызывает активацию липолиза , протеолиза, а также дисагрегаыию компонентов ыитоскелетa /S.Orrenius et al. , I9cd, В.К.Siesjo,

Исследования печени при терминальных состояниях затрагивают , в основном, иитоплазматические структуры гепатоиита / Т.Е. Казуева , I9d5, В.Д.Конвай ,ISüo, Ы.Б.Биленко ,19о9, С.Е.Никулина, 1969, Г.С.Левин , 1991, B.F.Trimp и др., 19о2, L.V.bíolchano-va и др., 1991 / и в меньше?, степени - ядерный аппарат клетки /' к.ш.Ть:рть:аников , I9Ó6, H.l¿.Lazaras,A.Hopfenbeck,I97ó, 1979 /. Мевду тем известно , что деструкция ДНК хроматина является определяющим фактором сохранения жизнеспособности клетки. Однако, механизма деградации нуклеиновых кислот е печени при смертельной кровопотере совершенно не изучена. До настоящего времени в патогенезе ии;емического повреждения печени при терминальных состояниях не определена роль ключевых ферментов обмена нуклеиновых кислот - Са^^о'-зависимых эндонуклеаз. Последнее представляется особенно важным для раскрытия механизмов повреждения структуры и функции этого органа при массивной кровопотере и в постреанимакионных состояниях.

Ь сеязигс участием ионов калы:ия в механизмах регулянии активности Са^'-^-зависимих эндонуклеаз в клетке было важным определить роль кальциевых блокаторов в динамике активности этих ферментов при гиповолемическом шоке и после реанимации. Это позволит не только исследовать некоторые механизмы, связанные с нарушением Опосинтетических функций клеток г.ечени, но и разработать пути эффективней защит:-: гепатоыита от повреждающего действия терминального и постреснимапионного процессов.

ыель работы. Целью настоящего исследования было изучение за-:-'Ономерносте.°. изменения активности Се~"7"'£'-эееисимых эндонуклеаз :-:леточн;-х ядер печени соОак в динамике длительно;': гипоьеле-мической гипот-знзии и в посгрэаним£1:ионн: 2 период, включая стда

достижения поставленной гели были определен;:' следующие задачи: 1

1. Исследовать зависимость между длительностью гиповолеми-ческой гипотекзии и активностью Са^+, М^ ^-зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени.

2. Выявить динамику активности Са^+, Мд ^"-зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени в постреанимационный период.

3. Выяснить общие закономерности и различия в изменении активности Мр ^"-зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени и коры головного мозга при умирании на фоне длительной гипо-волемической гипотензии и в постреанимационный период.

4. Оценить влияние блокатора кальциевых каналов верапамила на уровень активности Са^+, -зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени в процессе гиповолемического шока и после реанимации.

Научная новизна работы. Настоящими исследованиями впервые обнаружено, что Са^4", М^ ^-зависимый эндонуклеолиз з ядрах ге-патоцитов является Еакным патогенетическим механизмом ишемичес-кого повреждения печени при тяжелом гиповолемическом шоке. Показано, что массивная кровопотеря вызывает активацию Са'"+, зависимкх эндонуклеаз в клеточных ядрах печени, прогрессирующую по мере удлинения периода артериальной гипотензии. Установлено также, что в постреанимационном периоде (1-3 мес.) активность Сас+, 1,1$ ^"-зависимых эндонуклеаз не имеет тенденции к снижения. Обнаружены общие закономерности в изменении активности исследуемых ферментов в клеточных ядрах печени и корь; головного мезга собак при длительной гиповэлемкческой гипотензии и в псстреанк-мациенный период.

Получены новые данные, свидетельствующие об ингибиру:ощем елиянии верапамила, введенного внутривенно как за 30 минут до массивной кровопотери, так и в реанимационном комплексе, на процесса Са"+, !■'. д ^-зависимого эндскукт.еолиза в клеточных ядрах печени собак.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные гкосят существенней вклад в изучение молекулярных механизмов повреждения клеток печени при длительно.1.: гиповолемическом шоке и з постреанима'ционный период. Выявлены и прбанализи-

рованы закономерности активации Са^+, М^ ^"-зависимых эндонуклеаз клеточных ядер печени и коры мозга в терминальный период и после реанимации. Установлена возможность коррекции процессов эндонук-леолиза в клеточных ядрах печени блокатором кальциевых каналов верапамилом в дозе 0.1 и 1.0 мг/кг. Полученные в работе данные о молекулярных механизмах нарушений биосинтетических процессов в умирающей клетке и защитной роли кальциевых блокаторов позволяют наметить новые подходы для коррекции гипоксических повреждений в организме при смертельной кровопотере и профилактики осложнений постреанимационной болезни.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Массивная кровопотеря вызывает активацию

зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени, прогрессирующую по мере удлинения периода гиповолемической гипотензии.

