Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Исследования по разработке и стандартизации растительного средства с противоязвенной активностью

Старцева Людмила Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ И СТАНДАРТИЗАЦИИ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА С ПРОТИВОЯЗВЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

1 2 МАЙ 2011

Самара -2011

¿Я/

4846249

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук

Пупыкина Кира Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук

Боковикова Татьяна Николаевна

Доктор биологических наук, профессор

Агапов Альберт Иванович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «02» июня 2011 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г.Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук,

доцент

И.К. Петрухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время отмечается неуклонный рост заболеваний органов пищеварения. Одно из ведущих мест среди них по распространенности, тяжести течения, осложнениям занимает язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (Насекина Е.Ю., 2006). Ежегодно регистрируется 35000 новых случаев заболевания, 10000 из них подвергаются хирургическому лечению, и этот показатель растет во всех странах мира (Комаров Ф.И., 2006; Насыров Х.М., 2001). Истинная картина частоты возникновения язвенной болезни не установлена. В настоящее время увеличивается число лиц с сопутствующими заболеваниями органов пищеварения, требующими одновременного назначения ряда лекарственных препаратов, в том числе нестероидных противовоспалительных средств, которые имеют противопоказания и ограничения к применению, не всегда предотвращают развитие рецидива заболевания после их отмены. От осложнений, связанных с неадекватным лекарственным лечением язвенной болезни, только в России ежегодно умирают 6000 человек в трудоспособном возрасте (Губачев Ю.М. и др., 1990; Насыров Х.М., 2001). Таким образом, вопросы профилактики и лечения язвенной болезни желудка представляют серьезную проблему.

Лекарственные растения находят широкое применение при лечении заболеваний данной патологии. Однако, целесообразным является применение растительных композиций (сборов), содержащих разнообразные биологически активные вещества, которые обеспечивают комплексное воздействие, позволяют быстро устранять симптомы обострения, восстанавливать нарушенные функции желудочно-кишечного тракта, обеспечивать активное заживление язвы, за счет способности продуцировать защитную слизь, предотвращать повторные рецидивы, увеличивать продолжительность ремиссии (Бахтина С.М. и др., 2003; Буданцев А.Л. и др., 2003). Среди разрешенных к применению в РФ. лекарственных растительных сборов, при язвенной болезни желудка рекомендуется «Сбор желудочно-кишечный», имеющий и другие показания к применению. Этого, учитывая распространенность данного заболевания, недостаточно, поэтому расширение исследований по разработке и внедрению в практическую медицину новых препаратов растительного происхождения для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований является разработка растительного средства с противоязвенной активностью на основе многокомпонентной растительной композиции в виде экстракта сухого и гранул.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- обосновать состав сбора, провести его фармакогностическое изучение, установить показатели качества и нормы содержания основных групп биологически активных веществ;

- провести исследования по подбору оптимальных параметров экстракции биологически активных веществ из растительной композиции для разработки рациональной технологии получения экстракта сухого и гранул;

- изучить химический состав экстракта сухого и лекарственной формы на его основе, разработать показатели их качества;

- разработать методики сквозной стандартизации исходной композиции, экстракта сухого и гранул;

- провести валидацию методик количественного определения основных групп биологически активных веществ в сборе и гранулах;

- изучить токсичность и противоязвенную активность сбора, экстракта сухого и гранул;

- разработать нормативную документацию на сбор и гранулы.

Научная новизна. Разработан оптимальный состав соотношения компонентов в оригинальной растительной композиции, рекомендуемой для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка, с учетом влияния на различные звенья патогенетической цепи.

На основе изучения химического состава противоязвенного сбора, разработаны параметры экстракции биологически активных веществ и подобраны оптимальные условия, обеспечивающие максимальный выход суммы экстрактивных и действующих веществ, которые положены в основу технологических схем получения экстракта сухого и гранул.

С использованием современных методов анализа впервые проведено сравнительное изучение химического состава разработанных растительных средств (сбора, экстракта сухого и гранул). Изучен их качественный, количественный состав на присутствие различных групп биологически активных веществ и установлено наличие полисахаридов, аминокислот, аскорбиновой кислоты, каротиноидов, макро- и микроэлементов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, дубильных веществ, сапонинов, эфирных масел. Разработаны методики количественного определения содержания в сборе суммы флавоноидов в пересчете на рутин и полисахаридов, которые положены в основу сквозной стандартизации разработанных растительных средств по принципу: растительное сырье - субстанция - лекарственная форма.

Методами фармакологических исследований подтверждена рациональность состава сбора, экстракта сухого и гранул для применения в качестве противоязвен-

ных средств и их безопасность применения. Приоритет и новизна проведенных исследований подтверждены патентом РФ № 2331430 «Сбор лекарственных растений для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка» и заявкой на изобретение № 2010123636 «Гранулы с растительным экстрактом для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка».

Практическая значимость работы. На основании данных фитохимического, морфолого-анатомического и товароведческого анализа разработаны проекты фармакопейных статей на сбор для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка и гранулы; технические условия на «Напитки чайные» (ТУ № 9191. 004-26795008-2002).

Результаты исследований диссертационной работы внедрены в работу ООО «Травы Башкирии», учебный процесс кафедр фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, фармацевтической технологии с курсом биотехнологии Башкирского государственного медицинского университета; материалы по определению подлинности разработанных средств, установлению числовых показателей качества и методик определения содержания основных групп биологически активных веществ, апробированы в ГУЗ «Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Республики Башкортостан (акты внедрения). Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке состава и стандартизации растительной композиции;

- результаты исследований по подбору оптимальных параметров экстракции биологически активных веществ из растительной композиции и разработке рациональной технологии получения экстракта сухого и гранул;

- результаты исследований по изучению химического состава, установлению характеристик подлинности и показателей качества сбора, экстракта сухого и гранул;

- результаты разработки методик количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и полисахаридов в сборе, применения их для стандартизации экстракта сухого и гранул, валидации методик анализа;

- результаты фармакологических исследований разработанных средств.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научно-практических конференциях (Уфа 2006, 2008, 2009, 2010; Пермь 2007,2010); научном конгрессе «Традиционная медицина» (Москва, 2007);УП Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2007); II Российском фитотерапевтическом съезде и международном форуме «Интегративная медицина» (Москва, 2010).

