Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование мутагенеза химерного гена Р53, индуцированного канцерогеном аристолохиевой кислотой, в клетках гуманизированных мышей Hupki

на правах рукописи

Неделько

Татьяна Николаевна

Исследование мутагенеза химерного гена р53, индуцированного канцерогеном аристолохиевой кислотой, в клетках гуманизированных мышей Нирк1

Специальность: 14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003463544

Работа выполнена в Немецком центре раковых исследований (Deutscheskrebsforschung Zentrum, Im Neuenheimer Feld 280, D69120 Heidelberg)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Забежинский Марк Абрамович Научные консультанты:

профессор доктор М. Хольштейн (Германия, Англия) доктор медицинских наук П.Г. Князев (Германия)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Владимир Николаевич доктор биологических наук, профессор (Сомов Вадим Петрович

Ведущая организация:

ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Росмедтехнологий

Защита диссертации состоится «_» марта 2009 г.,. в_часов на заседании

Диссертационного совета Д208.052.01 в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» по адресу: 197758, С-Петербург, п.Песочный - 2, ул. Ленинградская, д.68

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» по адресу: 197758, СгПетербург, п.Песочный - 2, ул. Ленинградская, д.68 и на сайте (www.niioncologii.ru)

Автореферат разослан «_» февраля 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Е В. Бахидзе

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Вот уже более 25 лет ген р53 и кодируемый им ядерный белок р53 являются предметом исследования многих лабораторий во всем мире. Белок р53 играет важную роль а регуляции клеточного цикла и апоптоза (Сейц И.Ф., Князев П.Г., 1986; Анисимоа В.Н., 1997, Чумаков ГШ., 2000; Копнин Б.П., 2000). Ген р53 представляет собой одну из основных мишеней действия канцерогенов окружающей среды. Изучение эффекта канцерогенов на структуру гена и соответствующего белка важно как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для оценки индивидуального канцерогенного риска при молекулярно-зпидемиологических исследованиях и разработки соответствующих профилактических мероприятий (Напалков Н.П., 1989; Забежинский М.А. и др., 2004).

Исследования гена р53 на лабораторных животных in vivo и in vitro не раскрывают полностью роль р53 и его белка в развитии заболеваний человека, включая рак, поскольку известно, что даже незначительные различия в их первичной последовательности нуклеотидов генов и, соответственно, белков приводят к существенным расхождениям на функциональном уровне (Bargmann C.I., et ai, 1986). В этой связи актуальной задачей является создание моделей трансгенных животных (например, мышей) с гуманизированными формами белков.

Возможности генной инженерии позволили получить линию гуманизированных мышей Hupki (Hüman-E53-j<nock-jn), в геном которой был встроен участок гена р53 человека, представленный центральным доменом (экзоны 5-8), а также рядом расположенными экзонами 4 и 9 (Luo J.-L., et а/., 2001). Этот участок вызывает особый интерес исследователей в связи с тем, что наибольшее количество мутаций (более 80%), обнаруженных в гене р53 опухолей человека, сосредоточено именно в указанном домене (Hollstein М., eta!., 1991; Levine A.J., eta!., 1991; Harris C.C., and Hoilstein M„ 1993). Более того, в 4-м зкзоне выявлен уникальный полиморфизм 72-го кодона, который определяет, вследствие нуклеотидной замены гуанина на цитозин, наличие аминокислоты аргинина или пролина в молекуле белка (Murphy М.Е., 2006). Взгляды ученых на данный полиморфизм не однозначны и сводятся к следующему предположению; если 72-м кодоном кодируется аргинин, это может способствовать ускорению развития апоптоза в клетке, а наличие пролина будет сопровождаться задержкой клеточного цикла (Pirn D., and Banks L., 2004; Murphy M.E., 2006). Для изучения этой проблемы необходимо получение соответствующих линий гуманизированных мышей Hupki.

В лаборатории Немецкого Центра Раковых Исследований (DKFZ, Heidelberg) была получена линия гомозиготных мышей HupkiA,3/Ara (Luo J.-L., et al, 2001). Актуальной задачей остаётся получение гомозиготных линий Нирк1Рга,Рго и гетерозиготных HupkiA,g/p'°. Использование этих линий мышей и полученных на их основе клеточных культур

V

позволит изучать механизмы влияния канцерогенов окружающей среды на ген р53 и исследовать последующую цепь событий, ведущих к развитию рака у человека.

Одним из недавно выявленных канцерогенов для человека является аристолохиевая кислота (АК), содержащаяся в травянистом растении Аристолохии (или Кирказоне) и вызывающая опухоли у лабораторных грызунов (Mengs U., et al., 1982). У людей, лечившихся китайскими травами, содержащими АК, возникали карциномы из уротелия (Nofrier J,,'et al., 2000), в связи с чем подобные медицинские средства, содержащие АК, отнесены экспертами Международного агенства по изучению рака (МАИР) к группе 1 -безусловно доказанных канцерогенов для человека (IARC Monographs, 2002). Следует отметить, что АК, её аддукты ДНК и вызванные АК мутации р53, в том числе, трансверсии А:Т -> Т:А обнаруживали у лиц с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия, наблюдаемыми на территории Балканского полуострова и, предположительно, вызванными употреблением в пищу аристолохии, произрастающей в виде сорняка среди злаков (Grollman А.Р., et al., 2007). На мышах Hupki*4"13 уже были проведены исследования мутагенеза при действии АК (Feldmeyer N.. et al., 2006), однако, актуальным является продолжение этих работ с изучением мутагенного эффекта АК в клетках мышей HupkiPro/Pro и HupWAWPre .

При изучении мутагенеза гена р53 целесообразно параллельно проанализировать изменения гена p19-ARF, который связан с р53 и Mdm2 сигнальным путем и является маркером функциональной активности р53, в случаях мутаций р53 (Haupt Y., et al, 1997; Kubbutat M.H., et al., 1997). Известно, что канцерогены могут вызывать делеции p19-ARF (Shapless N.E., and de Pinho R.A., 2005). Поскольку генные мутации ведут к изменению свойств белков - актуально также изучение белков р53 и p19-ARF при действии канцерогенов, включая АК.

Изучению описанных выше проблем и посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы являлось изучение мутагенеза химерного гена р53 гуманизированных мышей Hupki, индуцированного канцерогеном окружающей среды аристолохиевой кислотой, и оценка влияния полиморфизма 72-го кодона на частоту возникновения и спектр мутаций р53. Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) создать гомозиготную Hupkir>,0,p'° и гетерозиготную Нирк1АгзЛ^° линии мышей, различающиеся по полиморфизму 72-го кодона;

2) получить первичные культуры фибробластов (ПКФ) эмбрионов мышей Hupkipr0/pr° и HupkiAr9,p'° и на их основе - иммортализованные клеточные линии (КЛ). пригодные для изучения мутагенеза химерного гена р53: , .

3) послэ воздействия АК на ГЖФ, исследовать образование специфических аддуктов ДНК;

4) в контрольных КЛ (КК/1) и экспериментальных КЛ (ЭКЛ), полученных из ПКФ, обработанных АК, провести сравнительный анализ мутаций химерного гена р53 с 4-го по 9-й экзон включительно;

5) оценить влияние полиморфизма 72-го кодона химерного гена р53 на частоту и спектр мутаций в ЭКЛ и ККЛ;

6) установить наличие или отсутствие делеций гена р19-АР!Р в ЭКЛ и ККЛ.

7) исследовать присутствие белков р53 и р19-АР?Р в ККЛ и ЭКЛ мышей Нирк!.

Научная новизна работы

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые были созданы гомозиготная (Нирк1р,["ргс) и гетерозиготная (Нирк^^'0) линии мышей по аллелям химерного гена р53. Получены первичные культуры фибробластов эмбрионов мышей НирЫ и иммортализованные клеточные линии, пригодные для изучения мутагенеза при действии канцерогенов, в частности, аристолохиевой кислоты. В этих экспериментах установлено, что АК индуцирует мутации, близкие по спектру (трансверсии А:Т Т:А) к ранее обнаруженным у людей с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия.