2. Процесс Са^+, Мр ^"-зависимого эндонуклеолиза в клеточных ядрах гепатоцитов сохраняет высокую активность и в постреа-нимационнок периоде после длительной артериальной гипотензии.

3. Существуют общие закономерности в изменении активности Са^+, М^ +-завискмых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени и коры головного мозга собак при длительной гиповолемической гипотензии и в постреанимационный период.

4. Предварительное введение верапамила до массивной крово-потери, также как к включение^его в реанимационный комплекс.вызывает снижение активности Са*""1", ь'^. +-завксимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на итоговой научной конференции Института общей реаниматологии А1£-1 СССР (г. Москва, 1990), научной конференции молодых ученых Института общей реаниматологии АМН СССР (г. Москва, 1991), международном конгрессе патофизиологов (г. Москва, 19Э1), Всеармейской научной конференции "Актуальные вопросы совершенствования диагностики и лечения пострадавших в районах массовых бедствий" (г. Ленинград, 1991), 2-ой Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (г. Гродно, 1992)., конференции "Профилактика и экспериментальная тера-

пия экстремальных и терминальных состояний" (г. Омск, 1992) конгрессе анестезиологов-реаниматологов Украины (Запорожье, 1992).

Апробация работы состоялась 30 января 1992 г. на межлабораторной научной конференции Института общей реаниматологии РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста, содержат 9 таблиц, II рисунков, 5 фотографий. Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения методов и результатов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 123 отечественных и 123 иностранных источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 59 взрослых беспородных собаках обоего пола массой 9-15 кг, из которых 15 служило контролем. После премедикации промедолом (8 мг/кг) в условиях поверхностного нембуталового наркоза (5-8 мг/кг) (.1% Sol. Hembutali natrii ) в сочетании с местной анестезией у гепаринизированных (500 МЕ/кг) собак проводили быстрое (в течение 5-8 минут) кровопускание из бедренной артерии, снижая артериальное давление до 40 мм рт.ст. и поддерживая его на этом уровне в течение 2-х, 4-х, 6-и часов в зависимости от целей опыта. Объем кровопотери у этих животных составил в среднем 42-45 ыл/кг массы тела. Перед опытом и в процессе проведения эксперимента следили за общим состоянием животных и регистрировали их основные физиологические параметры (АД, ЗКГ) на полиграфе фирмы " San-3i " (Япония). Уровень гипоксии определяли по показателям кислотно-щелочного состояния артериальной крови на аппарате "Аструп".

Реанимацию животных проводили внутриартериальным нагнетанием (в течение первых Ь минут) смеси, состоящей из крови с поли-глюкином (40% и 60/Ь от объема кровопотери) с микродозами гепарина. 3 течение 1-го часа реанимации внутривенно проводили над-трансфузим 20 мл/кг смеси крови и плазмозамещающих растворов (кровь-реополиглюкин-лактасол 1:1:1). С целью изучения влия-

о , о

кия верапамила на активность Са "П^-зависимых эндонуклеаз ки-вотным за 30 минут до массивной кровопотери внутривенно вводили препарат из расчета 0.1 и 1.0 мг/кг.

Б части опытов верапзкил в дозе 1.0 мг/кг включали е инфу-зконнуш терапию после 4-часовой гиповолемической гипотекзии. Пр: этом реанимационный комплекс дополняли дофмином в дозе 5-8 мкг/ кг массы тела.

Для биохимических исследований животных забивали электротоком от сети / напряжение 127 В / под нембуталовым наркозом чере: 2,4,6 часов артериальной гипотензии и через I час и 1-3 месяца после реанимации. Контрольную грушу составили анестезированные животные, неперенесшие массивной кровопотери.

Ткань печени для исследования Са^тф-зависимых эндонуклеаз во всех опытах получали из левой доли через разрез брюшной полости. Затем образец ткани немедленно помещали в лед.

В части опытов активность Са^*М^"-зависимых эндонуклеаз определяли в клеточных ядрах коры головного мозга. Биохимические исследования проводили параллельно с исследованиями в печени. Ткань мозга / лобно-височная доля / получали через трепа- "" национное отверстие в течение 8-10 минут с момента забоя животного и помещали в лед.