Связь задач исследования с проблемным планом НИР. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» и является фрагментом исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (номер государственной регистрации № 01200507996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них в журналах, рекомендуемых ВАК - 3 статьи, 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследований, 3 глав собственных исследований, выводов, списка литературы, включающего 211 источников, в том числе 25 иностранных, приложений. Работа содержит 35 рисунков и 45 таблиц.

Во введении представлена актуальность проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы, а также изложены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе на основании обзора данных литературы дана общая характеристика язвенной болезни желудка, современные методы ее лечения, номенклатура и классификация используемых лекарственных средств, анализ ассортимента растительных средств, рекомендуемых для лечения язвенной болезни желудка, а также обобщены сведения о стандартизации многокомпонентных растительных средств.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследований, используемые методы и приборы.

Третья глава посвящена разработке, теоретическому и экспериментальному обоснованию компонентного состава противоязвенного сбора, его фармакогности-ческому изучению, определению показателей подлинности и доброкачественности, изучению химического состава, разработке методик количественного определения флавоноидов, полисахаридов и их валидации.

Четвертая глава включает результаты экспериментальных исследований по подбору оптимальных условий и разработке способа получения экстракта сухого и лекарственной формы на его основе в виде гранул, исследованию их химического состава, изучению показателей подлинности и доброкачественности.

В пятой главе отражены результаты фармакологических исследований по определению токсичности и противоязвенной активности разработанных растительных средств на моделях острой и хронической язвы желудка.

Диссертация завершается общими выводами по работе, списком литературы и приложениями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Обоснование состава растительной композиции, ее фармакогностическое

изучение и стандартизация

При разработке состава сбора в основу был положен этиопатогенегический подход, учитывающий действие растительных компонентов на определенные звенья патогенетической цепи, а именно: стабилизации факторов «агрессии» и «защиты», нормализации секреторной активности ЖКТ, подавления кислотообразования, ферментативной активности и развития Helicobacter pylori, регенерации клеток слизистой оболочки, нормализации моторной функции ЖКТ, активизации переваривания пищи, снятия воспалительного процесса и спазма гладкомышечных волокон органов ЖКТ, регуляции функций ЦНС, коррекции дисбактериоза, повышения защитных свойств организма.

В результате предварительного анализа литературных данных и собственных исследований были отобраны 14 лекарственных растений, наиболее часто применяемых в гастроэнтерологической практике (подорожник, ромашка, солодка, девясил, сушеница, календула, лен, крапива, кровохлебка, синюха голубая, рябина, горец птичий, фенхель, пустырник), из которых составляли различные комбинации сборов, готовили водные извлечения и проверяли их активность. Первоначально была изучена антиоксидантная активность, так как известно, что развитие ряда заболеваний человека (язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, злокачественных образований и др.) сопровождается активацией процесса свободнорадикального перекис-ного окисления липидов, и обеспечение антиоксидантной защиты может предотвратить разрушение клеточных мембран и повреждение тканей, органов. Определение антиоксидантной активности позволило установить виды лекарственного растительного сырья, проявляющие более выраженную активность не только в отдельности, но и в различных вариантах сборов, в результате чего было отобрано шесть композиций, показавших более высокие результаты.

Для выбранных вариантов разрабатываемого сбора была определена также противоязвенная активность на модели острой «ацетилсалициловой» язвы желудка (рис.1). Результаты исследований показали, что более выраженной противоязвенной активностью по сравнению с группой контроля и препаратами сравнения, обладает вариант сбора № 6, который и был выбран для дальнейших исследований; в его состав входят: цветки ромашки, трава сушеницы топяной, корни солодки, трава горца птичьего, корневища и корни девясила, листья подорожника большого по 2 части, трава пустырника, плоды рябины, листья крапивы, плоды фенхеля по 1 части.

Исследуемые образцы сборов и препарат сравнения и

Рис.1. Противоязвенная активность различных комбинации сбора

Для установления подлинности сбора изучали составные компоненты и дифференцировали их по принадлежности к определенной морфологической группе. Макроскопический анализ позволил выделить характерные внешние признаки сбора: смесь неоднородных по размеру и окраске частиц зеленовато-серого цвета с желтоватыми, белыми, кремовыми, бурыми и оранжево-красными вкраплениями, проходящих сквозь сито диаметром 7 мм. Запах ароматный, своеобразный. Вкус водного извлечения сладковато-горьковатый, слегка вяжущий с ощущением слизи-стасти. Для более достоверной идентификации сбора проводили подробное описание микродиагностических признаков составных компонентов и самого сбора. При последовательном просмотре микропрепаратов идентифицировались все его составляющие, выявлялись и подсчитывались диагностически значимые признаки, позволяющие определить подлинность сбора.

Для стандартизации и определения качества нового растительного сбора необходимо было определить числовые показатели, требуемые при разработке современной нормативной документации. В результате анализа сбора установлены следующие нормы числовых показателей: влажность - не более 14%; зола общая - не более 13%; зола, нерастворимая в 10% растворе НС1, - не более 4%; частиц, не проходящих сквозь сито с (3=7 мм, - не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с с1= 0,18 мм, - не более 7%; содержание примесей: органических - не более 2%, минеральных - не более 1%. Определены показатели радиологической и микробиологической чистоты сбора в соответствии с требованиям ОФС, ГФ XII, которые позволили отнести его к категории 4А.

Лекарственное растительное сырье, входящее в состав сбора содержит биологически активные вещества (БАВ) различных химических групп, поэтому необходимо провести изучение его химического состава для разработки методов стандартизации. Качественные реакции, проведенные с водным и спиртовым извлечением из сбора позволили установить присутствие полисахаридов, аминокислот, флаво-

ноидов, дубильных веществ, сапонинов. Для обнаружения аскорбиновой кислоты в водном извлечении использовали метод ТСХ (система этилацетат - кислота уксусная 80:20), и наблюдали появление пдсле проявления хроматограммы белого пятна на розовом фоне (Яу~0,89). Качественное обнаружение каротиноидов и витамина К проводили после экстракции гексаном в липофильной фракции методом ТСХ: каро-тиноиды - а- и Р-каротин (система гексан - диэтиловый эфир 80:20) обнаруживали после проявления хроматограммм в виде пятен синего цвета на желто-зеленом фоне (К/-0,61; Л/-0,82), а витамин К (система бензол - эфир петролейный 1:1) при просмотре в УФ-свете обнаруживался в виде пятна с желто-зеленой флюоресценцией (Яу~0,68). Для изучения флавоноидов сбора получали очищенное спиртовое извлечение и, учитывая различную растворимость фенольных соединений, проводили избирательную экстракцию растворителями с возрастающей полярностью (рис. 2),