Практическая значимость полученных результатов

Создана гуманизированная по гену р53 модель мышей Нирк!, пригодная для выявления особенностей мутагенеза при действии канцерогенов окружающей среды и использования полученных результатов в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, связанных с выявлением групп повышенного онкологического риска. Модель гуманизированных мышей Нирй позволяет проводить тестирование различных факторов на мутагенную и канцерогенную активность, результаты которого с большей степенью надежности можно будет экстраполировать на человека.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые получены гомозиготная Нирк1Рга/Рг° и гетерозиготная Нирк1Дгз,,рг° линии мышей, первичные культуры эмбриональных фибробластов Нирк1 двух разных генотипов и иммортализованные клеточные линии. , '

2. При воздействии аристолохиевой кислоты на культуры эмбриональных фибробластов, в их геноме были обнаружены специфические ДНК-аддукты, соответствующие выявленным ранее у людей, употреблявших АК. Количество аддуктов ДНК возрастало с увеличением времени инкубации культур с АК.

3. После инкубации культур клеток Нирк! с АК, в клеточных линиях были выявлены мутации гена р53, в значительной степени соответствующие типам мутаций,

обнаруженных у больных «балканской» нефропатией и опухолями из уротелия, связанными со случайным употреблением в пищу АК. Частота мутаций возрастала с увеличением времени экспозиции к АК. 4. Полиморфизм 72-го кодона гена р53 не оказывал существенного влияния на мутагенный эффект АК.

Апробация работы

Результаты работы доложены на ежегодном симпозиуме EEMS (European Environmental Mutagen Society - Базель, Швейцария, сентябрь 2007) и на третьей ежегодной конференции, которая проходила в Немецком центре исследования рака (DKFZ Heidelberg) в июле 2008 года, организованной Институтом исследования рака (Великобритания) и Международным агенством по исследованию рака (Лион, Франция).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения собственных исследований и выводов. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 29 рисунками. Библиографический указатель включает 250 публикаций на русском и английском языках.

Материалы и методы

Получение гомозиготной НиркГ'°"'г° и гетерозиготной НиркгЛгд/Рг° линий мышей

На первом этапе с помощью метода трансгенных технологий были получены мыши HupklProWrt. Для этого рекомбинантный аллель, содержащий фрагмент гена р53 человека (с 4-го по 9-й экзон), вводили в бластоцисты линии мышей дикого типа 129Sv. Используемый метод позволял целенаправленно осуществить замену 4-го - 9-го экзонов гена р53 мыши на соответствующие зкзоны гена р53 человека (Luo J.-L., ef al., 2001). Химерных мышей HupkiPrc,w" скрещивали между собой в первом поколении с целью создания гомозиготной линии HupkiPr°/'Sr°. Затем для формирования гетерозиготной популяции Нирк1А,9Л=га, гомозиготные особи Нирк"1РгЫРг0 скрещивались с мышами HupkiAfs'A'9, поддерживаемыми в отделе «Генетические изменения при канцерогенезе» Немецкого центра раковых исследований {DKFZ, Heidelberg).

Генотипирование мышей Hupki по аппелям гена р53 человека

С целью определения корректности введения рекомбинантного аллеля в ген р53 мыши, животных первого поколения и эмбрионов последующих поколений генотипировали. используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование (Luo J.-L. ef al., 2001).

Для изучения полиморфизма 72-го кодона аллелей Hupki использовался метод секеенировзния ПЦР 4-го экзона гена р53. Исследуемым материалом для анализа была геномная ДНК, получаемая из биопсийного материала (хвост мыши) или из ПКФ, ДНК выделяли по протоколу, рекомендованному Ригедепе (США). Для амплификации 4-го экзона использовали праймеры: GCE 4F - 5'-GTC-CTC-TGA-CTG-CTC-TTT-TCA-CCC-ATC-ТАС-3'; GCE 4R - 5'-GGG-ATA-CGG-CCA-GGC-AGG-CAT-TGA-AGT-CTC-3'; ПЦР осуществляли на приборе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия). Для электрофоретического разделения продуктов амплификации использовали 2% гель агарозы на основе 1 х ТВЕ буфера. Продукты амплификации очищали на колонках PeqLab (Германия) в соответствии с рекомендациями изготовителя и секвенировали на приборе ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).

Получение первичных фибробластов эмбрионов мыши Hupkfm/Pra и Hupkf'Я/Рг0 и иммортализоеанных клеточных линий

Первичные фибробласты выделяли из эмбрионов на 13,5 день внутриутробного развития. От каждой линии мышей Нирк!рго/р,° и HupkiA,a,p,° использовался лишь один эмбрион. После удаления головы, сердца и печени оставшиеся ткани эмбриона подвергали трипсинизации (1хТрипсин-Е0ТА, РАА Laboratories GmbH, Австрия) и получали клеточную взвесь первичных фибробластов, которую обозначали клетками нулевого пассажа. Культуры пересевали в ростовой среде DMEM (РАА Laboratories GmbH, Австрия) с добавлением 1% пенициллин-стрептомицина, 1% глютамина, 10% сыворотки новорожденных телят, 1% пирувата натрия. В процессе пассирования ПКФ вели ежедневное наблюдение за ростом клеток и анализировали морфологические изменения с помощью световой микроскопии, отмечая наступление фазы остановки пролиферации (ОП) и её продолжительность по характерным фенотипическим изменениям клеток. По окончанию «критической фазы» ОП из ПКФ образовывались иммортализованные КЛ, которые поддерживали на той же питательной среде и регулярно пересевали.

Инкубация первичных культур фибробластов эмбрионов мышей Hupkf'0"'"' и Hupkf3"*' с аристолохиевой кислотой

Использованная в работе аристолохиевая кислота, растворённая в воде в концентрации ЮмМ, была получена в отделе молекулярной токсикологии Немецкого центра раковых исследований (DKFZ, Heidelberg).

С целью выбора оптимальной концентрации АК, пригодной для изучения мутагенеза р53, на первом этапе ПКФ мышей Hupki"8"5'0 первого пассажа обрабатывали АК в трех различных концентрациях: 20мкМ, 50мкМ и ЮОмкМ в течение 48 часов. С начала экспозиции с канцерогеном, каждые 24 часа (вплоть до 120 часов) производился подсчет

живых клеток в камере Горяева. Результаты этого токсикологического эксперимента представлены на рис. 1.

1600000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 1

Рис. 1. Анализ количества живых клеток ПКФ (экпериментальных и контрольных) через определенные интервалы времени (каждые 24 часа), при инкубации с АК.

Как видно из данных, представленных на рис. 1, с увеличением концентрации АК скорость пролиферзции клеток уменьшалась. В качестве подходящей для дальнейшего опыта была выбрана концентрация аристолохиевой кислоты 50мкМ, когда способность клеток к делению сохранялась, но скорость пролиферации снижалась примерно в 2 раза по сравнению с контрольными клетками. Такой выбор был основан на предположении, что данная концентрация будет достаточно высокой для проявления мутагенного эффекта, и в то же время, не ограничит значительно жизнеспособность экспонированных к АК культур.

Схема эксперимента

Для проведения эксперимента использовались первичные культуры фибробластов эмбрионов мышей Нирк1Рго/Рга и Нирк1А'9,Рг0. Схема опыта представлена на рис. 2.

Анализ белков

Аддукты ДИК (p53, plS-ARF)

SOmkM АК f Анализ генома .

Т | (р53, p19-ARF) Т

HuDkiP'0/Pr° * I (р53, p19-ARF) Т Замораживание КЛ ....-.-Л°Л>го —|-1-f-1-1......|-1-i-h......I

n.1 n.2 n.3 n.4 n.5 n.14 n.15 n.16 n.17 n.20

1 группа AK

Анализ белков

Аддукты ДНК р1Э.АК|=)

50мкМ АК 50ыкМ АК ♦ Анализ генома »

НиркГ"^ т Т ' (р53, р1 Э-АЯЯ) Т Замораживание КЛ

—|-|-1-1-Г......I-1-1-1"......I

, Р ' .„ п-1 п.2 п.З п.4 п.5 п.14 п.15 п.16 п.17 п.20

2 группа АК

... „,.„ Анализ белков

Аддукты ДНК (р53 р1в.ДКР)

т Анализ генома .

„ „ {р53, р19-АЯЯ) Т Замораживание КЛ

Нирк) -н-,-,-1-,.......-;-н......I

Нирк! " п.1 п.2 п.З п.4 п.5 п.14 п.15 п.16 п.17 п.20

контроль

Рис. 2. Схема эксперимента.

