Автореферат и диссертация по медицине (14.00.24) на тему:Исследование глюкозы и гликированного гемоглобина при экспертной оценке гликемического статуса потерпевших в случаях насильственной смерти

Министерство здравоохранения Российской Федерации Российский государственный медицинский университет

. I }

Г 1

.}

на правах рукописи

КАЧИНА НАТАЛИЯ НИКОЛАЕВНА

УДК

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛЮКОЗ» И ГЛШШГОВАННоГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКЕ ГЛИКЕМИЧЕСКОГО СТАТУСА ПОТЕРПЕВШИХ В СЛУЧАЯХ НАСИЛЬСТВЕННОЙ СМЕРТИ

( 14.00.24 - судебная медицина )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1993 год

Работа выполнена в Российском государственном медицинском университете

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Н.КРЮКОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор М.В.КИСИН кандидат медицинских наук А.Ф.КИНЛЕ

Ведущее учреждение: Центральная судебно-медицинская лаборатория МО РФ

Защита состоится ¿¿-¿'^ъХ993 года.

в _ часов на заседании специализированного Совета

К.084.14.04 Российского государственного медицинского университета по адресу: ул. Островитянова, д.1.

Автореферат разослан "__1993 года.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат медицинских наук доцент И.В.Буромский

Актуальность исследования:

Для решения различных вопросов судебной медицины в качестве диагностического параметра жидкой крови неоднократно использовали количественную оценку•глюкозы. Так, по уровню глюкозы в крови пытались судить о давности наступления смерти ( Santini, 1958; Еотезату Г.А.,1975), причинах смерти (1'убин Н.М.,Марченко H.H..Сухоьеенко 0.В., 1987), решать вопрос о прижизненное™ кровоподтека (Гориков А.Н.,1977) или механической (странгуляци-онной) асфиксии (Литвак А.С.,Чвалун А.В.,1979; Шершевский А.Л.,1981), диагностировать прижизненную гипер- или гипогликемию, в том числе и при сахарном диабете (Галицкий Ф.А.1985; Пермяков Н.К., Пафимов Г.А., Потемкина С.А., Хватов В.Б.,1978; Sumbilia О.М., Zielkt; H.K., Krause B.L.,Ozand Р.Т.,1983; Галицкий Ф.А., Падай И.Н., Шкиренко- В.А. 1988), устанавливать стрессовые состояния (Литвак А.С.,Чиалун А.В.1979; Шершевский А.Л.1981; Губин Н.М., Марченко Н.П., Сухоьеенко 0.В.1987; Меерсон Ф.З., Пшешшкова М.Г., 1988). Предполагалось, что по уровню глюкозы в крови можно судить о гшю- или гипергликемическом состоянии человека, а также о заболевании сахарным диабетом. Сахарный диабет как основное заболевание примерно в 50Ж случаев при аутопсии не диагностируется ( Sullivon J.В.,Mohan С.М.,1982), а отсутствие строго специфических морфологических изменений создает значительные трудности при постмортальной диагностике сахарного диабета. Вообще, надежных результатов получено не было, так как глюкоза в трунной крови утилизируется довольно бистро, и уже к концу вторых суток теряется около Э0% ее исходного уровня (Сое J л.1972; Галицкий Ф.А.1985). Выл окончательно сделан вывод, что при аутопсии использовать концентрацию глюкозы для какой-либо достоверной диагностики не представляется возможным.

Таким образом на сегодняшний день определение уровня гликемии в крови является нерешенной и актуальной задачей в судебной медицине.

Одним из подходов к решению данной проблемы является использование в качестве объекта исследований не жидкой крови, а сухого ее пятна, так как имеются данные о том, что в сухом пятне донорской крови, концентрация глюкозы более стабильна по времени (Балаховский И.С.,Наточий Ю.В.,1973). Тем не менее, экстрапож-

ровать результаты in vivo на секционный материал, с которым обычно имеет дело судебно-медицинский эксперт, без предварительных исследований нельзя.

На месте происшествия нередко обнаруживают подсохшие потеки и пятна крови, излившейся в момент нанесения повреждения. Возможно ли использовать этот материал для оценки гликемического статуса потерпевшего непосредственно перед наступлением смерти или даже в момент наступления смерти ? Этот же вопрос можно поставить и при экспетизе потерпевших в случаях причинения нес-мертельпых повреждений.

