Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Исследование фармакологической активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты
- Ученая степень
- кандидата медицинских наук
- ВАК РФ
- 14.03.06
Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование фармакологической активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты
На правах рукописи
005054632
СИДЕХМЕНОВА АНАСТАСИЯ ВИТАЛЬЕВНА
ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЛИПОЕВОЙ КИСЛОТЫ
14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
-.8 НОЯ 2012
Томск -2012
005054632
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Официальные оппоненты:
Суслов Николай Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория фитофармакологии, заведующий лабораторией
Афанасьев Сергей Александрович, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт кардиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, лаборатория молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики, заведующий лабораторией
Ведущее учреяадение: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится "Р/гд-г Л 2012 г. в "_" часов на заседании
диссертационного совета Д.001.031.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (634028, Томск, пр. Ленина, 3)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт фармакологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Автореферат разослан " ^ т2 12 г.
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
Плотников Марк Борисович
профессор, заслуженный деятель науки РФ
Научный консультант:
доктор медицинских наук, доцент
Носарев
Алексей Валерьевич
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук
Амосова Е.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей - распространенное заболевание, представляющее собой большую медицинскую и социальную проблему, особенно в индустриально развитых странах, где встречаемость этой патологии среди взрослого населения достигает 50% [Савельев B.C., 2001; Allan P.L., 2000; Bergan J.J., 2007]. Высокая социально-экономическая значимость хронической венозной недостаточности нижних конечностей обусловлена большим количеством больных, высокой стоимостью лечения, а также снижением качества жизни и потерей трудоспособности. Несмотря на развитие новых эффективных методов диагностики и терапии, проблема хронической венозной недостаточности в полной мере не разрешена и усугубляется тем, что данное заболевание является прогрессирующим и имеет склонность к рецидивам [Chiesa R., 2007; Forssgren А., 2008]. Ежегодные затраты на лечение хронической венозной недостаточности в западноевропейских странах составляют 1—2% от всего бюджета здравоохранения [Beebe-Dimmer J.L., 2005; Hafiier J., 2010].
В патогенез хронической венозной недостаточности нижних конечностей вносят свой вклад множество факторов: оксидативный стресс, нарушение проницаемости капилляров и лимфооттока, расстройства реологических свойств крови, гемостаза и микроциркуляции, дисфункция эндотелия, воспалительные реакции [Allegra С., 2003; Bergan J.J., 2007]. Поэтому актуальной проблемой является разработка эффективных флеботропных средств, обладающих широким спектром фармакологической активности, с целью повышения качества терапевтических мероприятий при лечении данной группы больных.
Исходя из современных представлений о механизмах формирования хронической венозной недостаточности нижних конечностей целесообразно использование веществ, способных уменьшать оксидативный стресс и ингибировать воспалительный каскад, что может предотвращать прогрессирование повреждения функций венозных клапанов. Известно, что антиоксиданты способны проявлять противовоспалительную, гемореологическуго, ангиопротекторную и капиляропротекторную активность [Менгцикова Е.В., 2006; Cadenas Е., 2002; Packer L., 2007]. Ввиду этого перспективным является разработка новых флеботропных средств на основе антиоксидантов.
Цель работы: исследовать фармакологическую активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели хронической венозной недостаточности и выявить механизмы ее флеботропного действия.
Задачи исследования;
1. Изучить антиоксидантную, капилляропротекторную, лимфокинетическую и гемореологическую активность композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты в сравнении с эффектами отдельных компонентов композиции.
2. Исследовать влияние дагидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен.
3. Изучить влияние композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели отека, воспаления, микроциркуляции и гемостаза в условиях модели хронической венозной недостаточности.
4. Исследовать антитромбогенную активность композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты на модели венозного тромбоза.
Научная новизна. Получены данные об усилении общей антиоксидантной активности композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты по сравнению с отдельными компонентами в модельной системе in vitro. Выявлена капилляропротекторная, лимфокинетическая и гемореологическая активность композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты. Впервые проведено исследование влияния дагидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен. Разработана оригинальная модель хронической венозной недостаточности, которая заключается в частичной окклюзии каудальной полой вены. На модели хронической венозной недостаточности установлено, что композиция дагидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет противоотечный и противовоспалительный эффекты, улучшает показатели микроциркуляции и гемостаза. Новыми являются данные о наличии у композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты антитромбогенного эффекта, выявленного в условиях модели венозного тромбоза.
Практическая значимость. Полученные данные о флеботропной активности композиции дагидрокверцетина и липоевой кислоты позволяют рекомендовать ее в качестве основы для разработки средства лечения хронической венозной недостаточности. Оригинальная модель хронической венозной недостаточности у крыс может быть рекомендована для доклинических исследований флеботропных препаратов.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научно-практической конференции «Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири» (Красноярск, 2010); Annual Russian-Korean Conference «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» (Novosibirsk, 2010); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина» (Уфа, 2010); VI Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Санкт-Петербург, 2010);
Научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Крым, Украина, 2011); I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биологический конгресс» (Барнаул, 2011); Всероссийской молодежной научной конференции «Химия и технология новых веществ» (Сыктывкар, 2011).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получены 3 патента на изобретения.
Объем и структура работы: Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 230 источников, из них 59 отечественных и 171 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 5 рисунками и 12 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на 172 аутбредных крысах-самцах сток Вистар массой 250-300 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН г. Томск. Животные находились в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе и свободном доступе к воде и пище. Массу животных контролировали еженедельным взвешиванием для коррекции вводимой дозы препаратов. Условия содержания и манипуляции с животными соответствуют стандартам, указанными в нормативных документах регламентирующих работу с лабораторными животными [ГОСТ 53434,2010; ГОСТ Р ИСО 10993-2,2009].
В работе использовали дигидрокверцетин (ООО «Флавир», Россия), липоевую кислоту (ООО «Марбиофарм», Россия), гесперидин+диосмин (Детралекс «Лаборатория Сервье Индастри», Фрашщя)
Хирургические процедуры выполняли под общим наркозом (тиопентал натрия 60 мг/кг внутрибрюшинно или диэтиловый эфир ингаляционно).
Препараты в виде суспензий в 1% крахмальной слизи вводили внутрижелудочно однократно или курсом в зависимости от условий эксперимента.
Моделирование хронической венозной недостаточности осуществляли путем ограничения кровотока в полой вене. Для этого у животных в асептических условиях под эфирным наркозом проводили лапаротомию, выделяли участок каудальной полой вены проксимальнее правой почечной вены. Подводили под сосуд лигатуру после чего в бедренную вену вводили
гепарин в дозе 250 БД/кг и осуществляли частичную окклюзию каудальной полой вены. Для этого на участок полой вены помещали иглу диаметром 0,8 мм и перевязывали полую вену. Затем иглу удаляли, частично восстанавливая просвет сосуда. Рану послойно ушивали и проводили обработку операционного поля антисептиками (0,02% раствор фурацилина, порошок стрептоцида). Для снижения риска послеоперационных инфекций перед операционным вмешательством животным внутримышечно вводили гентамицин (4 мг/кг). У ложнооперированных животных полностью повторяли оперативное вмешательство, исключая этап окклюзии сосуда.
Венозный тромбоз моделировали через час после последнего введения композиции методом, описанным I. Reyers et al. [1989]. Для этого животных наркотизировали тиопенталом натрия, вскрывали брюшную полость, выделяли полую вену, очищали ее от прилежащих тканей и полностью лигировали хлопковой нитью ниже левой почечной вены. После чего брюшную полость послойно ушивали. Через 2 часа проводили лапаротомию, участок вены (длинной 7 мм) иссекали. Тромб выделяли из просвета сосуда, избыток крови удаляли фильтровальной бумагой. Оценивали массу влажного тромба [Н. Gerhard 2008].
.Определение общей антиоксидантной активности in vitro проводили с использованием спектрофотометрического метода, описанного Р. Prieto et al [1999]. В данном методе присутствие антиоксидантов в реакционной среде сопровождается увеличением оптической плотности, которое отражает выраженность антиоксидантной активности веществ.
Исследование капилляропротекторной активности проводили с использованием метода И.А. Ойвина и K.M. Монаковой [1953]. Критерием сосудистой проницаемости служило время выхода красителя в очаг воспаления, вызванного внутрикожным введением 0,02 мл ксилола. В качестве индикатора проницаемости (Бфасителя) капилляров использовали синий Эванса.
При оценке лимфокинетической активности определяли скорость оттока лимфы (мкл/кг-мин), выделившейся из катетерезированной млечной цистерны (cisterna chili) животных. Лимфу стабилизировали гепарином в конечной концентрации 50 ЕД/мл.
Для исследования гемореологической активности забор проб цельной крови осуществляли из общей сонной артерии крыс. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1.
Гемореологическую активность оценивали на модели «гипервязкости» крови in -vitro [Плотников М.Б., 1996]. Модель «гипервязкости» крови воспроизводили инкубацией проб крови при температуре 22±1 °С в течение 60 минут. Абсолютные значения вязкости крови измеряли на ротационном
вискозиметре АКР-2 [Левтов В.А., 1982]. В кювету вискозиметра объемом 0,8 мл помещали стабилизированную кровь. Вязкость крови регистрировалась при скоростях сдвига 3 с"1, 5 с'1, 7 с"1, 10 с"1, 50 с"1, 100 с"1 и 300 с"1 [Добровольский H.A., 1997].
Для исследования сократительной функции вен эвтаназию животных проводили без применения медикаментозного наркоза методом декапитации. После этого вскрывали брюшную полость, выделяли участок воротной вены. Максимальный промежуток времени между забором материала и началом эксперимента не превышал 15 минут. Для изучения сократительной активности приготавливались кольцевые сегменты воротной вены шириной 1-2 мм. При исследовании сократительной активности сегментов воротной вены использовали метод механографии. В качестве механоэлектрического преобразователя применяли прецизионный датчик силы FTlOg (Украина), что позволяло проводить эксперимент в условиях, близких к изометрическим. В качестве регистрирующего устройства использовали персональный компьютер с 14-битным АЦП L791 (Л-Кард, Россия). Данные обрабатывали с помощью программы «Lgraph 2». Эффекты дигидрокверцетина, липоевой кислоты и норадреналина оценивали в процентах от амплитуды контрольного сокращения сегментов (100%) на стандартную концентрацию KCl, которая составляла 40 мМ. После 30-минутной инкубации сегментов с дигидрокверцетином (25 мкМ) или липоевой кислотой (25 мкМ) оценивали амплитуду сокращения сегментов на норадреналин гидротартрат (1-Ю"6 М). В отдельной серии экспериментов оценивали реакцию сосудов на последовательное введение дигидрокверцетина и липоевой кислоты в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ). Липоевую кислоту и дигидрокверцетин растворяли в растворе Кребса с добавлением диметилсульфоксида (1,3 мМ).
Давление в каудальной полой вене регистрировали прямым методом с использованием аппаратного комплекса для электрофизиологаческих исследований Biopac (США) на уровне впадения в нее подвздошной вены с помощью датчика давления TSD104A. Перед измерением давления крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, затем внутривенно вводили гепарин в дозе 250 ЕД/кг. Доступ осуществлялся через бедренную вену.