Растительное сырье

Экстракция 70% этиловым спиртом

Фильтрация

Отгон спирта под вакуумом

Отработанное сырье

Растворение остатка в горячей воде

Обработка фил ьтрата гексаном

1

Водный остаток, содержащий сумму фенольных соединений

Осадок отбрасывается

Экстракт, содержащий липофильные вещества

Избирательная

Диэтиловым эфиром (агликоны флавоноидов)

Этил ацетатом (моногликозиды флавоноидов, оксико-ричные, фенолкарбо-новые кислоты)

Бутанолом (биозиды, поли-гликозидные формы фенольных соединений)

Хроматографическое разделение

Хлороформом (кумарины)

Рис.2. Схема выделения фенольных соединений

Флавоноиды сбора исследовали методами одномерной и двумерной бумажной хроматографии (БХ) в системах н-бутанол-кислота уксусная-вода 4:1:2 и 15% кислота уксусная в сравнении с достоверными образцами свидетелей. По хромато-графическому поведению, окраске пятен в видимом (бледно-желтая) и УФ-свете (от желтой, желто-зеленой до коричневой) до и после обработки хромогенными реактивами установлено присутствие в сборе следующих флавоноидов: лютеолин-7-глю-козид (Л/Ч),44), рутин (Л/Ч),45), космоссиин (Л/Ч),65), гнафалозид (Л/Ч),67), астрага-лин (Л/~0,70), изорамнетин (Л/Ч),74), кверцетин (Л/Ч),78), гиперозид /Лг-0,84). При обнаружении флавоноидов с помощью ТСХ наилучшее разделение наблюдалось в системе этилацетат-кислота уксусная-вода 5:1:1 (рис. 3). Для выделения агликонов спиртовый раствор сбора подвергали кислотному гидролизу нагреванием с 2 н. раствором кислоты хлористоводородной в течение 30 мин. Агликоны извлекали диэтиловым эфиром. В эфирной фракции обнаружены агликоны: кверцетин (Л/ -0,98), апигенин (Л/Ч),46).

Дг0,95

Я —0 85 ^ ~ гипеР03ид Я/~о',72 -2 — кверцетин

3 - сумма флавоноидов

4 — рутин Я/Ч),57 5 _ авикулярин

6 - апигенин 0 42 7 - лютеолин-7-глюкозид

Яг 0,28

Рис. 3. Хроматограмма флавоноидов, обнаруженных в сборе (ТСХ) (система: этилацетат-кислота уксусная-вода 5:1:1)

Оксикоричные и фенолкарбоновые кислоты обнаруживали методом БХ в системах н-бутанол-кислота уксусная-вода 4:1:2 и 2% кислота уксусная по ярко-голубой, зеленовато-голубой, фиолетовой флюоресценции, которая становилась интенсивнее после обработки проявляющими реактивами. В первой системе обнаружено 9 зон адсорбции, из которых к оксикоричным и фенолкарбоновым кислотам можно отнести 6 зон: и-оксибензойная (Л/~0,93), и-кумаровая (Л/Ч),90), феруловая (Л/Ч),87), кофейная (Л/Ч),84), хлорогеновая (Л/Ч),68), галловая (Л/Ч),67) кислоты.

Методом ТСХ хорошее разделение наблюдалось в системе хлороформ-метанол-вода (62:32:7) (рис. 4).

Я/-0,73 Я/--0,64

Лг0,36

1 — сумма фенолкарбоновых и оксикоричных кислот

2 - кофейная

3 - галловая

4 - хлорогеновая кислоты

Рис. 4. Хроматограмма ФКК и оксикоричных кислот сбора

Кумарины исследовали методом ТСХ (система: этилацетат - бензол 1:2) и обнаруживали по голубой, зеленовато-голубой, фиолетовой флюоресценции, которая становилась интенсивнее после обработки проявляющими реактивами; обнаружены: умбеллиферон (Л^-0,28), скополетин (Я/~0,55), герниарин (Яу~0,75), кумарин (Дг0,80).

Для более детального изучения фенольного комплекса проводили исследование методом ВЭЖХ спиртового извлечения из сбора при длине волны 254 и 360 нм с использованием достоверно известных образцов веществ (рис.5 и рис.6).

тУ 2000

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

3 7|

;

2,

4..... »••К? >*щ - '2012 223 24236 22 1 29 Г 30, -- 31333........

11 (Ы --- --- - -1- ----1-- -ч—п— -1-- -1----

Рис. 5. Хроматограмма спиртового извлечения сбора при Х=254 нм

3- галловая к-та,7- глицирризиновая к-та, 9 - хлорогеновая к-та; 11- кофейная к-та, 14- лютео-лин-7-глюкозид, 15- изокверцитрин, 17-рутин, 18- авикулярин, 21-кверцетин, 23- гиперозид,

24-ликуразид; 26 - апигенин

®V ¡ | i | i II |Ц | | I м I ! : :

1800 .........t-.....|........i........|.........|.........|........H"'i........j........!•".......í........í.......i......-i--------1........|

1600 ---------i........í..............:.........i........i........|-|-i.....-j........r........Г........í-------i".....1......."i"......i

I i .■ ! ! li I i ! I I i i i

1400 -........;........;---------------;.........Г......;........í ""í........:..............Г".....;.......:........:........1......"i

1200 -........I........f-"j........¿--------"|........i........'j-j-i........i........í........f-......I—i........i--------i........!

