Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Исследование механизмов действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при активации эндотоксинами

На правах рукописи

Винокуров Максим Григорьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА янооовастея сАРяимттш. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ И АПОПТОЗ ФАГОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АКТИВАЦИИ ЭНДОТОКСИНАМИ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

^^оьвв

Москва 2007

003159668

Работа выполнена в лаборатории экстремальных состояний НИЦ ГОУ ММА им И М Сеченова Росздрава и в лаборатории регуляции апопгоза ИБК РАН

Научный консультант:

академик РАМН

доктор медицинских наук, профессор Сергей Витальевич ГРАЧЕВ

Официальные оппоненты.

Чл -корр РАМН

доктор медицинских наук, профессор Геннадий Васильевич ПОРЯДИЛ Чл -корр РАМН

доктор медицинских наук, профессор Виталий Кузьмич РЕШЕТНЯК доктор биологических наук, профессор Юрий Владимирович АРХИПЕНКО

Ведущая организация

Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН

Защита состоится «#7 » 2007 г в » часов на заседании

Диссертационного совета Д 212 203/06 в Российском Университете дружбы народов по адресу

117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 8, медицинский факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского Университета дружбы народов по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д 6

Автореферат разослан » 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Галина Александровна ДРОЗДОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Эндотоксиновый шок является ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе, в патогенезе которого ключевая роль принадлежит эндотоксинам [Rietschel et al, 1994] В США [Angus et al, 2001] и в странах Европы [Riederman et al, 2003] ежегодно более чем у 500000 пациентов развивается сепсис, причём количество подтвержденных случаев растет на -1,5% в год, несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению Легальность при сепсисе (даже в условиях комплексной терапии) варьирует в пределах от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 40-80% [Bone, 1991, Martin et al, 2003]

Попадая в кровоток, эндотоксины (несекретируемые липополисахариды (LPS)) взаимодействуют с миелоидными клетками - нейтрофилами и моноцитами, играющими важную роль в патогенезе сепсиса Установлено, что в патогенезе сепсиса ключевую роль играет активация этих клеток [Ulmer et al, 2002, Weigand et al, 2004] и увеличение их числа Активация клеток-мишеней эндотоксинами вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием Высвободившиеся циркулирующие свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что в конечном итоге приводит к развитию эндотоксинового шока [Rietschel et al, 1996]

Результаты исследования механизмов действия эндотоксинов нашли отражение в развитии терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов и заканчивая вмешательством в механизмы нарушения гемостаза Современная терапия включает ингибирование синтеза простагландинов, блокирование медиаторов воспаления, использование кортикостероидов и ингибиторов коагуляции [Пак, 2003] Следует, однако, отметить, что большинство клинических приемов, направленных на блокаду специфических провоспалительных медиаторов, а также использование растворимых рецепторов для связывания цитокинов, оказались безуспешными [Riedermann et al, 2003, Van Amersfoort et al, 2003]

Поскольку клетки врожденного иммунитета в ответ на эндотоксины экспрессируют специфические для них рецепторы, в настоящее время пытаются для лечения эндотоксинового шока использовать вещества, способные конкурировать с

эндотоксинами за рецепторы к ним В связи с этим в данной работе в качестве антагониста эндотоксинов использовался липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG (LPS/«, caps ) Ранее для LPS из Rhodobacter capsulatus В10 была показана способность защитного действия от некоторых эффектов эндотоксинов на мышах линии С57/В16 - от ингибирующего действия эндотоксинов на ферментативную активность, связанную с системой цитохрома Р450, и на нейтрофилах человека - по подавлению Са+2-ответа, индуцируемого различными эндотоксинами [Грачев и др , 1998, Асташкин и др , 1999]

Помимо воздействия на функциональную активность фагоцитов крови, эндотоксины изменяют регуляцию апоптоза этих клеток Эндотоксины увеличивают время жизни нейтрофилов, ингибируя их апоптоз, и нарушают процесс клиренса этих клеток из тканей, что приводит к усилению повреждения тканей при воспалении [Keel et al, 1997, Jimenez et al, 1997, Sheth et al, 2001, Marshall et al, 2007] В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда заболеваний, в том числе сепсиса [Oberholzer et al, 2001, Perl et al, 2006], однако число работ, посвященных направленной модуляции апоптоза нейтрофилов при сепсисе, невелико [Oberholzer et al, 2001]

В литературе описаны различные механизмы активации апоптоза нейтрофилов Установлено, что ключевая роль в его активации принадлежит суперсемейству TNF-альфа рецепторов, в том числе и Fas-рецептору [Маянский и др , 2000, Hanna et al, 2005] Выявлено, что индукция апоптоза нейтрофилов под действием Fas-лиганда снижает экстравазацию нейтрофилов и повреждение тканей при воспалении [Suzuki et al, 2006] Тримеризация Fas-рецептора, помимо действия Fas-лиганда и анти-Fas моноклональных антител (энти-Fas AT), может быть вызвана действием ультрафиолетового излучения диапазона С (УФС) [Rehemtulla et al, 1997], являющегося индуктором апоптоза в некоторых типах клеток [Martin et al, 1995, Новожилова и др , 1996, Li et al, 2002, Takasawa et al, 2005]

Работы по исследованию действия эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов проводятся в основном с использованием липополисахаридов S-хемотипа, характерного для большинства клинических изолятов Е coli [Hemnchs et al, 1998] И хотя известно, что структура эндотоксинов влияет на патогенетические механизмы сепсиса, влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена)

липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше [Feist et al, 1989, Lentschat et al, 1999, Loppnow et al, 1989] по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А [Muller-Loemues et al, 1998] Число работ, посвященных выяснению влияния хемотипа эндотоксинов на активацию нейтрофилов, невелико Отсутствуют работы, касающиеся изучения влияния хемотипа эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов

Все вышеизложенное обусловило необходимость проведения экспериментов, направленных на выявление возможного модулирующего действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и ультрафиолетового излучения на функционирование фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры Полученные новые данные позволят расширить понимание закономерностей и особенностей функционирования миелоидных клеток при действии липополисахаридов разной структуры и разработать подходы для направленной коррекции функционального состояния клеток врожденного иммунитета периферической крови, вызванного действием эндотоксинов

Цель и задачи диссертационного исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании механизмов действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов

Задачи исследования

1 Исследовать действие LPS Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы миелоидных клеток при действии эндотоксинов, в том числе на

1) адгезионные свойства нейтрофилов,

2) генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами,

3) поглощение нейтрофилами объектов фагоцитоза.

2 Исследовать влияние LPS Rhodobacter capsulatus PG на регуляцию апоптоза фагоцитов при действии эндотоксинов

3 Исследовать защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG от эффектов, вызываемых разными хемотипами эндотоксинов

4 Исследовать взаимодействие LPS разной структуры с рецепторами миелоидных клеток, входящими в рецепторный комплекс эндотоксинов

5 Исследовать влияние Fas- и ультрафиолет С-опосредованного апоптоза на клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов

Научная новизна исследования Значительная часть результатов, приведенных в данной работе, носит приоритетный характер В работе впервые проведено систематическое исследование действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG (LPSS6rapS) на функциональные ответы миелоидных клеток периферической крови человека при действии эндотоксинов разной структуры Показано, что LPSКь.сар! снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии Рг-интегринов нейтрофилов

В проведенных экспериментах установлена способность LPSiAia/w снижать эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза нейтрофилов

Показано, что при действии LPSR(,rap.y происходит подавление продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и моноцитами, индуцированное эндотоксинами LPS№rapj ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами различных объектов фагоцитоза При этом у нейтрофилов, не активированных эндотоксином, не происходит увеличения фагоцитарной активности

Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин Установлено, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации этих клеток

Проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина Е coli (S-, Ra-, Rc- и Re-) на продукцию АФК и апоптоз нейтрофилов Показано, что возрастание величины продукции АФК нейтрофилами в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS) зависит от длины полисахаридной цепи эндотоксина и максимально для S- хемотипа исследованных эндотоксинов С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов Показано, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG одинаково снижает активацию нейтрофилов при действии эндотоксинов независимо от их хемотипа

Исследование механизмов действия LPS® caps на фагоциты крови при их активации эндотоксинами показало, что защитные эффекты липополисахарнда

Rhodobacter capsulants PG связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы

При сравнительном изучении эффективности задержки эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов при действии индукторов апоптоза (УФС и анти-Fas AT) установлена ббльшая эффективность ультрафиолетового излучения

Практическая значимость работы

1 Результаты работы указывают на то, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG не только не активирует фагоциты крови человека в широком диапазоне исследованных концентраций, но и проявляет свойства антагониста эндотоксинов различных хемотипов, блокируя связывание эндотоксинов со специфическими рецепторами исследованных клеток-мишеней

2 Оценка функциональной активности клеток врожденного иммунитета использованным в работе комплексом методов может быть применена для рекомендаций по выбору восстановительной терапии сепсиса.

3 LPSm,.c1¥1î может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока

4 Полученные в результате проведенных исследований данные позволяют рекомендовать WSRb,capS в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов

5 Ультрафиолетовое излучение диапазона С снижает время жизни активированных эндотоксином нейтрофилов, активируя их апоптоз

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG обладает способностью блокировать эндотоксин-индуцированные функциональные ответы фагоцитов периферической крови человека при последующем действии эндотоксинов

2 Хемотип эндотоксина влияет на характер ингибирования апоптоза и продукцию активных форм кислорода нейтрофилами

3 Липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG подавляет эндотоксин-индуцированную задержку апоптоза миелоидных клеток человека

4 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает эндотоксин-индуцируемую активацию миалоидных клеток по механизму взаимодействия со специфическими рецепторами эндотоксинов клеток-мишеней

5 Ультрафиолетовое излучение диапазона С более эффективно, чем анти-Fas моноклинальные антитела, снижает зндотшссин-индуцированное иншбирование апоптоза нейтрофилов.

Внедрение результатов в практику. Результаты проведенной работы дополняют представления о механизмах взаимодействия эндотоксинов разной структуры и их антагонистов с клетками врожденного иммунитета, а также о механизмах защиты организма на клеточном уровне Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании раздела о патогенезе сепсиса магистрантам Пущинского ГУ, а также при выполнении магистерских и кандидатских диссертаций Полученные результаты применяются также в отделении кардиологии Больницы Пущинского научного центра РАН при проведении терапии с использованием аутотрансфузии облученной ультрафиолетом крови

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции "Здоровье, профилактика и эядоэкологическая реабилитация Новые медицинские технологии" (Пущино, 1998), III открытой городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1998), конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, 2000), Международном симпозиуме "Biological motility new trends in research" (Pushchino,

2001), II Всероссийском симпозиуме по кардиологии (Москва, 2001), конференции "От современной фундаментальной науки к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001), XIV зимней международной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002), 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино,

2002), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2003), Международном семинаре «Экология и здоровье, экологическая медицина Управление качеством жизни» (Москва, 2003), конференции "Инфекционные и паразитарные болезни в

современном обществе" (Москва, 2003), Международном симпозиуме «Biological motility» (Pushchmo, 2004), I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2004), конференции «Фундаментальные науки -медицине Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), конференции «Фундаментальные науки - медицине Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 научные работы, из них 29 в рецензируемых журналах

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 435 источников, из которых 23 - отечественных авторов Диссертационная работа иллюстрирована 3 таблицами и 45 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовались нейтрофилы и моноциты, выделенные из крови здоровых доноров

В работе исследовали липополисахарид, полученный из фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter capsulatus PG (ВКМ В-2381Д) из Российской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, относящийся к a-подклассу Proteobacteria [Wiese et al, 1998]

В работе были использованы Re-LPS Е coli JM103, Rc-LPS Е coli J5, Ra-LPS E coli EH100, относящиеся к R-хемотипу бактерий, LPS Е coli 055 В5, относящийся к S-хемотипу ("Sigma") и LPS Salmonella typhimurium, относящийся к S-хемотипу ("Sigma") Re-LPS Е coli JM103 был изолирован из бактерий методом Галанос [Galanos et al, 1969] экстракцией смесью фенол/хлороформ/петролейный эфир Препараты Re-LPS были проверены на содержание белков и нуклеиновых кислот по поглощению при 260 нм и 280 нм [Thome et al, 1978]

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров с помощью метода дифференциального центрифугирования на 2-х слойном градиенте фиколла-верографина (1,119 и 1,077)

Моноциты выделяли по методике [Almeida et al, 2000] центрифугированием мононуклеарной фракции (полученной на градиенте фиколла-верографина плотностью 1,077 при выделении нейтрофилов) на градиенте перколла плотностью 1,064 Чистоту выделенных моноцитов контролировали с помощью проточной цитофлуориметрии, регистрируя С014-положительные клетки [Heinzelmann et al, 1998], а также с помощью светового микроскопа