Ядра печени и коры головного мозга выделяли детергентньм методом с использованием тритона Х-ЮО.Эндонуклеолиз хроматина проводили только в свегкевыделенных препаратах клеточных ядер. Для активации эндогенных ДНКаз клеточные ядра переносили в буфер, содержащий 50 м;.1 трис-КОС, рН 7.4 при 37 С, 0.25 1Л сахарозу и соли дивалектных металлов: 2 мЫ СаСб +5 м1.1 2.Контроль за глубиной расщепления ДНК хроматина ^-зависимыми эндо-нуклеазами осуществляли, измеряя прирост поглощающего при 260 и.; материала в кислоторастворимой / 0.5н НС^О^/ фракции.

Ядерный экстракт получали, лизируя клеточные ядра в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС£ ,рК7.9, 2 Ы УаС<?, 50 мЫ ЭДГА, 5 м!.; уз-меркаптоэтанола и осаждая ДНК раствором полиэтиленгли-коля-6000.

Для определения активности зависимых эндонуклеаз

в клеточных ядрах в качестве субстрата использовали ДНК плаз-миды штамма рКС 15, выделенную нами по методу, описанному е

руководстве Т.Маниатиса / Iv84 /. 'Концентрации белка в препаратах определяли по методу J.Cedmar;:, S.Crossberg /1577/.

ДНК из клеточные ядер печени собак Еьделялк, используя обработку протеиназой К и РККазой к и TI. Электрофорез ДНК проводили в блоках 2fs агарозь:. :.;олекулярнозесовым стандартом служили гидролизаты ДНК (:ага лямбда рестрнктазами Hind IiI.EooHl. Гели окра"лизали в растворе бромистого этидия и фотографировали через-оранжевый светофильтр в отраженном ультрафиолете. Негативы сканировал!! на денситометре "Хромоскан-200" /Англия/.

цифровые результаты проведенных исследований обработаны методом вариационной статистики с применением критерия Стьюдекта для определения достоверности различий.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУДЩШ

Результаты экспериментов показали, что величина активности Са^'^-зависимых эндонуклеаз находится в прямой зависимости от длительности периода гиповолемической гипотензии.

На рисунке I. показана динамика активности Са^Т^-зависи-мых эндонуклеаз в различные периоды длительной артериальной гипотензии. Как видно из представленных данных, активность исследуемых ферментов в ядрах гепатецитов ко 2-му часу гиповолемичес-кого ыска составила 3300+177 ед/мг белка по сравнению с 2636+

167 ед/мг белка в контроле / р^О.Оо /. К 4-му часу гипотензии активность Ca^il^-sasKCjaibsc эндонуклеаз была равна 4966+3G5 ед/мг белка / r<0.CCi /, а к б-му часу - возросла на ИБС по сравнению с контролем v. составила Ь754+ЬЗо ед/мг белка / p^C.CCi /.

Аналогичные изменения обнаружены на:.:;; при анализе кинетики накопления кислоторастворимых продуктов аутстидролиза ДНК хроиа-тина клеточных ядер печени собак. Установлено, что с удлинением периода гиповолемической гипотензии ускоряется гропесс деградации ДНК хроматина .ядер гег.атоыитов, который сыл наиболее выражен к 6-му часу гипотензии.

Многие авторы /s.Orrenius и др IsES, D.Conkey и др ISS9 / от;.'.еча:от, что гибель клетки сопровождается резким увеличением эндогенной -зависимей, зндснуклеазксй активнее-

О О

Динамика активности Са "^''у+-зависимь!Х эндонуклеаз клеточных ядер печени на фоне артериальной гипотензии.

А,ед/мг белка

6000 I

5000 --

4000 ..

3000

2000 --

о (X б" X о

2 4 6 Гипотензия

рисунок I.

ти, что псзБоляет считать зтот фермент фактором клеточной гибели. Таким образом, полученные и б наших исследованиях количественные данные об активации Са^ТН*^"-зависимых зкдонуклеаз б динамике терминального периода указывают на нарастание деструктивных процессов б клеточных ядр?а печени по мере удлинения периода гипотензии.

Количественный рост эндснуклеазной активности в процессе гипс Еолеыического шока сопровождается ростом нуклеоссмной длины фрагментов ДНК хроматина изолированных ядер печени собак, обнаруживаемых в агарозном геле при электрофорезе.