Противоотечный эффект оценивали по изменению объема стопы задних конечностей онкометрическим методом и морфологически. На гистологических препаратах мышцы голени, окрашенных гематоксилином и эозином, с помощью программы «Adobe Photoshop CS2» измеряли площадь
интерстициального пространства по отношению к стандартной площади ткани (в %) в полях зрения при десятикратном увеличении1.
Состояние микроциркуляции задней конечности оценивали у животных под эфирным наркозом методом лазерной допплеровской флоуметрии, используя анализатор мшфоциркуляции крови ЛАКК-02. В качестве показателя характеризующего состояние микроциркуляции использовали коэффициент вариации (Ку) [Крупаткина А.И., 2005].
Для оценки показателей гемостаза пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 после чего центрифугировали для получения плазмы. Исследование показателей свертывающей системы крови проводили на коагулометре КО-4 (Соппау, Польша). Концентрацию фибриногена в плазме оценивали методом тромбообразования Клауса с использованием набора реагентов для определения концентрации фибриногена «Фибриноген-тест». Определение активированного парциального (частичного) тромбопластинового времени и протромбинового времени проводили с помощью наборов «АГГГВ (АЧТВ)-тест» и «Техшгастин-тест» («Технология-стандарт», Россия) соответственно.
Для оценки адгезионной активности лейкоцитов пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом и стабилизировали гепарином 25 ЕД/мл. Суспензию лейкоцитов получали центрифугированием в градиенте плотности (фшсолл-верографиновый буфер; 30 мин при 1500 об./мин). Лейкоциты дважды отмывали раствором Хэнкса, центрифугируя при 1000 об./мин в течение 15 мин. Осадок ресуспендировали в 5 мл раствора Хенкса [Гольдберг Е.Д., 1992]. Полученную суспензию лейкоцитов (40 мкл) помещали в капилляр с внутренним диаметром 1 мм, предварительно обработанный раствором Дюльбекко. Клетки инкубировали при 37 "С в течение 60 мин. Клеточную взвесь удаляли из капилляра при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,05 кгс/см2. После чего капилляр заполняли раствором Дюльбекко и освобождали от содержимого уже при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,225 кгс/см2. Число клеток подсчитали в исходной суспензии, а также первом (неадгезировавшие и с малой силой сцепления) и втором (со средней силой сцепления) смыве, используя камеру Горяева. Из полученных данных рассчитывали число клеток, оставшихся в капилляре (с большой силой сцепления) [Ме£е I., 1989].
1 Выражаем искреннюю благодарность к.м.н., старшему научному сотруднику отдела лекарственной токсикологии НИИ фармакологии СО РАМН Фоминой Т. И. за помощь в
проведении эксперимента.
С-реактивный белок в сыворотке крови определяли методом латекс-агглютинации с помощью набора «С-реактивный белок латекс тест» («Ольвекс диагностикум», Россия).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 8.0». Данные представлены в виде М±т, где М - среднее значение, т - стандартная ошибка среднего значения. Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрические критерии Mann-Whitney U test и метод %-квадрата.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании антиоксидантных свойств дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции in vitro выявлено, что общая антиоксидантная активность дигидрокверцетина в концентрации 0,002% была выше, чем у липоевой кислоты в аналогичной концентрации в 1,5 раза.
Рис. 1. Общая антиоксидантная активность дигидрокверцетина (ДКВ), липоевой кислоты (ЛК) и их композиции (ДКВ+ЛК). ОБ^з - оптическая плотность растворов.
* - р<0,05 по сравнению со значениями в пробах с липоевой кислотой (0,002%); & - р<0,05 по сравнению со значениями в пробах с дигидрокверцетином (0,002%) и липоевой кислотой (0,002%).
При добавлении в реакционную смесь композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в концентрации каждого компонента 0,002% установлено, что общая антиоксидантная активность превышала значения, полученные при добавлении дигидрокверцетина в концентрации 0,002% (в 1,6 раз) и липоевой кислоты в концентрации 0,002% (в 2,4 раза) (рис.1).
Таким образом, общая антиоксид антная активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 превышала активности компонентов смеси в отдельности, т.е. наблюдалось явление суммированного синергизма в модельной системе in vitro.
При изучении капилляропротекторной активности установлено, что дигидрокверцетин в дозе 20 мг/кг при курсовом введении в течение 7 дней увеличивал время выхода красителя на 27% по сравнению с контрольными значениями. Возрастание времени выхода красителя при введении липоевой кислоты в дозе 20 мг/кг по аналогичной схеме было не достоверно (табл. 1). Следовательно, дигидрокверцетин в отличие от липоевой кислоты проявляет выраженную капилляропротекторную • активность, существенно снижая проницаемость капилляров у крыс.
Таблица 1
Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиций на проницаемость капилляров у крыс Вистар______
Группы животных Время выхода красителя, с
Контроль, п=6 148±5
Дигидрокверцетин (20 мг/кг), п=6 188±4+
Липоевая кислота (20 мг/кг), п=6 160±6
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (10 мг/кг), п=6 193±9+
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (20 мг/кг), п=6 224±12+#
Дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевая кислота (40 мг/кг), п=6. 167±4+
Примечание: + - р<0,05 по сравнению с контролем; # - р<0,05 по сравнению со значениями у животных, получавших дигидрокверцетин (20 мг/кг).
Композиция дигидрокверцетина (20 мг/кг) и липоевой кислоты (10 мг/кг) при курсовом введении увеличивала время выхода красителя на 30% по сравнению с контролем. В группе животных, получавших композицию дигидрокверцетина (20 мг/кг) и липоевой кислоты (20 мг/кг) время выхода красителя на 51% превышало контрольное значение и на 19% - значения у крыс, получавших один дигидрокверцетин. В группе животных, получавших
дигидрокверцетин (20 мг/кг) и липоевую кислоту (40 мг/кг), время выхода красителя превышало контрольные значения на 13% (табл. 1).
Таким образом, липоевая кислота способна усиливать капилляропротекторные свойства дигидрокверцетина. Наиболее эффективным соотношением дигидрокверцетина и липоевой кислоты является 1:1. Одним из механизмов капилляропротекторной активности может быть повышение общей антиоксидантной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты, так как в основе капилляропротекторного действия биофлавоноидов, в частности дигидрокверцетина, лежит их способность прямо или косвенно влиять на биомембраны, что, в свою очередь, связано с ингибированием в них свободнорадикальных процессов [Плотников М.Б. и соавт., 2005]. .
Инкубирование крови в течение 60 минут при температуре 22±1 °С приводило к достоверному повышению вязкости крови в диапазоне скоростей сдвига от 3 с*1 до 300 с1 на 13-29%, что свидетельствовало о формировании «гипервязкости» крови.
В группе крыс, получавших дигидрокверцетин в дозе 50 мг/кг в течение 7 суток, вязкость крови до инкубации во всем исследуемом диапазоне скоростей сдвига была ниже на 6-16% по сравнению с контрольными значениями. После инкубации вязкость крови у животных этой группы на скоростях сдвига 3-10 с" 1 и 50-300 с"1 была ниже значений контроля на 11-14% и 8-10% соответственно.
У животных, получавших липоевую кислоту в дозе 50 мг/кг в течение 7 суток, исходные значения вязкости крови как в диапазоне скоростей сдвига 3— 10 с'1, так и при скорости сдвига 50 с"1 были ниже значений в контроле на 1619% и 9% соответственно. Вместе с тем, липоевая кислота практически не сдерживала возрастание вязкости крови после инкубации в течение часа по сравнению с контролем, значимые изменения наблюдались лишь на скорости сдвига 300 с"1.
Введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 7 суток приводило к достоверному снижению исходных значений вязкости крови на скоростях сдвига 3-300 с'1 по сравнению с контролем на 6-17%. Кроме того, рассматриваемая композиция эффективно ограничивала увеличение вязкости крови после инкубации в диапазоне скоростей сдвига 3-10 с'1 на 16-18% и в диапазоне скоростей сдвига 50-300 с'1 на 8-13% по сравнению со значениями в контрольной группе (рис. 2).
Рис. 2. Влияние курсового (7 суток) внутрижелудочного введения композиции дигидрокверцетина с липоевой кислотой (по 50 мг/кг) на вязкость крови (мПа-с) через 1 ч после инкубации при температуре 22±1 °С у крыс Вистар. По оси ординат - вязкость крови; по оси абсцисс - скорость сдвига; 1 - контроль; 2 -композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты; + - р<0,05 по сравнению с контролем.
Таким образом, установлено, что курсовое внутрижелудочное введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) снижает вязкость крови у крыс и препятствует ее увеличению в условиях модели «гипервязкости» крови т \itro.
При изучении лимфокинетической активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции установлено, что в контрольной группе скорость лимфооттока составила 10б±4 мкл-кг/мин. Детралекс при однократном введении в дозе 50 мг/кг статистически достоверно увеличивал скорость лимфооттока на 38%. В группе крыс, получавших однократно липоевую кислоту в дозе 50 мг/кг, значимых изменений скорость лимфооттока по сравнению с контрольными значениями не выявлено. У животных, получавших однократно дигидрокверцетин в дозе 50 мг/кг, скорость лимфооттока превышала значения в контрольной группе на 25%. Результатом совместного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг), явилось усиление лимфокинетического эффекта дигидрокверцетина: скорость лимфооттока в этой группе животных достоверно превосходила показатель в контроле на 38% (рис. 3).
Таким образом, установлено, что дигидрокверцетин обладает лимфокинетической активностью, которая сохраняется в композиции с липоевой кислотой. Наблюдаемый лимфокинетический эффект композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) сопоставим с эффектом детралекса.
Рис. 3. Влияние однократного внутрижелудочного введения детралекса (50 мг/кг), дигидрокверцетина (50 мг/кг), липоевой кислоты (50 мг/кг) и композиции дигидрокверцетина с липоевой кислотой (по 50 мг/кг) на скорость лимфооттока (мкл/кг-мия) у крыс Вистар. + - р<0,05 по сравнению с контролем.
При изучении влияния дигидрокверцетина на сократительную активность изолированных сегментов воротной вены (п=8) было установлено, что данный препарат в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) не влиял на тонус сосудов (рис. 4).
Время, мин
Рис. 4. Сократительная активность изолированных сегментов воротной вены печени крыс при добавлении в омывающий раствор дигидрокверцетина в нарастающих концентрациях. Стрелкой указан момент добавления дигидрокверцетина.
При последовательном введении липоевой кислоты в нарастающих концентрациях (7,2 мкМ, 12,5 мкМ, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ) тоническое напряжение сегментов воротной вены (п=8) не менялось (рис. 5).
Время, мин
Рис. 5. Сократительная активность изолированных сегментов воротной вены печени крыс при добавлении в омывающий раствор липоевой кислоты в нарастающих концентрациях. Стрелкой указан момент добавления липоевой кислоты.
Поскольку имеются данные о способности ряда веществ повышать венозный тонус, продлевая стимулированную норадреналином активность венозной стенки, в следующей серии экспериментов было исследовано влияние дигидрокверцетина (25 мкМ) и липоевой кислоты (25 мкМ) на сокращение сегментов воротной вены, вызываемое добавлением в инкубационный раствор норадреналина шдротартрата (1 • 10"6 М).