1000 1........H"i......hi........n ti........H.....i.......í......I........!........i........i

800 1 i........ní.......Ы-r-l.......'ti........i........i........i........i........¡........Г---1........i

600 i........í........iflt......Ц-Н........n;t m.....1........i".......i........H........i........1........1

400 1.............Ц.......i-U..7.4--ÍA-V ........•;-..............;..... Í........i.-.-!

i, '«i^W^2627282930 3132 ! i

200 ................j-^- 1-^--:--------

Chi ____:__;___:_I I i : :__j_______!_ i i i__

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 ~X4 15 16 мин

Рис.6. Хроматограмма спиртового извлечения сбора при 1=360 нм

2- галловая к-та,4- глицирризшовая к-та, 6 - хлорогеновая к-та; 8 кофейная к-та, 10- лютеолин-

7-глюкозыд, 11- изокверцитрин, 13- рутин, 14- авикулярш, 18-кверцетин, 20- гиперозид,

24-ликуразид; 25- апигенин В результате исследования спиртового извлечения из сбора методом ВЭЖХ обнаружено при длине волны 254 нм - 33 вещества, при длине волны 360 нм - 32 вещества, из которых 8 идентифицированы как флавоноиды (рутин, кверцетин, изокверцитрин, авикулярин, гиперозид, лютеолин-7-глюкозид, ликуразид, апигенин), 3 как фенолкарбоновые, оксикоричные кислоты (галловая, хлорогеновая, кофейная) и глицирризиновая кислота. Из флавоноидов в смеси преобладал при 1=360 нм - рутин (16,84%), из кислот при /1=254 нм - кислота галловая (28,25%) и кислота глицирризиновая (39,77%), относящаяся к группе титерпеновых сапонинов.

В результате хроматографического разделения этилацетатной фракции на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента хлороформ и градиентную систему растворителей хлороформ - этанол и хлороформ - метанол 91:9 и 92:8, выделили фракции, содержащие флавоноиды, фенолкарбоновые и оксикоричные кислоты. | Из них были выделены вещества, очищенные путем рехроматографии, кристаллизации и перекристаллизации. Для полученных веществ были изучены физико-химические характеристики и проведено сравнение УФ-, Ж- и ЯМР - спектров, J которые позволили идентифицировать и охарактеризовать вещества, представленные в таблице 1. J

Эфирное масло из сбора получали методом перегонки с водяным паром с подбором оптимальных условий количественного определения: навеска - 30,0 г, из- | мельченность сырья - 3 мм и перегонка с водяным паром в течение 2 часов, обеспечивала максимальный выход эфирных масел (0,956±0,025%).

13

li

2,

I 10,

2\

¡1 \ 1

» . я i

4, J 19202- 5262- '2829 30 31 32

chl Л-j-l-

Г 2 Г 4 6 7 ~8 9 10 И 12 13 14 15 16

Таблица 1

Характеристика веществ, выделенных из сбора противоязвенного

Название выделенного вещества Идентифицированное соединение ('Н-ЯМР-спектр) Описание выделенного вещества

Кверцетин (3,5,7,3',4'-пентаоксифла-вон) ^срг 1 Ч 11 . ... .11 Яг 1- I » ¡1 ' : ' : Мелкокристаллический порошок лимонно-желтого цвета, Т.пл 316-318 °СДтах(ЕЮН), нм 374,255

п т ■ ;! 1 .

Изокверцит-рин (З-О-р-Б-гаокопирано-зид кверцети-на) л й-?. » "вдаь ....... 'ГТ :п < 1 "! 1 1 [ ] г.™ .. ..... - Желтый кристапличе-I ский порошок, Т.пл - 224—225°С, \тах (ЕЮН), • нм 355,258

( 1 1 к Г

1 : : ; , ! ,

" " " " " " " ......

Гиперозид (3-О-р-Б-галак-топиранозид кверцетина) ,— ! Г......1 .......■' ■ ? ■ 1 1 <1 ¡1........ -...............—т- 1 .1 .....41........1-..... в........... Е Желтый кристаллический порошок, Т.пл 237 -238°СДтах(ЕЮН), нм 360,254

" " № " г« " " " " " "" "

Авикулярин (З-О-а-Ь-арабофурано-зид кверцетина) ' 1 к 1 Зкаг" ............ «9 .З.ВЧ и ¡1! ,- ...... 1;. ..Г 1 Желтый мелкокристаллический порошок. Т.пл 229 - 230°С, Хтах (ЕЮН), нм 365,258

1—

Рутин (3- рутинозид кверцетина) "тт'т1 -, Ч < И Ьг: [ ЕИ-А. ^...... 1! 1 мам* «р; 1. ' р». " | ; - 1 ; ! | - Желтый кристалличе-_ ский порошок. Т.пл Ч 195-198 °С, Хтах (ЕЮН), - нм 361,258

. Л .11 г 1 л .11 щ г ...

•• »" « •»

Галловая кислота •—еоем--— 1 Сфероидные кристаллы, Т.пл 240 -243°СДтах (ЕЮН), нм 276,222

Изучение компонентного состава эфирного масла и идентификацию соединений осуществляли методом хроматомасс-спектрометрии. В результате обнаружено 36 веществ, среди которых углеводороды монотерпеновой и сесквитерпеновой природы представлены 20 веществами: в большем количестве обнаружены - и-аллил-анизол (29,53%), эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (18,54%), а-мууролен (7,08%), санталол (2,42%), а-кадинол (1,86%), производные азулена (1,57%), спатуленол (1,41%) и в меньшем количестве - а-бисаболол, кариофиллен оксид, ледол, а-калакорен, эвкалиптол, изолонгифолен.

Изучение аминокислотного состава сбора позволило установить присутствие 14 аминокислот, из которых восемь незаменимых (лизин 0,21%, метионин 0,13%, гистидин 0,08Р/о, треонин 0,31%, валин 1,16%, изолейцин 0,19%, лейцин 0,09%, фе-нилаланин 0,37%) и шесть заменимых (цистеин 0,53%, аргинин 0,51%, серин 0,48%, пролин 1,40%, глицин 0,96%, тирозин 0,34%). Суммарное содержание - 6,76%.

Исследования элементного состава показало отсутствие в сборе тяжелых металлов: ртути, свинца и в то же время достаточно высокое содержание калия, натрия, фосфора, кальция, железа, марганца, цинка (рис. 7).

1,383

Рис.7. Содержание макро- и микроэлементов в сборе

Изучение состава органических кислот в сборе проводили в водном извлечении методом ВЭЖХ, который позволил установить, что преобладающей в смеси

Рис.8. Хроматограмма свободных органических кислот сбора

(1 - яблочная, 2 - лимонная, 3 - винная кислоты)

Количественное определение содержания основных групп БАВ в сборе проводили с использованием различных методов анализа (табл. 2). Кроме того, в связи с тем, что в состав сбора входят корни солодки, осуществляли количественное определение сапонинов в пересчете на глицирризиновую кислоту методом ВЭЖХ. Гли-

цирризиновая кислота идентифицировалась по времени выхода пика стандартного образца, расчет вели методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы и по формуле (табл. 2).