Жизнеспособность нейтрофилов и моноцитов контролировали методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентного зонда иодида пропидия (PI, 30 мкМ) путем измерения доли клеток, непроницаемых для PI от общего количества клеток (в присутствии 40 мкг/мл дигнтонина) [Afanasyev et al, 1993]

Для исследования апоптоза выделенные нейтрофилы (10б кл/мл) культивировали в среде (КС), содержащей RPMI-1640, 1% L-глутамина, 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% термоивактивированной эмбриональной сыворотки теленка ("Sigma", США) при 37°С в атмосфере с 5 % С02 в течение 14 часов

Адгезию нейтрофилов проводили в 96-ти луночных плоскодонных, планшетах (Nunc), покрытых фибриногеном (Shen et al, 1999), в присутствии 10% аутологической плазмы или 10% эмбриональной телячьей сыворотки В опытную лунку (200 мкл) вносили 0,2х106 нейтрофилов Величину адгезии определяли по количеству прилипших нейтрофилов и выражали в процентах (за 100% принимали максимальную адгезию) Жизнеспособность клеток во всех экспериментах по адгезии составляла 95-98% и соответствовала жизнеспособности контрольных клеток

Величину адгезии определяли, регистрируя количество неприлипших клеток (методом проточной цитометрии с использованием флуоресцентно-меченых латексов известной концентрации), а также регистрируя количество прилипших клеток Для этого прилипшие клетки лизировали 1 % холатом натрия и определяли их количество по содержанию общего белка по методу Лоури [Lowiy et al, 1951], используя в качестве стандарта альбумин и лизат нейтрофилов в 1% холате натрия

Кинетику образования АФК нейтрофилами и моноцитами определяли хемшпоминесцентным методом [Владимиров, Шерстнев, 1989] (с использованием

люминола) в среде Хенкса, содержащей ионы Са2+ и Mg2+, 2% аутологической сьгаоротки В качестве активатора продукции АФК нейтрофилами (0,2х106 клеток/мл) и моноцитами (0,1x10е клеток/мл) использовали 1 мкМ N-формил-метионил-лейцил-фенилаланина (fMLP), перед добавлением которого клетки инкубировали 25 мин при 37°С (с и без добавления липополисахарида) Суммарную продукцию АФК рассчитывали как площадь под кривой зависимости интенсивности хемилюминесценции от времени Регистрацию хемилюминесценции осуществляли на люминометре 1250 LKB (Швеция) при 37°С

Образование АФК в нейтрофилах регистрировали также методом проточной цитофлуориметрии с использованием флуоресцентного зонда дигидрородамина 123 (1 мкМ) [Rothe et al, 1991]

Процент апоптозных клеток определяли методами проточной цитометрии с использованием флуоресцентного зонда Hoechst-33258 После окончания культивирования клетки фиксировали в 70% этаноле и хранили до регистрации при -20°С Фиксированные клетки окрашивали 1 мкг/мл флуоресцентного зонда Hoechst-33258 [Afanasyev et al, 1993] Для регистрации апоптоза использовали Annexm V -FITC [Van Engeland et al, 1996]

Для изучения уровня экспрессии клеточных рецепторов CDllb/CD18, CD95, CD 14 на поверхности нейтрофилов и моноцитов применяли метод проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) Для регистрации экспрессии CD95 использовали вторичные козьи антитела, коньюгированные с R-фикоэритрином (Caltag, США)

Облучение ультрафиолетовым светом нейтрофилов проводили с использованием аппарата "Изольда" МФ-73М с бактерицидной лампой ДРБ-8 мощностью 6 Вт Дозу облучения клеток регулировали, изменяя время экспозиции при постоянном расстоянии от окна прибора Для дозиметрии использовали приборы «ULX-3W» и «Аргус-0б» Клетки облучали в фосфатном буфере (рН 7,4) в силиконизированной стеклянной посуде

Фагоцитарную активность нейтрофилов регистрировали на флуоресцентном микроскопе «Люмам» (JIOMO, Россия) В качестве объекта фагоцитоза использовали FITC-меченые пекарские дрожжи [Zhang, 2003] и FITC-меченые, предварительно фиксированные, эритроциты барана [Винокуров и др, 1999] При приготовлении

объектов фагоцитоза соотношение FITC/объект фагоцитоза контролировали с использованием спектрофотометра "Specord М40" ("Carl Zeiss", Германия) и проточного цитометра Для регистрации флуоресценции FITC использовали светофильтры "Chroma" (США) Подсчет фагоцитированных пекарских дрожжей и эритроцитов вели в 1% растворе трипанового синего для тушения экстраклеточной флуоресценции FITC и для контроля жизнеспособности нейтрофилов после фагоцитоза

Действие ингибиторов Перед добавлением липополисахаридов и действием УФС нейтрофилы инкубировали с ингибиторами PD98059, SB203580, Wortmanniij, LY294002 в течение 30 мин

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ "Statgraphics" Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния структуры LPS на функциональные свойства клеток-мишеней привело к получению липополисахаридов (имеющих различия в структуре липида А), обладающих различной биологической активностью [Christian, Ulrich, 2002] Однако механизмы взаимодействия этих соединений с клеточными рецепторами, а также их влияние на функционирование клеток-мишеней в настоящее время изучены недостаточно

В представленной работе проведены исследования действия эндотоксинов разной структуры и липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на активацию и реакции нейтрофилов и моноцитов, которые реализуются в организме при развитии эндотоксинового шока В работе также исследовано действие индукторов апоптоза на апоптоз нейтрофилов, активированных эндотоксином

1. Исследование действия LPS Rhodobacter capsulatus PG на

функциональные ответы миелоидных клеток при действии эндотоксинов

1 1 Изучение действия LPS разной структуры на адгезионные свойства нейтрофилов

Бактериальные липополисахариды вызывают в нейтрофилах разнообразные

ответы, в том числе повышение уровня рецепторов [Van Amersfoort, 2003], увеличение адгезии [Condliffe et а!., 1999]. Известно, что под действием эндотоксинов происходит увеличение экспрессии ßr-интегринов в мембране нейтрофилов [Lynn et al., 1991]. В данной работе эксперименты по адгезии нейтрофилов к поверхности были проведены в планшетах, покрытых фибриногеном, поскольку связывание нейтрофилов с фибриногеном реализуется через CD 1 lb-рецепторы нейтрофилов [Ugarova, Yakubenko, 2001]. Адгезия нейтрофилов при культивировании в течение 60120 мин практически не изменялась.

Инкубирование культивируемых нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл LPS Salmonella typhimurium (LPSs.^.) (рис. 1, 4) и 500 нг/мл LPSs (рис. 1, б) приводила к дозозависимому увеличению величины адгезии этих клеток при увеличении концентрации LPSj.,^. Адгезия нейтрофилов при действии LPS^^«, (рис. 1, /) была значительно меньше, чем адгезия в присутствии LPSj.,^, и близка к контролю (рис. 1, 2). Предварительное культивирование нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл

6

Рис. 1. Влияние различных LPS на адгезионные свойства нейтрофилов человека. 1, 3, 5 - 100 нг/мл LPSWnvJ; 4 - 100 нг/мл LPSs. wk\ 6 -500 нг/мл LPSj №jt. 2 - контроль, 3 и 5 - последовательное инкубирование нейтрофилов с LPStfiifap,. и с 100 нг/мл (i) и 500 нг/мл (J) LPSj. .

äf su ■

5 60

at

■? 40

20 О

S

'■ I * ±Щ i

Ii I I

LPSjöfajij, (60 мин) значительно снижало величину адгезии нейтрофилов при последующем добавлении и культивировании (60 мин) с LPSj. прк в концентрациях 100 нг/мл (рис. 1, 3) и 500 нг/мл (рис. 1, 5) по сравнению с адгезией в присутствии только LPSs.1^.

Выраженный эндстоксин-активированнный ответ клеток человека характерен и для липоггалнеахаридов, полученных из Е. coli.

Инкубация культивируемых нейтрофилов в течение 60 мин с липополисахаридом Е. coli (LPSK IDfl) (рис. 2, I) приводила к дозозависимому увеличению адгезии нейтрофилов в интервале концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл. Количество адгезированных клеток изменялось от 25% (в контроле) до 100% при концентрации эндотоксина, равной 500 нг/мл. Действие LPSK(,r„pl в этом же

диапазоне концентраций не приводило к увеличению адгезии нейтрофилов при их культивировании в течение 2 часов (рис 2,5) Предварительное культивирование

120

100

80

£

60

40

20

ю1 ю2

Концентрация LPS, нг/мл

ю-5

Рис 2 Действие

липополисахаридов разной структуры на адгезию нейтрофилов человека К -адгезия контрольных

нейтрофилов 1 - LPSecoii, 2 -последовательное инкубирование нейтрофилов с LPS®, caps И LPSc.OT(„ -LPS gj, caps

клеток в течение 30 мин в присутствии LPS®^ значительно снижало величину адгезии нейтрофилов при последующем добавлении LPS£>„/, и культивировании (60 мин) по сравнению с адгезией в присутствии только LPS£c<,;, (рис 2, 2)

Известно, что взаимодействие нейтрофилов с поверхностью, покрытой фибриногеном, идет с участием р2-интегриновых рецепторов, самой многочисленной популяцией из которых являются CD lib/CD IS рецепторы [Ugarova, Yakubenko, 2001] Связывание анти-CDl Ib-FITC меченых антител с контрольными нейтрофилами (рис 3, К) практически не отличалось от связывания их с нейтрофилами, обработанными LPSRi,OTpj (рис 3, Г), но было существенно меньше

400

f 360 о

|320 zr о

cl |280

10 100 1000 Концентрация LPS, нг/мл

Рис 3 Связывание FITC-конъюгированных моноклональных антител к CD! lb с нейтрофилами (106 клеток/мл) К - контроль, 1 -LPSм raps, 2 - LPS£coft, 3 - нейтрофилы, инкубированные сначала с LPSRb caps, затем с LPSK,„t,

величины связывания этих антител с нейтрофилами, обработанными LPS£.coi, (рис 3, 2) Предварительное инкубирование нейтрофилов с LPS^,«^ практически полностью отменяло эндотоксин-зависимое увеличение экспрессии CD lib/CD 18 рецепторов этих клеток (рис 3,3)

Результаты проведенных исследований позволяют сделать заключение о том, что LPS/a,.capj отменяет эндотоксин-активируемую адгезию нейтрофилов, обусловленную увеличением экспрессии CDllb/CD18 рецепторов этих клеток Эти данные могут иметь важное терапевтическое значение, поскольку известно, что при развитии грамотрицательного сепсиса происходит увеличение экстравазации нейтрофилов, нарушение процессов микроциркуляции и коагуляции, приводящие к тромбозу В этих процессах важная роль принадлежит агрегации нейтрофилов друг с другом и с тромбоцитами, происходящая с участием CDllb/CD18 рецепторов [Anderson et al, 1987; Rinder et al, 1992]

1 2 Влияние LPS разной структуры на генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами

Функциональные ответы фагоцитов в значительной степени зависят от их исходного функционального состояния В организме эти клетки могут находиться в одном из трех функциональных состояний покоящемся, праймированном (предактивированном) и активированном [Condliffe et al, 1998] Эндотоксины оказывают прайм ирующее действие на клетки врожденного иммунитета, сопровождающееся усилением респираторного взрыва [Guthrie et al, 1984] АФК, продуцируемые активированными нейтрофилами и макрофагами, связаны с воспалительными ответами клеток, которые сопровождаются повреждением тканей при септическом шоке [Oldner et al, 1999, Cheng et al, 1999, Lamarque, Whittle, 1995] АФК играют также ключевую роль в патогенезе гемодинамической нестабильности и органной дисфункции [Haglund, Gerdin, 1991, Omar et al, 1992, Fukuyama et al, 1997]

В настоящей работе активацию фагоцитов проводили в присутствии 2% аутологической сыворотки, что позволило работать с физиологическими концентрациями эндотоксина, поскольку рецепторы фагоцитов распознают комплекс LPS-LBP в нанограммовых концентрациях [Antal-Szalmas, 2000]

Исследование действия липополисахаридов из Е coli и Rb capsulants на образование АФК в нешрофилах (регистрируемое методом проточной цитометрии с

использованием флуоресцентного зонда дигидрородамина 123) показало, что ЬР.Ч^бсщ,; снижает эндатоксин-йндуцированнун> продукцию АФК в исследованных клетках (рис. 4, 2) по сравнению с действием Ц^.и,« (рис. 4, /). В отсутствии эндотоксина ЬРЗ^со/и-. в концентрации 100-1000 нг/мл даже незначительно уменьшает образ о в ар 1ис АФК (рис. 4, 3) но сравнению с контрольными клетками.