В качестве предсокращающего фактора, вызывающего полумаксимальное сокращение сегментов воротной вены, использовали КС1 в конечной концентрации 40 мМ.
Норадреналина гадротартрат (МО"6 М) вызывал сокращение сегментов воротной вены (п=10). Амплитуда этого сокращения составила 112±12% от контрольного гиперкалиевого предсокращения (табл. 2).
Аналогичные опыты были проведены после предварительной 30-минутной инкубации сегментов воротной вены с дигидрокверцетином (25 мкМ) и липоевой кислотой (25 мкМ). Как и в предыдущей серии экспериментов, наблюдалось сокращение сегментов воротной вены в ответ на добавление норадреналина гидротартрата (МО45 М) в инкубационный раствор. Однако амплитуда сокращения сегмента воротной вены в ответ на добавление норадреналина после инкубации с дигидрокверцетином составила 46±11%, а
после инкубации с липоевой кислотой - 44±11% от контрольного предсокращения (табл. 2).
Таблица 2
Влияние дигидрокверцетина (25 мкМ) и липоевой кислоты (25 мкМ) на амплитуду сокращения сегментов воротной вены, вызванного норадреналином 10* М
Серия экспериментов Амплитуда, %
Контроль, п=6 ПШ2
После 30-минутной инкубации с дишдрокверцетином (25 мкМ), п=6 46±11*
После 30-минутной с липоевой кислотой (25 мкМ), п=б 44±11*
Примечание: * -р<0,05 по сравнению со значениями в контроле. Амплитуду сокращения сосуда в ответ на добавление КС1 в конечной концентрации 40 мМ принимали за 100%.
Следовательно, на изолированных сегментах воротной вены крыс дигидрокверцетин и липоевая кислота не проявляют венотонического эффекта и снижают стимулированную норадреналином сократительную активность.
Таким образом, в результате первого этапа исследования было установлено, что композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 обладает капилляропротекторной, гемореологической, антиоксидантной и лимфокинетической видами активности. В экспериментах по изучению антиоксидантной и капилляропротекторной активности выявлено усиление эффекта композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты по сравнению с эффектами ее компонентов в отдельности.
Полученные результаты явились основанием для выбора композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в соотношении 1:1 в качестве объекта для дальнейшего углубленного исследования на модели хронической венозной недостаточности у крыс.
Модель хронической венозной недостаточности, воспроизводимая частичной окклюзией каудальной полой вены у крыс приводила к ограничению кровотока в полой вене и повышению венозного давления до 105,0±7,2 мм вод.ст., что значительно превышало показатели у ложнооперированных животных (38,4±7,2 мм вод. ст.). Венозная гипертензия являлась стойкой, что свидетельствует о стабильности модели. Наряду с развитием гипертензии у
животных с частичной окклюзии каудальной полой вены на 14-е сутки наблюдалось увеличение объема стопы задних конечностей на 8% по сравнению с ложнооперированными животными (табл. 3).
Таблица 3
Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на объем стоп задних конечностей у крыс с хронической венозной недостаточностью _
Группы животных Исходный объем, мл Объем на 14-е сутки, мл
Левая лапа Правая лапа Левая лапа Правая лапа
Ложнооперированные, п=5 1,90±0,03 1,92±0,02 1,87±0,02 1,91±0,01
Контроль, п=5 1,86±0,04 1,89±0,04 2,01±0,03*# 2,05±0,04* *
Дишдрокверцетин и липоевая кислота, п=5 1,85±0,04 1,93±0,02 1,90±0,02+ 1,93±0,03+
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных; + - р<0,05 по сравнению с контролем; " - р<0,05 по сравнению с исходными значениями.
При гистологическом исследовании выявлено увеличение интерстициального пространства на 20% по сравнению с ложнооперированными животными, что свидетельствует о признаках отека мышечной ткани (рис. 6).
Рис. 6. Мышцы голени крыс. Ложнооперированные животные (а), животные с хронической венозной недостаточностью (б) и животные с хронической венозной недостаточностью, получавшие внутрижелудочно композицию дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) (в). Отек интерстициального пространства. Окраска гематоксилином и эозином, х 10.
Таким образом, частичная окклюзия каудальной полой вены вызывала развитие стойкой венозной шпертензии, сопровождающейся отеком задних конечностей.
Борьба с отеком конечностей, который обусловлен как венозным, так и лимфатическим компонентами имеет чрезвычайно важное значение в лечении больных с хронической венозной недостаточностью. Появление отека в условиях венозного стаза и гипертензии, связано с дисбалансом между процессом транскапиллярной фильтрациии и процессами реабсорбции межтканевой жидкости и лимфатического дренажа [Низамов Ф.Х., 2008].
Введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в условиях модели хронической венозной недостаточности не влияло на венозное давление. Вместе с тем, исследуемая композиция значимо ограничивала увеличение объема конечностей и препятствовала формированию тканевого отека.
Объем стоп задних конечностей в группе животных, получавших дигидрокверцетин и липоевую кислоту, был достоверно ниже по сравнению со значениями в контроле и не отличался от величин у ложнооперированных животных (табл. 3). При этом площадь интерстициального пространства в опытной группе была меньше значений в контроле на 4% (рис. 6).
Таким образом, композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при курсовом введении крысам с моделью хронической венозной недостаточности способна снижать выраженность отека в мышечной ткани и уменьшать объем задних конечностей.
В настоящее время ведущее значение в возникновении отека и прогрессировании трофических изменений на фоне хронической венозной гипертензии отводится нарушениям, происходящим на микроциркуляторном уровне [Junger М., 2000]. В данной работе для оценки микроциркуляции использовали коэффициент вариации: соотношение величин среднего потока крови в интервалах времени регистрации и среднего колебания перфузии. Увеличение этого параметра отражает улучшение микроциркуляции, так как это повышение обусловлено лучшей вазомоторной активностью микрососудов.
У животных в условиях модели хронической венозной недостаточности выявлено нарушение микроциркуляции, отразившееся в снижении коэффициента вариации на 14% по сравнению с ложнооперированными животными. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты препятствовала нарушению микроциркуляции в этих условиях: коэффициент вариации у животных, получавших композицию дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 14 суток был выше значений в группе контроля на 11% (р<0,05) (табл.4).
Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на коэффициент вариации (Ку) в условиях модели хронической венозной недостаточности у крыс
Группа животных Кч, %
Ложнооперированные, п=5 11,82±0,10
Контроль, п=5 9,14±0,04*
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, п=5 10,16±0,09*+
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;+ — р<0,05 по сравнению со значениями у контрольных животных.
Таким образом, композиция на основе дигидрокверцетина и липоевой кислоты улучшает микроциркуляцию в условиях модели хронической венозной недостаточности у крыс.
При исследовании системы гемостаза у животных с хронической венозной недостаточностью обнаружено укорочение протромбинового времени на 14 % по сравнению с ложнооперированными животными. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты нормализовала, данный показатель до уровня значений, наблюдаемых в группе ложнооперированных животных (р<0,05) (табл.5).
Таблица 5
Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на показатели гемостаза у крыс с хронической венозной недостаточностью
Группа животных АПТВ, с ПВ, с ФГ, г/л
Ложнооперированные, п -7 1-1,8±0,7 22,2±0,6 3,2±0,1
Контроль, п-6 11,0±0,6 19,0±1,3* 3,4±0,2
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, п=7 11,2±0,3 22,9±0,8+ 3,1±0,2
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;
+ - достоверные различия по сравнению со значениями у контрольных животных (р<0,05).
В последние годы большинство авторов придерживаются мнения, что в основе патогенеза хронической венозной недостаточности нижних конечностей лежит венозная гипертензия и стаз венозной крови, активация и адгезия
лейкоцитов, дисфункция эндотелия и выделение медиаторов воспаления [Bergan J.J., 2006; Ojdana D., 2009; Pascarella L., 2005; Stvrtinova V., 2001; Takase S., 2004]. При этом активация лейкоцитов и их адгезия к эндотелию является основным пусковым механизмом воспалительных реакций.
В наших исследованиях было выявлено, что моделирование хронической венозной недостаточности у крыс приводит к достоверному повышению доли лейкоцитов с большой силой сцепления в 2,6 раза и снижение доли неадгезировавших лейкоцитов и лейкоцитов с малой силой сцепления в 1,6 раза по сравнению с ложнооперированными животными (табл. 6).
Таблица 6
Влияние курсового (14 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на адгезионную способность лейкоцитов у крыс с хронической венозной недостаточностью_
Группа животных Неадгезировавпше лейкоциты и лейкоциты с малой силой сцепления, % Лейкоциты со средней силой сцепления, % Лейкоциты с большой силой сцепления, %
Ложнооперированные, п=5 60,3±5,2 22,4±2,7 17,4±б,1
Контроль, п=6 37,6±4,1* 20,3±3,5 42,7±4,6*
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, п=5 54,3±5,9+. 26,0±2,1 19,7±3,9+
Примечание: * - р<0,05 по сравнению со значениями у ложнооперированных животных;+ — р<0,05 по сравнению с контролем.
У животных в условиях хронической венозной недостаточности наблюдалось достоверное повышение С-реактивного белка. В группе ложнооперированных крыс лишь у одного животного концентрация С-реактивного белка составила 5-10 мг/л, а у остальных - <5 мг/л. На 14-е сутки после создания модели хронической венозной недостаточности у всех животных контрольной группы содержание С-реактивного белка находилось в диапазоне 5-10 мг/л (табл. 7). Полученные нами данные свидетельствуют о развитии процесса воспаления при моделировании хронической венозной недостаточности.
Распределение животных в группах по содержанию С-реактивного белка
Группа животных С-реактивный белок 5-10 мг/л С-реактивный белок <5 мг/л Р
Ложнооперированные, п=5 1 6
Контроль, п=5 7 0 р<0,05
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, п=5 2 5 pi<0,05
Примечание: р<0,05 — по сравнению с распределением в группе ложнооперированных животных; р!<0,05 — по сравнению с распределением в группе контрольных животных.
Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при курсовом введении уменьшала в 2,2 раза число лейкоцитов с большой силой сцепления и увеличивала число неадгезировавших лейкоцитов и лейкоцитов с низкой силой сцепления в 1,2 раза, по сравнению со значениями в контроле (табл. 6).
Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты достоверно снижала уровень С-реактивного белка по сравнению с контролем: лишь у двух животных содержание С-реактивного белка находилось в диапазоне 5—10 мг/л, а у остальных значения показателя не превышали 5 мг/л (табл. 7).
Таким образом, композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет противовоспалительную активность, снижая адгезионную активность лейкоцитов и уровень С-реактивного белка.
Замедление кровотока, дисфункция эндотелия, повышение коагуляционного потенциала крови составляют триаду Вирхова и являются пусковыми механизмами венозного тромбоза [Lopez J.A., 2004]. Данные нарушения наблюдаются при хронической венозной недостаточности. Следовательно, у пациентов с хронической венозной недостаточностью повышается риск возникновения венозного тромбоза [Дибиров М.Д., 2004].
Стаз — важнейший механизм, предрасполагающий к тромбообразованию. Используемая нами модель стаз-индуцированного тромбоза, сопровождается быстрой дилатацией полой вены и образованием тромба.