Цель исследования:

Целью исследования явился поиск и внедрение биохимической методики оценки гликемии при экспертизе тех видов смерти, при которых данные исследования позволят эксперту решить вопрос о глике мнческом статусе потерпевшего непосредственно в момент нанесения повреждения. Эти дашше можно было би использовать в случаях автомобильной травмы, поскольку около 90% аварий связаны с особенностями поведения людей или состоянием их здоровья, и даже причиной внезапной смерти водителей, находящихся за рулем автомобиля (Солохин Л.А.,Кузьмин И.И.1993). Не последнее место занимает диагностика гликемического статуса при скоропостижной смерти в том числе и для исключения гипергликемической комы и заболевании сахарным диабетом.

Объектами исследований стали жидкая кровь и сухие пятна крови людей, погибших от различных причин, а также кровь здоровых доноров. При оценке содержания глюкозы использовали следующие методы: спектрофотометричекий, биохимический и статистический. Уровень глюкозы определяли глюкозо-оксидазным и орто-толуидиновым методами. Согласно рекомендации ВОЗ от 1985 года уровень гликемии у живых людей с целью диагностики тяжести заболевания должен определяться только по уровню гликированного гемоглобина, наиболее точно ее отражающей (WHO Expert Committee on Diabetes Mellitus Report 1985). В данном исследовании у погибших наряду с изучением глюкозы устанавливали и величину гликированного гемоглобина. Последний показатель в свою очередь является стабильной формой гемоглобина и свидетельствует об уровне глюкозы в крови на протяжении

длительного периода (3-4 месяца). Содержание глюкозы ь крови является наиболее лабильным и непостоянным показателем и отражает лишь один момент непрерывно сдвигаемого в ту или другую сторону динамического равновесия метаболизма углеводов. Уровень гликиро-ванного гемоглобина определяли унифицированным колориметрическим методом по Городецкому ( Карпова Е.А.,Городецкий В.К., 1984).

Задачи исследования:

Для достижения поставленных целей предполагалось решить следующие задачи:

1. Установить зависимость уровня глюкозы и гликированного гемоглобина в цельной трупной крови и сухом пятне в зависимости от давности наступления смерти и места ее изъятия.

2. Провести оценку влияния различных предметов-носителей (металл, дерево, стекло, пластик, хлопок) на уровень гликемии в сухом пятне крови по уровню гликированного гемоглобина.

3. Отработать и предложить для внедрения в практику судебной медицины метод оценки уровня гликемии по глюкозе и гликиро-ванному гемоглобину в сухом пятне крови, в том числе и с целью диагностики сахарного диабета.

Научная новизна:

Научная новизна исследования заключается в том, что была установлена динамика падения концентрации глюкозы ь сухом пятне крови, а также были предложены для внедрения методики определения гликемии у погибших путем измерения гликированного гемоглобина в жидкой трупной крови и в сухом пятне.

При измерении гликированного гемоглобина в трупной крови из разных отделов сосудистой системы одного и того же субъекта обнаружено отсутствие региональных особенностей (в отличие от глюкозы). Оказалось, что количество гликированного гемоглобина одинаково во всех отделах сосудистой системы трупа, и, кроме того, постоянно в жидкой крови в течение одного года при хранении in vitro. Выявлено влияние предметов-носителей на содержание гликированного гемоглобина при высушивании трупной крови, а также при хранении сухих образцов.

Практическая ценность:

Предлагаемые методики оценки гликемии в сухом пятне крови позволят целенаправленно совершенствовать работу судебно медицинских экспертов, связанную с диагностикой различных форм гликемии ( п том числе и с целью диагностики сахарного диабета ). повысить эффективность качества судебно медицинских пкечпфтиз по объективизации экспертных выводов, а также поможет в решении научных проблем по данному вопросу.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Количественное содержание глюкозы в крови, изъятой из трупа при аутопсии и хранении ее in vitro зависит как от давности наступления смерти, так и места изъятия, в то время как эти параметры не оказывают влияния на уровень гликированного гемоглобина по крайней мере в течение одного года.

2. Процесс хранения крови в виде сухого пятна приводит к снижению содержания в ней глюкозы вплоть до полного ее исчезно нения, в то время как уровень гликированного гемоглобина может оставаться неизменным по крайней мере в течение ТОО суток или даже повышаться в зависимости от пила предмета-носителя.