Анализ кинетики защитного действия ЬР8№с1!ги. на образование АФК фагоцитами при воздействии эндотоксинов по регистрации люмивол^зависимой хемилюминееценции (ХЛ) показал, что 80-ти процентное ингибирование эндотоксин-индуцир о ванной активации происходит через 2 мии инкубирования и полная защита -через 4 минуты (данные не приведены)- Величину ХЛ нейтрофилов в присутствии ЬРЗдь«!,,,. принимали за [00%.

3SC

280

о 240

800

обоо с

X

400

Ю1

10й

I0J

10

Концентрация LPS, нг/мл

Рис. 4. Действие липополисахаридов разной Рис. 5. Последовательное действие 20

структуры на генерацию активных форм нг/мл LPS/;f> caps. 11 20 нг/мл

кислорода в нейтрофилах человека. АФК эндотоксина LPSIW,U на генерацию

регистрировали методом проточной АфК нейтрофилами в ответ на fMLP.

цитофлуориметрии. К - контроль; 1 -

LPS/.coi;', 2 - последовательное

инкубирование нейтрофилов с LPSjt^j и

LPSjicof; (концентрации обоих LPS

одинаковы -100 нг/мл); 3 - LPSm«^..

В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное исследование действия ЬРЗ^ь^. и ЬР5Е™/| "а продукцию АФК миелойдными клетками. Добавление иЗ^ск к нейтрофилам приводило к увеличению величины регистрируемой ХЛ, причем величина ХЛ достигала 90%-го насыщения при концентрации равной, соответственно, 20 нг/мл для нейтрофилов (рис. 6а. 1)

и 2 нг/мл для моноцитов {рис. 66, !). ЬР5и,.«ц>г. в диапазоне концентраций от 10 нг/мл

до 2 мкг/мл не вызывал увеличения продукции АФК нейтрофилов (рис 6а, 2) и моноцитов (рис 66, 2) по сравнению с генерацией АФК контрольными клетками (в отсутствии LPS)

Для оценки эффективности подавления липополисахаридом Rb capsulatus эндотоксин-зависимой продукции АФК миелоидными клетками были выполнены эксперименты, в которых исследовали защитное действие LPS®,^ (от 0,2 нг/мл до 200 нг/мл) при постоянной концентрации эндотоксина Е coh (20 нг/мл и 2 нг/мл для нейтрофилов и моноцитов, соответственно) Значительное ингибирование активации нейтрофилов к продукции АФК наблюдалось уже при соотношении LPS/foa^j/LPSs сои равном 1, при этом происходило снижение

хл,% 120 г

100

80

60

О ltf> 101 102 10® Концентрация LPS, нг/мл

Рис 6 Действие LPS£ra(, (1) и LPS^x, нейтрофилами (а) и моноцитами (б)

1оР ю' 102 Концентрация LPS, нг/мл (2) на продукцию активных форм кислорода

активации от 100% до 39% (в контроле - 30%) (рис 7а) Для моноцитов (рис 76) подобное снижение активации было получено при соотношении LPS,» caps /LPS£c„;, равном 10 1, отмечалось снижение активации от 100% до 68% (в контроле - 61,5%) Для контроля возможного влияния LPSRbrapj на пути внутриклеточной трансдукции сигналов от рецепторов эндотоксинов мы исследовали действие специфических ингибиторов сигнальных путей на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами в присутствии и отсутствии LPS^,^ Было исследовано действие SB203580 (ингибитор р38МАРК), PD98059 (ингибитор ERK), LY294002 и "Wortmannm (ингибиторы фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3K)) Сравнительный анализ полученных экспериментальных данных показывает, что все исследованные ингибиторы практически одинаково действуют как на контрольные нейтрофилы, так

и на клетки, обработанные ЬР8д&.СЧк, что подтверждает отсутствие исследуемых клеток липополисахаридом КЬ сарткаив (рис 8)

активации

ХЛ, %

120

100 k

80 an

du 40

20

хл, %

120 г

100

80

60

к

б

10-1

10"

10'

10

Ю-5 0 to"1 Юи Ю1 102 103 Концентрация LPS, нг/мл Концентрация LPS, нг/мл

Рис 7 Влияние концентрации LPSiic,,^ на дезактивацию нейтрофилов при последующем действии 20 нг/мл LPSsco/i (а) и на дезактивацию моноцитов при последующем действии 2 нг/мл LPSeci, (б)

ХЛ,%

100 80 60 40 20

и

Рис 8 Действие ингибиторов на fMLP-индуцируемую продукцию АФК нейтрофилами в отсутствии LP.SRi) сар, (J) и в его присутствии (2) PBS -контроль (принят за 100%), SB -SB203580 (0,5 мкМ), PD - PD98059 (1 мкМ), LY - LY294002 (1 мкМ), Wort -Wortmannin (50 нМ) Концентрация LPSRhcaps - 1 мкг/мл

PBS SB

PD

13 Влияние LPSsbcaps и LPSecou на поглощение объектов фагоцитоза нейтрофилами

Адгезия и генерация АФК являются важными компонентами фагоцитоза, играющего ключевую роль в механизмах защиты организма человека от бактериальной инфекции При грамотрицательном сепсисе происходит увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов [Heyderman et al, 1999, Martins et al, 2003]

Исследование поглощения объектов фагоцитоза нейтрофилами человека, проведенное в данной работе показало, что при концентрации LPSe.,0i, равной 200

нг/мл наблюдалось увеличение фагоцитоза дрожжей нейтрофилами по сравнению с контрольными клетками на 35% (рис 9, 2) Действие 500 нг/мл LPS№copS вызывало уменьшение фагоцитоза на 10% по сравнению с контролем (рис 9, 3) Предварительное инкубирование, исследуемых клеток с 500 нг/мл LPSR6c<¥,s в течение 5 минут перед добавлением 200 нг/мл эндотоксина полностью отменяло увеличение фагоцитоза дрожжей нейтрофилами под действием LPSEcou и было на 5% меньше, чем в контроле (рис 9,4)

Для оценки эффективности подавления липополисахаридом Rb capsulatus PG поглощения объектов фагоцитоза праймированными эндотоксином нейтрофилами были выполнены эксперименты, в которых исследовали защитное действие LPS^^s (в концентрации от 50 нг/мл до 500 нг/мл) при постоянной концентрации эндотоксина Е coli (200 нг/мл)

Концентрация LPSж, saps нг/мл Рис 9 Действие липополисахаридов Рис 10 Ингибирование эндотоксин-разной структуры на фагоцитоз индуцированного фагоцитоза дрожжей дрожжей нейтрофилами человека 1 - нейтрофилами липополисахаридом Rb контроль, 2 - 200 нг/мл LPS£co(1, 3 - capsulatus Концентрация LPS£co;, - 200 500 нг/мл LPSsj,C4)J, 4 - нг/мл последовательное инкубирование нейтрофилов с 500 нг/мл LPS№.C4,s и 200 нг/ мл LPS£co/,

Значительное ингибирование фагоцитоза нейтрофилами дрожжей наблюдалось уже при соотношении LPSsilCiips/LPS£ со(,равном 0,5, при этом происходило снижение величины фагоцитоза от 134% до 106% (в контроле - 100%) (рис 10) При соотношении LPSRicepj/LPSE coiI равном 1, величина фагоцитоза была равна контролю При изменении соотношения LPS Rt.mps /LPSe.coIi от 1 до 2,5 величина фагоцитоза

изменялась от 100% до 95%, не достигая при этом величины фагоцитоза при действии одного LPS®.^

Нами показано, что при действии липополисахаридов Е coli и Salmonella typhimunum величина адгезии достигает максимальных значений при концентрации эндотоксина, равной 500 нг/мл Эта концентрация значительно выше, чем концентрация эндотоксина, требуемая для достижения максимальной продукции активных форм кислорода этими клетками (рис б а и 66) Вероятно, это связано с тем, что при исследовании адгезионных свойств нейтрофилов в связи с более длительным временем эксперимента, процесс интернализации CD 14 рецепторов вносит больший вклад в исследуемый процесс, чем при регистрации АФК Кроме того, не следует исключать возможность связывания некоторой доли как эндотоксина, так и LPS® ,:aps не только с нейтрофилами, но и с дрожжевыми клетками, что может снизить концентрацию свободных липополисахаридов

Учитывая эти результаты, в экспериментах по исследованию влияния липополисахаридов разной структуры на фагоцитарные свойства нейтрофилов была использована концентрация липополисахарида Е coli, равная 200 нг/мл Снижение фагоцитоза нейтрофилов под действием LPS®««» (по сравнению с контрольными клетками (рис 9 и 10)), вероятно, обусловлено взаимодействием этого липополисахарида с рецепторным комплексом эндотоксинов в мембране нейтрофилов Это предположение подтверждается нашими экспериментальными данными по уменьшению продукции АФК нейтрофилами при действии 500 нг/мл LPS Rb caps Учитывая, что установлено существование непосредственного взаимодействия Tool like 4 рецептора (T1R4) и НАДФН-оксидазы [Kitchens et al, 1999] и то, что T1R4 влияет на экспрессию CD lib/CD 18 рецепторов [Ugarova et al, 2001], не исключено, что LPS/^^ несколько снижает фагоцитоз за счет своего непосредственного взаимодействия с рецептором эндотоксина

2. Исследование действия LPS Rhodobacter capsulatum PG на регуляцию апоптоза фагоцитов, опосредованную действием эндотоксинов.

Помимо воздействия на функциональные свойства нейтрофилов, эндотоксины увеличивают продолжительность жизни активированных клеток, ингибируя их апоптоз Исследование действия LPSß^caps на. регуляцию апоптоза нейтрофилов показало, что этот липополисахарид оказывает небольшое ингибирующее действие

Рис 11 Действие LPSRbcaps на апоптоз нейтрофилов в присутствии 1 мкг/мл LPS£co(, (/) и в отсутствии LPS£co;, (2).

2

-§-

L-,-у/ , ...........................

О 101 102 103 ю4

Концентрация LPSяь caps • нг/мл

на апоптоз культивируемых нейтрофилов (10% при концентрации 10 мкг/мл) (рис 11, 2) При предварительном инкубировании (в течение 30 мин) нейтрофилов с LPS®.,^ (перед добавлением 1 мкг/мл LPSe«,/,) происходит дозозависимое уменьшение эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза этих клеток (с 50% при 10 нг/мл до 20% при 10 мкг/мл LPS^«^, соответственно (рис 11, 1)) Даже при максимальном соотношении исследуемых липополисахаридов (LPSh,.«^ /LPS£ „(¡=10) полная отмена эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов не достигается U?S№caps примерно на 75% подавлял действие эндотоксина (рис 11,

Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемая разница в эффективности защитного действия LPS и, СЩк по подавлению активирующего действия эндотоксина может быть связана с различием в механизмах взаимодействия исследуемых липополисахаридов с клетками-мишенями Быстрое ингибирование образования активных форм кислорода при действии LPS®capj в течение нескольких минут после воздействия, возможно, объясняется прямым взаимодействием T1R4 рецептора (после связывания LPS) и НАДФН-оксидазы, что согласуется с результатами работы [Park et al, 2004]

Исследование действия ингибиторов на регуляцию апоптоза нейтрофилов показало, что предварительное инкубирование нейтрофилов с ингибитором ERK (PD98059, 10 мкМ и 50 мкМ) отменяло ингибирование апоптоза при действии LPSffco;i и не оказывало влияния на апоптоз в присутствии LPSebay» (рис 12, PD 10 мкМ) При

1)

концентрации Р098059, равной 50 мкМ, наблюдалось небольшое ингибирование апоптоза при действии ЬРБи сар! и ЦР8£сЛ Инкубирование нейтрофилов с

К PDIOmkM PD 50mkM SBImkM SBIOmkM

Рис 12 Действие ингибиторов МАРК и ERK на апоптоз нейтрофилов при действии LPS разной структуры К - без ингибиторов, PD-PD98059, 10 мкМ и 50 мкМ, SB-SB203580, 1 мкМ и 10 мкМ Концентрации LPS Е coli и Rb caps равны 1 мкг/мл 1- контроль, 2 - LPSB coi„ 3 - LPSÄi, Mps

ингибитором р38МАРК (SB203580, 1 мкМ) практически не оказывало влияния на апоптоз контрольной пробы и пробы с LPS®^, но увеличивало ингибирование апоптоза в пробе с LPS£co;, (рис 12, SB 1 мкМ) SB203580 в концентрации 10 мкМ незначительно ингибировал апоптоз во всех пробах (рис 12, SB 10 мкМ)

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные показывают, что PD98059 снижает эндотоксин-индуцированную задержку апоптоза нейтрофилов, а SB203580 увеличивает ингибирование апоптоза под действием LPSEce!, Это указывает на то, что существует взаимодействие между ERK и р38МАРК сигнальными путями в регуляции апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов, что также подтверждается литературными данными [Klein et al, 2001]

Результаты ингибиторного анализа в присутствии LPS^,^ (рис 12) показывают, что этот липополисахарид, в отличие от LPS£ rai„ не оказывает существенного влияния на передачу внутриклеточного сигнала с участием ERK и р38МАРК сигнальных путей

3. Исследование защитного действия LPS Rhodobacter capsulatus PG от эффектов, вызываемых разными хемотипами эндотоксинов.