Несмотря на прогресс в изучении ферментов обмена нуклеиновых кислот, до настоящего времени недостаточно определены механизмы увеличения активности ДНК-эндонуклеаз. А.Г.Еаснакьян с соавт. / 1989 /указывают на возможность их образования из неактивных белковых предшественников путем ограниченного протеслиза. Среди возможных механизмов регуляции активности Са^ь^+-зависимых эндонук-леаз авторы отмечают фосфорилирование к поли /АДФ/рибозилирование / П.А.Келипсвич и др . , 1984, 11 Ьелипович« Л» В.Никонова, 1984, О. Hayaisi, К. Ueda ,I977,H.Kizaki и др ., 1989 /. Другие исследователи /ъ. Conkey и др .,1989-а / предполагают участие протеинкиназы С в ингибировании процессов фрагментации ДНК. Содержанке протеинкиназы С в гепатоцитах крыс при геморрагическом шоке значительно снижается / Г.Ф.Лескова, 1992 /. Сопоставление этих данных с вышеизложенными даст основание предполагать, что уменьшение содержания протеинкиназы С в гепатоцитах - один из механизмов, обуславливающих фрагментацию ДНК в клеточных ядрах печени.

Известно, что б хроматине печени крыс присутствуют участки, обладающие различной чувствительностью к эндогенной нуклеазе /Н.Н. Хсдарев, хъ'60 /. Но данным автора, Солее "доступной" кон!ормаци-еГ: для нуклеазы обладают участки, содержащие супершетилкруемую ДНК и функционально связанные с синтезом FHK. Еозмсжко, это и обуславливает феномен опережающего падения концентрации FHK по отношению к ДНК в ткани печени при умирании ст массивной кровопоте-рп / Е.Д.Кожура, 1»80 /. Именно в этот.период, как показано нами, достоверно возрастает активность Са^ы^-зависимых зкдонуклеаз в ядрах гепатсцитов.

В постреанпмационный период активность Са^^-зависимых зн-

донуклеаз в клеточных ядрах печени собак не имеет выраженной тенденции к снижению. Как видно на рисунке 2, величина активности фер ментов через I час после реанимации составила 4702+245 ер/иг белка, что существенно превысило контрольные величины 2636+187 ед/мг белка / р^О.ОО! /. Следует заметить, что активность ДКК-эндонук-леаз в раннем постреанимационном периоде суцестЕенно не различал-лась с таковой в конце 4-го часа гиповолемического шока 4366+365 ед/мг белка / р^О.9 /. Таким образом, активность Са2|4+ -зависимы? экдонуклеаз к 1-му часу постреанимационного периода оставалась высокой- по отношению к контролю.

Через 1-3 месяца после реанимации активность исследуемых ферментов достоверно увеличилась на 93% и составила 5087+509 ед/мг белка по сравнению с 2636+187 ед/мг белка в контроле / р43.001 /. Этот факт указывает на устойчивость процесса активации за-

висимых эндснуклеаз и свидетельствует о продолжающемся деструктивном процессе в клеточных ядрах гепатоцитов.

Важно отметить, что электрофореграмма препаратов ДНК хроматина изолированных ядер печени собак, полученных в отдаленный /1-3 мес. / постреанимационный период после 4-часового гиповолемкческо-го пока, обнарукивает отсутствие зависимости между интенсивностью фрагментации ДНК хроматина и временем инкубации её проб ка протяжении 60-и минут наблюдений. Последнее, как мы полагаем, указывав на формирование изменений физико-химических характеристик ядерно-хроматина клеток печени в отдаленные сроки после реанимации.

Анализ кинетики накопления кислотораствсримок фракции ДНК хрс матина клеточных ядер печени обнаруживает снижение суммарной Са'г"' ^-зависимых нуклеазной активности по сравнении с контролем в отдаленном восстановительном периоде. Скм»:ение активности по кпело-торастворимой фракции при сохранении увеличенной активности г.о электрофорезу объясняется, по-видимому, изменением нзоферыектного спектра ендонуклеаз ядер б сторону снижения активности мелксщепля-щкх экдонуклеаз. Важно подчеркнуть, что для жизнеспособности клетки критически?.::: являются первые двуцепочечные разрывы, поэтому уве лнчение активности г.о электрофорезу может рассматриваться как боле значимый маркер деструктивных изменений .клетки, нежели накопление разрывов,приводящих к увеличению кислстсраствсримой фракции или пс явление низксмслекулярнсй ДНК.