Профилактическое введение композиции дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) в течение 7 суток ограничивало тромбообразование. Масса тромба у животных, получавших композицию дигидрокверцетина и липоевой кислоты, была меньше на 46% по сравнению с массой тромба животных контрольной группы (табл. 8).
Влияние курсового (7 дней) внутрижелудочного введения дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) на тромбообразование_
Группы животных Масса тромба, мг
Контроль, п=6 3,19±0,38
Дигидрокверцетин и липоевая кислота, п=5 1,45±0,22+
Примечание:+ - р<0,05 по сравнению с контролем.
Таким образом, композиция дигидрокверцетина (50 мг/кг) и липоевой кислоты (50 мг/кг) проявляет антитромбогенную активность, ограничивая тромбообразование у крыс на модели венозного тромбоза.
Дигидрокверцетин и липоевая кислота в композиции проявляют эффект синергизма в модельной системе in vitro при определении общей антиоксидантной активности. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты обладает капилляропротекторной и гемореологической активностью и по лимфокинетическому эффекту не уступает детралексу. Компоненты исследуемой композиции не проявляют венотонического эффекта.
Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели хронической венозной недостаточности, вызванной частичной окклюзией каудальной полой вены, устраняет проявления отека, воспалительных реакций, нарушения гемостаза и микроциркуляции.
Профилактическое введение композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты снижает тромбооброзование в условиях модели тормбоза, индуцированного стазом.
Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты может быть рекомендована, как основа для разработки нового флеботронного средства.
ВЫВОДЫ
1. Композиция дищцрокверцетина и липоевой кислоты проявляет суммированный синергизм в отношении антиоксидантной активности.
2. Капилляропротекторный эффект композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты превышает эффекты ее компонентов в отдельности. Наиболее выраженным капилляропротекторным эффектом обладает композиция с соотношением компонентов 1:1.
3. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты обладает гемореологяческой и лимфокинетической активностью.
4. В условиях in vitro дигидрокверцетин и липоевая кислота не оказывают венотонического действия на тонус изолированных сегментов воротной вены крыс и уменьшают амплитуду сокращения сегментов вен под действием норадреналина.
5. На модели хронической венозной недостаточности у крыс композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты снижает выраженность отека задних конечностей, проявляет противовоспалительный эффект, улучшает микроциркуляцию и нормализует протромбиновое время.
6. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при профилактическом введении проявляет антитромбогенную активность, ограничивая тромбообразование на модели венозного тромбоза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Лимфокинетическая активность дигидрокверцетина // Вопросы сохранения и развития здоровья населения севера и Сибири: Материалы итоговой научно-практической конференции, Красноярск, 2010. - Вып. 9. - С. 261.
2. Investigation of capillary-protective composition oil the base of dihydroquercetin and lipoic acid // Book of Abstracts 2nd Annual Russian-Korean Conference «Current issues of natural products chemistry and biotechnology». -Novosibirsk, 2010. - P. 75 (соавт. Ivanov I.S., Anischenko A.M., Plotnikov M.B.).
3. Гемореологическая активность композиции липоевой кислоты и дигидрокверцетина // Химия и медицина: Тез. VIII Всероссийской конференции с международным участием, Уфа, 2010. — С. 221 (соавт. Иванов И.С., Плотников М.Б.).
4. Лимфокинетическая активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты // Химия и полная переработка биомассы леса: Тезисы докладов VI Всероссийской конференции, Санкт-Петебург, 2010. - С. 247-248 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Плотников М.Б.).
5. Фармакологическая активность композиции на основе дигидрокверцетина и липоевой кислоты И Бюл. сиб. мед. — 2011. - № 1. С. 4347. (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Антценко А.М., и др.).
6. Эффекты антиоксидантной композиции на модели хронической венозной недостаточности // Medline.ru - 2010. - Т. 11. - С. 590-595 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Фомина Т.И. и др.).
7. Изменения в системе гемостаза на модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Материалы I Всероссийской
научно-практической конференции молодых ученых «Сибирский медико-биолошческий кошресс», Барнаул, 2011 - С. 30-31 (соавт. Иванов И.С.).
8. Влияние липовертина на внешний путь свертывания крови на модели хронической венозной недостаточностью нижних конечностей у крыс // Тезисы докладов научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Киев, 2011. - С. 501-502 (соавт. Иванов И.С., Плотников М.Б.).
9. Влияние антиоксидантной композиции на основе дигвдрокверцетина на уровень С-реактивного белка на модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Химия и технология новых веществ и материалов: Тезисы докладов Всероссийской молодежной научной конференции, Сыктывкар, 2011. - С. 65 (соавт. Иванов И.С.).
10. Противоотечный эффект антиоксидантной композиции в условиях модели хронической венозной недостаточности // Бюл. эксперим. биол. и мед. -2011. - Т. 152, № 7. - С. 28-31 (соавт. Иванов И.С., Алиев О.И., Фомина Т.И. и ДР-)-
И. Влияние композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели гемостаза в условиях модели хронической венозной недостаточности нижних конечностей у крыс // Бюл. сиб. мед. - 2012. - Т. 27, № 1. - С. 122-124 (соавт. Плотников М.Б., Иванов И.С.).
12. Патент на изобретение (1Ш) № 2414230 «Средство, обладающее капилляропротекторной активностью». Зарегистрирован в Госреестре РФ 20.03.2011 (соавт. Плотников М.Б., Тюкавкина Н.А., Алиев О.И. и др.).
13. Патент на изобретение (ДЦ) № 2423138 «Средство, обладающее лимфокинетической активностью». Зарегистрирован в Госреестре РФ
10.06.2011 (соавт. Плотников М.Б., Алиев О.И., Иванов И.С. и др.).
14. Патент на изобретение (1Ш) № 2438686 «Средство для лечения хронической венозной недостаточности». Зарегистрирован в Госреестре РФ
10.01.2012 (соавт. Плотников М.Б., Алиев О.И., Иванов И.С.и др.).
Отпечатано в ООО «НИП» . Томск, ул. Советская, 47, тел.53-14-Тираж 100 экз.
Оглавление диссертации Сидехменова, Анастасия Витальевна :: 2012 :: Томск
Список сокращений.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. Фармакологическая коррекция хронической венозной недостаточности нижних конечностей (обзор литературы).
1.1. Патогенез хронической венозной недостаточности нижних конечностей
1.2. Фармакотерапия хронической венозной недостаточности нижних конечностей.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Объекты исследования.
2.2. Методы исследования.
2.3. Техника проведения эксперимента.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Исследование общей антиоксидантной активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции in vitro.
3.2. Исследование капилляропротекторной активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиций.
3.3. Исследование гемореологической активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции на модели «гипервязкости» in vitro.
3.4. Исследование лимфокинетической активности дигидрокверцетина, липоевой кислоты и их композиции.
3.5. Влияние дигидрокверцетина и липоевой кислоты на сократительную активность воротной вены крыс Вистар.
3.6. Исследование противоотечной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты у крыс в условиях модели хронической венозной недостаточности.
3.7. Исследование влияния композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели микроциркуляции и гемостаза у крыс в условиях модели хронической венозной недостаточности.
3.8. Исследование противовоспалительной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты у крыс в условиях модели хронической венозной недостаточности.
3.9. Исследование антитромбогенной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели венозного тромбоза у крыс.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Сидехменова, Анастасия Витальевна, автореферат
Актуальность проблемы. Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей (ХВННК) - распространенное заболевание, представляющее собой большую медицинскую и социальную проблему, особенно в индустриально развитых странах, где встречаемость этой патологии среди взрослого населения достигает 50% [41; 64; 74]. Высокая социально-экономическая значимость ХВННК обусловлена большим количеством больных, высокой стоимостью лечения, а также снижением качества жизни и потерей трудоспособности. Несмотря на развитие новых эффективных методов диагностики и терапии проблема ХВННК в полной мере не разрешена и усугубляется тем, что данное заболевание является прогрессирующим и имеет склонность к рецидивам [91; 107]. Ежегодные затраты на лечение хронической венозной недостаточности в западноевропейских странах составляют 1-2% от всего бюджета здравоохранения [65; 70; 120].
В патогенез ХВННК вносят свой вклад множество факторов: оксидативный стресс, нарушение проницаемости капилляров и лимфооттока, расстройства реологических свойств крови, показателей гемостаза и микроциркуляции, дисфункция эндотелия, воспалительные реакции [65; 73]. Поэтому, актуальной проблемой является разработка эффективных флеботропных средств, обладающих широким спектром фармакологической активности, с целью повышения качества терапевтических мероприятий при лечении данной группы больных.
Исходя из современных представлений о механизмах формирования ХВННК целесообразно использование веществ способных уменьшать оксидативный стресс и ингибировать воспалительный каскад, что может предотвращать прогрессирование повреждения функций венозных клапанов. Известно, что антиоксиданты способны проявлять противовоспалительную, гемореологическую, ангиопротекторную и капиляропротекторную активность [32; 85; 165]. Ввиду этого перспективным является разработка новых флеботропных средств на основе антиоксидантов.
Цель работы: исследовать фармакологическую активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели хронической венозной недостаточности и выявить механизмы ее флеботропного действия.
Задачи исследования:
1. Изучить антиоксидантную, капилляропротекторную лимфокинетическую и гемореологическую активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты в сравнении с эффектами отдельных компонентов композиции.
2. Исследовать влияние дигидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен.
3. Изучить влияние композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на показатели отека, воспаления, микроциркуляции и гемостаза в условиях модели хронической венозной недостаточности.
4. Исследовать антитромбогенную активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты на модели венозного тромбоза.
Научная новизна. Получены данные об усилении общей антиоксидантной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты по сравнению с отдельными компонентами в модельной системе in vitro. Выявлена капилляропротекторная, лимфокинетическая и гемореологическая активность композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты. Впервые проведено исследование влияния дигидрокверцетина и липоевой кислоты на тонус вен. Разработана. оригинальная модель хронической венозной недостаточности, которая заключается в частичной окклюзии каудальной полой вены. На модели хронической венозной недостаточности установлено, что композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет противоотечный и противовоспалительный эффекты, улучшает показатели микроциркуляции и гемостаза. Новыми являются данные о наличии у композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты антитромбогенного эффекта, выявленного в условиях модели венозного тромбоза.
Практическая значимость. Полученные данные о флеботропной активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты позволяют рекомендовать ее в качестве основы для разработки средства лечения хронической венозной недостаточности. Оригинальная модель хронической венозной недостаточности у крыс может быть рекомендована для доклинических исследований флеботропных препаратов.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, получены 3 патента на изобретения.
Объем и структура работы: Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 230 источников, из них 59 отечественных и 171 зарубежных. Иллюстративный материал представлен 5 рисунками и 12 таблицами.
Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование фармакологической активности композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты"
ВЫВОДЫ
1. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты проявляет суммированный синергизм в отношении антиоксидантной активности.
2. Капилляропротекторный эффект композиции дигидрокверцетина и липоевой кислоты превышает эффекты ее компонентов в отдельности. Наиболее выраженным капилляропротекторным эффектом обладает композиция с соотношение компонентов 1:1.
3. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты обладает гемореологической и лимфокинетической активностью.
4. В условиях in vitro дигидрокверцетин и липоевая кислота не оказывают венотонического действия на тонус изолированных сегментов воротной вены крыс и уменьшают амплитуду сокращения сегментов вен под действием норадреналина.
5. На модели хронической венозной недостаточности у крыс композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты снижает выраженность отека задних конечностей, проявляет противовоспалительный эффект, улучшает микроциркуляцию и нормализует протромбиновое время.
6. Композиция дигидрокверцетина и липоевой кислоты при профилактическом введении проявляет антитромбогенную активность, ограничивая тромбообразование на модели венозного тромбоза.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Сидехменова, Анастасия Витальевна
1. Богачев В.Ю. Консервативное лечение хронической венозной недостаточности нижних конечностей с точки зрения доказательной медицины // Consilium Medicum. -2005. Т. 7. - № 5. - С. 415-418.
2. Богачев В.Ю. Фармакотерапия хронических заболеваний вен в свете Российских и международных рекомендаций // Ангиология и сосудистая хирургия. 2010. - № 4. - С. 88-92.
3. Богачев В.Ю., Голованова О.В., Сергеева H.A., Кузнецов А.Н. Об участии лейкоцитов в патогенезе первичных форм хронических заболеваний вен нижних конечностей // Ангиология и сосудистая хирургия. 2011. - № 3. -С. 71-75.
4. Богачев Ю.П. Хронические заболевания вен нижних конечностей: от патогенеза к лечению и профилактике // Ангиология и сосудистая хирургия. 2008. - Т. 14. - № 2. - С. 65-72
5. Веденский А.Н. Варикозная болезнь. Л: Медицина, 1983. 207 с.
6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1992. - 264 с.
7. ГОСТ 53434. Принципы надлежащей лабораторной практики. М.: Изд-во Стандартинформ, 2010. - 16 с.
8. ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к обращению с животными. М.: Изд-во Стандартинформ, 2009. - 16 с.
9. Грязев С.М., Петров С.В., Бубнова Н.А.,Варзин с.А. Динамика изменения микроциркуляции при различных методах лечения больных с хронической венозной недостаточностью // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2008. - Т. 7. - №4. - С. 42-^16.
10. Дибиров М.Д. Профилактика и лечение тромбоза поверхностных и глубоких вен нижних конечностей // Consilium Medicum 2004 - № 4. С.
11. Добровольский Н.А., Лопухин Ю.М., Парфенов А.С., Пешков А.В. Анализатор вязкости крови // Реологические исследования в медицине. М. -1997.-Вып. 1.-С. 45-51.
12. Ерофеев Н.П., Орлов Р.С. Лимфатическая система — необходимый элемент жидкостного гомеостаза организма человека новый взгляд на старые проблемы // Вестник Санкт-Петербургского Университета. 2008. - Сер 11.-Вып. 4. - С 78-86.
13. Жуков Б.Н., Яровенко Г.В., Каторкин С.Е., Мышенцев П.Н. Сочетанные оперативные вмешательства при хронической лимфовенозной недостаточности нижних конечностей // Флебология. 2008. - Т. 4. С. 62-67.
14. Золотухин И.А. Лимфедема нижних конечностей в клинической практике: возможности диагностики и лечения // Справочник поликлинического врача. 2004. - № 2. - С. 51-54
15. Золотухин И.А. Факторы риска хронической венозной недостаточности нижних конечностей и возможности ее медикаментозного лечения // Consilium Medicum 2006 - № 1. С 40^3.
16. Золотухин, И. А. Алгоритм лечения хронической венозной недостаточности нижних конечностей // Consilium-medicum. 2005. -№6. -С. 509-510.
17. Ильясов И.Р., Белобородое В.Л., Тюкавкина Н.А. и др. Применение радикал-катионов ABTS'+ в оценке антиоксидантной активности флавоноидов // Фармация. 2008. - №6. - С. 15-18.
18. Ильясов И.Р., Белобородов В.Л., Тюкавкина Н.А. Индукционный период образования ABTS *+ как характеристика антирадикальной активности ряда природных антиоксидантов // Фармация. 2008. - №8. - С. 14-17.
19. Кириенко А.И., Богачев В.Ю., Гаврилов С.Г. и др. Хронические заболевания вен нижних конечностей у работников промышленных предприятий г. Москвы // Ангиол. и сосуд, хир. 2004. - Т. 10. - № 1. - С. 77-85.
20. Кириенко А.И., Григорян Р.А., Золотухин И.А. Современные принципы лечения хронической венозной недостаточности // Consilium medicum. -2003. Т. 5. - № 6, С. 361-366.
21. Козлов В.И., Гурова О.А., Азизов Г.А., Петров С.В., Дергачева Л.И. Применение новых вазоактивных препаратов в лечении хронической венозной недостаточности нижних конечностей // Справочник поликлинического врача. 2008. - №7. - С.32-36.
22. Колхир В.К., Тюкавкина Н.А., Быков В.А. и др. Диквертин новое антиоксидантное и капилляропротекторное средство // Хим.-фарм. журн. -1995. - № 9. - С.61-64.
23. Котов С.В., Лиждвой В.Ю., Рудакова И.Г. Тиоктацид в лечении больных рассеянным склерозом в период обострения // Лечение нервных болезней 2000. - № 2. - С. 17-19.
24. Кошкин В.М., Каралкин А.В., Саитова Г.Д., Наставшева О.Д. Микро- и макроциркуляция в нижних конечностях у больных с различными формами хронической венозной недостаточности // Региональное кровообращение и циркуляция. 2004. - Т. 3. - № 2. - С. 47-51.
25. Кравченко Л.В., Морозов С.В., Авреньева Л.И., Бабкин В.А., Тутельян В.А. Оценка антиоксидантной и антитоксической эффективности природного флавоноида дигидрокверцетина // Токсикологический вестник. 2005. — №1. -С. 14-20.
26. Кубатиев A.A. Тюкавкина H.A. Быков В.А. Рудько И.А. Ядигарова З.Т. Подавление диквертином АДФ- и тромбин-индуцированного накопления цитоплазматического кальция в тромбоцитах человека // Химико-фармацевтический журнал. 1999. -№ 12. - С.3-4.
27. Кубатиев A.A., Ягогарова З.Т., Рудько И.А. и др. Диквертин -эффективный ингибитор агрегации тромбоцитов флавоноидной природы // Вопр. биол., мед. и фармацевтич. химии. 1999. - №3. - С. 47-50.
28. Кузнецов A.B. Новый способ забора лимфы у животных // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1993. - Т. 116. - № 9. - С. 329-331.
29. Ларионов М.В., Обыденнов С.А., Хафизьянова Р.Х. Патогенез развития хронической венозной недостаточности и основные направления лечебной тактики // Казанский медицинский журнал. 2004. - Т. 85. - № 6. - С. 433436.
30. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина И.Х. Реология крови. М.: Наука, 1982.-268 с.
31. Меныцикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М: Слово 2006;556.
32. Небылицин Ю.С., Сушков С.А., Солодков А.П. Дисфункция эндотелия при экспериментальном моделировании острой венозной недостаточности // Вестник ВГМУ. 2007. - Т. 6. - №2. - С. 48-55.
33. Низамов Ф.Х. Консервативное лечение заболеваний вен нижних конечностей: коррекция отечного синдрома // Справочник поликлинического врача. 2008. - №5. - С. 64-66.
34. Ойвина И.А., Монакова К.Н. Методика количественного изучения противовоспалительных средств // Фармакол. и токсикол. 1953. - Т. 16. - № 6.-С. 50-51.
35. Пахомов В.П., Горошко O.A. Антиоксидантная активность субстанции дигидрокверцетина различной чистоты // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010. - № 9. - С.52-54.
36. Петров C.B., Азизов Г.А., Козлов В.И. Расстройства микроциркуляции при хронической венозной недостаточности нижних конечностей и ее оценка неинвазивными методами исследования // Фундаментальные исследования. -2007. -№12. -С. 235-240.
37. Плотников М.Б., Колтунов A.A., Алиев О.И. Метод отбора лекарственных веществ, влияющих на реологические свойства крови in vitro // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1996. - № 6. - С. 57-58.
38. Плотников М.Б., Тюкавкина H.A., Плотникова Т.М. Лекарственные препараты на основе диквертина. Томск. Изд-во Том. ун-та, 2005. - 228 с.
39. Поташов Л.В., Амосов В.И., Лапенкин C.B., и др. Патогенетические основы развития варикозной болезни вен нижних конечностей по данным динамической радионуклидной флебографии // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2005. - Т. 4. - С. 13-19.
40. Савельев B.C. Флебология. М: «Медицина», 2001. - 660 с.
41. Сапелкин C.B. Отек как мера тяжести ХВН и критерий эффективности проводимой терапии // Ангиология и сосудистая хирургия. 2008. - Т. 14. -№ 3. - С. 79-82.
42. Сиротин Б.З., Жмеренецкий К.В. Состояние микроциркуляции у больных хронической венозной недостаточностью нижних конечностей.//Ангиология и сосудистая хирургия. 2003. - №3. - С. 60-66.
43. Стойко Ю.М. Факторы риска хронической венозной недостаточности нижних конечностей и возможности комплексной консервативной терапии // Consilium medicum, 2007.- № 11. С. 104-108.
44. Стойко Ю.М., Ермаков H.A., Шайдаков Е.В. Консервативная терапия хронической венозной недостаточности нижних конечностей в стадии трофических расстройств (клинические и фармакоэкономические аспекты) // Флеболимфология. 2003. - №19. - С. 12-16.
45. Стойко Ю.М., Мазайшвили К.В., Хлевтова Т.В., Моренко Д.Н., Кутидзе H.A. «Порочный круг» патогенеза хронической венозной недостаточности нижних конечностей: выбор эффективной фармакотерапии // Consilium medicum. Хирургия. 2011. - № 1. - С.20-21.
46. Стуров В.Г., Романова Е.Г. Применение растительных изокверцетинов в лечении дисгорманальной ангиофлебопатии у женщин в менопаузе на фоне заместительной гормонотерапии // Тромбоз гемостаз и реология, 2012. № 1. - С.65-71.
47. Тутельян В.А., Кравченко J1.B., Авреньева Л.И., Морозов C.B., Бабкин В.А. Оценка антиоксидантной и антитоксической эффективности природного флавоноида дигидрокверцетина // Токсикологический вестник. 2005. - № 1. -С. 14-20.
48. Тюкавкина H.A., Колесник Ю.А., Смирнова Л.П., и др. Механизм ингибирующего действия дигидрокверцетина на процесс пероксидного окисления фосфолипидов мембран // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. 2003. - № 6. - С. 37^3.
49. Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск XI. Под редакцией А.Г. Чучалина (главный редактор), Ю.Б. Белоусова, В.В. Яснецова. Изд-во «Эхо», 2010. - 896 с.
50. Харкевич Д. А. Венотропные (флеботропные) средства // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. - № 1. - С. 69-77.