Для большинства клинических изолятов Е coli характерен S-хемотип (колонии микроорганизмов гладкой формы), включающий трехкомпонентную структуру эндотоксина, имеющего в своем составе гидрофобный компонент липид А -фосфорилированный неповторяющийся олигосахарид, известный под названием олигосахаридный кор, и полисахарид, который находится над поверхностью бактериальной клетки (О-антиген), определяемый по серотипированию [Christian, 2002] Микроорганизмы, формирующие колонии шероховатой формы, синтезируют LPS без О-антигена (R-хемотип) В пределах R-хемотипа возможны структуры кора, отличающиеся количеством и составом Сахаров - от максимально усеченного (Re-хемотип) до полного кора (Ra-хемотип)

В настоящее время влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена) липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше по сравнению с эффектами, обусловленными липидом А [Miiller-Loennies et al, 1998]

Исследование действия различных хемотипов липополисахарида Е coli на генерацию АФК нейтрофилами показало, что все эндотоксины вызывали значительное увеличение люминол-зависимой ХЛ по сравнению с контролем (рис 13) S-LPS хемотип Е coli вызывал наибольшее увеличение продукции АФК нейтрофилами Возрастание величины регистрируемой XJI наблюдалось в ряду контроль < Rc-LPS < Re-LPS < Ra-LPS < S-LPS При этом различия между численными значениями хемшпоминесценции между Re-LPS (219%) и Rc-LPS (209%) были существенно меньше, чем между Ra-LPS (256%) и S-LPS (285%) (рис 13) Таким образом, изменения величины XJI в ряду S- LPS > Ra-LPS > Re-LPS (рис 13) коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида исследованных хемотипов эндотоксина £ coli

Ранее было показано, что кинетика интернализации разных хемотипов LPS коррелирует с увеличением длины цепи полисахарида в составе молекулы LPS и, как следствие, с уменьшением гидрофобности эндотоксинов [Brandenburg et al, 1995] Однако липид А имеет меньшую скорость интернализации, чем Re-LPS и Rd-LPS Это может быть связано с тем, что липид А, вследствие своих гидрофобных свойств,

образует крупные мицеллы, которые медленнее интернализуются по сравнению с хемотипами LPS, имеющими в своем составе внутренний (Re) и внешний (Rd) кор

Несколько большая величина XJI нейтрофилов в присутствии Rc-LPS по сравнению с Re-LPS (рис 13), по-видимому, связана со структурными свойствами этих эндотоксинов и с особенностями их взаимодействия с эндотоксиновыми рецепторами миеяоидных клеток

ХЛ, % 35 О

300 250 200 150 100 50 0

■

Рис 13 Действие разных хемотипов LPS Е coli (20 нг/мл) на генерацию АФК нейтрофилами К - контроль Re-, Rc-, Ra- , S-хемотипы LPS

Re Rc

Ra

В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина Е coli на величину апоптоза культивируемых нейтрофилов Было показано, что величина ингибирования апоптоза под действием этих эндотоксинов возрастает в ряду Re-LPS > Rc-LPS > Ra-LPS > S-LPS (рис 14) Из полученных результатов следует, что эндотоксин, структура которого имеет только липид А и 2 молекулы З-дезокси-О-манно-октулозоновой кислоты (КДО) оказывает на апоптоз нейтрофилов максимальный ингибирующий эффект

Максимальное ингибирование апоптоза нейтрофилов наблюдается для Re-LPS, не имеющего внешнего кора и полисахаридной цепи из исследованных хемотипов (рис 14, а) и имеющего более низкую скорость интернализации по сравнению с Ra-LPS [Lentschat et al, 1999] и S-LPS [Kitchens, Munford et al, 1999] Таким образом, наблюдаемое увеличение величины продукции АФК в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS > контроль) связано, по-видимому, с особенностями механизма взаимодействия этих липополисахаридов с рецепторами эндотоксинов и хорошо коррелирует с длиной полисахаридной цепи этих LPS С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования

апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов, что коррелирует с увеличением гидрофобности этих хемотипов

100

.80

¡3 60

с о

С 40 <

20

-in

■

Я ■

Л

HS

1

- Я

■ в 1 Шй! gig pffl Ш ü я Я isli рий

Re Rc Ra S

100

80

g 40 <

20

ü

12 12 Re Rc

ib lb

1 2 Ra

1 2 S

Рис 14 Действие разных хемотипов LPS Е coli (200 нг/мл) на апоптоз нейтрофилов в отсутствии (а) и присутствии LPSRbcaps {б) К - контроль Re-, Rc-, Ra-, S- хемотипы LPS Время культивирования нейтрофилов - 9 час Пунктирная линия - апоптоз нейтрофилов в присутствии 1 мкг/мл LPSRhmps 1 - 100 нг/мл эндотоксина (Re-, Rc-, Ra-, S-), 2 - последовательное действие 1 мкг/мл LPSSArapl и 100 нг/мл эндотоксина (Re-, Rc-, Ra-, S-)

Предварительное инкубирование нейтрофилов с 1 мкг/мл LPSИ, сар! в течение 5 мин отменяло эндотоксин-индуцированное увеличение продукции АФК (таблица 1) и ингибирование апоптоза нейтрофилов (рис 14, б) при последующем действии 100 нг/мл исследованных хемотипов эндотоксина Е сок

Таблица 1

Действие липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на продукцию АФК нейтрофилами при действии разных хемотипов эндотоксина Е сок

Хемотип Продукция АФК нейтрофилами

(контроль принят за 100%)

Re- 100 ± 5,8

Rc- 100 ±4,7

Ra- 100 ± 5,5

S- 100 ± 5,9

Полученные экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что защитное действие LPS№caps практически не зависит от исследованных хемотипов (табл 1 и рис 14, б)

4. Исследование влияния LPSrj счк на взаимодействие эндотоксинов с

CD14 рецепторами моноцитов.

Полученные результаты по защитному действию липополисахарида Rkodobacter capsulatus PG на эндотоксин-индуцированную активацию адгезии, продукцию АФК и фагоцитоз исследованных клеток позволили предположить, что LPS® caps нарушает сборку рецепторного комплекса, происходящую при связывании эндотоксинов с клетками-мишенями [Ulmer et al, 2002] (или уменьшает его экспрессию в клеточной мембране). Для проверки этого предположения было исследовано влияние нетоксичного LPS на связывание FITC- меченого LPS£co/, с

9

Г

-160

к

§

х 160

о

£?130 в

120

&

8140

101

10*

ю-3

10'

10"

10°

Концентрация FITC-LPSg ^ нг/мл

10

Концентрация FITC-CPSffi,.eapS., нг/мл

Рис 15 Связывание с моноцитами ИТС- Рис 16 Связывание с моноцитами ИТС-

1 - ИТСХРБя«,;,, 2 - моноциты Ц^и,.«?» 1 - РИС^Рвда.^, 2 - в

предварительно инкубировали с 1 мкг/мл присутствии 1% трипанового синего ЬРви, сар!

моноцитами

Из данных рис. 15 видно, что предварительное инкубирование моноцитов с LPSRbcepj в течение 20 мин (рис 15, i) значительно уменьшает связывание LPSEcd;, -FITC (рис 15, 2) с CD14 рецепторами моноцитов, что, вероятно, объясняется связыванием с этим рецептором нетоксичного LPSRi,ct,Pi,, что, в свою очередь, ингибирует сборку рецепторного комплекса эндотоксинов этих клеток

С целью оценки величины связывания LPS ¡¡ь caps с мембраной клеток-мишеней и интернализации этого липополисахарида в клетки-мишени были выполнены эксперименты по определению связывания FITC-меченого LPS^.«^ с моноцитами

(ИТС-ЬРЗяь сяр*) С увеличением концентрации Р1ТС-ЬР8И) ст

наблюдалось увеличение флуоресценции, что свидетельствует об увеличении связывания этого липополисахарида с моноцитами (рис 16, 1) В присутствии 1% раствора трипанового синего (тушащего флуоресценцию Р1ТС-ЬР5гамр,, связавшегося с мембраной) рост флуоресценции ШТС начинался с концентрации ИТС-иРви,^, равной 100 нг/мл, что свидетельствует об интернализации части Р1ТС-ЬРЗ№сар1, связавшегося с клеткой (рис 16, 2)

Для оценки влияния ЬР8№сч,5 на экспрессию С014 рецепторов в мембране моноцитов в присутствии (и отсутствии) эндотоксинов были выполнены эксперименты с использованием моноклональных анти-СО!4 антител При действии ЬРЭяс;, (100 нг/мл) наблюдалось некоторое увеличение экспрессии СВ14 рецепторов в мембране моноцитов (рис 17, 2) по сравнению с контролем (рис 17, 1) Инкубирование моноцитов с 1 мкг/мл ЬР8ЛЬетр1 в течение 10 - 60 мин не приводило к увеличению экспрессии этих рецепторов, наблюдалось даже некоторое снижение их экспрессии по сравнению с контролем (рис 17, 3) Предварительное инкубирование моноцитов с 1 мкг/мл ЬРЗяг,^ в течение 10 мин перед добавлением ЬРЗЕстЛ и последующей инкубацией моноцитов 20 мин с эндотоксином отменяло увеличение экспрессии СО 14 рецепторов моноцитов практически до уровня флуоресценции при действии ЬРЭ^др, (рис 17,4)

5:300

§

Рис 17 Влияние LPSsi caps (1 мкг/мл) и LPSЕсок (100 нг/мл) на экспрессию CD 14 рецепторов в мембране моноцитов 1 - контроль, 2 - LPS£c„/„ 3 - LPSm, caps, 4 - последовательное добавление LPS®, еда, затем

LPS^co/,

Результаты проведенных экспериментов показывают, что LPSrarapl отменяет связывание эндотоксина с моноцитами и уменьшает эндотоксин-активируемую экспрессию CD14 рецепторов этих клеток Эти рецепторы, как и р2-интегрины, также участвуют в процессах распознавания фагоцитами объектов фагоцитоза [Gregory, Devitt, 2004] Отмена эндотоксин-индуцированной активации фагоцитоза

нейтрофилов лицополисахаридом Rb capsulatus, по-видимому, связана с незначительным подавлением уровня экспрессии CDllb/CD18 и CD14 рецепторов в этих клетках Увеличение уровня экспрессии этих рецепторов не наблюдалось ни в одном из экспериментов При действии ÍPSu^caps в нейтрофилах снижается эндотоксин-активируемое увеличение экспрессии CDllb/CD18 рецепторов (рис 3), увеличение экспрессии которых обусловлено образованием рецепторного комплекса в мембране клеток-мишеней после их активации эндотоксинами [Chnstian, Ulrich, 2002]

Полученные экспериментальные результаты показывают способность LPSgi,cm незначительно снижать экспрессию рецепторов, входящих в состав рецепторного комплекса, а также нарушать эндотоксин-зависимую сборку этого комплекса

5. Исследование влияния Fas- и ультрафиолет С-опосредованного апоптоза на

клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов.