Таблица 2

Содержание некоторых групп БАВ в сборе_

Группа БАВ Метод определения Числовые показатели

Аскорбиновая кислота Титриметрия 0,060±0,001

Органические кислоты в пересчете на яблочную Титриметрия 2,46±0,10

Каротиноиды (в пересчете на р-каротин) Спектрофотометрия 0,040±0,001

Эфирные масла Перегонка с вод. паром 0,956±0,025

Дубильные вещества Перменганатометрия 4,04±0,10

Оксикоричные кислоты (в пересчете на хлорогеновую) Хроматоспектрометрия 1,76±0,07

Кумарины в пересчете на кумарин Спектрофотомтерия 0,46±0,02

Сапонины в пересчете на: - олеаноловую кислоту -глицирризиновую кислоту Спектрофотометрия ВЭЖХ 1,45±0,02 1,13±0,04

При выборе приоритетных групп БАВ, по которым в дальнейшем планируется проводить стандартизацию сбора, учитывали их значение в оказании конечного лечебного эффекта. Поэтому были выбраны две группы: флавоноиды, так как они оказывают противоязвенное, противовоспалительное, спазмолитическое, гастропро-текторное, ангисекреторное, капиляяроукрепляющее действие и полисахариды, которые принимают участие в общем противоязвенном эффекте, так как повышают резистентность слизистой оболочки желудка, оказывая противовоспалительное, ра-нозаживляющее и обволакивающее действие и проявляют иммуномодулирующие свойства. Для количественного определения данных групп веществ необходимо было подобрать условия и разработать методики, адаптированные для нашего сбора.

Количественное определение суммы флавоноидов проводили спектрофото-метрическим методом. Изучение спектральных характеристик спиртовых извлечений сбора в сравнении с веществами-свидетелями флавоноидов показало, что спектры поглощения не совпадали ни с одним из флавоноидов, что вполне объяснимо возможным наложением полос поглощения других, структурно близких, веществ фенольного происхождения. Поэтому было использовано добавление комплексообразующей добавки - раствора А1С13 и наблюдался батохромный сдвиг полос спектра (рис. 9). При этом спектр поглощения сбора имел более близкий максимум поглощения к спектру рутина и находился в области 410 нм, поэтому он выбран в качестве доминирующего в сумме, на который вели пересчет.

Рис. 9. Спектры поглощения с добавкой АЮ3 спиртового извлечения из сбора (1) и рутина (2)

Было установлено, что оптимальными параметрами экстракции флавоноидов являются: экстрагент - спирт этиловый 60%; измельченность сырья - 5 мм; соотношение сырье - экстрагент 1:100, время экстракции - 30 минут нагревания на кипящей водяной бане и равновесное состояние в системе по доминирующим компонентам при первом контакте фаз достигалось за 30 минут, при втором и третьем контакте также за 30 минут; комплексообразователь - 5% спиртовый раствор А1С13 в количестве 2 мл; реакция комплексообразования развивается в течение 30 мин и комплексы остаются стабильны в течение 1 часа (табл. 3).

Таблица 3

Метрологические характеристики методики определения флавоноидов

Г X Б Бх Р,% Ах

8 1,34 0,06355 0,02119 95 2,36 0,05 ±3,73

Опыты с добавками рутина показали отсутствие систематической ошибки и правильность методики (табл.4).

Таблица 4

Результаты количественного определения суммы флавоноидов в сборе

с использованием метода добавок ГСО рутина

Содержание сум- Добавлено Ожидаемое Полученное Ошибка

мы флавоноидов в ГСО рути- содержание, содержание, абс., мкг отн.,%

аликвоте, мкг на, мкг мкг мкг

188,52 50 238,52 244,13 5,61 2,29

188,52 100 288,52 283,54 -4,98 1,76

188,52 150 338,52 342,06 3,54 1,03

На основании полученных результатов предложена норма показателя «содержание флавоноидов в пересчете на рутин» не менее 1,3%.

Количественное определение суммы полисахаридов проводили методом спек-трофотометрии, который предусматривает экстракцию полисахаридного комплекса из сырья водой, его осаждение спиртом этиловым, гидролиз, образование окрашенного комплекса продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в ще-

лочной среде, последующее измерение оптической плотности. Полученный окрашенный комплекс имел максимум поглощения при длине волны 460 нм, как и комплекс глюкозы с пикриновой кислотой (рис. 10).

400 460 ВОО 6ВО 600

Рис. 10. Спектр поглощения комплекса продуктов гидролиза полисахаридов (1) и комплекса глюкозы (2) с пикриновой кислотой

При разработке методики были определены оптимальные условия экстракции полисахаридного комплекса: степень измельченности - 3 мм; соотношение сырье-экстрагент (вода) - 1:50; полнота извлечения суммы полисахаридов достигается - в течение 1 часа; полнота осаждения суммы полисахаридов - при соотношении экст-рагента и осадителя (95% спирта этилового) 1:3, полнота гидролиза полисахаридов 8% кислотой хлористоводородной - достигается через 2 ч. При этом окрашенный комплекс продуктов гидролиза полисахаридов с пикриновой кислотой становится стабильным через 10 мин (табл.5).

Таблица 5

{ X Б Блг Р,% Ах

8 4,32 0,18314 0,06105 95 2,36 0,14 3,24

Относительная ошибка в опытах с добавками глюкозы не превышает относительной ошибки среднего результата и указывает на отсутствие систематической ошибки (табл. 6). На основании полученных результатов предлагается норма показателя «содержание суммы полисахаридов» не менее 4%.

Таблица 6

Результаты количественного определения суммы полисахаридов в сборе

с использованием метода добавок ГСО глюкозы

Содержание моносахаридов в аликвоте в пересчете на глюкозу, мкг Добавлено ГСО глюкозы, мкг Ожидаемое содержание, мкг Полученное содержание, мкг Ошибка

абс., мкг отн.,%

3586 1000 4586 4704 118 2,51

3586 2000 5586 5640 54 0,96

3586 3000 6586 6497 -89 1,37

Разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и полисахаридов оценены по критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность.

Таким образом, на основании результатов товароведческих, морфолого-анатомических и фотохимических исследований сбора предложены критерии подлинности и доброкачественности, необходимые для стандартизации, на основе которых разработан проект фармакопейной статьи на сбор для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка.