■'!. Разработан и предложен метод установления уронин го дер жания гликированного гемоглобина, который в сочетании с опреде лением наличия глюкозы в жидкой крови или высохшем пятне может быть использован для оценки гликемичегкого статуса при -'/геп^р тизе трупа.

Апробация:

Материалы диссертации доложены на научном семинаре заведующих биохимическими отделениями Российской Федерации в Бюро главной судебно-медицинской экспертизы РФ и на научной конференции кафедры судебной медицины Российского государственного медицинского университета.

Публикации:

По томи диссертации опубликованы 4 работы, методическое письмо Бюро главной судебно-медицинской экспертизы РФ и получены положительные решения на выдачу патентов по двум заявкам на изобретения.

Объем и структура работы:

Диссертация изложена на (^страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка используемой литературы и приложения. Текст иллюстрирован <¿3 рисунками и 5* таблицами. Список используемой литературы содержит 136 источников, из них 84 иностранных. Приложение к диссертации оформлено на 3 страницах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали цельную кровь, взятую из различных отделов сосудистой системы ( бедренная, воротная, печеночные и локтевая вены ) трупов лиц мужского и женского иола в возрасте с II до 86 лет. Исследовали как цельную трупную кровь, взятую в различные сроки посмертного периода, так и донорскую кровь. Отдельную группу составили погибшие, в анамнезе у которых был сахарный диабет как причина смерти или как сопутствующее, фоновое заболевание. Давность наступления смерти определяли, как правило, согласно записям в сопроводительных документах и по степени выраженности рашшх или поздних трупных явлений. Минимальный и максимальный срок от момента наступления смерти составлял 2-3 и 65-70 часов.

Кровь изымали в количестве 2-5 мл и хранили в пузырьках с резиновой пробкой в холодильнике при Ь -- + 5°С, либо в помещении лаборатории при комнатной t = + 14-17°С. Исследование проводили через 1-1,5 часа после взятия крови из трупа и через 20-30 минут после взятия крови у доноров.

Была исследована кровь от 86 трупов и 14 доноров. Причинами смерти погибших были острая сердечно-сосудистая недостаточ-

ность, механическая асфиксия, различные отравления, сочетанная тупая травма, острая и обильная кровопотеря и некоторые другие. Всего было произведено 1372 измерения, причем каждую пробу проводили по двум параллелям. Среди них: определение глюкозы в цельной жидкой крови и сухих пятнах крови глюкозоспецифичным ферментативным глюкозооксидазным методом, а также орто-толуидиновым методом. .

определение глнкироватюго гемоглобина в жидкой крови и сухом его пятне производилось двумя способами: колориметрическим и колоночным с помощью аффинного сорбента.

Колориметрический метод Городецкого В.К. основан на кислотном гидролизе HbAIс с помощью трихлоруксусной кислоты при нагревании пробы на кипящей водяной бане, денатурации белков, центрифугировании, инкубации выделившейся фруктозы с тиобарбиту-ровой кислотой и спектрофотометрическом измерении цветного комплекса.

В основе колоночного метола ( Ковалева Г.Г. ) лежит свойство цис-диольной группы углеводов образовывать пятичленнне циклы с борной кислотой.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием критерия Стьюдента и методов регрессионного анализа. Уровнем доверительной вероятности считали Р < 0,05. На графиках указаны границы + б/ Л/ ( N - 1 )', где е*''= ( Xi- X )'VN, N - количество точек или величина выборки, Х| значение экспериментальна определенной точки или измеряемой величины, X - среднее значение экспериментально определенной точки или измеряемой величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. (игррдоление глюкозы в жидкой кропи.

Уровень глюкозы в крови является достаточно лабильным пара метром у погибших людей, что подтверждают и наши исследования.

На рис.1 приводятся данные по определению глюкозы в жидкой крови, взятой из бедренной вены трупов в различные сроки после наступления смерти. Давность наступления смерти определяли cor ласно записям в судебно-медицинской документации и с. учетом выраженности трупных изменений. Почти всегда эти параметры совпадали. Разброс, параметра давности наступления смерти не превышал

трех часов. 1/1 Li рис.1 следует, что уровень глюкозы у умерших снижается и достигает нуля, как правило, уже через двое-трое суток после наступления смерти. _ 150

С

*р

hifi

100

50

8

и

(8x3ро %о §

20

40

60

80

Т(час)

I Концентрация глнжизи i,Cj в жидкой крови из бедренной вины в зависимости от давности наступления смерти (Т). Обозначения: V - странгуляционная асфиксия;

О - Другие 1фичины смерти.