С целью выяснения закономерностей и особенностей воздействия УФ излучения на апоптоз нейтрофилов было проведено исследование действия УФС в широком диапазоне доз (от 0 до 600 Дж/м2) на продолжительность жизни культивируемых нейтрофилов Нами было обнаружено, что в диапазоне доз от 0 до 300 Дж/м2 происходит активация апоптоза исследуемых клеток При дальнейшем увеличении дозы облучения (до 600 Дж/м2) процент апоптозных клеток не увеличивается Доля живых нейтрофилов в этом диапазоне доз изменяется незначительно (94-98%) Культивируемые нейтрофилы, не облученные УФС, погибают медленнее, чем после действия ультрафиолета С Увеличение дозы УФС облучения клеток приводит к более быстрой гибели этих клеток (рис 18, 1, 2) по сравнению с контролем (рис 18, 3) Характер дозовой зависимости апоптоза при действии УФС (рис 19, а) близок к зависимости величины апоптоза нейтрофилов от концентрации анти-Fas-АТ (рис 19,6)

С целью выяснения закономерностей и особенности взаимосвязи механизмов регуляции апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов и индукторов апоптоза было исследовано совместное и раздельное действие эндотоксинов, УФ излучения и анти-Fas моноклональных антител Из полученных данных зависимости апоптоза от дозы УФС и концентрации знти-Fas-AT (рис 19) были выбраны оптимальные экспериментальные условия

^ 200

£ 400

о

I 300

<0

500

600

100

0 ^---—

0 300 600 Доза УФС, Дж/м2

а

400 б

0 ь-'--

0 100 200 Анти-Рае АТ нг/мл

0 5 10 15 20 25 30 час

Рис 18 Действие УФС и ЬРБе«,;, на Рис 19 Действие индукторов на

кинетику апоптоза нейтрофилов По апоптоз нейтрофилов Влияние дозы

оси ординат - доля апоптозных клеток, УФС (а) и анти-Бав АТ (б) Время

% 1, 2, 3 - 320, 80, 0 Дж/м2, культивирования нейтрофилов - 5

соответственно 4-100 нг/мл ЬР8£(Г0(, часов По оси абсцисс - время культивирования нейтрофилов

В первой серии экспериментов нейтрофилы сначала обрабатывали 100 нг/мл ЬРБ^со/, и затем через 1 час и 2 часа воздействовали индукторами апоптоза В отсутствии ЬР8£сог, (рис 20, а) УФС (70 Дж/м2) и анти-Рае-АТ (100 нг/мл) вызывали увеличение апоптоза нейтрофилов по сравнению с контролем (рис 20, 1г) на 250% и 230%, соответственно Ингнбирование спонтанного апоптоза нейтрофилов липополисахаридом (рис 20, 2г) составляло 55% от контроля (рис 20, 1г) В присутствии ЬРБесоь ('00 нг/мл) происходило постепенное снижение величины апоптоза нейтрофилов при добавлении анти-Рав-АТ и действии УФС через один час (рис 20, б) и через два часа культивирования нейтрофилов (рис 20, в) При замене культуральной среды нейтрофилов, культивируемых с эндотоксином (через 2 часа культивирования), на среду того же состава, но без ЬР8£сой, не происходило изменения величины апоптоза исследуемых нейтрофилов, что свидетельствует о максимальном ингибировании апоптоза нейтрофилов эндотоксином в этих экспериментальных условиях

При воздействии анти-РаБ-АТ и УФС на нейтрофилы (которые культивировались с эндотоксином в течение двух часов) наблюдалось значительное увеличение апоптоза по сравнению с величиной апоптоза этих клеток только в присутствии эндотоксина (рис 20, 2г) Действие анти-Рав-АТ и УФС вызывало увеличение апоптоза нейтрофилов в присутствии в 2,7 раза и 5,1 раза,

соответственно (рис. 20, в).

400 г

^о 300

Ь 200

с

о с:

< юо

а б в г

1

12 12 12 12

Рис. 20, Действие УФС (1) и анти-Ра$-АТ (2) на апоптоз нейтрофилов после добавления эндотоксина, а - в отсутствии бив- воздействие

УФС и анти-Ра$-АТ после культивирования нейтрофилов с 100 нг/мл ЬР5через 1 час (б) и 2 часа соответственно, г - без УФС и анти-Рак-АТ, \г - контроль, 2г - 100 нг/мл ЬРБ^ гЫ:.

Во второй серии экспериментов (рис. 21) на нейтрофилы вначале воздействовали индукторами апоптоза, а затем через 1 час (рис. 21, 5) и через 2 часа (рис, 21, в) добавляли эндотоксин. Оба индуктора апоптоза задерживали эндотоксин-индуцированное ингибиробание апоптоза этих клеток более эффективно, чем при

:гоо

Рис. 21. Действие УФС (1) и анти-ра зоо | ^ АТ (2) на апоптоз нейтрофилов до

добавления эндотоксина. а - в отсутствии ЬР5Г'со1, - бив- воздействие УФС и анти-Ра$-АТ перед 100 ^ ^ 1 культивированием нейтрофилов с 100

нг/мл ЬР$£.Г0|, в течение 1 час и 2 часов, соответственно.

воздействии после эндотоксина (рис, 20). Однако действие УФС (рис. 21, 16 и 1в) было более эффективно по сравнению с использованием анти-Раз-АТ (рис. 21. 26 я 2в).

Таким образом, полученные нами данные показали, что УФС и анти-Рак-АТ уменьшают эндотоксин-индударованное ингибирование апоптоза нейтрофилов. При этом УФС действует более эффективно, чем анти-РаБ-АТ, что связано, вероятно, с участием разных механизмов регуляции апоптоза нейтрофилов при действии этих индукторов на эндотоксин-индуиированное ингибирование апоптоза этих клеток.

Для изучения данного вопроса была исследована роль отдельных путей внутриклеточной сигнализации, участвующих в регуляции апоптоза при действии эндотоксинов, анти-Ра$-АТ и УФС (рис. 22). В присутствии ингибитора ЕИК (РП98059) происходила практически полная отмена ингибирования апоптоза,

вызванного эндотоксином. При этом величина апоптоза, активированного УФС н анти-Раз антителами, практически не изменялась.

PBS PD SB Wort LY

Рис. 22. Действие ингибиторов на апоптоз нейтрофилов; PBS — без ингибиторов; PD - 30 мкМ PD98059; SB - 10 мкМ SB203580; Wort - 50 нМ Wortmannin; LY - I мкМ LY 294002. I - контроль; 2 -LPS; 3 - 100 нг/мл анти-Fas моноклинальные антитела; 4 — УФС, 70 Дж/м2.

При действии ингибитора р38 МАРК (88203580) происходило увеличение эндотокеин-индуцированного ингибирования апоптоза (на 37%) и ингибированив УФС- индуцированного апоптоз нейтрофилов (на 36%). Ингибитор 5В203580 не оказывал существенного влияния па апоптоз этил клеток, опосредованный действием анти-Рая-АТ. Ингибиторы Р1-ЗК (\Vortmannin и ЬУ294002) сильнее ингибировали апоптоз, активированный анти-Раз-АТ, чем апоптоз, индуцированный УФС (рис. 22).

Результаты ингибиторного анализа показали, что ЕИК участвуют только в LPS-яццуцярованном пнгибировании апоптоза «ейчрофняоя и :к принимают участия в активации апоптоза при действии УФС и анти-Рак-АТ р38МАРК участвуют в регуляции УФС-индуцированного апоптоза. а также в регуляции апоптоза при действии эндотоксинов, так как ингибитор ЭВ203580 увеличивает ингибирование апоптоза нейтрофилов эндотоксинами. Р1-ЗК вносит больший вклад в регуляцию ЙПОптоза, активированного алти-Раз-АТ по сравнению с регуляцией УФС-индуцированного апоптоза.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о способности ультрафиолетового излучения более эффективно по сравнению с анти-Рай моноклональными антителами снижать эндотоксин-индуцированнос ингибировапис апоптоза нейтрофилов. Более эффективное действие УФС (по сравнению с анти-Раэ-АТ) связано, по-видимому, как с активацией Рак-рецептора, так и с активацией рЗВМАРК.

Защита организма человека от воздействия эндотоксинов - одна из актуальных проблем современной медицины Это обусловлено ключевой ролью этих компонентов клеточной стенки грамотрицательных бактерий в патогенезе эндотоксинового шока, являющегося ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе

В данной работе были исследованы эффекты, вызываемые разными эндотоксинами в клетках врождённого иммунитета - нейтрофилах и моноцитах, т к эти клетки являются основными клеточными мишенями эндотоксинов в периферической крови человека

Действие эндотоксинов на клетки-мишени является сложным комплексным механизмом, включающим внеклеточное распознавание эндотоксина, сборку мультирецепторного комплекса, проведение сигнала через мембрану, внутриклеточное распознавание, последующий сигнальный процессинг, транскрипцию и экспрессию генов Все эти события сопровождаются выраженной и быстрой активацией клеток-мишеней

В связи с этим мы изучили функциональные ответы нейтрофилов и моноцитов при действии эндотоксинов, протекающие за относительно короткие промежутки времени адгезию, генерацию активных форм кислорода (АФК), фагоцитоз, экспрессию клеточных рецепторов, участвующих в распознавании эндотоксинов клетками Кроме того, было исследовано действие эндотоксинов разной структуры на апоптоз нейтрофилов

Обнаружено, что ответы нейтрофилов на эндотоксины разных бактерий семейства Enterobacteriacea, в частности, на LPS Е coli и LPS S typhimurium, носили близкий характер Оба эндотоксина усиливали адгезивную активность нейтрофилов При этом сравнение результатов регистрации величины адгезии нейтрофилов при действии LPSSOilA. и LPS£coil показывает, что LPS£coil при концентрации 100 нг/мл вызывает большее увеличение адгезии нейтрофилов, чем LPSs№/l в той же концентрации (соответственно, 80% и 48%) Эти различия связаны, по-видимому, с особенностями структуры исследованных эндотоксинов, определяющими их биологическую активность

Одним из ранних проявлений активности клеток врожденного иммунитета является синтез АФК Образование АФК является важным функциональным ответом фагоцитов в связи с ролью свободных радикалов в большом количестве

физиологических и патологических процессов В условиях тяжелого сепсиса и септического шока эта защитная реакция фагоцитов переходит в патологическую, выходящую из-под контроля организма, что приводит к окислительному повреждению тканей и органов, характерному для эндотоксинового шока В таких условиях эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов приводит к нарушению их клиренса тканевыми макрофагами и усиливает повреждение тканей активированными фагоцитами

Эндотоксины из Е coli и S typhimurium активировали клетки к респираторному взрыву в ответ на вторичный стимул Следует отметить, что максимальная продукция АФК нейтрофилов достигалась при концентрациях эндотоксинов, значительно более низких (в 20 раз), чем при концентрациях, необходимых для максимального увеличения адгезии Это может быть связано с различными путями передачи сигнала в клетку и участием разных рецепторов

Сравнительное исследование действия липополисахаридов из Е coli различных хемотипов на генерацию АФК нейтрофилами показало, что все эндотоксины вызывали значительное увеличение продукции АФК LPS Е coli S-хемотипа вызывал наибольшее увеличение продукции АФК нейтрофилами Возрастание величины регистрируемой XJI наблюдалось в ряду контроль < Rc-LPS < Re-LPS < Ra-LPS < S-LPS При этом различия между численными значениями хемилюминесценции между Re-LPS (219%) и Rc-LPS (209%) были существенно меньше, чем между Ra-LPS (256%) и S-LPS (285%) Таким образом, изменения величины ХЛ в ряду S- LPS > Ra-LPS > Re-LPS коррелирует с увеличением длины кора и цепи полисахарида эндотоксина Е coli исследованных разных хемотипов

Эндотоксины влияют на время жизни фагоцитов, замедляя апоптоз нейтрофилов Под действием S-хемотипа эндотоксина из Е coli (1 мкг/мл) происходило ингибирование апоптоза нейтрофилов на ~ 50 % Используя ингибиторы к р38МАРК- и ERK-киназам, взаимодействие между сигнальными путями с участием этих ферментов, как полагают, влияет на развитие воспалительного процесса при грамотрицательном сепсисе, мы показали, что именно эти киназы играют важную роль в механизмах регуляции апоптоза

Сравнительное исследование действия эндотоксинов Е coli разных хемотипов на апоптоз нейтрофилов показало, что величина апоптоза под действием этих эндотоксинов возрастает в ряду Re-LPS > Rc-LPS > Ra-LPS > S-LPS) Из полученных

результатов следует, что эндотоксин Re- LPS, в состав которого входит только липид А и 2 молекулы КДО, оказывает на апоптоз нейтрофилов максимальный ингибирующий эффект Из исследованных хемотипов этот эндотоксин не обладает внешним кором и полисахаридной цепью и имеет более низкую скорость интернализации по сравнению с Ra-LPS и S-LPS

Исследование функциональной активности фагоцитов в ответ на липополисахарид из бактерии Rhodobacter capsulatus PG, который отличается по своему строению от использованных в работе эндотоксинов, показало, что LPSRb_caps не влиял ни на один из исследованных функциональных ответов фагоцитов в диапазоне концентраций, превышающем диапазон концентраций эндотоксинов Для выяснения вопроса о том, сопровождается ли отсутствие токсичности проявлением антагонистических свойств у липополисахарида из Rhodobacter capsulatus PG, были выполнены эксперименты по исследованию влияния этого LPS на функциональные ответы фагоцитов при действии эндотоксинов

Результаты проведенных исследовании показали, что LPSRbxaps значительно снижал эндотоксин-индуцированную адгезию нейтрофилов, что связано с отменой увеличения экспрессии CDllb/CD18 рецепторов в клеточной мембране этих клеток под действием эндотоксинов LPSsfcCapS проявлял антагонистические свойства, снижая эндотоксин-индуцированную продукцию АФК исследованными фагоцитами, а также отменял активацию эндотоксином фагоцитоза дрожжей нейтрофилами

Исследование действия LPS^^ на апоптоз нейтрофилов человека показало, что этот липополисахарид оказывает небольшое ингибирующее действие на апоптоз культивируемых нейтрофилов

Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин

Полученные данные указывают на то, что LPS^.«^ достаточно быстро блокирует передачу активационного сигнала от эндотоксинов внутрь клетки, что может быть обусловлено связыванием с рецепторами эндотоксинов клеток-

мишеней или с нарушением процесса сборки рецепторного комплекса эндотоксинов Это предположение было подтверждено результатами исследования влияния липополисахарида Rb caps на взаимодействие эндотоксинов с клеточными рецепторами, на экспрессию клеточных рецепторов и активацию внутриклеточных сигнальных путей

Нами показано, что LPSK, сар! не вызывает активации сигнальных путей при эндотоксин-индуцированном увеличении продукции АФК нейтрофилами и ингибировании их апоптоза

Результаты проведенных экспериментов по изучению роли рецепторов в действии LPSgb(:aps показывают, что этот липополисахарид незначительно снижает экспрессию CD14 и CDllb/CD18 рецепторов моноцитов и нейтрофилов, участвующих в доставке эндотоксинов к TLR4 рецепторам Установлено, что LPS№ot/„ отменяет связывание эндотоксина (меченого FITC) с моноцитами LPSffftraps. также отменяет эндотоксин-обусловленную экспрессию CDllb/CD18 рецепторов нейтрофилов, что может указывать на антагонистическую активность LPS^,,.^ Исследование связывания LPSRbcaps с моноцитами показало, что этот LPS, меченный FITC, связывается с моноцитами и частично интернализуется в клетки

CD14 рецепторы, как и CDllb/CD18 рецепторы, участвуют в процессах распознавания фагоцитами объектов фагоцитоза Отмена эндотоксин-индуцированной активации фагоцитоза нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG, по-видимому, связана с блокированием увеличения экспрессии этих рецепторов под действием эндотоксинов, а также с незначительным снижением уровня экспрессии этих рецепторов в исследованных клетках

Полученные экспериментальные результаты показывают способность LPSm,«^ незначительно подавлять экспрессию рецепторов, входящих в состав рецепторного комплекса, а также нарушать эндотоксин-зависимую сборку этого комплекса Эти структурно-функциональные свойства липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG обеспечивают его способность блокировать связывание эндотоксинов со специфическими эндотоксин-связывающими рецепторами, отменяют эндотоксин-зависимую экспрессию клеточных рецепторов, ингибируют эндотоксин-индуцированную адгезию и продукцию активных форм кислорода фагоцитами крови, а также подавляют ингибирование апоптоза этих клеток под действием эндотоксинов В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда заболеваний, в том числе сепсиса Сравнительное исследование двух индукторов апоптоза нейтрофилов энти-Fas AT и УФС показало, что эти индукторы задерживают эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов как до, так и после его воздействия эндотоксина на клетки Величина апоптоза нейтрофилов при

действии индукторов апоптоза через 2 часа после обработки клеток эндотоксином превышает апоптоз контрольных клеток При этом эффект ультрафиолетового облучения проявляется более выражено, чем действие анти-Fas антител

На основании выполненных работ и литературных данных можно выделить несколько механизмов или уровней воздействия на клетки врожденного иммунитета для снижения их активации при действии эндотоксинов Первый заключается в использовании нетоксичных соединений, обладающих способностью блокировать действие эндотоксинов на клетки-мишени Второй - воздействие на механизмы регуляции апоптоза клеток-мишеней И в первом и во втором случаях следует выделить два уровня возможного терапевтического влияния

1 на специфические мембранные рецепторы, участвующие в регуляции апоптоза клеток-мишеней,

2 на внутриклеточные пути регуляции апоптоза, на этом уровне важная роль принадлежит взаимосвязи сигнальных путей

Физиологический смысл существования разнообразных механизмов регуляции апоптоза заключается не только в удалении лишних или функционально поврежденных клеток, но и, по-видимому, в целенаправленной регуляции численности популяций различных клеток в зависимости от "потребностей" организма Вместе с тем ингибирование апоптоза нейтрофилов является одной из причин неэффективного клиренса этих клеток из тканей и вследствие этого повреждения тканей нейтрофилами при воспалении

Исследование действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на активацию фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры показало высокую эффективность этого вещества по снижению эндотоксин-индуцированной активации функционального состояния нейтрофилов и моноцитов

ВЫВОДЫ

1 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии р2-интегринов нейтрофилов

2 Под воздействием липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на миелоидные клетки происходит подавление продукции активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами, вызываемое эндотоксинами

3 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами объектов фагоцитоза и не вызывает увеличения фагоцитоза не активированных эндотоксином нейтрофилов

4 Время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин для исследованных эффектов действия эндотоксинов

5 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG дозозависимо снижает эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза миелоидных клеток Максимальное защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG наблюдается при 5-10-кратном его избытке по сравнению с концентрацией эндотоксина

6 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG ингибирует влияние исследованных хемотипов эндотоксина Е coli (S-, Ra-, Rc-, Re-) на продукцию активных форм кислорода и апоптоз нейтрофилов

7 Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации этих клеток

8 Активация апоптоза нейтрофилов энти-Fas -антителами и ультрафиолетовым излучением диапазона С уменьшает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов Эффект ультрафиолетового облучения проявляется более выражено, чем действие анти-Fas антител

9 Полученные результаты указывают на то, что защитные эффекты липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG от действия эндотоксинов на миелоидные клетки периферической крови человека связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы

10 Применение липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и индукторов апоптоза нейтрофилов позволяет уменьшить продолжительность жизни нейтрофилов при действии эндотоксинов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Липополисахарид КЬойоЪасгег сархиШиь Рв может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока

2 Проведенное исследование обосновывает целесообразность применения ЬР8я&СЧР5 в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов

3 Комплекс методов, использованный в работе с целью оценки функциональной активности клеток врожденного иммунитета, может быть применен для коррекции восстановительной терапии сепсиса

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Винокуров М Г, Афанасьев В Н, Печатников В А, Николаева Н Н , Долгачев В А Связывание анти-М- и анти-М-моноклональных антител с эритроцитами человека Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, С 31

2 Николаева Н Н, Долгачев В А , Донская И А, Афанасьев В Н, Тяжелова В Г., Винокуров М Г Апоптоз тимоцитов, индуцированный УФ облучением исследование механизма. Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, С 67

3. Долгачев В А, Николаева Н Н, Афанасьев В Н, Лонская И А, Винокуров М Г Изучение апоптоза тимоцитов, индуцированного ультрафиолетовым облучением Вестник новых медицинских технологий, 1998, № 1, С 63

4 Печатников В А, Косякова Н И , Винокуров М Г, Николаева Н Н , Долгачев В А, Афанасьев В Н Действие ультрафиолета С на иммунокомпетентные клетки человека и животных "Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация (новые медицинские технологии)" Тезисы докладов научно - практической конференции Пущино-Серпухов, 1998, С 22

5 Николаева Н Н, Афанасьев В Н, Долгачев В А, Лонская И А, Винокуров М Г, Печатников В А Изучение апоптоза иммунокомпетентных клеток под действием ультрафиолета С III открытая городская научная конференция молодых ученых Тезисы докладов Пущино, 1998, С 112-113

6 Винокуров М Г, Афанасьев В Н, Николаева Н Н, Семенов В С , Корнеев В Н, Печатников В А Связывание анти-М и анти-1Ч-моноклональных антител с эритроцитами человека Иммунология, 1999, № 3, С 18-21

7 Винокуров М Г, Николаева Н Н , Косякова Н И, Печатников В А Действие ультрафиолета С на лимфоциты и нейтрофилы периферической крови человека Медицинская иммунология, 1999, № 3-4, С 10

8 Винокуров М Г, Косякова Н И , Николаева Н Н, Печатников В А Модуляция апоптоза нейтрофилов периферической крови человека ультрафиолетовым излучением диапазона С и гамма-излучением Биофизика, 1999, Т 44, С 929-930

9 Винокуров М Г , Долгачева Н Н , Юринская М М , Анисимов Р Л , Прохоренко И Р, Сахно И В , Гражданкин Е Б, Печатников В А Влияние ультрафиолета С и липополисахаридов на апоптоз нейтрофилов человека Медицинская иммунология, 2000, Т 2, № 2, С 126

10 Винокуров М Г, Долгачева Н Н , Печатников В А Апоптоз нейтрофилов периферической крови модулируется гамма-излучением Медицинская иммунология, 2000, Т 2, № 2, С 127-128

11 Долгачева Н Н , Винокуров М Г , Печатников В А Влияние гамма -излучения на апоптоз нейтрофилов человека Конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000 г, 30 мая -1 июня, С 28-29

12 Долгачева Н Н, Винокуров М Г, Анисимов Р Л , Ванина В Н , Печатников В А Действие УФС на апоптоз нейтрофилов человека Конференция "Горизонты физико-химической биологии", Пущино, 2000 г, 30 мая -1 июня, С 128-129

13 Винокуров М Г, Долгачева Н Н , Юринская М М , Анисимов Р Л , Печатников В А Изучение действия ультрафиолета С на апоптоз нейтрофилов человека Международная конференция "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода", Пущино, 2000 г, С 30-32

14 Винокуров МГ, Прохоренко ИР, Юринская ММ, Долгачева НН, Косякова НИ, Гражданкин ЕБ, Печатников В А Действие эндотоксинов на регуляцию ультрафиолет С - индуцированного апоптоза нейтрофилов человека Конференция "Патофизиология и современная медицина", Москва, 2000 г, 13-14 октября, С 54-56

15 Винокуров M Г, Прохоренко И Р , Юринская M M, Долгачева H H , Печатников В А Действие липополисахаридов и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека Иммунология, 2001, № 2, С 25-27

16 Юринская ММ, Винокуров МГ, Долгачева НН, Гражданкин ЕБ, Косякова H И, Печатников В А Цинк ингибирует ультрафиолет С-зависимое ускорение апоптоза нейтрофилов человека Медицинская иммунология, 2001, Т 3,№ 2, С 137-138

17 Винокуров M Г, Юринская M M, Прохоренко И Р Гражданкин Е Б Косякова H И Печатииков В А Действие ультрафиолета С на кинетику модулированного апоптоза нейтрофилов человека Медицинская иммунология, 2001, Т 3, № 2, С 309

18 Vinokurov M G, Yunnskaya M M, Pechatnikov V A The rôle of apoptosis m the fonction of the human neutrophils International symposium "Biological motility new trends m research", Pushchino, 2001, P 172-173

19 Винокуров M Г, Юринская M M, Сусликов A В, Садикова Д Г, Печатников В А. Влияние ультрафиолетового излучения диапазона С на активацию и апоптоз нейтрофилов человека II Всероссийский симпозиум по кардиологии, Москва, 9-11 октября 2001, С 75

20 Винокуров M Г, Юринская M M, Косякова H И , Гражданкин Е Б, Сусликов А В Прохоренко И Р , Печатников В А Индукция апоптоза в нейтрофилах человека ультрафиолетовым излучением Конференция "От современной фундаментальной науки к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2001, С 47

21 Прохоренко ИР, Гражданкин ЕБ, Косякова НИ, Мурашев АН, Винокуров M Г., Юринская M M , Грачев С В Влияние структуры эндотоксинов на развитие воспалительного процесса у крыс Sprague-Dowly Конференция "От современной фундаментальной науки к новым наукоёмким технологиям", Пущино, 2001, С 93

22 Винокуров M Г, Юринская M M, Долгачева H H, Печатников В А Динамика индуцированного ультрафиолетом С апоптоза нейтрофилов при действии липополисахарида и цинка Биофизика, 2001, № 6, С 1150-1152

23 Винокуров M Г, Юринская M M , Сусликов А В , Садикова Д Г , Печатников В А Исследование апоптоза культивируемых нейтрофилов человека,

индуцированного коротковолновым излучением Цитология, 2001, Т 43, № 9, С 845-846

24 Винокуров М Г, Юринская М М, Печатников В А Ионы ртути ингибируют апоптоз нейтрофилов человека, индуцированный ультрафиолетовым излучением диапазона С Биофизика, 2002, № 4, С 683-685

25 Садикова Д Г, Винокуров М Г, Юринская М М, Беляева Т В , Печатников В А Исследование влияния ультрафиолетового излучения диапазона С на фагоцитоз и время жизни нейтрофилов человека XIV зимняя международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2002, С 104

26 Садикова Д Г , Винокуров М Г , Юринская М М , Беляева Т В Печатников В А Действие ультрафиолета С на образование активных форм кислорода активированных нейтрофилов Сборник тезисов 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 20-24 мая 2002 г, Т 1, С 31-32

27 Винокуров М Г, Юринская М М , Прохоренко И Р , Печатников В А Взаимодействие механизмов активации и ингибирования апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов Цитокины и воспаление, 2002, № 2, С 7-8