Как видно из рис. 2, ПКФ, выделенные из эмбрионов каждой линии мышей, были разделены на 3 группы: контрольную и 2 экспериментальные, инкубированные с АК в концентрации 50мкМ. ПКФ первой экспериментальной группы инкубировали с АК 48 часов однократно на 1-м пассаже (п.1), а ПКФ второй экспериментальной группы - два раза по 48 часов на 1-м и 3-м пассажах. Аддукты ДНК определяли в ПКФ 1-й группы на 2-м пассаже, в ПКФ второй группы и в контроле - на 4-м пассаже. Анализ генома проводили уже в образовавшихся из ПКФ иммортализованных КЛ, на 15-м пассаже во всех группах. На 17-м пассаже из иммортализованных КЛ выделяли и анализировали белки р53 и P19-ARF. Опыт заканчивали на 20-м пассаже, когда все культуры замораживали.

Определение аддуктов ДНК

Анализ аддуктов ДНК проводили с помощью радиоактивного изотопа фосфора "Р (Phillips D., Arlt V.M., 2007). Из каждой группы первичных культур фибробластов гомо- и гетерозиготных мышей получали пул клеток в равном соотношении, а затем выделяли ДНК. Для проведения анализа использовали геномную ДНК с концентрацией 1,1 мкг/мкл из первой группы фибробластов, 1,3 мкг/мкл из второй группы и 0,39 мкг/мкл из контрольных клеток. ДНК подвергали ферментативному мононуклеотидному гидролизу. При этом использовались экзо- и эндонуклеазы (микрококковая эндонуклеаза и экзонуклеаза селезенки). Реакцию обогащения мононуклеотидов проводили бутанолом, а расщепление ДНК - с помощью нуклеазы Р1. Мечение мононуклеотидов осуществляли Т4-лолинуклеотид киназой, которая присоединяет радиоактивный фосфор [y-j2P]-ATP.

Образовавшиеся дезоксирибонуклеозид-3'-5'-бифосфаты, меченные 32Р, в дальнейшем определяли методом тонкослойной хроматографии и авторадиографччески, сравнивая со стандартными образцами трёх специфических аддуктов ДНК, образующихся при действии АК: 7-(деоксиаденозин-Ы6-ил)аристолактама II; 7-(деоксиаденозин-1\16-ил)-аристолактама I, и 7-(деоксигуанозин-Мг-ил)аристолактама I. Количество образующихся аддуктов сравнивали между собой по уровню радиактивности.

Анализ мутаций гена р53

Для анализа мутаций гена р53 использовали метод секвенирования продуктов полимеразно-цепной реакции. Мыши Нирк1 содержат в своем геноме участок р53 человека с 4-го по 9-й экзон. Ка>вдый экзон амплифицировался отдельно с помощью специфичных праймеров (табл. 1).

Таблица 1

Нуклеотидная последовательность праймеров, специфичных кжзонам гена р53 человека

Участок амплификации Прэймер Сиквенс Размер ПЦР продукта

Экзон 4 GCE4F 5-GTCCTCTGACTGCTCTTTTCACCCATCTAC-3' 368 пн.

GCE4R 5'-GGAATACGGCCAGGCAGGCATTGAAGTCTC-3'

Экзон 5 GCE5F 5'-CTTGTGCCOTGACTTTCATCAACTCTGTCTG-3' 272 пн.

GCE5R 5'-TGGGCAACCAGCCCTGTCGTCTCTCCA-3'

Экзон S GCE6F 5'-CCAGGCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC-3' 204 пн.

GCE6R 5'-GCCACTGACAACCACCCTTAACCCCTC-3'

Экзон 7 GCE7F 5'-GCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATCTCC-3' 175 пн.

GCE7R 5-GGCCAGTGTGCAGGGTGGCAAGTGGCTC-3'

Экзон 8 GCE8F 5'-GTAGGACCTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC-3' 241 пн.

GCE8R 5'-ATAACTGCACCCTTGGTCTCCTCCACCGC-3'

Экзон 9 GCE9F 5'-CACTTTTATCACCTTTCCTTGCCTCTTTCC-3' 146 ПН.

GCE9R 5'-AACTTTCCACTTGATAAGAGGTCCCAAGAC-3'

ПЦР осуществляли с использованием аппарата Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия). При электрофорезе продуктов амплификации применяли 2% гель агарозы на основе 1хТВЕ буфера. Продукты амплификации очищали на колонках PeqLab (Германия) и секвенировали на приборе ABI Prism 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США).

Полученные данные сравнивали с последовательностью нуклеотидов гена р53 человека, используя базу данных МАИР «IARC ТР53 Mutation Database» (http://ww.v-p53.iarc.fr). В настоящее время в этой базе данных представлены сведения о 23957 мутациях гена р53 у человека, опубликованных в литературе с 1989 года. Если мутации были обнаружены, то определяли кодон, тип аминокислотной замены и, соответственно, вариант мутации (миссенс, нонсенс, сдвиг рамки считывания и другие), гомозиготность или гетерозиготяость. Возможную функциональную активность мутантного белка также определяли по базе данных МАИР.

Определение делений зкзонов гена р1Э-АИР в иммортализованных клеточных линиях мы шей

С целью определения наличия или отсутствия делеций гена р19-АРР был разработан метод амлификации его экзонов с помощью ПЦР. Для проведения реакции использовали специфичные праймеры (табл.2).

Таблица 2

Нуклеотидная последовательность праймеров, специфичных к экзонам гена р19-АВР мыши

Участок амплификации Праймер Сиквенс Размер ПЦР продукта

Экзон 1 p19-Ex1F 5'- GTC ACA GTG AGG CCG CCG CT-3' 231 пн.

p19-Ex1R S1- TGG TCC AGG ATT CCG GTG C-3'

Экзон 2 p19-Ex2F 5'- TTA ACA GCG GAG С TT CGT AC-3' 452 пн.

p19-Ex2R 5'- TTT GGA CCA ACT ATG CTC ACC-3'

Экзон 3 p19-Ex3F 5'- GGA GAC TCC AGA TCC CATTAG-5' 9S5 пн.

pl9-Ex3R 5'- ATG GCT GTT GTG ACT GAC G-3'

Определение присутствия белков р53 и p19~ARF в фибробластах гуманизированных мышей HupktдаРто и Hupki"3"'"

Для анализа присутствия белков р53 и p19-ARF в исследуемых экспериментальных и контрольных клетках использовался метод их электрофореза в лолиакриламидном геле (ПААГ). с последующим выявлением на мембранах после инкубации в растворе специфичных антител (Вестерн блоттинг). Белковые лизаты получали из иммортализованных клеточных линий (17-й пассаж), с помощью лизирующего буфера, содержащего 1% Triton х 100 (Sigma, Германия) и ингибиторы протеаз (Roche, Германия). Концентрация белков в лизатах измерялась на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США). Для разделения белков использовался вертикальный 12% ПААГ. Предварительно 20 мкг белкового лизата смешивали с 4-кратным буфером Лэммлй, содержащим ß-меркаптоэтанол, а затем денатурировали в течение 10 мин при температуре 70°С. Для контроля нанесения лизатов использовали антитела к белку GAPDH.

Иммуноблоттинг

Перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Protran ВА85, Германия) проводили по стандартной методике (Маниатис Т., и др., 2001) с небольшими модификациями. Мембрану с белками инкубировали в течение часа в блокирующем буфере, содержащем 5% сухого молока, и затем разрезали горизонтально на 3 части. В течение 1 часа проводили инкубацию мембран с раствором первичных антител, соответственно: к белку р53 (Novo Castra, Великобритания), при разведении 1:1000; к

белку GAPDH (Ambion, Великобритания) 1:5000 и к белку p19-ARF (Calbiochem, США) в разведении 1:1000.

Статистический анализ

При статистической обработке результатов использовали методы параметрической и непараметрической статистики с использованием пакета статистических программ STATGRAPbi, STATISTICA (5.5) и STADIA. Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика полученных линий мышей Hupki

Используя трансгенные технологии, нами были получены 5 гетерозиготных мышей Hupkip'0/Wl (2 самки и 3 самца). При скрещивании HupkiProM" между собой были выделены 2 гомозиготных особи HupkiPr°'Pra (1 самка и 1 самец), которые впоследствии использовались для формирования колонии гомозиготных мышей. Результаты генотипирования представлены на рис. 3.

400 пн->

400 пн-^

Рис. 3. Электрофорез ПЦР фрагментов гена р53 мышей НирЮ.