2. Исследования по разработке состава и технологии получения гранул с растительным экстрактом из сбора

В последнее время актуальным является создание таких лекарственных форм на основе растительных сборов, которые содержали бы максимальное количество биологически активных веществ и, соответственно, сохраняли бы основной фармакологический эффект. Для увеличения сроков годности и точности дозирования удобны для применения сухие экстракты.

В ходе эксперимента изучены основные факторы, влияющие на процессы экстракции БАВ из растительной композиции (измельченность сырья 7 мм, экстрагент вода очищенная (80-90°С), соотношение сырье - экстрагент 1:10 с учетом экспериментально подобранного коэффициента водопоглощения 2,30, время экстракции 120 минут). Процесс экстрагирования контролировали по выходу суммы экстрактивных веществ и содержанию водорастворимых полисахаридов, в результате чего разработана рациональная технология получения экстракта сухого (рис. 11). Опытные партии экстракта сухого были получены на оборудовании предприятия ООО «Травы Башкирии», выход готового продукта составил 21,27 ± 0,02%. Полученный экстракт представлял собой зеленовато-бурый аморфный порошок со специфическим запахом, сладковато-горького вкуса, гигроскопичный. Экстракт имеет хорошую растворимость в горячей воде (60-80°С), 10-30% спирте этиловом, плохо растворим в 4070% спирте этиловом, практически нерастворим в 80-96% спирте этиловом, хлороформе, ацетоне, этилацетате.

Изучение химического состава экстракта сухого осуществляли с помощью качественных реакций, различных методов хроматографии (БХ, ТСХ, ВЭЖХ), которое показало его соответствие по основным водорастворимым БАВ исходной растительной композиции. Учитывая это, стандартизацию экстракта сухого решено было проводить по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин и сумме полисахаридов (табл. 7). Отсутствие систематической ошибки методик было доказано при помощи опытов с добавками ГСО рутина, глюкозы и относительная ошибка при этих испытаниях не превышала относительной ошибки среднего результата.

Растительное сырье

1

ТП. 1 Измельчение растительного сырья

ТП 2.1 Экстракция расти- . тельного сырья

ТП2.2 Фильтрация экстракта

ТП2.3 Концентрирование экстракта

ТП2.4 Центрифугирование, очистка концентрированного экстракта

ТП2.5 Сушка очищенного экстракта

Вода очищенная

ТП. 2 Получение

готового

продукта

Шрот в отход

Вода в отгон

Балластные вещества в отход

УМО. 1 Фасовка, упаковка,

маркировка экстракта

ТП2.6 Измельчение сухого

экстракта

Рис. 11. Технологическая схема получения сухого экстракта

Таблица 7

Метрологические характеристики методик определения

флавоноидов и полисахаридов в экстракте сухом _

Группа БАБ Г X в Бх Р,°/о Ах

Флавоноиды 8 3,01 0,10169 0,03389 95 2,36 0,08 ±2,66

Полисахариды 8 10,12 0,47034 0,15678 95 2,36 0,37 ±3,65

Для разработанного экстракта сухого из сбора были определены следующие технологические показатели качества: насыпная масса при свободном падении 0,49 г/см3, при уплотнении 0,65 г/см3; угол естественного откоса 35-37 сыпучесть 1,2 г/с; потеря в массе при высушивании не более 5%, нормы содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 2,5%, содержания суммы полисахаридов -не менее 9%. Таким образом, экстракт сухой из сбора по основным показателям отвечает требованиям ГФ-Х1 (статья «Экстракты»), рекомендуемый срок годности - 2 года.

Экстракты природного происхождения из-за сложного многокомпонентного состава являются высокогшроскопичными субстанциями, поэтому перед нами стояла задача повысить устойчивость отсыревающих веществ, сыпучесть, снизить их гигроскопичность. Этого можно достигнуть путем создания рациональной лекарственной формы в виде гранул, которые удобны в применении, дозировании, могут способствовать более быстрому растворению лекарственных веществ, улучшению вкуса,обеспечивать стойкость при хранении, удобство и гигиеничность применения.

Для выявления оптимального состава получаемых гранул было проведено математическое планирование с использованием латинского куба второго порядка. Рассматривалась трехкомпонентная система: гранулирующая жидкость (увлажнитель), наполнители, их соотношение. Изучались свойства композиций с тремя видами гранулирующих агентов (крахмальный клейстер, метилцеллюлоза, ПВП), тремя типами наполнителей (желатин+крахмал, глюкоза+крахмал, тальк+крахмал), в которых менялись на трех уровнях концентрация гранулирующих жидкостей и на девяти уровнях - соотношение наполнителей. В качестве параметра оптимизации использовали растворимость гранул в воде. При этом было установлено, что оптимальным является состав гранул №12, имеющий лучшую растворимость в воде и отвечающий требованиям статьи ГФ-Х1 «Гранулы»:

Растительный экстракт 25,0

Смесь вспомогательных веществ (1:1):

Картофельный крахмал 37,0

Глюкоза 37,0

Раствор метилцеллюлозы в воде очищенной 3% 1,0

В результате была предложена технологическая схема получения гранул с растительным экстрактом. Полученная лекарственная форма представляет собой -гранулы неправильной шарообразной формы, диаметром 2 мм, однородные, светло-коричневого цвета. Для разработанных гранул определены технологические показатели качества: средний размер 0,56±0,03 мм; остаточная влага 2,7±0,12%; сыпучесть 5,8±0,31 г/с; прессуемость 5,5±0,26 кг; прочность на истирание 79,8±2,34%; гранулы распадаются в течение времени не более 15 мин; при определении растворимости гранул контролировали содержание основной группы действующих веществ - флавоноидов и было установлено, что через 45 мин в раствор переходит не менее 75% флавоноидов. Результаты проведенного качественного анализа свидетельствовали о наличии в экстракте сухом и гранулах тех же групп БАВ, что и водном извлечении из сбора, поэтому в основу стандартизации гранул положена методика, разработанная для исходной растительной композиции и используемая для

экстракта сухого по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом дифференциальной спектрофотометрии (табл. 8).

Таблица 8

Метрологические характеристики определения флавоноидов в гранулах

f X 8 в* Р,% Ах е,%

8 0,98 0,03814 0,01271 95 2,36 0,03 ±3,06

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были проведены опыты с добавками рутина (табл.9), которые свидетельствовали об отсутствии систематической ошибки и правильности методики.