28 Винокуров М Г, Юринская М М, Садикова Д Г, Беляева Т В , Сусликов А В , Печатников В А Действие ионов ртути на респираторный взрыв и регуляцию апоптоза нейтрофилов человека Цитокины и воспаление, 2002, № 2, С 8

29 Grachev S V , Prokhorenko IR , Grazhdankm E В , Murashev A N, Vmokurov M G, Zembatov M R Structure of endotoxin influences the vascular system of rats Acta Physiologica Hunganca, 2002, V 89,№1-3,P 293

30 Печатников В A, Винокуров M Г, Юринская М М , Сусликов А В Молекулярные механизмы апоптоза нейтрофилов человека Медицинские аспекты Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 2002 г, С 111

31 Бурковецкая ME, Винокуров МГ, Юринская ММ, Беляева ТВ, Печатников В А, Сусликов А В Влияние ультрафиолетового облучения крови на активность миелопероксидазы нейтрофилов больных сердечно-сосудистыми заболеваниями Сборник тезисов 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века», Пущино, 14-18 апреля 2003 г, С 55

32 Печатников В А , Винокуров M Г , Юринская M M , Беляева Т В , Сусликов А В Молекулярные механизмы апоптоза нейтрофилов человека В кн Медицинские аспекты Горизонты биофизики От теории к практике, Пущино, 2003, С 225-228

33 Винокуров M Г, Беляева Т В , Юринская M M, Сусликов А В , Печатников В А Совместное действие ультрафиолетового излучения и ионов ртути на реактивность нейтрофилов человека Медицинская иммунология, 2003 г, Т 5, № 3-4, С 195

34 Винокуров M Г, Юринская M M, Беляева Т В, Сусликов А В , Косякова H И, Печатников В А Совместное действие ионов ртути и ультрафиолета С на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека Сборник научных трудов международного семинара «Экология и здоровье, экологическая медицина Управление качеством жизни», Москва, 2003, С 102-104

35 Винокуров M Г , Прохоренко И Р, Юринская M M , Прохоренко С В , Грачев С В Влияние липополисахаридов разной структуры на адгезию и генерацию активных форм кислорода нейтрофилами человека Доклады РАН, 2003, Т 393, № 2, С 273-275

36 Винокуров M Г, Прохоренко И Р, Юринская M M, Прохоренко С В , Грачев С В Модулирование функциональных свойств нейтрофилов человека липополисахаридами разной структуры Материалы конференции "Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе" Москва, 2003, С 45-46

37 Винокуров М.Г, Юринская M M, Прохоренко И Р , Косякова H И, Гражданкин Е Б , Грачев С В Взаимодействие липополисахаридов разной структуры с нейтрофилами человека в присутствии белков плазмы крови Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2003 Т 5 С 13-14

38 Беляева Т В , Винокуров M Г, Юринская M M , Сусликов А В , Печатников В А Влияние ультрафиолета С и ионов ртути на функционирование нейтрофилов человека Цитология, 2003, Т 45, № 9, С 849-850

39 Vinokurov M G, Yunnskaya M.M., Pechatnikov V A Modulation of apoptosis among the neutrophils of penpheral human blood by ultraviolet С irradiation and lipopolysacchande International Symposium "Biological motility" Pushchino, 2004 P 203-204

40 Винокуров М Г, Юринская М М , Прохоренко И Р , Прохоренко С В , Грачев С В Функциональная активность моноцитов человека при действии липополисахаридов разной структуры Доклады РАН, 2004, Т 395, № 3, С 418-420

41 Прохоренко И Р , Винокуров М Г , Юринская М М , Кабанов Д С , Гражданкин Е Б , Кустанова Г А , Зубова С В , Прохоренко С В , Волошина Е В , Грачев С В Изучение защитного действия нетоксичных ЛПС от эффектов эндотоксинов в экспериментах in vivo и m vitro I международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность" Москва, 2004 г, С 159

42 Грачев С В , Прохоренко И Р , Винокуров М Г , Гражданкин Е Б, Зубова С В, Кабанов Д Б, Кустанова Г А, Прохоренко С В Исследование антагонистических активностей липополисахарида из Rhodobacter в целях создания препаратов для лечения эндотоксинового шока Конференция "Фундаментальные науки - медицине" Программа фундаментальных исследований Президиума РАН Москва, 2-3 декабря 2004 г Тезисы докладов, С 172-173

43 Прохоренко И Р , Винокуров М Г, Юринская М М , Кабанов Д С , Гражданкин Е Б , Кустанова Г А , Зубова С В , Прохоренко С В , Волошина Е В , Грачев С В Изучение защитного действия нетоксичных LPS от эффектов эндотоксинов в экспериментах т vivo и т vitro I Международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность" Москва, 2004 Сборник тезисов, С 159

44 Винокуров М Г, Юринская М М , Прохоренко И Р , Грачев С В Регуляция апоптоза нейтрофилов при действии эндотоксинов XVHI Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 2005, С 11-12

45 Грачев С В , Прохоренко И Р , Винокуров М Г, Зубова С В , Золотущенко Е В, Прохоренко С В Изучение влияния нетоксичного ЛПС из Rhodobacter capsulatus (ЛПСяг,гарт) на активационные механизмы эндотоксинового шока Конференция "Фундаментальные науки - медицине" Программа фундаментальных исследований Президиума РАН Москва, 14 -16 декабря 2005 Тезисы докладов, С 160-162

46 Прохоренко И Р , Зубова С В , Волошина Е В , Гражданкин Е Б , Винокуров М Г, Мурашев А Н, Грачев С В Эндотоксины- потентные активаторы клеток врожденного иммунитета XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская

конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, 2005, С 44-45

47 Vinokurov M G, M M Yunnskaya, and I G Akoev Effect of Ionizing Radiation on Activation and Inhibition of Human Neutrophil Apoptosis Biophysics, Vol 50, Suppl N 1, 2005, P. S86-S89

48 Винокуров M Г, Юринская M M, Прохоренко И Р, Грачев С В Действие липополисахарида из Kb Capsulatus и из £ coli на фагоцитарную активность нейтрофилов человека Патогенез, 2005, № 3, С 41-45

49 Винокуров M Г , Юринская M M , Прохоренко И Р , Прохоренко С В , Грачев С В Липополисахарид Rb capsulatus подавляет эндотоксин-индуцированную задержку апоптоза миедоидных клеток человека Доклады РАН, 2006, Т 406, № 3, С 398-401

50 Винокуров M Г, Юринская M M, Прохоренко И Р, Грачев С В Липополисахарид Rhodobacter capsulatus нейтрализует эндотоксин-индуцированные ответы нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека Молекулярная медицина, 2006, № 4, С 56-62

51. Винокуров M Г, Юринская M M Сусликов А В , Печатников В А , Грачев С В Исследование динамики Fas- и стресс-индуцированного апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов Доклады РАН, 2006, Т 410, № 1, С 124-126

52. Винокуров M Г , Юринская M M, Прохоренко И Р , Грачев С В Действие различных хемотипов липополисахарида Е coli на апоптоз и активацию нейтрофилов человека Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2006, Т 147, № 8, С 136-138

Аннотация Винокуров Максим Григорьевич ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА RHODOBACTER CAPSULATUS НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОТВЕТЫ И

АПОПТОЗ ФАГОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ АКТИВАЦИИ ЭНДОТОКСИНАМИ

Липополисахариды (эндотоксины) играют ключевую роль при сепсисе и септическом шоке в патогенезе грамотрицательных инфекций В активационных процессах сепсиса значительная роль принадлежит миелоидным клеткам

периферической крови Целью данного исследования являлось изучение механизма защитного действия липополисахарида из фотосинтезирующих бактерий Rhodobacter capsulatus (LPSRecaps) на активацию миелоидных клеток человека под действием разных хемотипов эндотоксина Е coh (LPS£ci)i,) Предварительное инкубирование клеток с LPSRbxiips отменяло эндотоксин-индуцированную продукцию активных форм кислорода и значительно снижало (32-интегрин-зависимую адгезию нейтрофилов Методом проточной цитометрии показано, что LPSRi!)c4,j значительно уменьшает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза, нейтрофилов человека, отменяет увеличение экспрессии CDllb/CD18 рецепторов нейтрофилов и связывание LPS^«,/, с моноцитами Полученные результаты показывают, что защитное действие LPS№c4>s, реализуется на уровне сборки мембранного рецепторного комплекса эндотоксинов исследованных клеток Исследовано сравнительное действие ультрафиолета С (УФС) и airra-Fas моноклональных антител на регуляцию апоптоза нейтрофилов человека при действии эндотоксинов Показано, что УФС и анти-Fas моноклональные антитела ингибируют LPS-зависимую задержку апоптоза нейтрофилов При этом действие УФС более эффективно по сравнению с действием анти-Fas моноклональных антител Полученные результаты показали, что липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG может быть эффективным терапевтическим средством для предупреждения и лечения грамотрицательного шока у людей

Summary Vmokurov Maxim Grigorievich RESEARCH OF MECHANISMS OF THE RHODOBACTER CAPSULATUS LIPOPYSACCHARIDE ACTION ON FUNCTIONAL RESPONSES AND APOPTOSIS OF HUMAN BLOOD PHAGOCYTES BY ENDOTOXIN ACTIVATION

Lipopolysacchandes (endotoxins) play a key role m a sepsis and a septic shock m pathogenesis of Gram-negative infections In activation processes of a sepsis the significant role belongs to myeloid cells of peripheral blood The purpose of the given research was studying the mechanism of protective action of lipopolysacchande from photosynthetic bacteria Rhodobacter capsulatus PG (LPS®^ ) on activation of the human myeloid cells under action of endotoxins E coh (LPS£c(,;,), its chemotypes (Ra-, Rc-, Re-) and Salmonella

typhimurium (LPSsAypk) Preliminary incubation of cells with LPSKbXaps cancelled endotoxins-induced production of reactive oxygen species and considerably reduced (32-mtegnn-depended adhesion of neutrophils By a method of flow cytometiy it is shown, that LPS№caf)s considerably reduces endotoxins-mduced inhibition of the human neutrophil apoptosis, cancels increase of CDllb/CD18 receptors expression on neutrophils and binding of LPSeco& with monocytes The received results demonstrate, that protective action of LPSijcps is realized on the investigated cells at a level of assembly a membrane receptor complex Comparative research of an ultraviolet C (UVC) action and monoclonal antibody against Fas receptor on apoptosis regulation of human neutrophils by action endotoxins was earned out It is shown, that at action UVC and monoclonal antibody against Fas receptor the inhibition of LPS-dependent neutrophil apoptosis considerably decreases Thus UVC is more effective in comparison with action anti-Fas monoclonal antibody LPS from Rhodobacter capsulatus PG may be an effective therapeutic agent for human septic shock due to Gram-negative bacteria

Подписано в печать 12 09 2007 г Исполнено 12 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 701 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Актуальность проблемы. Эндотоксиновый шок является ведущей причиной смертности при грамотрицательном сепсисе, в патогенезе которого ключевая роль принадлежит эндотоксинам [Rietschel et al., 1994]. В США [Angus et al., 2001; Martin et al., 2003] и в странах Европы [Riederman et al., 2003] ежегодно более чем у 500000 пациентов развивается сепсис, причём количество подтверждённых случаев растёт на -1,5% в год, несмотря на многолетние исследования, направленные на поиск подходов к лечению. Летальность при сепсисе (даже в условиях комплексной терапии) варьирует в пределах от 20% до 40%, а в случае развития инфекционно-токсического шока может достигать 40-80% [Bone, 1991; Martin et al., 2003].

Попадая в кровоток, эндотоксины (несекретируемые липополисахариды (LPS)) взаимодействуют с миелоидными клетками -нейтрофилами и моноцитами, играющими важную роль в патогенезе сепсиса. Установлено, что в патогенезе сепсиса ключевую роль играет активация этих клеток [Ulmer et al., 2002; Weigand et al., 2004] и увеличение их числа. Активация клеток-мишеней эндотоксинами вызывает синтез провоспалительных цитокинов, обладающих ауто- и паракринным действием. Высвободившиеся циркулирующие свободные цитокины активируют клетки различных тканей и органов, индуцируя метаболические, гормональные и нейроэндокринные изменения в организме, что в конечном итоге приводит к развитию эндотоксинового шока [Rietschel et al., 1996].

Результаты исследования действия эндотоксинов нашли отражение в развитии терапии бактериальных инфекций, начиная с применения сорбентов и заканчивая вмешательством в механизмы нарушения гемостаза. Современная терапия включает ингибирование синтеза простагландинов, блокирование медиаторов воспаления, использование кортикостероидов и ингибиторов коагуляции [Пак, 2003]. Следует, однако, отметить, что большинство клинических приёмов, направленных на блокаду специфических провоспалительных медиаторов, а также использование растворимых рецепторов для связывания цитокинов, оказались безуспешными [Riederman et al., 2003; Van Amersfoort et al., 2003].