Дорожки обозначены цифрами. Стрелкой указан размер фрагментов ПЦР, равный 400 пн. На первой и девятой дорожках - молекулярный маркер. На дорожках 2-13 - образцы фрагментов ПЦР, полученных при амплификации геномной ДНК мышей. Образцы на дорожках 5, 6, 10 и 13 - Нирк1РгоМЛ, имеющие двойные полоски. На дорожках 3 и 11 -Нирк1рг0/р'!1. с размером продукта ПЦР 368 пн. На 2-й, 4-й, 7-й и 12-й дорожках - продукты ПЦР. имеющие размер 450 пн, характерные для мышей дикого типа 1295у. На дорожке 14 - образец геномной ДНК мыши дикого типа 129ву, используемый в качестве позитивного контроля. На дорожке 15 - геномная ДНК мыши Нирк1А,9Лд (позитивный контроль) и на последней дорожке - вода вместо геномной ДНК (негативный контроль).

Скрещивая гомозиготные линии Нирк1р""Рго и Нирк1А'9/А'9. нами также получены гетерозиготные мыши Нирк1ЛГ9/Рга. Мыши Нир№ трёх разных генотипов (НиркГ'0'1"'0,

HupkiA'9'A',0 и Hupki"9"5"'), не отличаясь друг от друга по внешнему виду, размеру, окраске и фенотипически соответствовали дикому типу 129Sv.

Рост эмбриональных фибробластов мышей Hupki в культуре и влияние на него аристолохиевой кислоты

Рост первичных фибробластов мыши в культуре не является однородным и постоянным. Существует механизм, ограничивающий число делений нормальных клеток за счет прогрессивного укорочения длины теломер во время репликации. Установлено, что при культивировании in vitro клетки после 50-60 делений (число Хейфлика) перестают размножаться и останавливаются преимущественно в G1 фазе клеточного цикла.

Мы наблюдали, что на начальных пассажах первичные фибробласты, которые имеют звездчатую форму с отростками, размножаются и растут довольно интенсивно. Однако, по достижении ими определенного числа делений, рост их становился менее выраженным и клетки постепенно теряли эту способность. Этот особый период называется «кризисом» или репликативным (клеточным) старением, сопровождавшимся остановкой пролиферации (ОП). При этом размеры клеток значительно увеличивались, а их форма округлялась.

В контроле, независимо от линий мышей (гетерозигот или гомозигот) период «кризиса» наступал через 4 недели культивирования первичных фибробластов на 8-м/9-м пассаже и длился от 12 до 15 дней, что не отличалось существенно от наблюдавшегося нами в параллельных опытах роста ПКФ мышей дикого типа 129Sv. Таким образом, генетическая модификация, при получении мышей Hupki, не отражалась на характеристике роста культур эмбриональных фибробластов, в процессе иммортализации.

Однако, использование канцерогена АК ускоряло наступление кризиса и увеличивало его продолжительность. Клетки обоих генотипов, обработанные однократно аристолохиевой кислотой (1-я группа), демонстрировали ОП немного раньше, на 6-м/7-м пассаже с продолжительностью более 3 недель. Фибробласты второй экспериментальной группы с двойной обработкой канцерогена теряли способность к росту и делению на 4-м/5-м пассаже в течение 4-5 недель. Следует отметить, что поведение фибробластов в культуре не выявило существенных различий между клетками HupkiArsPra и Hupkip,t"pr°. Тем не менее, начало наступления и длительность ОП были различны между контрольными и экспериментальными клетками. Подобная закономерность (раннее наступление кризиса и ббльшая его продолжительность) отмечена и при действии других канцерогенов (Vom Brocke J., et al., 200S: Reinbold M., et al„ 2007).

После завершения периода кризиса клетки начинали делиться и формировать новые популяции, образуя иммортализованные клеточные линии, отличавшиеся быстрым ростом.

Характеристика аддуктов ДНК, образующихся после инкубации первичных культур эмбриональных фибробластов мышей Нирк'1 с аристолохиевой кислотой

Результаты анализа аддукггов ДНК представлены на рис. 4. Авторадиограмма с использованием геномной ДНК контрольных фибробластов не содержала никаких следов присутствия аддуктов ДНК (Рис. 4В). В то же время, все три известных специфических аддукта выявлены при анализе ДНК экспериментальных ПКФ гомо- и гетерозиготных мышей (рис. 4 А, Б). В наибольшем количестве образовывался 7-(деоксиаденозин-М6-ил) аристолактам. Суммарное количество образующихся специфических аддуктов ДНК, определяемое по интенсивности радиоактивного излучения, было в 3 раза больше в клетках второй группы, по сравнению с фибробластами первой группы, что обусловлено дополнительным временем воздействия канцерогена.

Рис. 4А, Б и В. Авторадиограмма ДНК-аддуктов, присутствующих в геноме экспериментальных - обработанных АК клеток мышей Hupki, меченных радиоактивным изотопом фосфора 32Р [у-згР]-АТР.

На рисунке буквами обозначены авторадиограммы образцов (А - первая группа экспериментальных клеток - 48 часов инкубации с АК, Б - вторая группа - инкубация с АК 2 раза по 48 часов, В - контрольные клетки). Цифрами отмечены специфические ДНК-аддукты: 1 - 7-(деоксиаденозин-й5-ил) аристолактам II; 2 - 7-(деоксигуанозин-М2-ил)аристолактам I и 3 - 7-(деоксиаденозин-1М6-ил) аристолактам I.

Идентичные аддукты ДНК были обнаружены при исследовании ДНК мышей дикого типа 129Sv, получавших с кормом аристолохиевую кислоту (Mengs U., 1987; Mengs U., Stotzem C.D., 1993), а также в процессе анализа корковой и медуллярной зон почек у пациентов с нефропатией Балканского региона (Grollman А.Р., et al„ 2007). Во всех случаях, в наибольшем количестве присутствовал 7-(деоксиаденозин-М6-ил)аристолактам I. Видимо, с его образованием в наибольшей степени связан мутагенный эффект АК.

Характеристика спонтанных мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9) в контрольных иммортализованных клеточных линиях мышей Hupki

Полученные из контрольных первичных культур фибробластов иммортализованные клеточные линии (ККЛ) были обозначены номерами. Всего было использовано 24 ККЯ от гетерозиготного эмбриона Нирк|Агз/Рго (ККЛ №№ 1-24) и 24 ККЛ, соответственно, от гомозиготного Hupkf ,0/р'° (ККЛ №№ 25-48).

- Мутации в исследуемом участке гена р53 обнаружены в 2 из 24 гетерозиготных ККЛ (8,3 %) и в 3 из 24 гомозиготных ККЛ (12,5%). Таким образом, статистически достоверных различий в частоте спонтанных мутаций, в зависимости от полиморфизма 72-го кодона гена р53, не обнаружено.

Сведения о типах спонтанно возникших мутаций в химерном гене р53 контрольных гетерозиготных Нирк1Аго/рго и гомозиготных НирМр""р'° фибробластов представлены в таблице 3.

Таблица 3

Спонтанно возникшие мутации химерного гена р53 (экзоны 4-9) в контрольных иммортапизованных клеточных линиях фибробластов мышей Нирк!^Я/Рга и НиркР"*™'

1 2 3 4

7 R/P R/P 176 TGC - TAC M ( ) Cyc-> Tyr 79

12 R/P -IP 147 GTT -» GGT M ( ) Val-. Glu 7

32 Р/Р Р/Р 175 CGC - САС M ( ) Arg-» His 1063

37 Р/Р Р/Р 135 TGC -» TGG M ( ) Сy$-> Trp 24

46 Р/Р Р/Р 280 AGA- АСА M ( ) Arg -» Thr 84

1 - полиморфизм 72-го кодона гена р53 первичных фибробластов (R/P - HupkiAr9l=,°; P/P-Hupkif,'apra); 2 - полиморфизм 72-го кодона гена р53 клеточных линий; 3 - количество описанных случаев данной мутации гена р53 у человека (база данных МАИР); 4 -сохранение функциональной активности белка дикого типа мутантным белком (база данных МАИР).