обращает на себя внимание большой разброс в результатах определения содержания глюкозы в ранние сроки посмертного периода, что может быть отчасти обусловлено различным исходным уровнем ьтого углевода непосредственно в момент смерти. Естественно, что чем больше концентрация глюкозы в крови погибшего в момент смерти, тем дольше она будет сохраняться вплоть до полного исчезновения. Тем ни менее почти во всех случаях глюкоза в крови, взятой из бедренной вены, полностью утилизировалась к концу 2-х суток, а в некоторых случаях и раньше.

Отдельно был проведен анализ того, влияет ли причина смерти на характер зависимости, указанной на рис.1. Было обнаружено, что явное различие ( повышение ) существует только для изменения уровня глюкозы у лиц, погибших от странгуляционной асфиксии, в то время, как в остальных случаях такой закономерно™ выявлено не

было.

При хранении трупной крови in vitro при комнатной температуре ( + 14-17°С ) уровень глюкозы также достигал нулевой отметки к концу третьих суток от момента изъятия крови (как и при нахождении eft в течение трех суток в трупе). Однако, при изменении условий хранения (например, в холодильнике при t - + 4-5нС), скорость снижения концентрации глюкозы заметно снижалась.

Следовательно, уровень глюкозы в жидкой крови трупов и при ее хранении in vitro не является постоянным параметром, а зависит как от давности наступления смерти, момента ее изъятия, так и от исходной концентрации данного углевода в крови. Однако, Fin-явить какую-либо закономерность скорости снижения концентрации глюкозы не представляется возможным из-за явной зависимости данного параметра и от температуры окружающей среды.

Исследуя динамику снижения концентрации глюкозы в одном и том же образце жидкой крови двумя методами одновременно ( глюко-зооксидазнмм и орто-толуидиновнм ) мотою убедиться, что использование орт" толуидиноного реактива дает некоторое "завышение" результатов. Нероятнее всего ото вызвано тем, что этим методом выявляют не только глюкозу, но и другие "сахара". Именно определение "побочных Сахаров" "маскирует" истинный характер уменьшения глюкозы в трупной крови.

Таким образом концентрация глюкозы в трупной крови неизмен но снижается после смерти. Естественно, чем выше был исходный уровень, тем длительнее по времени процесс утилизации ]'.'lK!i:'i:>|J в крови.

Я. Исследование глюкозы и сухом пятне крови.

После того, как был установлен факт снижения концентрации глюкозы в жидкой трупной крови, была поставлена задача изучить характер изменения ее концентрации в сухом пятне.

Кровь брали из трупов лиц в неодинаковые сроки после наступления смерти ( от 2-Я до 65-70 часов ) и с различными причинами смерти. Сначала определяли исходный уровень глюкозы в жидкой крови, затем в сухих пятнах крови, высушенных в эксикаторе над осушителем.

Согласно нашим данным (рис.2) наиболее выраженное уменьшение уровня глюкозы в сухой крови наблюдается только на 20 сутки, за

тем концентрация продолжает медленно снижаться и достигает нуля

через 3-4 месяца (если кровь взята из печеночной вены и определение проводили с использованием глюкозооксидазного метода). В высушенной крови (при условии хранения образцов в пластиковых чашечках Петри при комнатной температуре, -I М-1У°С), по сравнению с жидкой, период снижения концентрации глюкозы удлиняется в несколько раз и равен нескольким десяткам суток ( протяженность данного периода зависит от исходного уровня глюкозы в кропи, то есть, чем выше концентрация глюкозы в крови, тем дольше она сохраняется в образцах). Такая же кинетика уровня глюкозы наблюдалась и при изучении тех же образцов крови с помощью орто-толуи-динового реактива, однако, абсолютные значения глюкозы в течение даже 2-х, 3-х месяцев от наступления смерти (согласно этому способу) гораздо выше по сравнению с энзиматическим способом. Например, при измерении одной и той же пробы двумя способами мы по-

лучали резкое завышение результатов при использовании орто-толу-идинового реактива (Таблица I).

Таблица I.

Сравнительное исследование глюкозы в сухих пятнах крови спустя длительное время хранения при использовании разных способов оценки "сахара" в одном и том же образце.