Таблица 9

Результаты количественного определения суммы флавоноидов

Содержание сум- Добавлен Ожидаемое Полученное Ошибка

мы флавоноидов в ГСО ру- содержание, содержание, абс., мкг отн.,%

аликвоте,мкг тина, мкг мкг мкг

145,6 50 195,6 199,92 4,32 2,16

145,6 100 245,6 239,39 -6,21 2,59

145,6 150 295,6 299,61 4,01 1,34

Предлагаемая методика оценена по критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность. В результате исследования рекомендуется ввести в проект ФС на гранулы норму показателя «содержание флавоноидов в пересчете на рутин» - не менее 0,8%.

3. Фармакологическое изучение разработанных растительных средств Изучение острой токсичности сбора, экстракта и гранул показало, что они относятся к группе практически нетоксичных веществ.

Профилактическое действие изучали на двух моделях острых экспериментальных язв: модель «стресс-язвы» и «ацетилсалициловой язвы желудка». Наблюдения за экспериментальными животными с моделированными острыми язвами показали, что у них отмечались изменения со стороны органов ЖКТ, слизистой оболочки желудка (СОЖ), которые проявлялись в виде гиперемии, эрозивных и язвенных повреждений, встречающихся в различных местах пилорического и функционального отделов желудка.

Визуальное исследование СОЖ мышей с язвенными деструкциями нейроген-ного происхождения выявило максимально выраженную противоязвенную активность, уменьшение количества деструкций СОЖ у групп, получавших настой из сбора противоязвенного, экстракта и гранул. Аналогичным оказалось влияние исследуемых растительных средств на процесс язвообразования, вызванного кислотой ацетилсалициловой у крыс. При макроскопическом изучении морфологических изменений СОЖ крыс было отмечено, что наиболее выраженный гастрозащитный эф-

фект, по сравнению с группой контроля и препаратом сравнения («Сбор желудочно-кишечный»), проявлялся у животных, получавших настой, экстракт и гранулы из сбора, противоязвенная активность которых составила 6,0; 5,7; 5,8 соответственно и проявлялась как в достоверном уменьшении количества язвенных и эрозивных поражений СОЖ, так и в снижении числа животных с язвами.

Лечебный эффект изучали на модели хронической экспериментальной язвы, которую воспроизводили внутрибрюшинным введением бутадиона. Наблюдения в ходе всего эксперимента показали, что на 7-е и 14-е сутки площадь язвенных дефектов в сравнении с контрольной группой уменьшалась незначительно. В более поздние сроки и на 21-е сутки степень заживления язв у животных опытных групп была более выраженной - в 3,4 раза (настой из сбора), в 3,5 раза (экстракт) и в 3,4 раза (гранулы с экстрактом), а у препарата сравнения - в 2,5 раза. СОЖ у животных, получавших настой, экстракт и гранулы, в конце эксперимента выглядела лучше, чем в других группах. Для получения более объективной информации о действии исследуемых объектов на язву желудка были проведены гистологические исследования на животных с моделированной хронической язвой, которые подтвердили, что разработанные растительные средства проявляют выраженный гастропротекторный эффект на развитие хронического язвенного процесса у животных.

ВЫВОДЫ

1. На основании скрининга антиоксидантной и противоязвенной активности теоретически и экспериментально обоснован и разработан оптимальный состав соотношения компонентов в растительной композиции, рекомендуемой для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка.

2. Выявлены характерные макро- и микроскопические признаки, необходимые для определения подлинности сбора, определены товароведческие показатели качества, микробиологическая и радиологическая чистота сбора. С использованием современных методов анализа изучен качественный состав сбора и установлено присутствие полисахаридов, аскорбиновой кислоты, каротиноидов, органических кислот, аминокислот, дубильных веществ, сапонинов, флавоноидов, фенолкарбоновых и ок-сикоричных кислот, кумаринов. Методом ВЭЖХ подтверждено присутствие флавоноидов; фенолкарбоновых, оксикоричных и органических кислот; глицирризиновой кислоты. Выделены и идентифицированы индивидуальные вещества: кверцетин, изокверцитрин, гиперозид, авикулярин, рутин, галловая кислота, структура которых подтверждена методами УФ-, ИК- и ЯМР-спектрометрии, физико-химическими характеристиками. Методом хроматомасс-спектрометрии в составе эфирного масла сбора идентифицировано 20 веществ терпеновой природы.

3. Определено количественное содержание основных групп биологически активных веществ: аскорбиновой кислоты 0,060±0,001%, органических кислот 2,46±0,10%, эфирного масла 0,956±0,025%, каротиноидов 0,040±0,001%, оксикоричных кислот 1,76±0,07%, дубильных веществ 4,04±0Д0%, кумаринов 0,46±0,02%, сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту 1,45±0,02% и в пересчете на глицирризиновую кислоту 1,13±0,04%, суммарное содержание аминокислот (6,76%), важные макро- и микроэлементы, среди которых выявлено высокое содержание калия, натрия, фосфора, кальция, железа, марганца, цинка.

4. Определены числовые показатели, характеризующие качество сбора и нормы их содержания: влажность - не более 14%; зола общая - не более 13%; зола, нерастворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, - не более 4%; содержание органических примесей не более 2% и минеральных, - не более 1 %; содержание частиц, не проходящих сквозь сито с1=7 мм, - не более 10% и частиц, проходящих сквозь сито <1=0,18 мм, - не более 7%; содержание суммы полисахаридов - не менее 4%; содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 1,3%.

5. Экспериментально обоснованы оптимальные параметры экстракции биологически активных веществ из растительной композиции и разработан способ получения экстракта сухого из сбора; на основании метода математического планирования осуществлен оптимальный выбор вспомогательных веществ для получения гранул с растительным экстрактом, разработан рациональный состав и технология их получения, содержащих растительный экстракт 0,25, смесь глюкозы и крахмала (1:1) по 0,34 и 3% раствор метилцеллюлозы 0,1.

6. Изучен химический состав экстракта сухого и гранул, исследованы их физико-химические и технологические свойства, предложены критерии и нормы оценки качества; определено содержание основных групп БАВ, по которым предлагается стандартизация экстракта - суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 3,5%, суммы полисахаридов не менее 9,0%; для гранул суммы флавоноидов не менее 0,8%.

7. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы полисахаридов, применяемые для стандартизации сбора и экстракта сухого, а методика определения суммы флавоноидов легла в основу сквозной стандартизации по принципу растительное сырье - субстанция - лекарственная форма.

8. Проведена валидация методик количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов в сборе и лекарственной форме, которая показала их соответствие критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность.