Анализ кодонов, в которых произошла мутация, показал, что все они были уникальными, т.е. не повторялись. Возможно, это связано с низкой частотой спонтанных мутаций. Среди выявленных мутаций одна (в 175-м кодоне) с заменой нуклеотидов CGC на САС относится к числу часто обнаруживаемых у человека. Эта мутация выявлена в гомозиготной КЛ. Замены нуклеотидов и аминокислот в каждом случае были также уникальными и не повторялись. Все это свидетельствует о случайном характере спонтанных мутаций гена р53 (экзоны 4-9) в контрольных КЛ. Следует отметить, что единственным общим признаком всех спонтанных мутаций явилось то, что они относились к типу миссенс-мутаций. Характерно, что и у человека, согласно базе данных МАИР, большинство соматических мутаций гена р53 являются миссенс-мутациями (73%). Данные, представленные в последней колонке таблицы 3, свидетельствуют о том, что ни один из мутантных белков не сохранил активность, свойственную белку дикого типа. У человека также, в большинстве случаев мутаций р53, регистрируется потеря нормальной функциональной активности белка.

Здесь также следует отметить потерю гетерозиготное™ р53 в Ккл 12. Первичные фибробласты данной клеточной линии имели генотип HupkiA^/pr°, а иммортализованная КЛ на пассаже 15 стала гемизигатной Hupki",Cr0, в результате потери Arg аллеля. Делеции

р53, наряду с мутациями, также обнаруживают в опухолях у человека (база данных МАИР).

Таким образом, анализ спонтанного мутагенеза химерного гена р53 показал, что полиморфизм 72-го кодона не влияет на этот процесс.

Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в эмбриональных фибробластах мышей HupkiArgJPm

Полученные из первичных культур фибробластов, инкубированных с аристолохиевой кислотой, иммортализованные экспериментальные клеточные линии (ЭКЛ) были обозначены номерами. Всего было использовано 36 ЭКЛ от гетерозиготного эмбриона HupkiAr8/p,°, в том числе в первой группе, с однократным воздействием АК -18 (NsNs 1-18), во второй группе, с двукратным воздействием АК - также 18 (№№ 19-36). Результаты исследования обнаруженных мутаций представлены в таблице 4.

Таблица А

Индуцированные аристолохиевой кислотой мутации гена р53 (экзоны 4-9) в иммортализованных клеточных линиях фибробластов гетерозиготных мышей

Hupkiw

1 2 3 4

* 2 R/P R/- 273 CGT- TGT M ( ) Arq — Cys 611

*3 R/P -/P 179 CAT-» CGTJ M ( ) His -» Arq 139

*12 R/P R/P 104 CAG-» CTG M ( ) Gin -» Leu 1

"19 R/P R/P 135 TGC - TGG M ( ) Cys -» Trp 24

"19 R/Р R/P 159 GCC- CCC M ( ) Ala — Pro 26

"21 R/P R/P 239 AAC- GAC M ( ) Asn -» Asp 43

"22 R/P R/P 131 AAC — TAC M ( ) Asn -» Tyr 5

"22 R/P R/P 291 AAG-TAG ( ) Lys -> Stop 5 —

"29 R/P R/P 131 AAC- АТС M ( ) Asn -* lie 6

"31 R/P R/P 168 CAC- CAG M ( ) His -» Gin 1

"31 R/P R/P 169 ATG — TTG M ( ) Met -» Leu — —

"32 R/P RA 258 GAA- GAC M ( ) Glu Asp 4

"33 R/P R/P 305 AAG- TAG < ) Lys -• Stop 14 -

1 - полиморфизм 72-го кодона гена р53 первичных фибробластов (Н1Р - НирЮАг9/Рг°); 2 -полиморфизм 72-го кодона гена р53 клеточных линий; 3 - количество описанных случаев данной мутации гена р53 у человека (база данных МАИР); 4 - сохранение функциональной активности белка дикого типа мутантным белком (база данных МАИР). В названии клеточных линий звездочкой отмечено время инкубации с канцерогеном: * -48 часов; ** - 2 раза по 48 часов. Прочерк - нет данных.

Среди экспериментальных клеточных линий гетерозиготного варианта НиркГ'^10, в первой группе было зафиксировано только 3 мутации в 3 из 18 ЭКЛ (16,7%). В то же время, во второй группе отмечено 10 мутаций в 7 из 18 ЭКЛ (38,9%). Три клеточные линии имели сразу по 2 мутации (ЭКЛ 19, ЭКЛ 22 и ЭКЛ 31). Если учитывать отношение

общего количества мутаций к числу изученных ЭКЛ, то различия в частоте мутаций р53 между первой и второй группами будут еще большими: 3/18 (16,7%) и 10/18 (55,6%), то есть в 3,3 раза, и достигнут уровня статистической достоверности, р<0,05. Резкое увеличение количества мутаций гена р53 во второй группе по сравнению с первой объясняется удвоенным временем воздействия на клеточный геном канцерогена АК.

Сравнение общей частоты мутаций в ЭКЛ и ККП гетерозиготных фибробластов показало, что частота мутаций в ЭКЛ первой группы несколько выше, чем в контроле: 3/18 (16,7%) и 2/24 (8,3%), хотя отмеченные различия носят характер тенденции (р>0,05). Во второй группе частота мутаций (10/18; 55,6%) существенно выше, чем в контроле (р<0,05).

При действии АК в гетерозиготных фибробластах отмечен широкий спектр поражаемых мутациями кодонов. Лишь в 2 случаях они совпадали, это касалось кодона 131 в ЭКЛ 22 и ЭКЛ 29. Однако, характер нуклеотидных замен был разным: в первом случае ААС - TAC, во втором - ААС - АТС. Соответственно разным был и тип аминокислотных замен. Среди наиболее часто встречаемых у человека, следует отметить замену нуклеотидов CGT на TGT в кодоне 273, который относится к так называемым «горячим точкам» мутаций гена р53 (ЭКЛ 2). Другая уникальная замена нуклеотида произошла в позиции 169 (ЭКЛ 31). Согласно базе данных МАИР, подобная мутация ни разу не была выявлена в злокачественных новообразованиях у человека. Трансверсии А:Т- Т:А обнаружены в 6 из 13 мутаций (46,2%), в то же время, в контроле подобные мутации не отмечены.

Как и в контрольной группе, большинство мутаций - 11/13 (84,7%) в гетерозиготных ЭКЛ относились к типу миссенс мутаций. Отмечены также две нонсенс мутации, которые привели к образованию стоп-кодона (ЭКЛ 22 и ЭКЛ 33). В 5 случаях замены нуклеотидов гомозиготны, в остальных имели место гетерозиготные варианты.

Сохранение нормальной функциональной активности мутантным белком зафиксировано лишь в 3 КЛ (ЭКЛ 12, ЭКЛ 21 и ЭКЛ 31) из 36 (8,4%).

Потеря гетерозиготности р53 первичных фибробластов в процессе иммортализации произошла в 3 экспериментальных клеточных линиях (ЭКЛ 2, ЭКЛ 3 и ЭКЛ 32). В случаях с ЭКЛ 2 и ЭКЛ 32 был потерян Pro аллель и, в конечном итоге, данные КЛ стали гемизиготными Hupki^-, в то время как в ЭКЛ 3, наоборот, произошла потеря Arg аллеля и клетки к 15-му пассажу стали гемизиготными Hupki-

Характеристика мутаций химерного гена р53 (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой in vitro в эмбриональных фибробластах мышей HupkiPm/Pro

Аналогично экспериментам с гетерозиготными эмбриональными фибробластами, иммортализованные экспериментальные клеточные линии (ЭКЛ) гомозиготных фибробластов, инкубированных с аристолохиевой кислотой, были обозначены номерами.

Всего было использовано 36 ЭКЛ от гомозиготного эмбриона Нирк1р,ол>го, в том числе в первой группе - ЭКЛ №№ 37-54 и во второй - ЭКЛ №№ 55-72. Результаты исследования мутаций представлены в таблице 5.

Таблица 5

Таблица 5. Индуцированные аристолохиевой кислотой мутации гена р53 (экзоны 49) в иммортализованных клеточных линиях фибробластов гомозиготных мышей НиркГ^

1 2

*42 209 АйА-» ТвА ( ) Ага Бйр 12 -

* 46 55 АСТ-» ТСТ М ( ) ТЬг Эег - -

*51 135 ТвС- TGGj м ( ) Суэ - Тгр 24

*53 194 СТТ-* ТТТ М ( ) 1_еи РИе 25

"55 249 АСв-. ТСС М ( ) Агр Тгр 34

"56 249 АйС-. Тйб М ( ) Агд -» Тгр 34

"61 135 ТСС - Твв м ( > СуБ -* Тгр 24

"66 209 АСА-» ТйА ( ) Агд -» вЮр 12 -

"67 164 ААв- ТАв ( ) |_у$ -» Эюр 14 —

"67 213 СОА~ ССА м ( ) Агд — Рго 6

"68 154 6СС- втс м ( ) Иу Уа1 59

"69 245 асе- ссс ( ) А1а А1а 12

1 - количество описанных случаев данной мутации гена р53 у человека (база данных МАИР); 2 - сохранение функциональной активности белка дикого типа мутантным белком (база данных МАИР). В названии клеточных линий звездочкой отмечено количество экспозиций с канцерогеном: * - 48 часов;" - 2 раза по 48 часов. Прочерк - нет данных.