А, ед/мг белка 6000

5000 -

4000 .. 3000 --

2000

0 1ч 1-3 мес.

Постреанимационный период

рисунок 2.

О О

Динамика активности Са зависимых экдонуклеаз клеточных ядер печени в постреанимационном периоде.

•а

ч о л (X о

ОтсутстЕие тенденции :-: нгрм.ал:'активности Са^^-зави-сп.мых эндонуклеаз наряду со снижением суммарной Са^^-зависимой нуклеазнсй активности в постреани;.:ациснный период можно рассматривать как в&лный критерий устойчивого повреждения ДНЕ хроматина яде гепатсцитов.

Наличие деструктивного процесса в печени подтверждается ростом активности LH' / глютампко-ппруват трансаыиназы / е плазме кро ви собак в отдаленные / 1-3 мес. / сроки после массивной кровопс— тери / Л.Е.Молчанова, Е.Л.Кожуре , 1976 /. ГзЕестно, что даже спус тя год после временного выключения печени из кровообращения процесс псстишемического повреждения ткани органа был еще не завершен / A.A.КккалашБкли, 1988 /.

Одним из проявлений активного повреждения печени в постреаки-мационный период является обнаруженная нами фрагментация ДКК её клеточных ядер. Эти результаты в значительной степени дополняют ис следования Н. Lazarus, А. Hopfenbeck / 1979 /, которые устакс вили наличие разрывов цепей ДНК хроматина в клеточных ядрах печем крыс при гиповолемическом шоке. Сохранение высокой активности Сг.^1, ¡.^-зависимых: эндонуклеаз в напих опытах монет объяснить механизм формирования разрывов цепей ДЖ хроматина и в постреанимационном периоде.

Б научной литературе по-разному оценивается рель структурны?: нарушений хрсмосоы з процессах гибели клетки. По мнению K.P. Hutchinson/ 1979 /, R.B.Painter/ 1980 /, двуцепочечные разрывы цепей ДНК не сепарируются и являются для клетки летальными. H.Lazarus, А. Hopfenbeck / 1^79 /обнаружили отсутствие репарации ДНК хроматина в течение полутора часов постыскового периода.

Известно, что одно- и двуцепочечные разрывы цепей ДНК активируют поли/ АД£-рибозо /-пелимеразу / J.Sims и др - , 1983, н.Зе: ger , 1985 /. В присутствии обширной у. устойчивой срагментации ДНУ. полимераза активно расходует пул её клеточного субстрата-ЬУ-ДГ1", что ведет к снижению синтеза АТС- и к гибели клетки Зегсег и ДР ., 1978, S. Berger и др . , 1Ь86, D.A.Carson и др .,1986, i:. Berger и др ., 1937 /. Липь единичные сообщения указывают на возможность репарации двуцепочечных разрывов в молекуле ДНК путем рекомбинации / Б.Д.Еестякккков, 1979 /.

постишемнческие изменения в ядре клетки характеризуются не только формированием разрывов цепей ДНК. Б зтот период обнаружива-

ется и перестройка гистонового компонента хроматина / и.П.Аврущенкс и др ., 1550, ы.П.Аврущенкс, 1952 /. Последнее, по мнению авторов, свидетельствует о возможном изменении спектра синтезируемых белков.

С целью сопоставления динамики активности Са^П^+-зависнмкх эндонуклеаз в печени коре головного мозга, как органах высокочувствительных к недостатку кислорода, были проведены параллельное исследования в процессе гиповолемического ыока и з отдаленный постреанимационный период. Установлено, что иыемический процесс в ткани печени и коры мозга вызывает однонаправленный сдвиг зндонукле-азной активности в исследуемых органах. Однако, темпы развития этих изменений различны.

Анализ кривых, представленных на рисунке 3,обнаруживает сущест венные различия в скоростях процессов деструкции ДНК хроматина клеточных ядер в ткани печени и коры мозга собак на фоне длительной артериальной гипотензии. Как в в печени, в клеточных ядрах коры мозга уже ко 2-му часу гипотензии наблюдается достоверное увеличение активности Са^^-зависимых эндонуклеаз, прогрессирующее по мере удлинения терминального периода. Так, если ко 2-му часу активность исследуемых ферментов з клеточных ядрах коры мозга достоверно возросла на 68;ъ, то к 6-му часу-более, чем в 3 раза, превысила контрольные величины.