9. Экспериментально доказано, что разработанные растительные средства относятся к группе практически нетоксических веществ, обладают отчетливым гастрозащит-

ным действием (на моделях острых язв желудка) и проявляют выраженный гастро-протекторный эффект на развитие хронического язвенного процесса у животных. 10. Разработаны проекты фармакопейных статей на сбор и лекарственную форму.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Старцева, Л.В. Разработка и изучение лекарственной формы на основе растительного экстракта из сбора /Л.В. Старцева, К.А. Пупыкина, Ю.В. Шикова [и др.] // «Медицинский вестник Башкортостана». - № 1, Т.6. - 2011. - С. 92 - 93.

2. Старцева, Л.В. Изучение качественного состава экстракта, полученного на основе растительной композиции / Л.В. Старцева, К.А. Пупыкина //«Башкирский химический журнал». - Т., № 4. - 2009. - С. 100 - 101.

3. Влияние растительного сбора на дисбактериоз кишечника / К.А. Пупыкина, Н.Ж. Бас-ченко...Л.В. Старцева [и др.] //«Фармация». -2007,- №6,- С.37-39.

4. Патент РФ № 2331430 на изобретение «Сбор лекарственных растений для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка»/К.А. Пупыкина, В.А. Лиходед, Л.В. Старцева [и др.]// Бюл. № 23 от 20.08.2008г.- 3 с.

5. Старцева, Л.В. Сравнительное изучение противоязвенной активности сбора и экстракта на его основе/Л.В.Старцева, К.А.Пупыкина // «Традиционная медицина» -20Ю.-№3 (22) // Сборн. научи, трудов II Рос. фитотерапевт, съезда. - С. 77-78

6. Пупыкина, К.А. Изучение элементного состава растительного сбора для комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки /К.А. Пупыкина, Л.В. Ро-гачева (Старцева) // Матер, межвуз. науч.-практ.конфер. «Актуальные проблемы техн., ес-тес. и гуманитарных наук».-Уфа,2006.-С.314-316

7. Изучение острой токсичности сборов для комплексного лечения язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки и дисбактериоза /К.А.Пупыкина, Н.Ж. Басченко, Л.В.Рогачева(Старцева) [и др.]//Матер. Всерос. науч.-практ. конф. «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» -Томск,2006,- С. 287-288.

8. Изучение возможности использования лекарственных растительных средств для комплексного лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш, Л.В.Старцева//Матер. Респ.конф.«Медицинская наука-2006».-Уфа, 2006.-С.120-122.

9. Пупыкина, К.А. Изучение содержания аминокислот в растительном сборе для комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / К.А. Пупыкина, Л.В. Рогачева (Старцева) //«Медицинский вестник Башкортостана» (спец. выпуск) Сборн. научн. тр. юбил. конф. - Уфа, 2006. -Т.4, №1 - С.166-167.

10. Фармакогностическое изучение сбора для комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки /К.А. Пупыкина, Л.В.Старцева, Е.А. Клыш // Матер, науч.-практ конф. «Вопросы теорет. и практ. медицины».-Уфа, 2006. - С.451 -452.

11. Разработка оптимальных условий получения экстрактов из растительных сборов при заболеваниях желудочно-кишечного тракта /К.А. Пупыкина, Л.В. Старцева, Е.А. Клыш,

JI.C. Глухова // «Медицинский вестник Башкортостана» (спец. выпуск) «Актуальные вопросы современной фармации и фарм.образования». - Уфа, 2006. - Т.4, №1 - С. 160-162.

12. Пупыкина, К.А. Изучение возможности использования растительного сбора для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки/К.А. Пупыкина,Л.В. Старцева//«Практическая фитотерапия», 2006,-№3.- С.18-20.

13. Изучение растительного сбора для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки /К.А. Пупыкина, Н.Ж. Басченко, Л.В. Старцева //«Традиционная медицина-2007»: Сборн.науч.трудов конгр.- Москва, 2007.- С.78-79.

14. Фармакогностическое изучение сборов для комплексного лечения язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки и дисбакгериоза /К.А. Пупыкина, В.А.Лиходед, Л.В. Старцева, Е.А. Клыш // «Запорожский медицинский журнал». - 2007. - №2,- С.134-136.

15. Пути переработки растительных сборов, разработанных для профилактики и комплексного лечения заболеваний ЖКТ / К.А.Пупыкина, Л.В.Старцева, Е.А.Клыш // Сборн. научн. тр. Междунар. симп. «Новые и нетрад. растения и перспективы их использования». - Т. III - Пущино, 2007.-С. 399-401.

16. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сборах / К.А. Пупыкина, С.А.Мещерякова, Л.В. Старцева [и др.] //Матер. Рос. науч.-практ.конф. «Достижения и перспективы в области создания нов.лекарст.средств».-Пермь, 2007.-С. 455 - 458.

17. Старцева, Л.В. Разработка показателей качества сухого экстракта на основе растительного сбора / Л.В. Старцева, К.А. Пупыкина //«Разработка, исследование и маркетинг новой фарм.продукции» Сборн. науч.тр. -Пятигорск, 2010. - С. 399 - 400.

18. Технологические показатели качества экстракта, полученного на основе протии-воязвенного сбора/Т.А.Иванова,Л.В.Старцева,К.А.Пупыкина [и др.] //Матер, респуб. на-учн.студ. и мол.уч.«Вопр.теорет.и практ. медицины».- Т.1.-Уфа, 2010.- С. 184- 185.

19. Разработка состава гранул с растительным экстрактом, полученным на основе противоязвенного сбора / Л.В. Старцева, К.А. Пупыкина, Ю.В. Шикова [и др.] // Вестник ПГФА, №7,2010,- Матер. Рос. науч.-практ.конф. -Пермь, 2010.-С. 194-196.

20. Пупыкина, К.А. Некоторые особенности использования растительного сбора для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка и двенадцати-перстной кишки / К.А. Пупыкина, Л.В. Старцева, Г.А. Павлова // Сбор. тез.У Меж-дунар. фор. «Интегративная медицина».- Москва, 2010. - С. 171-172.

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано к печати 01.04.2011 г. Отпечатано на ризографе с готового оригинал-макета, представленного авторами. Формат 60x84 1/16. Усл.-печ. л. 1,63. Тираж 100 экз. Заказ № 23. 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет Росздрава»