№ исходная конц. mftowj Время

глюкозы в жид-____^__хранения

акта кой крови (мгЖ) глюкозооксидаз- орто-толуидино- образца

ннй метод (мг%) вый метод (мг%) (сутки)

1756 368,5 6,8 33,7 88

Т757 676,0 65,9 124,4 88

1683 89,0 0 6,97 95

1687 206,3 5,3 14,5 95

Эти обстоятельства, на наш взгляд, как и использование неспецифических методов оценки глюкозы, дало основание ряду авторов предположить, что уровень глюкозы в высушенной крови более или менее постоянен (Валаховский И.С. .Наточий Ю.В., 1973; Галин кий Ф.Л., Крюков D.H. 1985).

При исследовании высушенной крови было установлено, что уменьшение уровня глюкозы в сухих образцах крови происходит по аналогичной кинетике (рис.3). Отличие наблюдается лишь в исход ном уровне глюкозы. В соответствии п этим просто удлиняется не риод, в течение которого происходит уменьшение уровня глюкозы вплоть до ее исчезновения. Выло отмечено, что в поротной цеце человека содержится наибольшее количество глюкозы ( вероятно вследствие выброса ее из печени в отпет на любую отреетвую ситуацию), что в свою очередь удобно для изучения rviKcii-wpn "ти снижения уровня данного углевода в динамике.

Все выше названные исследования производили с заранее известной кровью, взятой из трупа. Следующей задачей было изучение характера изменения глюкозы в сухом пятне, образовавшемся при еп истечении у живого человека.

Выла использована кровь из локтевой вены здоровых людей в момент ее изъятия на донорском пункте. Определяли исходный уровень глюкозы в жидкой крови, затем и сухих пятнах крови, вы сушенных на пластиковых чашках Петри. Причем, чашки С'ыли нп зак-

рыты, находились при комнатной температуре ( + 14 - 17°С ) в хорошо проветриваемом помещении. Исследование жидкой крови проводили через 20-30 минут после изъятия.

Un piv:..'{ показана г*пвисим<ч:ть снижения концентрации глюкопи в '-ух'-м ичтмг- донорской крови от времени (в сутках), выраженной ¡1 процентах, ипразцн хранили в пластиковых чашечках Цг-три при комнатной температуре ( -i [4-17°С ).

Поглаг'но нашим данным концентрация глюкозы в сухих пятнах д-.н.--рок"П крови такяс» н»'уклеило снижается, стремясь к нулю. Снижение уровня глюкозы fi vTiix образцах происходит по аналогичной кинетике, МТС) и в крови, взятой от трупов.

Il ходе наших экспериментов было замечено, что в процог-ое высушив:п 1ия глюкоза теряет в среднем около 45-50$ своего исходного уровня.

О другой стороны, зная закономерность падения концентрации глюкозы в сухом пятне крови, наверное, можно било бы высказаться, например, и о давности наступления смерти, и рассчитать уровень гликемии перед смертью. Но как ми уже указывали, на уровень глюкозы влияет скорость высушивания и загрязнение образцов крови различной микрофлорой, утилизирующей в первую очередь глюкозу ( Hill К., 1941; Балаховский И.С..Наточий Ю.В.,1973).

Таким образом, даже использование строго специфического глю-козооксидазного метода обнаружения глюкозы в сухих образцах трупной и донорской крови для оценки гликемии в судебно-медицинской практикь не предотвращает эксперта от ошибки. Ведь уровень гликемии у разных людей неодинаков, да и источник кровотечения порой не известен. Поэтому для решения этой проблемы можно предложить для судебно-медицинского эксперта использовать более надежный параметр, а именно - определение процента гликированного гемоглобина в крови.

3. Исследование гликированного гемоглобина в жидкой крови.

Согласно рекомендации ВОЗ от 1Э8Ь года уровень гликемии у живых лиц с целью диагностики тяжести заболевания сахарным диабетом должен определяться только по уровню гликированного гемоглобина, наиболее точно ее отражающей (WHO Expert Committee on I)iabuU:r, Me Ид tua Report 1985). Было совершенно очевидным, что необходимо выяснить, является ли стабильным уровень гликированного гемоглобина в крови, изъятой из трупов и зависит ли он от давности наступления смерти, а также сроков хранении крови in

vitro.