51. Черняк Ю.И., Щукина О.Г. Состояние процессов пероксидации у крыс в отдаленном периоде после хронического введения дигидрокверцетина // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2009. - Т. 147. - № 5. - С. 532-535.
52. Швальб П.Г. Системный подход к патогенезу хронической венозной недостаточности нижних конечностей // Ангиология и сосудистая хирургия. 2002. - Т.8. - № 3. - С. 30-35.
53. Швальб П.Г., Ухов Ю.И. Патология венозного возврата из нижних конечностей. Рязань, 2009. - 152 с.
54. Ядигарова З.Т., Кубатиев A.A., Тюкавкина H.A. Влияние ДКВ на взаимодействие тромбоцитов с моноцитами // Человек и лекарство: Материалы IX Рос. Конгресса М., 2002. С. 370.
55. Ядигарова З.Т., Кубатиев A.A., Тюкавкина H.A. Влияние ДКВ на содержание Ca . цит. и циклических нуклеотидов в моноцитактивированных тромбоцитах // Человек и лекарство: Материалы I X Рос. Конгресса М., 2002. С. 730.
56. Adam B.S., Pentz R., Siegers C.P, Strubelt О., Tegtmeier M. Troxerutin protects the isolated perfused rat liver from a possible lipid peroxidation by coumarin // Phytomedicine. -2005. Vol. 12(1-2). - P. 52-61.
57. Agus G.B. Medical treatment of chronic venous disease: evolution or involution? // Minerva Cardioangiol. 2011. - Vol. 59(3). - P. 285-298
58. Alberti L.R., Petroianu A., Correa D., Franco Silva T. The influence of physical activity on chronic venous insufficiency of the lower limbs // Acta Med Port. 2008. - Vol. 21(3). - P. 215-220.
59. Alexandru N., Georgescu A., Amuzescu M., Zamfir C., Badila A., Popov D. Platelet reactivity in chronic venous insufficiency // Clin Lab. 2011. - Vol. 57(7-8).-P. 527-534.
60. Allan P.L., Bradbury A.W., Evans C.J. et al. Patterns of reflux and severity of varicose veins in the general population. Edinburgh Vein Study // Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 2000. - Vol. 20. - P. 470-477.
61. Allegra C. Chronic venous insufficiency: the effects of healf-care reforms on the cost of treatment and hospitalization an Italian perspective // Current Medical Res Opinion. - 2003. - Vol. 19 (8). - P. 761-769.
62. Anandakumar P.P., Malarkodi S.P., Sivaprasad T.R. et al. Antioxidant DL-alpha lipoic acid as an attenuator of adriamycin induced hepatotoxicity in rat model // Indian J Exp Biol. 2007. - Vol. 45(12). - P. 1045-1049.
63. Anderson F.A.Jr., Spencer F.A. Risk Factors for Venous Thromboembolism // Circulation. 2003. - Vol. 107. - P. 1-9.
64. Bamigboye AA, Smyth R. Interventions for varicose veins and leg oedema in pregnancy // Cochrane Database Syst Rev. 2007. - Vol. 24: 1: CD001066
65. Becker C., Zijlstra J. A. New aspects of the pathogenesis of CVI and the site of action of Venoruton // Phlebology Digest. 2001. - № 14. - P. 8-11.
66. Beebe-Dimmer J.L., Pfeifer J.R., Engle J.S., Schottenfeld D. The epidemiology of chronic venous insufficiency and varicose veins // Ann Epidemiol.-2005.-Vol. 15(3).-P. 175-184.
67. Benakis A., Schopfer C., Ritschard J. Disposition of 14C-labelled ENDOTELON in humans // Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 2008. Vol. 33(1) -P. 37^13.
68. Bergan J.J Molecular mechanisms in chronic venous insufficiency // Ann Vase Surg. 2007. - № 21 - P. 260-266.
69. Bergan J.J. The Vein book. Elsevier Academic Press, 2007. - 617 p.
70. Bergan J.J., Geert M.D., Schmid-Schönbein G.W. et al. Chronic Venous Disease // N Engl J Med. 2006. - Vol. 355 - № 5 - P. 488-498.
71. Bergan J.J., Pascarella L., Schmid-Schönbein G.W. Pathogenesis of primary chronic venous disease: Insights from animal models of venous hypertension // J Vase Surg. 2008 - Vol. 47 - № 1 - P. 183-192.
72. Billmann M.K., Köhler Ch., Varelas X., Mayer D. Conservative therapy adapted to findings of superficial chronic venous ulcers // Vasa. 2004. - Vol. 33(2)-P. 97-101
73. Bito T. Roy S. Sen C.K., et al. Flavonoids differentially regulate IFNy-induced ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of action // FEBS Letters. 2002. - Vol. 520 - P. 145-152.
74. Blomgren L., Johansson G., Siegbahn A., Bergqvist D. Coagulation and fibrinolysis in chronic venous insufficiency // Vasa. 2001. - Vol. 30, № 3. - P. 184-187.
75. Boisseau M. R. Leukocyte involvement in the signs and symptoms of chronic venous disease. Perspectives for therapy // Clin Hemorheol Microcirc. -2007. Vol. 37. - № 3. - P. 277-290.
76. Boisseau M.R. Pharmocological targets of drugs employed in chronic venous and lymphatic insufficiency // Int Angiol 2002. - Vol. 21. - P. 33-39.
77. Boisseau M.R., de La Giclais B. Chronic venous diseases: roles of various pathophysiological factors // Clin Hemorheol Microcirc. 2004. - Vol. 31(1). - P. 67-74.
78. Bombardelli E., Morazzoni P. Aesculus hippocastanum L. // Fitoterapia. -1996.-№67.-P. 483-511.
79. Budzyn M., Iskra M., Krasinski Z., Dzieciuchowicz L., Kasprzak M., Gryszczynska B. Serum iron concentration and plasma oxidant-antioxidant balance in patients with chronic venous insufficency // Med Sei Monit. 2011. - Vol. 17(12).-P. 719-727.
80. Cadenas E., Packer L. Handbook of Antioxidants. New York, 2002. - 712 P
81. Callejas J.M., Manasanch J. Epidemiology of chronic venous insufficiency of the lower limbs in the primary care setting // Int Angiol. 2004. - Vol. 23(2). -P. 154-163.
82. Carrasco O.F., Vidrio H. Endothelium protectant and contractile effects of the antivaricose principle escin in rat aorta // Vascul Pharmacol. 2007. - Vol. 47. -P. 68-73.
83. Cavezzi A, Michelini S. Phlebolymphoedema. From diagnosis to therapy // Edizioni P.R. Bologna, Italy 1998. 214 p.
84. Cesarone M.R., Belcaro G., Ippolito E., et al. Clinical improvement in chronic venous insufficiency signs and symptoms with Venoruton® (HR): an 8-month, open-registry, cost-efficacy study // Panminerva Med. 2010. - Vol. 52. -Suppl. 1,-P. 43^18.
85. Chiwororo W. Dh., Ojewole J. A. Dual effect of quercetin on rat isolated portal vein smooth muscle contractility // Cardiovasc J Afr. 2010. - Vol 21. - № 3.-P. 132-136.
86. Clais B., Dournen M., Queval D., Scholtes C. at al. ENDOTELON 150 mg in veno-lymphatic failure and surface signs // Tribune Medicale. 1992. - Vol. 350.-P. 30-35.
87. Coleridge Smith P.D. Drug treatment of varicose veins, venous oedema, and ulcers. In: Gloviczki P, editor. Handbook of venous disorders: guidelines of the American venous Forum. 3rd ed. London, UK: Hodder Arnold, 2009. P. 359365.
88. Coleridge Smith P.D. From skin disorders to venous leg ulcers: pathophysiology and efficacy of Daflon 500 mg in ulcer healing // Angiology. -2003. Vol. 54. - Suppl. 1. - P. 45-50.
89. Coleridge Smith P.D. Neutrophil activation and mediators of inflammation in chronic venous insufficiency // J. Vase. Res. 1999. - Vol. 36. - Suppl. 1. - P. 24-35.
90. Coombes R. Venous thromboembolism caused 25000 deaths a year, say MPs // BMJ. 2005. - Vol. 330. - P. 559.
91. Cotonat A., Cotonat J. Lymphalogue and pulsatile activities of Daflon 500 mg on canine lymph duct // Inter. Angio. 1989. - Vol. 8.-№4.-P. 15-18.
92. Criqui M.H., Jamosmos M., Fronek A. et al. Chronic venous disease in an ethnically diverse population // Am J Epidemiol. 2003. - Vol. 158. - P. 448-456.
93. Dalsing M.C., Ricotta J.J., Wakefield T. et al. Animal models for the study of lower extremity chronic venous disease: Lessons learned and future needs // Annals of Vascular Surgery. 1998. - Vol. 12. - № 5- P. 487- 494.
94. Drug discovery and evaluation: pharmacological assays. 3 Edithion / Vogel H. G. (Ed.) / Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 2008 2071 p.
95. Eriksson E.E., Karlof E., Lundmark K., Rotzius P., Hedin U., Xie X. Powerful inflammatory properties of large vein endothelium in vivo // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. - Vol. 25(4). - P. 723-728.
96. Evans C.J., Fowkes F.G.R., Ruckley C.V., et al. Prevalence of varicose veins and chronic venous insufficiency in men and women in the general population: Edinburgh Vein Study // J Epidemiol Community Health. 1999. -Vol. 53.-P. 149-53.
97. Felixsson E., Persson I.A., Eriksson A.C., Persson K. Horse chestnut extract contracts bovine vessels and affects human platelet aggregation through 5-HT(2A) receptors: an in vitro study // Phytother Res. 2010. - Vol. 24(9). - P. 1297-1301.
98. Fiebig A., Krusche P., Wolf A., Krawczak M., Timm B., Nikolaus S., N., Schreiber S. Heritability of chronic venous disease // Hum Genet. 2010. - Vol. 127(6).-P. 669-674.
99. Forssgrenl A., Franson I., Nelzen O. Leg Ulcer Point Prevalence can be Decreased by Broad-scale Intervention: a Follow-up Cross-sectional Study of a Defined Geographical Population // Acta Derm Venereol. 2008. - Vol. 88. - P. 252-256.
100. Gajraj H., Browse N.L., Fibrinolytic activity of the arms and legs of patients with lower limb venous disease // Br. J. Surg. 1991. - Vol. 78. - № 7. - P. 853856.
101. Ghibu S., Richard C., Delemasure S. et al. An endogenous dithiol with antioxidant properties: Alpha-lipoic acid, potential uses in cardiovascular diseases //Ann Cardiol Angeiol. 2008. - Vol. 57.-№ 3.-P. 161-165.
102. Glauser F., Codreanu A., Tribout B., Mazzolai L., Depairon M. Prevention of chronic venous disease: which advice for our patients? // Rev Med Suisse. -2012. Vol. 8(327). - P. 306-310.
103. Gohel M.S., Davies A.H. Pharmacological agents in the treatment of venous disease: an update of the available evidence // Curr Vase Pharmacol. 2009. - Vol. 7.-P. 303-308.
104. Gohel M.S., Davies A.H. Pharmacological treatment in patients with C4, C5 and C6 venous disease // Phlebology. 2010. - Vol. 25, Suppl. 1. - P. 35-41.