Поскольку клетки врожденного иммунитета в ответ на эндотоксины экспрессируют специфические для них рецепторы, в настоящее время пытаются при лечении эндотоксинового шока использовать вещества, способные конкурировать с эндотоксинами за рецепторы к ним. В связи с этим в данной работе в качестве антагониста эндотоксинов использовался липополисахарид из Rhodobacter capsulatus PG (LPS^ ca/M ). Ранее для LPS из Rhodobacter capsulatus B10 была показана способность защитного действия от некоторых эффектов эндотоксинов: на мышах линии С57/В16 - от ингибирующего действия эндотоксинов на ферментативную активность, связанную с системой цитохрома Р450, и на нейтрофилах человека - по подавлению Са+2-ответа, индуцируемого различными эндотоксинами [Грачёв и др., 1998, Асташкин и др., 1999].

Помимо воздействия на функциональную активность фагоцитов крови, эндотоксины изменяют регуляцию апоптоза этих клеток. Эндотоксины увеличивают время жизни нейтрофилов, ингибируя их апоптоз, и нарушают процесс клиренса этих клеток из тканей, что приводит к усилению повреждения тканей при воспалении [Keel et al., 1997; Jimenez et al., 1997; Sheth et al., 2001; Marshall et al., 2007]. В настоящее время направленная регуляция апоптоза нейтрофилов рассматривается как возможный терапевтический подход для коррекции ряда заболеваний, в том числе сепсиса [Jumenez, 1997; Oberholzer et al., 2001; Perl et al., 2006; Bianchi et al., 2006], однако число работ, посвященных направленной модуляции апоптоза нейтрофилов при сепсисе, невелико [Oberholzer et al., 2001].

В литературе описаны различные механизмы активации апоптоза нейтрофилов. Установлено, что ключевая роль в его активации принадлежит суперсемейству TNF-альфа рецепторов, в том числе и Fas-рецептору [Маянский и др., 2000; Hanna et al., 2005]. Выявлено, что индукция апоптоза нейтрофилов под действием Fas-лиганда снижает экстравазацию нейтрофилов и повреждение тканей при воспалении [Suzuki et al., 2006]. Тримеризация Fas-рецептора, помимо Fas-лиганда и анти-Fas моноклональных антител (анти-Fas AT), может быть вызвана действием ультрафиолетового излучения диапазона С (УФС) [Rehemtulla et al., 1997], являющегося индуктором апоптоза в некоторых типах клеток [Martin et al., 1995; Новожилова и др., 1996; Li et al., 2002; Takasawa et al., 2005].

Работы по исследованию действия эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов проводятся в основном с использованием липополисахаридов S-хемотипа, характерного для большинства клинических изолятов Е. coli [Heinrichs et al., 1998]. И хотя известно, что структура эндотоксинов влияет на патогенетические механизмы сепсиса, влияние олигосахаридов кора и полисахаридной составляющей (О-антигена) липополисахаридов на развитие патологических процессов, вызываемых эндотоксинами, изучено значительно меньше [Feist et al., 1989; Lentschat et al., 1999; Loppnow et al., 1989] по сравнению с эффектами, обусловленными липидом A [Müller-Loennies et al., 1998]. Число работ, посвященных выяснению влияния хемотипа эндотоксинов на активацию нейтрофилов, невелико. Отсутствуют работы, касающиеся изучения влияния хемотипа эндотоксинов на апоптоз нейтрофилов.

Все вышеизложенное обусловило необходимость проведения экспериментов, направленных на выявление возможного модулирующего действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и ультрафиолетового излучения на функционирование фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов разной структуры. Полученные новые данные позволят расширить понимание закономерностей и особенностей функционирования миелоидных клеток при действии липополисахаридов разной структуры и разработать подходы для направленной коррекции функционального состояния клеток врожденного иммунитета периферической крови, вызванного действием эндотоксинов.

Цель и задачи диссертационного исследования. Цель данной работы заключалась в исследовании механизмов действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы и апоптоз фагоцитов крови человека при действии эндотоксинов.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать действие LPS Rhodobacter capsulatus PG на функциональные ответы миелоидных клеток при действии эндотоксинов, в том числе на:

1) адгезионные свойства нейтрофилов;

2) генерацию активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами;

3) поглощение нейтрофилами объектов фагоцитоза.

2. Исследовать влияние LPS Rhodobacter capsulatus PG на регуляцию апоптоза фагоцитов при действии эндотоксинов.

3. Исследовать защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG от эффектов, вызываемых разными хемотипами эндотоксинов.

4. Исследовать взаимодействие LPS разной структуры с рецепторами миелоидных клеток, входящими в рецепторный комплекс эндотоксинов.

5. Исследовать влияние Fas- и ультрафиолет С - опосредованного апоптоза на клеточный ответ нейтрофилов при действии эндотоксинов.

Научная новизна исследования. Значительная часть результатов, приведенных в данной работе, носит приоритетный характер. В работе впервые проведено систематическое исследование действия липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG (LPS^.^.) на функциональные ответы миелоидных клеток периферической крови человека при действии эндотоксинов разной структуры. Показано, что LPSRb.caps. снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии р2-интегринов нейтрофилов.

В проведенных экспериментах установлена способность L?^Rhcaps снижать эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза нейтрофилов.

Показано, что при действии LPS/й Caps. происходит подавление продукции активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами и моноцитами, индуцированное эндотоксинами. LVbRhcaps ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами различных объектов фагоцитоза. При этом у нейтрофилов, не активированных эндотоксином, не происходит увеличения фагоцитарной активности.

Обнаружено, что время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин. Установлено, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации этих клеток.

Проведено сравнительное исследование действия разных хемотипов эндотоксина Е. coli (S-, Ra-, Rc- и Re-) на продукцию АФК и апоптоз нейтрофилов. Показано, что возрастание величины продукции АФК нейтрофилами в ряду хемотипов (S-LPS > Ra-LPS > Rc-LPS > Re-LPS) зависит от длины полисахаридной цепи эндотоксина и максимально для S-хемотипа исследованных эндотоксинов. С уменьшением длины полисахаридной цепи наблюдается увеличение ингибирования апоптоза нейтрофилов под действием исследованных эндотоксинов. Показано, что липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG одинаково снижает активацию нейтрофилов при действии эндотоксинов независимо от их хемотипа.

Исследование механизмов действия на фагоциты крови при их активации эндотоксинами показало, что защитные эффекты липополисахарида Ккос1оЬас1ег саряиШш РО связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы.

При сравнительном изучении эффективности задержки эндотоксин-индуцированного ингибирования апоптоза нейтрофилов при действии индукторов апоптоза (УФС и анти-Раэ АТ) установлена большая эффективность ультрафиолетового излучения.

Практическая значимость работы

1. Результаты работы указывают на то, что липополисахарид из ШюйоЪаМег саръиШж РО не только не активирует фагоциты крови человека в широком диапазоне исследованных концентраций, но и проявляет свойства антагониста эндотоксинов различных хемотипов, блокируя связывание эндотоксинов со специфическими рецепторами исследованных клеток-мишеней.

2. Оценка функциональной активности клеток врождённого иммунитета использованным в работе комплексом методов может быть применена для рекомендаций по выбору восстановительной терапии сепсиса.

3. ЬР8/й са/м, может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока.

4. Полученные в результате проведённых исследований данные позволяют рекомендовать в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов.

5. Ультрафиолетовое излучение диапазона С снижает время жизни активированных эндотоксином нейтрофилов, активируя их апоптоз.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Липополисахарид из Шюс1оЬас1ег сарэиШш РО обладает способностью блокировать эндотоксин-индуцированные функциональные ответы фагоцитов периферической крови человека при последующем действии эндотоксинов.

2. Хемотип эндотоксина влияет на характер ингибирования апоптоза и продукцию активных форм кислорода нейтрофилами.

3. Липополисахарид из ЯкоЛоЬас^ег саряиШт РО подавляет эндотоксин-индуцированную задержку апоптоза миелоидных клеток человека.

4. Липополисахарид ЯкснЗоЬаМег сарзиШш РО снижает эндотоксин-индуцируемую активацию миелоидных клеток по механизму взаимодействия со специфическими рецепторами эндотоксинов клеток-мишеней.

5. Ультрафиолетовое излучение диапазона С более эффективно, чем анти-Баз моноклональные антитела, снижает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов.

Внедрение результатов в практику. Результаты проведенной работы дополняют представления о механизмах взаимодействия эндотоксинов разной структуры и их антагонистов с клетками врожденного иммунитета, а также о механизмах защиты организма на клеточном уровне. Полученные результаты используются в учебном процессе при преподавании раздела о патогенезе сепсиса магистрантам Пущинского ГУ, а также для выполнения магистерских и кандидатских диссертаций. Полученные результаты применяются также в отделении кардиологии Больницы Пущинского научного центра РАН при проведении терапии с использованием аутотрансфузии облученной ультрафиолетом крови.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно—практической конференции "Здоровье, профилактика и эндоэкологическая реабилитация. Новые медицинские технологии" (Пущино, 1998); III открытой городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1998); конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); Международной конференции "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), конференции "Патофизиология и современная медицина" (Москва, 2000), Международном симпозиуме "Biological motility: new trends in research" (Pushchino, 2001), II Всероссийском симпозиуме по кардиологии (Москва, 2001), конференции "От современной фундаментальной науки к новым наукоёмким технологиям" (Пущино, 2001), XIV зимней международной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002); 6 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2002); конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002); 7 Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2003); Международном семинаре «Экология и здоровье, экологическая медицина. Управление качеством жизни» (Москва, 2003); конференции "Инфекционные и паразитарные болезни в современном обществе" (Москва, 2003); Международном симпозиуме «Biological motility» (Pushchino, 2004), I Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2004); конференции «Фундаментальные науки - медицине. Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2004); I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005);

17 конференции «Фундаментальные науки - медицине. Программа фундаментальных исследований Президиума РАН» (Москва, 2005).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 52 печатные работы.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 435 источников, из которых 23 - отечественных авторов. Диссертационная работа иллюстрирована 3 таблицами и 45 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG снижает адгезию нейтрофилов, индуцированную эндотоксинами, по механизму подавления экспрессии р2~интегринов нейтрофилов.

2. Под воздействием липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG на миелоидные клетки происходит подавление продукции активных форм кислорода нейтрофилами и моноцитами, вызываемое эндотоксинами.

3. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG ингибирует эндотоксин-индуцированное увеличение фагоцитоза нейтрофилами объектов фагоцитоза и не вызывает увеличения фагоцитоза не активированных эндотоксином нейтрофилов.

4. Время защиты функциональных ответов нейтрофилов липополисахаридом Rhodobacter capsulatus PG реализуется в интервале 2-5 мин для исследованных эффектов действия эндотоксинов.

5. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG дозозависимо снижает эндотоксин-индуцируемое ингибирование апоптоза миелоидных клеток. Максимальное защитное действие LPS Rhodobacter capsulatus PG наблюдается при 5-10-кратном его избытке по сравнению с концентрацией эндотоксина.

156

6. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG ингибирует влияние исследованных хемотипов эндотоксина Е. coli (S-, Ra-, Rc-, Re-) на продукцию активных форм кислорода и апоптоз нейтрофилов.

7. Липополисахарид Rhodobacter capsulatus PG (в диапазоне концентраций от 10 нг/мл до 1000 нг/мл) в отсутствии эндотоксинов не вызывает изменения экспрессии мембранных рецепторов, участвующих в эндотоксин-индуцируемой активации моноцитов и нейтрофилов.

8. Активация апоптоза нейтрофилов анти-Fas - антителами и ультрафиолетовым излучением диапазона С уменьшает эндотоксин-индуцированное ингибирование апоптоза нейтрофилов. Эффект ультрафиолетового облучения проявляется более выражено, чем действие анти-Fas антител.

9. Полученные результаты указывают на то, что защитные эффекты липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG от действия эндотоксинов на миелоидные клетки периферической крови человека связаны с его способностью конкурировать с эндотоксинами за специфические клеточные рецепторы.

10. Применение липополисахарида Rhodobacter capsulatus PG и индукторов апоптоза нейтрофилов позволяет уменьшить продолжительность жизни нейтрофилов при действии эндотоксинов.

157

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Липополисахарид Шос1оЬа&ег саряиШий РО может быть рекомендован для разработки и создания препарата для профилактики и лечения эндотоксинового шока.

2. Проведенное исследование обосновывает целесообразность применения ЬРЗдь.сарл в качестве инструмента для изучения механизмов действия антагонистов эндотоксинов, а также для тестирования потенциальных антагонистов эндотоксинов.

3. Комплекс методов, использованный в работе с целью оценки функциональной активности клеток врождённого иммунитета, может быть применен для коррекции восстановительной терапии сепсиса.