Из всех существ!ющих на сегодняшний день методов определения гликированного гемоглобина в крови, был избран колориметрический метод, который является наиболее приемлемым для повседневной работы клинико-диагностических лабораторий и не требует дорогостоящей аппаратуры и реактивов (Карпова Е.А., Городецкий В.К.,1989). Кроме того, метод отличается высокой чувствительностью, точностью и хорошей воспроизводимостью.

Неферментативно гликозилированный ( гликированный ) гемоглобин определяли с помощью метода Городецкого, который основан на кислотном гидролизе гликированного гемоглобина с помощью трихлор-уксусной кислоты при нагревании пробы на кипящей водяной бане,

денатурации белков, центрифугировании, инкубации надосадочпой жидкости с тиобарбитуровой кислотой и концентрированнной соляной кислотой и спектрофотометрическом измерении цветного комплекса ТБК + 5-оксиметилфурфурола, образующегося из фруктозы в кислой среде в результате гидролиза.

Из рис.4 видно, что уровень гликированного гемоглобина не отличается от исходного при хранении крови в холодильнике при

5°С даже в течении одного года и более. При этом процент гликирования зависит от гликемического статуса погибшего, и не зависит от сроков хранения крови.

Как известно, содержание глюкозы в различных отделах сосудистой системы неодинаково (Потемкина С.А.,1975). Это было подтверждено и нашими исследованиями. Однако, изымая кровь из поротной, бедренной и печеночной вен, и измеряя концентрацию глюкозы и процент гликированного гемоглобина одновременно, было обнаружено, что гликированный гемоглобин так называемыми "репюнальны-

ми (юиоинностями" не обладает, то есть процент гликированного гемоглобина одинаков во всех отделах сосудистой системы ( Таблица 2 ).

Таблица 2.

Процент гликированного гемоглобина в крови, взятой из разных отделов сосудистой системы различных субъектов.

> процент гликированного гемоглобина (в %)

акта -----------------

печеночная вена воротная вена бедренная вена

УбЬ/УО 3,18 4,63 3,20

УУи/УС) 4,48 4,16 4,57

«67/У0 Ь,98 5,14 4,48

1046/90 3,02 2,80 3,27

1055.'УС) 5,45 5,37 5,98

Таким образом, для проведения биохимического анализа с целью установления количества гликированного гемоглобина можно брать кровь из любого отдела сосудистой системы, в то время как для определения количества глюкозы рекомендовано изъятие только из гч-дранной вены.

4. Посмертное исследование гликированного гемоглобина у больных сахарным диабетом.

одним из этапов исследований было изучение уровня гликированного гемоглобина в крови больных, умерших либо от диабетической комы, в результате заболевания сахарным диабетом, либо от тяжелых осложнений, сопровождавших данное заболевание (например, кардионаскулярные поражения) для того, чтобы убедиться в том, что уровень гликированного гемоглобина в крови больных сохраняется на высоким уровне и после смерти. Изъятие крови производили из трупов лиц, страдавших при жизни диабетом и находящихся на лечении в клинических болышцах Я 1 и № 68 г.Москвы.

Ь результате проведенных исследований было обнаружено, что уровень гликированного гемоглобина в 9 случаях из 10 превышал норму в 2-3 и более раз и все случаи заболевания сахарным диабетом были подтверждены гистологическими исследованиями.

Таким образом, после смерти больных с сахарным диабетом у них в крови сохраняется высокий уровень гликированного гемоглобина, что с успехом можно использовать в судебно-медицинской практике при выяснении и уточнении причин смерти.

5. Исследование гликированного гемоглобина в сухом пятне крови.

Следующим этапом наших исследований было установление содержания гликированного гемоглобина в жидкой крови с течением времени и при высушивании крови, а также влияние на его уровень предметононосителя.

Было проведено пять экспериментов, при которых было проведено сравнение процента гликированного гемоглобина в жидкой трупной крови и в сухом пятне крови того же образца, высушенном на изделиях из пластмассы.

Данные, приведенные в таблице 3, наглядно показывают, что сам по себе процесс высушивания на пластмассе не влияет на содержание гликированного гемоглобина в крови, поскольку результаты почти совпадают.

Таблица П.

Процент гликированного гемоглобина в жидкой крови и в пухом пятне после высушивания того же образца от различных субъектов.