105. Golledge J, Quigley F.G. Pathogenesis of varicose veins // Eur J Vase Endovasc Surg. 2003. - Vol. 25. - P. 319-324.
106. González-Pérez O., Moy-López N.A., Guzmán-Muñiz J. Alpha-tocopherol and alpha-lipoic acid. An antioxidant synergy with potential for preventive medicine // Rev Invest Clin. 2008. - Vol. 60(1). - P. 58-67.
107. Gschwandtner M.E., Ehringer H. Microcirculation in chronic venous insufficiency // Vascular Medicine. 2001. - Vol. 6. - P. 169-179.
108. Gumaraes P.C., Puech-Leao P., Netto B.M., et al Variations in white blood count tromboxane B2 levels and hematocrit in chronic venous hypertension // Rev. PauLMed.- 1998.-Vol 116.-P. 1721-1726.
109. Guzik B., Chwala M., Matusik P., et al Mechanisms of increased vascular superoxide production in human varicose veins // Pol Arch Med Wewn. 2011. -Vol. 121.-P. 279-286.
110. Hafner J. Conservative therapy in varicose symptom complex // Praxis. -2001.-Vol. 8.90(6).-P. 197-204.
111. Hafner J., Mayer D., Amann B., French L.E., Läuchli S., Hofer T., Ramelet A.A., Jeanneret Ch. Chronic venous insufficiency in postthrombotic syndrome and varicose veins // Praxis. 2010. - Vol. 6.99(20). - P. 1195-1202.
112. Hämäläinen M., Nieminen R., Asmawi M.Z., Vuorela P., Vapaatalo H., Moilanen E. Effects of flavonoids on prostaglandin E2 production and on COX-2 and mPGES-1 expressions in activated macrophages // Planta Med. 2011. - Vol. 77(13).-P. 1504-1511
113. Islam M.T. Antioxidant activities of dithiol alpha-lipoic acid // Bangladesh Journal of Medical Sciences. 2009. - Vol. 8(3). - P. 46-51.
114. Jacobs H , Peters R , den Hartog G J , van der Vijgh W J , Bast A , Haenen G R. Identification of the metabolites of the antioxidant flavonoid 7-mono-0-(ß-hydroxyethyl)-rutoside in mice // Drug. Metab. Dispos. 2011. - Vol. 39(5). - P. 750-756.
115. Janssens D., Delaive E., Houbion A., Eliaers F., Remacle J., Michiels C. Effect of venotropic drugs on the respiratory activity of isolated mitochondria and in endothelial cells // Br J Pharmacol. 2000. - Vol. 130(7). - P. 1513-1524.
116. Jantet G. Chronic venous insufficiency: worldwide results of the RELIEF study // Angiology. 2002.Vol. 53. - P. 245-265.
117. Jantet G. RELIEF study: fist European consolidated data // Angiology. -2000.-Vol. 51(4).-P. 31-37.
118. Jawien A. The influence of environmental factors in chronic venous insufficiency // Angiology. 2003. - Vol. 54. - Suppl. 1. - P. 19-31.
119. Jesudason E.P., Masilamoni J.G., Jebaraj C.E. et al. Efficacy of DL-alpha lipoic acid against systemic inflammation-induced mice: antioxidant defense system // Mol Cell Biochem. 2008. - Vol. 313(1-2). - P. 113-123.
120. Jones G.T, Grant M.W., Thomson I.A. et al. Characterization of a porcine model of chronic superficial varicose veins // Journal of Vascular Surgery. 2009. -Vol. 49.-№6.-P. 1554-1561.
121. Jones G.T. Animal models in chronic venous disease // Medicographia. 2008.-Vol. 30. -№. 2.-P. 154-156.
122. Jones W., Li X., Qu Z.C., et al. Uptake, recycling, and antioxidant action of a- lipoic acid in endothelial cells // Free Rad Bio Med. 2002. - Vol. 33. - P.83-93.
123. Junger M., Steins A., Hahn M, Hafner H.M. Microcirculatory dysfunction in chronic venous insufficiency (CVI) // Microcirculation. 2000. - Vol. 7. - P. 312.
124. Kahn S.R., Ginsberg J.S. Relationship between deep venous thrombosis and the postthrombotic syndrome // Arch. Intern. Med. 2004. - № 164. - P. 17-26.
125. Katsenis K. Micronized purified flavonoid fraction (MPFF): a review of its pharmacological effects, therapeutic efficacy and benefits in the management of chronic venous insufficiency // Curr Vase Pharmacol. 2005. - Vol. 3. - № 1. - P. 1-9.
126. Korthui R.J., Gute D.C. Anti-inflammatory actions of a micronized, purified flavonoid fraction in ischemia/reperfusion // Adv Exp Med Biol. 2002. - № 505. -P. 181-190.
127. Kostas T.I., Ioannou C.V., Drygiannakis I., et al. Chronic venous disease progression and modification of predisposing factors //J Vase Surg. 2010. - Vol. 51.-P. 900-907.
128. Krasinski Z., Sajdak S., Staniszewski R. et al. Pregnancy as a risk factor in development of varicose veins in women // Ginekol Pol. 2006. - Vol. 77(6). - P.441.449.
129. Krupinski K., Giedrojc J., Bielawiec M. Effect of troxerutin on laser-induced thrombus formation in rat mesenteric vessels, coagulation parameters and platelet function // Polish Journal of Pharmacology. -1996. Vol.48, Iss.3. - P. 335-339.
130. Labropoulos N., Gasparis A.P , Pefanis D., Leon L.R. Jr., Tassiopoulos A.K. Secondary chronic venous disease progresses faster than primary // J Vase Surg. -2009. Vol. 49(3). - P. 704-710.
131. Lai Y., Shih C., Huang Y., Chou T. Antiplatelet activity of a-lipoic acid // J. Agric. Food Chem.-2010.-Vol. 58.-№ 15.-P. 8596-8603.
132. Lawson C.A., Yan S.D., Yan S.F. et al. Monocytes and tissue factor promote thrombosis in a murine model of oxygen deprivation // J. Clin. Invest. 1997. - № 99.-P. 1729-1738.
133. Leach M.J , Pincombe J., Foster G. Clinical efficacy of horsechestnut seed extract in the treatment of venous ulceration // J Wound Care. 2006. - Vol. 15(4). -P. 159-167.
134. Lee A.J., Lowe G.D., Rumley A. et al. Haemostatic factors and risk of varicose veins and chronic venous insufficiency: Edinburgh Vein Study // Blood Coagul, Fibrinolysis. 2000. -Vol. 11. - № 8. - P. 775-781.
135. Lee S. B., Cha K. H., Seienge D., Solongo A., Nho C. W. The Chemopreventive Effect of Taxifolin Is Exerted through ARE-Dependent Gene Regulation//Biol. Pharm. Bull. 2007. - Vol. 30. -№ 6. - P. 1074-1079.
136. Lim C.S., Davies A.H. Pathogenesis of primary varicose veins // Br J Surg. -2009. Vol. 96. - P. 1231-1242.
137. Lopez J.A., Kearon C., Lee A.Y. Deep venous thrombosis // Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2004. - P. 439-456.
138. Lorenz D., Marek M.L. The active therapeutic principle of horse chestnut (Aesculus hippocastanum). Part 1. Classification of the active substance. Arzneimittelforschung. / Lorenz D., Marek M.L. 1960. - № 10. - P. 263-272.
139. Lyseng-Williamson K.A., Perry C.M. Micronised purified flavonoid fraction: a review of its use in chronic venous insufficiency, venous ulcers and haemorrhoids // Drugs. 2003. - Vol. 63. - № 1. - P. 71-100.
140. Maher P., Hanneken A. Flavonoids Protect Retinal Ganglion Cells from Oxidative Stress-Induced Death // IOVS. 2005. - Vol. 46. - № 12. - P. 47964803.
141. Martinez M.J., Bonfill X., Moreno R.M., Vargas E., Capellä D. Phlebotonics for venous insufficiency // Cochrane Database Syst Rev. 2005. - Jul 20;(3):CD003229.
142. McLafferty R.B., Passman M. A., Caprini J. A., et all Increasing awareness about venous disease: The American Venous Forum expands the National Venous Screening Program // J Vase Surg. 2008. - Vol. 48. - № 2. - P 394-399.
143. Mege J., Eon B., Saux P et al. Inhibition of granulocyte adhesion by pentoxifylline and analogues: Effect on leukocyte function // Proceedings of the workshop, France, 1989.-P. 17-23.
144. Meissner M. H., Moneta G., Burnand K., P. Gloviczki P., et all The hemodynamics and diagnosis of venous disease // J Vase Surg. 2007. - Vol. 46. - Suppl. S.-P. 4-23.
145. Middleton E., Kandaswami C., Theoharides T. C. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation // Heart Disease, and Cancer Pharmacol Rev. 2000. - Vol. 52, № 4. - P. 673-751.
146. Nael R., Rathbun S. Treatment of varicose veins // Curr Treat Options Cardiovasc Med. 2009. - Vol. 11(2). - P. 91-103.
147. Nicolaides A. N. From symptoms to leg edema: efficacy of Daflon 500 mg // Angiology. 2003. - Vol. 54. - Suppl. 1. - P. 33^4.
148. Nicolaides A. N. Primary chronic venous disease: a painful disease process linked to leukocyte-endothelium interaction // Medicographia. 2006. -Iss. 87. -Vol. 28,-№2.-P. 97-98.
149. Nicolaides A.N. Chronic venous disease and the leukocyte-endothelium interaction: from symptoms to ulceration // Angiology. 2005. - Suppl. 1. - P. 1119.
150. Nicolaides A.N., Allegra C., Bergan J.J. et. al. Management of chronic venous disorders of lower limbs, guidelines according to seicutific evidence. International // Angiology. 2008. - Vol. 27(1). - P. 1-59.
151. Ojdana D., Safiejko K., Lipska A. et al. The inflammatory reaction during chronic venous disease of lower limbs // Folia Histochemica et Cytobiologica. -2009. Vol. 47. - № 2. - P. 185-189.
152. Packer L, Cadenas E. Oxidants and antioxidants revisited. New concepts of oxidative stress // Free Radic Res. 2007. - Vol. 41(9). - P. 951-952.
153. Packer L., Cadenas E. Lipoic acid: energy metabolism and redox regulation of transcription and cell signaling // J. Clin. Biochem. Nutr. 2011. - Vol. 48. - № l.-P. 26-32.
154. Partsch H. Varicose veins and chronic venous insufficiency // Vasa. 2009. -Vol. 38(4).-P. 293-301.
155. Pascarella L., Lerond L., Bergan J.J., Schmid-Schonbein G.W. Venous hypertension, inflammation and valve remodeling // Eur J Vase Endovasc Surg. -2004. Vol. 28. - P. 484-493.
156. Pascarella L., Penn A., Schmid-Schonbein G.W. Venous hypertension and the inflammatory cascade: Major manifestations and trigger mechanisms // Angiology. 2005. - Vol. 56. - Suppl. l.-P. 3-10.
157. Pascarella L., Schmid-Schonbein G.W., Bergan J. An animal model of venous hypertension: The role of inflammation in venous valve failure // Journal of Vascular Surgery. 2005. - № 41. - P. 303-311.