В гомозиготных НиркГга'Рга фибробластах было обнаружено 12 мутаций, в том числе 4 из 18 (22,3%) - в первой группе клеток и 8 из 18 (44,5%) - во второй. Выявленные различия не достигали уровня статистической достоверности (р>0,05). При сравнении с контролем (12,5%), показатели частоты мутаций во второй группе были 3,6 раза выше, хотя это увеличение также носило характер тенденции. Значительный интерес представляет сопоставление данных по частоте мутаций, вызванных АК, среди гетеро - и гомозиготных фибробластов. В обеих линиях, частота мутаций в первой группе была сравнительно низкой: соответственно 3/18 (16,7%) и 4/18 (22,3%) и не зависела от линии мышей. Во второй группе частота индуцированных мутаций среди гетерозиготных фибробластов составила 10/18 (55,6%), а среди гомозигот - 8/18 (44,5%). По литературным данным (РеИтеуег N.. е/ а/., 2006), при инкубации ПКФ гомозиготных мышей НиркЛ0'*'0 с АК в концентрации 50мкМ 48 часов (аналогично с использованной в первой экспериментальной группе в наших опытах) мутации были обнаружены в 6 из 18 КЛ (33,3%), что сравнимо с нашими данными в ПКФ первой группы. Таким образом, и в этой группе существенных различий в данном показателе меяеду гетерозиготными и гомозиготными фибробластами не обнаружено (р>0,05).

При анализе распределения мутаций по отдельным кодонам, в первой группе изменения в каждой линии были уникальными и не повторялись. Во второй группе,

подвергавшейся более продолжительной суммарной инкубации с АК, отмечено только в 2 случаях повторение мутаций в одном и том же кодоне. Это - кодон 249, мутации в котором обнаружены в ЭКЛ 55 и ЗКЛ 56. В целом, среди гомозиготных фибробластов, инкубированных с АК, помимо 249-го кодона, 2 раза поражались: 209-й кодон (ЭКЛ 42 и ЭКЛ 66) и 135-й кодон (ЭКЛ 51 и ЭКЛ 61). Сравнение распределения мутаций в кодонах гомозиготных и гетерозиготных фибробластов, обработанных АК, выявило совпадение только в одном случае - это 135-й кодон, который поражался в ЭКЛ 19 (гетерозиготы), ЭКЛ 51 и ЭКЛ 61(гомозиготы). Следует отметить, что мутация в 135-м кодоне была обнаружена и в одной контрольной клеточной линии гомозиготных фибробластов.

В ПКФ гомозиготных мышей Нирк|АГЗ"*°, инкубированных с АК (РеИтеуег N.. et а/., 2006), спектр поражаемых кодонов ни в одном случае не совпадал с обнаруженными в наших опытах. Таким образом, можно предположить, что поражение того или иного кодона, при воздействии АК, носило случайный характер и не зависело от особенностей полиморфизма 72-го кодона гена р53.

Анализ замен нуклеотидов показал, что среди экспериментальных КЛ Нирк|р,0/рга превалировали трансверсии А:Т - Т:А. Их относительная частота составляла 6/12 (50%), что существенно не отличалось от данных у гетерозиготных фибробластов - 3/13 (48,2%). Сходная относительная частота трансверсий А:Т - Т:А выявлена в КЛ фибробластов мышей Нирк'Л9"*0 (РеИшеуег N.. е? а/., 2006), она составила 4/6 (66,7%). Таким образом, существенных различий в характере замен нуклеотидоэ между различными линиями фибробластов не выявлено. Во всех линиях основным эффектом воздействия АК было возникновение трансверсии А:Т - Т:А. Полиморфизм 72-го кодона не влиял на этот эффект АК.

При оценке типа мутаций, вызываемых АК в гомозиготных НиркГ0"*'0 фибробластах, обнаружено, что в своём большинстве они принадлежали к миссенс мутациям. Их относительная частота составила 8/12 (66,7%), что не отличалось существенно от аналогичного показателя у гетерозиготных фибробластов (11/13: 84,7%) и гомозиготных Нирк1А,3,Аг9 (4/6; 66,7%). Таким образом, независимо от полиморфизма 72-го кодона, воздействие АК приводило преимущественно к миссенс мутациям.

Результатом мутагенного воздействия АК на ПКФ гомозиготных Нирк)Рг0'Рг° явился синтез белков с нарушенной функциональной активностью. Подобный эффект отмечен и в опытах с фибробластами гетерозиготных мышей НиркГ,3/р'°.

В целом, анализ мутагенеза химерного гена р53, вызванного АК, не выявил существенного влияния полиморфизма 72-го кодона на мутагенный эффект. Это позволило нам суммировать данные, полученные на обеих линиях гомозиготных и гетерозиготных мышей. При этом отмечено, что суммарная частота спонтанных мутаций в исследованных КЛ составляет 5/48 (10,5%); частота мутаций, индуцированных однократной инкубацией с АК - 7/36 (19,5%); при двукратной инкубации с АК - 18/36

(50%). Статистический анализ показал, что однократная инкубация с АК приводит лишь к несущественному повышению частоты мутаций по сравнению с частотой в контрольных культурах (р>0,05). В то же время при двукратной инкубации с АК частота мутаций возрастает значительно: по сравнению с контролем - в 4,8 раза (р<0,001), а по сравнению с однократной инкубацией - в 2,6 раза (р<0,005). Вероятно, это можно объяснить тем, что при одноразовом воздействии канцерогена АК, даже несмотря на наличие сформированных специфических аддуктов, при повреждении ДНК «запускается» репарационная система клеток, приводящая к исправлению поломок. В то же время, при повторном, более длительном действии канцерогена (это относится ко второй группе КЛ) механизм репарации не срабатывает, что приводит к значительному возрастанию количества аддуктов в геномной ДНК второй группы (см. рис. 3). Время персистенции аддуктов является ключевым событием мутагенеза.

Также при суммарном анализе обнаружено, что относительная частота миссенс мутаций в обработанных АК гомо- и гетерозиготных КЛ составляет 19/25 (76%). В 12 случаях из 25 (48%) были обнаружены А:Т -» Т:А трансверсии, наиболее часто встречаемый тип нукпеотидных замен гена р53 при воздействии аристолохиевой кислоты на человека (СгоПтап А.Р., е(а/., 2007).

Целесообразно сравнить характер мутаций, обнаруженных нами у мышей Нирв, с выявленными у больных «балканской» нефропатией и раком из уротелия (рис. 5).

Как видно на рис. 5, обнаруженные в культурах фибробластов мышей Нирй замены нуклеотидов в кодонах 131, 179, 209 и 291 также были выявлены при анализе мутаций у 11 больных Балканского региона с почечной патологией. Хотелось бы обратить внимание на кодон 209, в связи с тем, что абсолютно такая же замена нуклеотидов была зафиксирована в эксперименте с АК, проведённом на фибробластах НирИ*8"*8 (РеИтеуег N.. еГ а/., 2006). Таким образом, кодон 209, имеющий нонсенс мутацию, в данном случае может рассматриваться как «горячая точка» воздействия аристолохиевой кислоты на ген р53.

55 104

1 ^ 2 — 3

131 131 135 135 135 154 159 164 168 169 179

- S -

131 144 158 162 179 179

239

194 245

2 09 249 273

209 249 291

213 258 305

6 - - 7 - - 8

209 241 274

251 274

280

280

280

11

282 286 291 291

Рис. 5. Сравнение мутаций гена р53 человека (экзоны 4-9), индуцированных аристолохиевой кислотой в фибробластах мышей Hupkt^" и Hupkf'°^'°, с обнаруженными у больных «балканской» нефропатией и уротепиальным раком.