Процент гликированного гемоглобина ________в конкретных случаях _

I 2 3 4 !>

г< жидксП трушюй кр'.'ВИ 1,Р0* 4,23% 4,50% 5,34% 5,\'/% I'. сухом пятне крови 4,01% 4,30% 4,59% 5,60% 5,44%

Как следует из диаграммы на рис.5 хранение образцов нп пластмассе п течение длительного периода, вплоть до 102 суток, существенно не сказывается на процессе гликирования: увеличивается статистический разброс результатов измерения, но сред ний уровень гликирования статистически достоверно не отличается от исходного.

В реальной ситуации судебно-медицинский эксперт сталкивается с необходимостью исследования следов крови, образовавшихся на

текстильных тканях (например, на хлопке), металлических поверхностях колюще-режущих предметов, стекле автомобиля, на деревянной

1'ис. Ь Изменение содержания гликированного гемоглобина (С)

при хранении сухого пятна крови in vitro (i-I4...t-I7 С) относительно исходного уровня (С ).

Обозначения: О - стекло, Ж - пластмасса.

поверхности мебели, паркете и т.д. Поэтому следующим этапом данного исследования было проведение сравнительного изучения того, как изменяется процент гликированного гемоглобина в сухих образцах крови на различных носителях - на стекле, дереве, металле и хлопке. Было проведено 316 экспериментов (каждое измерение проводилось дважды). В случаях исследования пятен крови, образовавшихся как на пластмассе, так и на стекле предметы-носители оказались индифферентным материалом и никоим образом не влияли на степень гликирования дыхательного белка крови сроком до I года от момента нанесения пятна. ( Рис.5 ).

В случаях нанесения пятен крови на хлопок с последующим высушиванием уже спустя сутки сказывалось на увеличении процента

неферментативной модификации протеина более, чем на 50% от исходного уровня и сохранялась в последующие 7 суток ( Рис.6 ).

Подобную зависимость наблюдали и в пятнах крови в высушенных на дереве образцах. Можно также отметить неуклонное усиление г.чикиронпния на дереве дпже на 54 сутки от момента изъятия крови у трупа ( Рис.6 ).

Гликирование на металле происходит более медленно, хотя и статистически достоверно увеличивается спустя 53 сутки от момента взятия проб крови ил трупа ( Рис.6 ).

Таким образом, точно судить о прижизненной гликемии по проценту гликирования гемоглобина в сухих образцах крови можно, если жидкая кровь изливалась на пластмассовую или стеклянную поверхность. При изучении сухих пятен крови на ткани, дереве или металле следует вводить поправку на спонтанное увеличение процента гликирования, которое, не связано с прижизненной гликемией. Конечно, точность способа в последних случаях становится меньше, чем исследование сухой крови нп стекле или пластике.

6. Сравнительное исследование гликированного гемоглобина двумя методами (колориметрическим и с помощью колоши).

Методика определения гликированного гемоглобина, предложенная Городецким В.К. Зила нами избрана как наиболее доступная, достоверная и не требующая дорогостоящей аппаратуры и реактивов. С другой стороны, она требует определенных навыков и внимания. Конечно, при всех своих положительных характеристиках данный метод трудоемок и занимает много времени ( около трех часов). Поэтому мы решили использовать колонку с аффинным сорбентом, содержащим фенилборную кислоту. Данный сорбент был разработан в институте биологической и медицинской химии АМН СССР Ковалевой Г.Г. и Городецким В.К.

Для исследований брали жидкую трупную кровь лиц мужского и женского пола с различными давностью наступления и причинами смерти. Определение процента гликированного гемоглобина проводили одновременно двумя методами - колориметрическим и с помощью колонки. На рис.7 показано, что существует хорошая корреляция между двумя методами, что позволяет надеется на дальнейшее внедрение экспресс-метода в практику судебно-медицинских лабораторий.

Рис. 7 Оценка содержания гликированного гемоглобина колоночным (ордината) и колориметрическим (абсцисса) методами. В - коэффициент корреляции, Р - его достоверность.

Следует подчеркнуть, что было бы ошибкой полностью отказаться от определения глюкозы у погибших. Эти два метода дополняют друг друга. Нам представляется - и это вытекает из наших наблюдений, что для идентификации различных прижизненных состояний необходимо определять два параметра одновременно: и уровень глюкозы в крови и процент гликированного гемоглобина. Например, высокая концентрация глюкозы в крови при нормальной степени глики-рования гемоглобина свидетельствует только об однократном повышении этого "сахара" (что, кстати, может быть и при стрессе). Напротив, нормальные цифры глюкозы при увеличении процента гликированного гемоглобина позволяют сделать вывод о прижизненной гипергликемии в течение 3-4 последних месяцев (а также заподозрить наличие скрыто протекающего или начинающегося сахарного диабета). При отсутствии же глюкозы в крови о гипер- или гипогликемии до момента смерти может свидетельствовать только процент гликированного гемоглобина.