Настоящие исследования существенно дополняют представления о механизме повреждения органов пр:: пиемии, подчеркивая факт существования единого молекулярного механизма деструкции для клеточных ядер печени и коры мозга. Еееко отметить, что акт и ваг.; :я газисимых эндонуклеаз б клеточных ядрах печени и коры головного мезга в постреанимаиискный период носит устойчивый характер, что свидетельствует о продолжающемся деструктивном процессе в этих органах.

При сопоставлении активности Са^'^-эа-виси.'.ых эндонуклеаз ь клеточных ядрах печени и коры мозга собгл: в отдаленный / 1-3 мес. / постреанимационный период в динами:-., активности исследуемых ферментов существенных различий не обнаружено. Так, в печени величина активности зависимых с-ндонук.теаз в этот период составила 5С67+5С» ед/мг белка по сравнению с 2636+187 ед/мг белка з контроле/ р<0.001 /. Е клеточных ядрах коры головного мозга эти величины составили 4309+538 ед/мг белка и 2839+231 ед/мг белка соответствен-

А, ед/мг белка

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

О о

Динамика активности Са "^^"-зависиыых эндонуклеаз клеточных ядер печени и коры мозга -на фоне артериальной гипо-тензии.

0 2 4 6 ¿,ч

Гипотензия

рисунок 3.

но.

Таким образом, исследуемый молекулярный механизм, связанный с повышением активности Са^"|^+-зависимых эндонуклеаз / Са^|],^"-зависимый эндонуклеолиз /, является важной составной частью ипемическо-го повреждения клеток печени и коры головного мозга в терминальны"! и постреанимационный период.

В механизмах гибели гепатоцита важная роль отеодится иона!/ Ca^t активирующим процессы Са^+зависимсго протеолиза, фоссолиполиза, нарушение структуры цитоскелета / B.P.Tramp и др . , I988,D.Conk:ey, 1985,D.Jon® и др ., 1989 /. Ранее было показано, что нарушение внутриклеточного кальциевого гомеостаза является фактором, приводящим к фрагментации ДНК хроматина в ядрах печени крыс /D.R.Hewish, L.A. Burgoune , 1973,А. Wyllie, 1980,R.C.Duke и др ., 1983 и ДР. /•

Учитывая тесную связь между поступлением ионов Са в клетку и активностью Са^Г»^+-зависимых эндонуклеаз мы предприняли попытку " оценить влияние блокаторов кальциевых каналов на активность изучаемых ферментов. В этой связи в часта опытов животным за 30 минут до массивной кровопотери внутривенно веодили верапамил в дозе 0.1 и 1.0 мг/кг массы тела.

Введение верапаыила интактным животным не оказывало влияния на активность Са |].1^+-завис1'ных эндонуклеаз в клеточных ядрах печени собак, которая в опыте составила 3062±151 ед/мг белка по сравнению с 2636+187 ед/мг белка у "нелечонных" животных, которым верапа-мил не вводили.

Как видно из рисунка 4, введение верапамила. в дозе 0.1 мг/кг массы тела животного предупреждало повышение активности эндонуклеаз е ядрах гепатоцитов. Так, у животных к 4-му часу гипоБслемическо-го шока активность исследуемых ферментов s группе с предварительны:.; введением препарата составила 1264+Qi ел/мг белка и была достоверно ниже контрольных величин. Е то же время активность зависимых эндонуклеаз б клеточных ядрах печени к 4-му часу гипотен-зии у"нелеченных" животных составила 4966^85 ед/мг Селка, т.е. была почти б 4 раза выле, чем в группе "леченных" животных.

Анализ кинетики накопления кислотсрастворимых продуктов ауто-гидролиза ДНК хроматина клеточных ядер печени собак, которым за 30 минут до массивной кровопотери внутривенно вводили Еерапамнл в дезе

Влияние верапамила. ка изменение активности Са^|^+_зависимых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени через 4 часа артериальной ги-потензии.

А, ед/мг белка'

3000

2000

1000 ..

а

о о.

с- и 21*

Л

о

о

рисунок 4 .

0.1 кг/кг, обнаруживает снижение сум-марной Са^фП^-зазпсимой нукле-агнсГ: активности к 4-му часу гиповслемическоп гипотензии г,с сравнению с контролем.

Следовательно, предварительное введение верапамила в дозе С.± :.:г/кг снижает не только активность зависимых зкдонуклеаз

клеточных ядер г.счени, но и суммарную Са'^^-зависпмую нуклеазную АКТИВНОСТЬ в них.