А - данные о 25 индуцированных мутациях, обнаруженных в гене р53 после воздействия АК на клетки мышей. Б - мутации, выявленные у 11 больных нефропатией и уротелиальным раком (Grollman А.Р., et al., 2007). Жирным наклонным шрифтом отмечены идентичные мутантные кодоны в обоих исследованиях. Подчеркиванием выделены А:Т-Т:А трансверсии. Прямоугольниками изображены экзоны гена р53.

Нами также было установлено, что среди 120 клеточных линий Hupki обоих генотипов, 9 имели делеции различных экзонов p19-ARF (4 линии - в контрольных и 5 - в экспериментальных группах, что составляло 8% и 7%, соответственно). Это указывает на отсутствие прямого влияния аристолохиевой кислоты на процесс потери экзонов гена P19-ARF.

Известно что, белок р53 дикого типа имеет достаточно короткую «продолжительность жизни», ввиду быстрой протеолитической деградации (Piette J., ei ai, 1997; Freedman D.A., et al., 1999; Guimaraes D.P., and Hainaut P., 2002). Однако, наличие миссенс мутаций в большинстве случаев меняет функциональные свойства белка, приводя к накоплению его в клетке. Для анализа экспрессии генов р53 и p19-ARF, посредством определения присутствия выше указанных белков, проводили иммуноблотинг. Выявлено, что мутантные формы р53 имеют четко выраженные специфические полосы. Отмечено, что в

КЛ без мутаций р53, ген р19-АЯР не экслрессировался, В всех случаях возникновения

мутаций р53 отмечалась повышенная экспрессия р19-А1ЧР.

Выводы

1. Впервые получены гуманизированные по гену р53 (экзоны 4-9) и различающиеся по полиморфизму 72-го кодона линии мышей (гомозиготная НиркГго;р,'г и гетерозиготная НиркЛ^'"), первичные культуры эмбриональных фибробластов НирМ двух разных генотипов и иммортализованные клеточные линии. Мыши Нирк1 являются перспективной моделью для изучения функциональной активности химерного гена р53 при спонтанном или индуцированном мутагенезе.

2. Культуры эмбриональных фибробластов обеих линий мышей Нирк'| морфологически и по характеру роста не отличались друг от друга. Обработка канцерогеном аристолохиевой кислотой культур фибробластов двух разных генотипов (Нирк|рга,,р'° и НиркГ"3^™) в одинаковой степени ускоряла наступление фазы клеточного старения, сопровождавшегося остановкой пролиферации, и увеличивала ее продолжительность.

3. После воздействия аристолохиевой кислоты на культуры эмбриональных фибробластов, в их геноме были обнаружены специфические аддукты ДНК, соответствующие аддуктам, выявленным у человека при экспозиции к этому канцерогену. Количество ДНК-аддуктов возрастало с увеличением времени инкубации культур с канцерогеном.

4. Частота спонтанных мутаций гена 53 (экзоны 4-9) в иммортапизованных клеточных линиях, образовавшихся из контрольных культур гетерозиготных и гомозиготных фибробластов, составила соответственно 8,3% (2/24) и 12,5% (3/24) по отношению к количеству клеточных линий.

5. После инкубации культур гетерозиготных и гомозиготных фибробластов с аристолохиевой кислотой (50 мкМ в течение 48 час.) частота мутаций в образовавшихся из этих культур клеточных линиях составила соответственно 16,7% (3/18) и 22,3% (4/18). При удвоении времени воздействия аристолохиевой кислоты, частота мутаций в экспериментальных клеточных линиях значительно возрастала, составив соответственно 55,6% (10/18) и 44,5% (8/18). Таким образом, различия в полиморфизме 72-го кодона гена р53 у двух линий мышей не оказывали существенного влияния на мутагенный эффект аристолохиевой кислоты.

6. Миссенс мутации гена 53 представляли наибольшую группу (76%) от общего числа обнаруженных в иммортализованных клеточных линиях. После воздействия аристолохиевой кислоты в 48% клеточных линий были обнаружены трансверсии А:Т -Т:А. Выявленные мутации гена р53 в значительной степени соответствовали типам

мутаций, обнаруженных у больных «балканской» нефропатией и опухолями из уротелия, связанными со случайным употреблением в пищу аристолохиевой кислоты. 7. Делеции экзонов гена р19-АИР были обнаружены в 8% контрольных и а 7% экспериментальных клеточных линий, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния на этот процесс аристолохиевой кислоты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Nedelko Т. Further studies with a cell immortalization assay to investigate the mutation signature of aristolochic acid in human p53 sequences. /Feldmeyer N., Schmeiser H.H., Muehlbauer K.R., Belharazem D., Knyazev Y., Nedelko Т., Hollstein M. IIMutation Research. - 2006. - Vol.608. - P.163-168.

2. Nedelko T. Mutagenesis of human p53 tumour suppressor gene sequences in embryonic fibroblast of genetically engineered mice. /Liu Z., Belharazem D., Muehlabauer K.R., Nedelko Т., Knyazev Y., Hollstein M. //Genetic Engineering, Principles and Methods. - 2007. - Vol. 28. -P. 45-54.

3. Nedelko T. Common tumour p53 mutations in immortalized cells from Hupki mice heterozygous at codon 72. /Reinbold M., Luo J.L., Nedelko T„ Jerchow В., Murphy M.E., Whibley C., Wei Q., Hollstein M. //Oncogene. 2008. Vol. 27. - P. 2788-2794.

4. Nedelko Т. TP53 mutation signature supports involvement of aristolochic acid in the etiology of endemic nephropathy-associated tumours. / Nedelko Т., Arlt V.M., Philips D.H., Weninger A., Hollstein M. II Int. Journal of Cancer. 2009 Feb 15; 124(4). - P. 987-990.

Благодарности

Приношу мою самую искреннюю благодарность за помощь при выполнении данной работы научному руководителю доктору медицинских наук Марку Абрамовичу Забежинскому, а также научному консультанту доктору медицинских наук Петру Григорьевичу Князеву. Также выражаю особую благодарность руководителю департамента «Генетические изменения при канцерогенезе» профессору, доктору Монике Хольилгейн за возможность осуществить данное исследование и финансирование проекта, а также членам моей семьи за психологическую поддержку.

Актуальность проблемы

Вот уже более 25 лет ген р53 и кодируемый им ядерный белок р53 являются предметом исследования многих лабораторий во всем мире. Белок р53 играет важную роль в регуляции клеточного цикла и апоптоза (Сейц И.Ф., Князев П.Г., 1986; Анисимов В.Н., 1997, Чумаков П.М., 2000; Копнин Б.П., 2000). Ген р53 представляет собой одну из основных мишеней действия канцерогенов окружающей среды. Изучение эффекта канцерогенов на структуру гена и соответствующего белка важно как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для оценки индивидуального канцерогенного риска при молекулярно-эпидемиологических исследованиях и разработки соответствующих профилактических мероприятий (Напалков Н.П., 1989; Забежинский М.А. и др., 2004).

Исследования гена р53 на лабораторных животных in vivo и in vitro не раскрывают полностью роль р53 и его белка в развитии заболеваний человека, включая рак, поскольку известно, что даже незначительные различия в их первичной последовательности нуклеотидов генов и, соответственно, белков приводят к существенным расхождениям на функциональном уровне (Bargmann C.I., et al., 1986). В этой связи актуальной задачей является создание моделей трансгенных животных (например, мышей) с гуманизированными формами белков.

Возможности генной инженерии позволили получить линию гуманизированных мышей Hupki (Human-p53-knock-in), в геном которой был встроен участок гена р53 человека, представленный центральным доменом (экзоны 5-8), а также рядом расположенными экзонами 4 и 9 (Luo J.-L., et al., 2001). Этот участок вызывает особый интерес исследователей в связи с тем, что наибольшее количество мутаций (более 80%), обнаруженных в гене р53 опухолей человека, сосредоточено именно в указанном домене (Hollstein М„ et al., 1991; Levine A.J., etal., 1991; Harris C.C., and Hollstein M., 1993). Более того, в 4-м экзоне выявлен уникальный полиморфизм 72-го кодона, который определяет, вследствие нуклеотидной замены гуанина на цитозин, наличие аминокислоты аргинина или пролина в молекуле белка (Murphy М.Е., 2006). Взгляды ученых на данный полиморфизм не однозначны и сводятся к следующему предположению: если 72-м кодоном кодируется аргинин, это может способствовать ускорению развития апоптоза в клетке, а наличие пролина будет сопровождаться задержкой клеточного цикла (Pim D., and Banks L., 2004; Murphy M.E., 2006). Для изучения этой проблемы необходимо получение соответствующих линий гуманизированных мышей Hupki.