ВЫВОДЫ:

1. Содержание гликированного гемоглобина в крови, в отличие от глюкозы, не зависит от места ее изъятия при аутопсии и его количество оказывается неизменным на протяжении одного года ггри хранении крови in vitro.

2. При длительном хранении крови в виде сухого пятна (при нормальных условиях), образованного на стекле ( I год ) или на пластмассе (100 суток), не происходит статистически значимого увеличения содержания гликированного гемоглобина в отличие от образцов, находящихся на хлопке, металле или дереве, где процесс гликирования ускоряется по мере хранения.

Концентрация глюкозы в пятнах крови, образованных на стекле и пластмассе в указанный период снижается вплоть до полного исчезновения .

3. Исследование сухих пятен крови, образованных на стекле

и пластмассе по крайней мере в течение первых 3-х суток позволяет ориентироваться в отношении исходного (повышенного, нормального или пониженного) содержания глюкозы в крови потерпевшего в момент происшествия. В сочетании с определением гликированного гемоглобина в тех же образцах крови возможно (в сопоставлении с данными аутопсии) судить о природе увеличения концентрации глю-

Т9

козы б крови потерпевшего в момент получения травмы.

4. Разработан и предложен для внедрения в практику судебной медицины метод определения гликированного гемоглобина в образцах жидкой крови, изъятой из трупа и в ее образцах из сухого пятна. Метод может бить использован для оценки гликомического статуса потерпевшего в случаях причинения смертельных повреждений .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

Для проведения исследования гликемического статуса трупа необходимо изъять кровь из бедренной вены в количестве 1-2 мл. Определение концентрации глюкозы производится с помощью ферментативного глюкозооксидазного метода, используемого в клинико-диагностических лабораториях, а определение процента гликированного гемоглобина - согласно методическому письму Бюро главной судебно-медицинской экспертизы Российской Федерации, 1993 г.

Проведение данных исследований можно рекомендовать судебно-медицинскому эксперту для определения прижизненного (непосредственно перед наступлением смерти или в момент наступления смерти) уровня гликемии, например, у водителей - участников дорожно-транспортных происшествий, либо в случаях скоропостижной смерти при отсутствии на секции какой-либо патологии, приведшей к смерти, либо использовать как один из критериев при идентификации ( особенно если известно, что при жизни человек болел сахарным диабетои) и т.д.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.Н.Качина с соавт. "Способ определения гликемии в трупной крови.Положительное решение от 23 января 1992 г.

N 4,.*иу846/14 (107246) Приоритет от 31 октября 1990 года.

2. Н.Н.Качина с соавт. "Способ определения отсроченной гликемии". Положительное решение от 28 декабря 1991 г.

N 4891)527/14 (П0341). Приоритет от 14 ноября 1990г.

3. Н.Н.Качина. "Посмертная оценка гликемии по уровню глюкозы и гликозилированного гемоглобина крови." - Судебно-медицинская экспертиза. М;"Медицина", 1991, N4, с.7-11.

4. Н.Н.Качина. "Уровень глюкозы в крови не может служить надежным параметром при судебно-медицинской экспертизе." В сб.: Современные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Выпуск 5, Ижевск, изд-во "Удмуртия", 1991, с Л68-171.

5. Н.Н.Качина. "Содержание гликированного гемоглобина в трупе как доказательство уровня прижизненной гликемии." В сб.: Современные вопросы судебной медицины и экспертной практики. Выпуск 6 Ижевск-Москва, изд-во "Удмуртия", 1993, с.197-200.

6. Н.Н.Качина. "Определение глюкозы в жидкой крови и в сухом пятне при проведении судебно-медицинских экспертиз." В сб.: 3-й Всероссийский съезд судебных медиков. - Саратов, 1992, с.239-243.

7. Качина H.H. "Способ определения гликемии в трупной крови". Методическое письмо. Бюро главной судебно-медицинской экспертизы Российской Федерации, 1993, 20 с.