Аналогичный эффект от предварительного введения верапамила наблюдался б группе животных, получавших его в дозе 1.0 мг/кг, где активность эндонуклеаз к 4-му часу артериальной гипотензии составила 17о4+145 ед/мг белка. Таким образом, профилактическое введение верапамила, предупреждая поступление ионов Са~+в цитозоль клетки , тор-/.озит активацию дНК-эндснуклеаз.

Полученные экспериментальные данные доказывают, что действие верапамила эффективно предупреждает активацию Са-фП^-зависимых -ндокуклеаз лишь в условиях нарушенной проницаемости мембран клеток течени, в том числе ядерных, что, как известно, имеет место в усло-знях геморрагического шока / З.Р.Тгшар и др . , 1952 /. ГнгиОируя 1рсцессы зависимого зндонуклеолиза, верапамил оказывает цп-

гепротекторное действие на гепатоцит.

Наибольший интерес гредставляли исследования о влиянии верапа-<ила на уровень Са'~|!1^.+-заь1'симой эндонуклеазной активности в пост-зеашжационккй период. С этой целью верапамил в дозе 1.0 мг/кг вкла-пгли в инфузионную терапию после 4-часовой артериальной гипотензии. ^результате исследования было установлено, что введение Еерапамн-:а 7„"е к 1-му часу псстреакимацнсннсгс периода достоверно у^екь^а-:о активность зависимых зндснуклеао по сраы-.е;-:::» с эти;.: п:~

n-.zs.ibz.zv. у :х::вотньзс, которым верапамил не бзсд::ли / рисунок С / . эта активность не отличалась ¿ч таковой в контроле.

полагаем, что ьегаг.ампл оказывает ;:::г;'С*/г*лт„ее влияние на

•.>, о л. - -"

хсцосси Са7 .^'-гаггегглего гндснуклеолига не только в случае прс-.илахтичесхсгс его введения, не и в результате включения в реанима-••'онный комплекс. Последнее обстоятельство сссСенно важно учитывать рп разработке методов реа-"-магии в условиях массивной нрсвспстерн.

Полненные данные открывают перспективу дальнейшего изучения олекулярных механизмов деструктивных процессов в печени других рганах, а также дает возможность управлять "ми с иелью зашиты клеек ст гипоксии и её последствий. Настоящие исследования углубляю?

Л, ед/мг белка 5000'

4000

3000

2000 ..

Влияние верапамила на изменение активности Са^|М^+-зависиыых эндонуклеаз в клеточных ядрах печени через I час после реанимации.

I

и. и 21*

о

е-

а с о

рисунок 5.

— 1Ъ —

понимание сущности и природы патологических процессов, протекающих в печени при длительна'.', геморрагическом шоке и г.ссле реанимации и имеют важное значение для разработки новых перееден и принципов рациональной терапии терминальных состояний.

Б .л Б С Д и

1. Массивная кровопотеря вызывает активацию Са^-'^-газисимых экдонуклеаз в клеточных ядрах печени , прогрессирующую по мере удлинения периода гиповолемической гипстензии.

2. Высокая активность Са^'^-завнсимых эндонуклеаз и рост кис-лоторастворимой фракции ДНК хроматина гег.атсцктсв при длительной артериальной гипотензии свидетельствуют об активном деструктивном процессе ь клеточных ядрах г.ечен;:.

3. Процесс Са^'^-зависимсго зндонуклеолиза в клеточных ядрах гепатсыитсв сохраняет высокую активность и в пострег-.нимационном периоде после длительной гипсзолемическсй гипстензии. Достоверно высокие величины обнаружены через i час и 1-3 месяца после реанимации.

4. L отдаленный постреанпмаыиснк-л": период / i-З мес. / нарушается зависимость между интенсивность» срагментацип ДНК хроматина клеточных ядер печен:: и временем её инкубации., что предполагает изменение физико-химических характеристик ядерного хроматина в этот период.

L. Обнаружены обжие закономерности в изменении активности Са""7 l..^"1"-зависимых эндонуклеаз в клеточных ядра:: печени и коры головного зга сосал при длительной гиповолемической г.'потеха:::: и в постреа-нимаыпонкъ.й период, что свидетельствует о наличии единого ¡.•.с-дьку.тяр-ного ;.;еханиз!.:а деструкции ДП; хроматика в ядра:-: клеток этих органов.