В лаборатории Немецкого Центра Раковых Исследований (DKFZ, Heidelberg) была получена линия гомозиготных мышей Нирк'Л9^ (Luo J.-L., et al., 2001). Актуальной задачей остаётся получение гомозиготных линий HupkiPra/Pro и гетерозиготных HupkiAr9/Pro. 5 позволит изучать механизмы влияния канцерогенов окружающей среды на ген р53 и исследовать последующую цепь событий, ведущих к развитию рака у человека.

Одним из недавно выявленных канцерогенов для человека является аристолохиевая кислота (АК), содержащаяся в травянистом растении Аристолохии (или Кирказоне) и вызывающая опухоли у лабораторных грызунов (Mengs U., et al., 1982). У людей, лечившихся китайскими травами, содержащими АК, возникали карциномы из уротелия (Notrier J., et al., 2000), в связи с чем подобные медицинские средства, содержащие АК, отнесены экспертами Международного агентства по изучению рака (МАИР) к группе 1 -безусловно доказанных канцерогенов для человека (IARC Monographs, 2002). Следует отметить, что АК, её адцукгы ДНК и вызванные АК мутации р53, в том числе, трансверсии А:Т -> Т:А обнаруживали у лиц с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия, наблюдаемыми на территории Балканского полуострова и, предположительно, вызванными употреблением в пищу аристолохии, произрастающей в виде сорняка среди злаков (Grollman А.Р., et al., 2007). На мышах HupkiAr9'Ar9 уже были проведены исследования мутагенеза при действии АК (Feldmeyer N., et al., 2006), однако, актуальным является продолжение этих работ с изучением мутагенного эффекта АК в клетках мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro.

При изучении мутагенеза гена р53 целесообразно параллельно проанализировать изменения гена p19-ARF, который связан с р53 и Mdm2 сигнальным путем и является маркером функциональной активности р53, в случаях мутаций р53 (Haupt Y., et al, 1997; Kubbutat M.H., et al., 1997). Известно, что канцерогены могут вызывать делеции p19-ARF (Shapless N.E., and de Pinho R.A., 2005). Поскольку генные мутации ведут к изменению свойств белков - актуально также изучение белков р53 и p19-ARF при действии канцерогенов, включая АК.

Изучению описанных выше проблем и посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы являлось изучение мутагенеза химерного гена р53 гуманизированных мышей Hupki, индуцированного канцерогеном окружающей среды аристолохиевой кислотой, и оценка влияния полиморфизма 72-го кодона на частоту возникновения и спектр мутаций р53. Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) создать гомозиготную HupkiPro/Pro и гетерозиготную HupkiArg/Pro линии мышей, различающиеся по полиморфизму 72-го кодона;

2) получить первичные культуры фибробластов (ПКФ) эмбрионов мышей HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro и на их основе - иммортализованные клеточные линии (КЛ), пригодные для изучения мутагенеза химерного гена р53;

3) после воздействия АК на ПКФ, исследовать образование специфических аддукгов ДНК;

4) в контрольных КЛ (ККЛ) и экспериментальных КЛ (ЭКЛ), полученных из ПКФ, обработанных АК, провести сравнительный анализ мутаций химерного гена р53 с 4-го по 9-й экзон включительно;

5) оценить влияние полиморфизма 72-го кодона химерного гена р53 на частоту и спектр мутаций в ЭКЛ и ККЛ;

6) установить наличие или отсутствие делеций гена p19-ARF в ЭКЛ и ККЛ;

7) исследовать присутствие белков р53 и p19-ARF в ККЛ и ЭКЛ мышей Hupki.

Научная новизна работы

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые были созданы гомозиготная (HupkiPro/Pro) и гетерозиготная (HupkiArg/Pro) линии мышей по аллелям химерного гена р53. Получены первичные культуры фибробластов эмбрионов мышей Hupki и иммортализованные клеточные линии, пригодные для изучения мутагенеза при действии канцерогенов, в частности, аристолохиевой кислоты. В этих экспериментах установлено, что АК индуцирует мутации, близкие по спектру (трансверсии А:Т —> Т:А) к ранее обнаруженные у людей с эндемической нефропатией и опухолями из уротелия.

Практическая значимость полученных результатов

Создана гуманизированная по гену р53 модель мышей Hupki, пригодная для выявления особенностей мутагенеза при действии канцерогенов окружающей среды и использования полученных результатов в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, связанных с выявлением групп повышенного онкологического риска. Модель гуманизированных мышей Hupki позволяет проводить тестирование различных факторов на мутагенную и канцерогенную активность, результаты которого с большей степенью надежности можно будет экстраполировать на человека.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые получены гомозиготная HupkiPro/Pro и гетерозиготная HupkiAr9/Pro линии мышей, первичные культуры эмбриональных фибробластов Hupki двух разных генотипов и иммортализованные клеточные линии.

2. При воздействии аристолохиевой кислоты на культуры эмбриональных фибробластов, в их геноме были обнаружены специфические ДНК-аддукты, соответствующие выявленным ранее у людей, употреблявших АК. Количество аддуктов ДНК возрастало с увеличением времени инкубации культур с АК.

3. После инкубации культур клеток Hupki с АК, в клеточных линиях были выявлены мутации гена р53, в значительной степени соответствующие типам мутаций, обнаруженных у больных «балканской» нефропатией и опухолями из уротелия, связанными со случайным употреблением в пищу АК. Частота мутаций возрастала с увеличением времени экспозиции к АК.

4. Полиморфизм 72-го кодона гена р53 не оказывал существенного влияния на мутагенный эффект АК.

Выводы

1. Впервые получены гуманизированные по гену р53 (экзоны 4-9) и различающиеся по полиморфизму 72-го кодона линии мышей (гомозиготная HupkiPro/Pro и гетерозиготная HupkiArg/Pro), первичные культуры эмбриональных фибробластов Hupki двух разных генотипов и иммортализованные клеточные линии. Мыши Hupki являются перспективной моделью для изучения функциональной активности химерного гена р53 при спонтанном или индуцированном мутагенезе.

2. Культуры эмбриональных фибробластов обеих линий мышей Hupki морфологически и по характеру роста не отличались друг от друга. Обработка канцерогеном аристолохиевой кислотой культур фибробластов двух разных генотипов (HupkiPro/Pro и HupkiArg/Pro) в одинаковой степени ускоряла наступление фазы клеточного старения, сопровождавшегося остановкой пролиферации, и увеличивала ее продолжительность.

3. После воздействия аристолохиевой кислоты на культуры эмбриональных фибробластов, в их геноме были обнаружены специфические аддукты ДНК, соответствующие аддуктам, выявленным у человека при экспозиции к этому канцерогену. Количество ДНК-аддуктов возрастало с увеличением времени инкубации культур с канцерогеном.

4. Частота спонтанных мутаций гена 53 (экзоны 4-9) в иммортализованных клеточных линиях, образовавшихся из контрольных культур гетерозиготных и гомозиготных фибробластов, составила соответственно 8,3% (2/24) и 12,5% (3/24) по отношению к количеству клеточных линий.

5. После инкубации культур гетерозиготных и гомозиготных фибробластов с аристолохиевой кислотой (50 мкМ в течение 48 час.) частота мутаций в образовавшихся из этих культур клеточных линиях составила соответственно 16,7% (3/18) и 22,3% (4/18). При удвоении времени воздействия аристолохиевой кислоты, частота мутаций в экспериментальных клеточных линиях значительно возрастала, составив соответственно 55,6% (10/18) и 44,5% (8/18). Таким образом, различия в полиморфизме 72-го кодона гена р53 у двух линий мышей не оказывали существенного влияния на мутагенный эффект аристолохиевой кислоты.

6. Миссенс мутации гена 53 представляли наибольшую группу (76%) от общего числа обнаруженных в иммортализованных клеточных линиях. После воздействия аристолохиевой кислоты в 48% клеточных линий были обнаружены трансверсии А:Т -Т:А. Выявленные мутации гена р53 в значительной степени соответствовали типам мутаций, обнаруженных у больных «балканской» нефропатией и опухолями из уротелия, связанными со случайным употреблением в пищу аристолохиевой кислоты.

7. Делеции экзонов гена p19-ARF были обнаружены в 8% контрольных и в 7% экспериментальных клеточных линий, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния на этот процесс аристолохиевой кислоты.