158. Perrin M., Ramelet A. A. Pharmacological treatment of primary chronic venous disease: rationale, results and unanswered questions // Eur J Vase Endovasc Surg. 2011. - Vol. 41(1). - P. 117-25.
159. Petruzzellis V., Troccoli T., Candiani C., et al. Oxerutins (Venoruton): efficacy in chronic venous insufficiency-a double-blind, randomized, controlled study // Angiology. 2002. - Vol.53. - № 3. - P.257-263.
160. Pistorius M.A. Chronic venous insufficiency: the genetic influence // Angiologyio 2003. - Suppl. 1. - P. 5-12.
161. Pittler M.H., Ernst E. Horse chestnut seed extract for chronic venous insufficiency // Cochrane Database Syst Rev. 2006. - Vol. 25(1):CD003230.
162. Prieto P., Pineda M., Aguilar M. Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex: specific application to the determination of vitamin E // Anal Biochem. 1999. -Vol. 1;269(2). - P. 337-341.
163. Rabe E., Guex J.J., Puskas A., Scuderi A., Fernandez Quesada F. Epidemiology of chronic venous disorders in geographically diverse populations: results from the Vein Consult Program // Int Angiol. 2012. - Vol. 31(2). - P. 105-115.
164. Raffetto J. D., Khalil R. A. Ca -dependentcontraction by the saponoside escin in rat vena cava: implications in venotonic treatment of varicose veins // J Vase Surg. 2011. - Vol. 54(2). - P. 489-496.
165. Raffetto J.D., Khalil R.A. Mechanisms of varicose vein formation: valve dysfunction and wall dilation // Phlebology. 2008. - Vol. 23. - P. 85-98.
166. Raffetto J.D., Qiao X., Beauregard K.G., Khalil R.A. Estrogen receptormediated enhancement of venous relaxation in female rat: implications in sex-related differences in varicose veins // J Vase Surg. 2010. - Vol. 51. - P. 972-981.
167. Raffetto J.D., Ross R.L., Khalil R.A. Matrix metalloproteinase 2-induced venous dilation via hyperpolarization and activation of K channels: relevance to varicose vein formation // J Vase Surg. 2007. - Vol. 45. - P. 373-380.
168. Ramelet A.A., Kern P., Perrin M. Lifestyle, physical therapy and prevention. In Varicose veins and telangiectasias. Paris: Elsevier SAS, 2004. P. 139-148.
169. Reich S., Altmeyer P., Stiicker M. Systemic therapy of chronic venous diseases // Hautarzt. 2006. - Vol. 57. - P. 12-8.
170. Reyers I., de Gaetano G., Donati M.B. Venostasisinduced thrombosis in rat is not influenced by circulating platelet or leukocyte number // Agents Action. -1989.-№28.-P. 137-141.
171. Robert A.M., Robert L., Renard G. Effect of procyanidolic oligomers on corneal collagen fibrillogenesis // J Fr Ophtalmol. 2005. - Vol. 28(10). -P. 10171025.
172. Robert A.M., Savoldelli M., Legeais J.M., Robert L., Renard G. Effect of procyanidolic oligomers on corneal collagen of rabbits treated by excimer laser photoablation // Biomed Pharmacother. 2006. - Vol. 60(3). P. 113-120.
173. Robert A.M., Tixier J.M., Robert L., Legeais J.M., Renard G. Effect of procyanidolic oligomers on the permeability of the blood-brain barrier // Pathol Biol (Paris). 2001. - Vol. 49(4). P. - 298-304.
174. Robertson L., Evans C., Fowkes F. G. R.Epidemiology of chronic venous disease // Phlebology. 2008. - Vol. 23. - P. 103-111.
175. Roland I.H., Bougelet C., Ninane N., et al. Effect of hydroxyethilrutosides on hypoxial-induced neutrophil adherence to umbilical vein endothelium // Cardiovasc. Drugs. Ther. 1998. -№ 12. - P. - 375-381.
176. Rosenberg H.R., Culik R. Effect of lipoic acid supplementation on vitamin C and vitamin E deficiencies // Arch Biochem Biophys. 1959. - № 8. - P. 86-93.
177. Rotelli A.E., Guardia T., Juarez A.O., et al. Comparative study of flavonoids in experimental models of inflammation // Pharmacol Res. 2003. -Vol. 48. - № 6.-P. 601-606.
178. Roztocil K., Stvrtinova .V, Strejcek J. Efficacy of a 6-month treatment with Daflon 500 mg in patients with venous leg ulcers associated with chronic venous insufficiency// Int Angiol. 2003. -Vol. 22. - № 1. - P. 24-31.
179. Ruckley C.V., Evans C.J., Allan P.L., Lee A.J., Fowkes F.G.R. Telangiectasia in the Edinburgh Vein Study: Epidemiology and Association with Trunk Varices and Symptoms // Eur J Vase Endovasc Surg. 2008. - Vol. 36. - P. 719-724.
180. Saharay M., Shields D.A., Georgiannos S.N., et al. Endothelial activation in patients with chronic venous disease // Eur J Vase Endovasc Surg. 1998. - Vol 15.-P. 342-349.
181. Saito S., Trovato M.J., You R., et al. Role of matrix metalloproteinases 1. 2, and 9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 in chronic venous insufficiency // J Vase Surg. 2001. - Vol. 34. - P. 930-938.
182. Sakata K., Hirose Y., Qiao Z., Tanaka T., Mori H. Inhibition of inducible isoforms of cyclooxygenase and nitric oxide synthase by flavonoid hesperidin in mouse macrophage cell line // Cancer Lett. 2003. - Vol. 25; 199(2). - P. 139145.
183. Salinthone S, Schilliace R.V., Marracci G.H. et al. Lipoic acid stimulates cAMP production via the EP2 and EP4 prostanoid receptors and inhibits INF gamma synthesis and cellular cytotoxicity in NK cells // J Neuroimmunol. -2008. -Vol. 199.-P. 46-55.
184. Sandor T. Chronic venous disease. A state of art // Orv. Hetil. 2010. - Vol. 154. - № 4. - P. 131-139.
185. Sansilverti-Morel P., Rupin A., Badier-Commander C., Fabiani J., Verbeuren T. Chronic venous insufficiency: Dysregulation of Collagen Synthesis // Angiology.-2003.-Vol. 54. Suppl. l.-P. 13-18.
186. Sato I., Kotujita H., Suzuku T., et al. Antiinflamatory effect of japans horse chestnut seeds // J. Vet. Med. Sci. 2006. - Vol. 68. - № 5. - P. 487-489.
187. Schilliace R.V., Pisenti N., Pattamanuch N. et al. Lipoic acid stimulates cAMP production in T lymphocytes and NK cells // Biochem Biophys Res Commun. 2007. - Vol. 354. - P. 259-264.
188. Serra R., Buffone G., de Franciscis A., Mastrangelo D., Moiinari V., Montemurro R., de Franciscis S. A genetic study of chronic venous insufficiency // Ann Vase Surg. 2012. - Vol. 26(5). - P.636-642.
189. Shay K.P., Moreau R.F., Smith E.J. et al. Alpha-lipoic acid as a dietary supplement: molecular mechanisms and therapeutic potential // Biochim. Biophys. Acta. 2009. - Vol. 1790. - № 10. - P. 1149-1160.
190. Shi J., Yu J., Pohorly J. E. et al. Polyphenolics in Grape Seeds -Biochemistry and Functionality. Review // J. Med. Food. 2003. - Vol. 6. - № 4. -P. 291-299.
191. Slagsvold C.E., Stranden E., Rosales A. Venous insufficiency in the lower limbs // Tidsskr Nor Laegeforen. 2009. - Vol. 5; 129(21). - P. 2256-2259.
192. Smith A.R., Shenvi S.V., Widlansky M., et al. Lipoic acid as a potential therapy for chronic disease associated with oxidative stress // Curr Med Chem. -2004.-Vol. 11.-P.l 135-1146.
193. Smith C. From skin disorders to venous leg ulcers: pathophysiology and efficacy of Daflon 500 mg in ulcer healing // Angiology. 2003. - № 54. - Suppl. l.-P. 45-50.
194. Stvrtinova V. Oet al Inflammatory mechanisms involving neutrophils in chronic venous insufficiency of lower limbs // Bratisl. Lek. Listy. 2001. - Vol. 102.-№ 5-P. 235-239.
195. Suter A., Bommer S., Rechner J. Treatment of patients with venous insufficiency with fresh plant horse chestnut extract: A review of 5 clinical studies // Adv Ther. 2006. - Vol. 23. - P. 179-190.
196. Takase S., Bergan J.J., Schmid-Schonbein G.W. Expression of adhesion molecules and cytokines on saphenous veins in chronic venous insufficiency // Annals of Vascular Surgery. 2000. - № 14. - P. 427^135.
197. Takase S., Lerond L., Bergan J.J., Schmid-Schonbein G.W. The inflammatory reaction during venous hypertension in the rat // Microcirculation. -2000.-Vol. 7.-P. 41-52.
198. Takase S., Pascarella L., Lerond L., Bergan J. J. Schmid-Scho'nbein G. W. Venous Hypertension, Inflammation and Valve Remodeling // Eur J Vase Endovasc Surg. 2004. - Vol. 28. - P. 484-493.
199. Taute B.M. Chronic venous insufficiency // Internist. 2010. - Vol. 51. - № 3.-P. 351—357.
200. Turner R.B., Fowler S.L., Berg K. Treatment of the common cold with troxerutin // APMIS. 2004. - Vol. 112(9). - P. 605-611.
201. Van der Stncht J. Флебология на заре XXI века // Флеболимфология. -1996.-№ 1.-С. 2—4.
202. Vandendries ER, Furie ВС, Furie В. Role of P-selectin and PSGL-1 in coagulation and thrombosis. Thromb Haemost. 2004. Vol. 92(3). - P. 459-466.
203. Weingarten M.S. State of the art treatment of chronic venous disease // Clinical Infectious Diseases. 2001. - Vol. 32. - № 6. - P. 949-954.
204. Woodside KJ, Hu M, Burke A, Murakami M, Pounds LL, Killewich LA et al. Morphologic characteristics of varicose veins: possible role of metalloproteinases // J Vase Surg. 2003. - Vol. 38. - P. 162-169.
205. Wu G., Fang Y.Z., Yang S. et al. Glutathione metabolism and its implications for health // J. Nutr. 2004. - Vol. 134. - № 3. - P. 489^192.
206. Yamaki T., Nozaki M., Sasaki K. Predictive values in the progression of chronic venous insufficiency associated with superficial venous incompetence // International Journal of Angiology. 2000. Vol. 9. - P. 95-98.
207. Ying Z, Kherada N, Farrar B et al. Lipoic acid effects on established atherosclerosis // Life Sci. -2010. Vol. 86. - P. 95-102.
208. Zhang W, Frey B. a-lipoic acid inhibits TNF- a-induced NF-kB activation and adhesion molecule expression in human aortic endothelial cells // FASEB J. -2001.-Vol. 15(3).-P. 2423-2432.
209. Zhou J., May L., Liao P. et al. Inferior vena cava ligation rapidly inducesitissue factor expression and venous thrombosis in rats // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2009. - № 29. - P. 863-869.