с • предел .ека возможность ко ррехцип ;;рс_есссг Са~ -ь + , .у — з л он_ —

го онд онуклеоли ,ееое гиповсле-

мпчзск ой ^ипотензни и раннего по с треаним&цнонног: пер;: ода íлокатора .

:::.'. кал шиезых к аналог, -ред^ар. ите льнсо введение зс.апа / -/ О.х ..

х . v. М Г /кг / до • ■ с- г. ■, - v - -'• - - г» ------ -■г т.

реаним комплекс / J..Í . 1 к. /, еы^ы^ал: ^осто- f-ОНО = с-.иже-

ние а:: тивностп завис им ых екдонуклеаз и гнгпСир овал о птопесс

на ко г. л ения кпол втораетзоримых про дуктез аутогидролиза i—l хроматина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУИЖОЗАННЫХ Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Влияние длительной артериальной гипотензии на уровень ДН экдонуклеазной активности ядер нейроцитов и гепато^итов // £арма логическая коррекция гипоксических состояний: Материалы 2-ой Все союзной конференции. - Гродно, - 1991. - Ч. 3. - С. 332-333.

2. Молекулярные механизмы гипоксического повреждения хромат на ядер нейронов мозга при гиповолемическом шоке // Фармакологии кая коррекция гипоксических состояний: Материалы 2-ой Всесоюзной конференции. - Гродно, 1991. - Ч. 2. - С. 295-296 / соавт. В.j..h /jCVIDci« Ж. В.Соловьева, И.С.Новодержкина.

3. Актуальные проблемы патогенеза и реанимационной терапии сроченного гиповолемического шока // Актуальные вопросы совершен вования диагностики и лечения пострадавших в районах массовых бе ствий: Тез. докл. Всеармейской научной конференции. - X:. - 1991. С. 46 / соавт. ВJi.Кожура, И.С.Новодержкина, А.К.Кирсанова, C.B. Дворецкий.

4. Влияние верапамила на активность Са^+, M<^+-зависимых з донуклеаз в ядрах печени собак при длительном гиповолемическом с ке // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1991. - №12. - С. 583-584 / соавт. В.X.Кожура, И.С.Новодержкина.

о. Обнаружение устойчивого повышения эндонуклеазной активно ти в клеточных ядрах печени собак при длительной артериальной ги потензии и в постреанимационный период // Вопросы мед. химии. -19Э2. - №2. - С. 50-52 /соавт. И.С.Новодержкина, А.Г.Васнакьян, Ь.Х.Кожура.

6. Патофизиологические и молекулярные механизмы ишемическог повреждения коры мозга при длительном геморрагическом шоке // Пр филактика и экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний: Материалы конференции. - Омск, 1992. - С. 16-19 / соавт. В.л.Кожура, 1.3.Соловьева, И.С.Новодержкина, А.К.Кирсанова, Т.Х.Березина.

7. Ультраструктурнке и молекулярные механизмы реконструктив ных процессов в ядрах нейреноЕ коры мозга в отдаленные сроки псс реанимационного периода //.Терминальные состояния и постреанкма-¿;и энная патология организма: патофизиология, клиника, профилакти ка и лечение. / Сб. тр. nil]' обшей реаниматологии РАМН. - ¡V.., 199 - 3. 60-64 / соавт. Ь.Х.Кожура, л.В.Соловьева, И.С.Новодержкина.

В. Применение гелий-неонового лааера с целью повышения компенсаторных возможностей организма при геморрагическом шоке // Конгресс анестезиологов-реаниматологов Украины. - Тез. докл. -Запорожье, 1932. - С. 238 / соавт. С.¿.Дворецкий, В.Ji.Кожура, И.С.Нозодерккина, А.К.Кирсанова, Т.Л.Березина, Ю.В.Чуев.

9. Derangement of nuclear-cytoplasniatic lies in oligodenc.ro-gliocytes in canine cerebral corte:-: at the terminal stage of hemo-rrnagic shock // International Society for Pathophysiology: Constituent congress bloscov;, - I.:., 1391. - P. 301 / co-authors V.L.Ko-shura, J.V.Solovjova, ?.i.Berezina, l.S.iiovoaerzhkina, A.K.Kirsa-nova.

10. Metabolic and ultrastructural characteristics of biosynthe-tic process in the cerebral cortex at 3 months following a prolonged hemorrhagic shock // Resuscitation. - 1991. - V. 21. - 1." 2. -?. 89-102 / co-authors V.L.Koshura, J.V.Solovjova, I.S.IJovoderzh-kina.