Исследование экспрессии мРНК маммаглобина у пациенток с различной патологией молочных желез.

Васкевич, Елена Федоровна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование экспрессии мРНК маммаглобина у пациенток с различной патологией молочных желез.

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Васкевич, Елена Федоровна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование экспрессии мРНК маммаглобина у пациенток с различной патологией молочных желез.

На правах рукописи

Васкевич Елена Федоровна

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ мРНК МАММАГЛОБ1П1А У ПАЦИЕНТОК С РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.12-онкология

2 3 СЕН 2010

Москва-2010

004609775

Работа выполнена в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологи Росмедтехнологий (директор - член-корреспондент РАМН, профессо; В.А.Солодкий.)

Научный руководитель

Доктор медицинских наук, профессор В.К. Боженко Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Н.С. Сергеева Доктор медицинских наук, профессор М.Б. Бычков

Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского

Диссертационного совета Д.001.017.01 при Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Защита состоится

года на заседании

Д.24)

Автореферат разослан «/ » 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного сове-Доктор медицинских наук, профессор

Ю.В. Шишкин

Актуальность проблемы.

Рак молочной железы (РМЖ) является одной из наиболее юпространенных злокачественных опухолей у женщин. Ежегодно в мире тистрируется 8 млн. новых случаев рака молочной железы. (Давыдов М.И., ксель Е.М., 2008).

В настоящее время до 30-50% вновь обнаруженных РМЖ имеют III-IV адию заболевания. Сложности своевременной диагностики обусловлены ¡специфичностью клинико - рентгено- сонографических проявлений как (брокачественных, так и злокачественных заболеваний молочной железы ожкова Н.И. и др., 2009). Актуальным является поиск новых [фференциально-диагностических критериев, позволяющих различать на юперационном этапе начальные проявления рака, предраковых процессов и зличных форм доброкачественных новообразований (Летягин В.П. и др., ЮЗ, Семиглазов В.Ф. и др., 2008).

Наряду с развитием клинико-рентгено-сонографических методов [агностики РМЖ в настоящее время все больше научных работ посвящается шекулярно-генетической диагностике данного заболевания (Кушлинский ,Е. и др., 2001). Определение молекулярно-генетических маркеров в ткани [ухоли может давать дополнительную информацию о биологической рактеристике опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и ггастазированию, устойчивости к химиопрепаратам.

Одним из наиболее перспективных молекулярно-генетических маркеров АЖ является маммаглобин, который принадлежит к семейству утероглобинов >пителиальных секреторных белков (Bustin S.A. и др. 2002, Kopreski M.S. и др. >99, Chen X.Q. и др. 2000, Wong S.C. и др. 2004). Впервые ген, продуктом :спрессии которого является маммаглобин (SCGB2A1), был идентифицирован atson М.А и Flemind Т.Р в 1996 году. Экспрессия маммаглобина определяется основном в эпителиальных клетках молочной железы. При этом мРНК шмаглобина в 10 раз интенсивней экспрессируется при злокачественных >вообразованиях, чем при доброкачественных процессах (Watson М.А., 1996). гзначительную экспрессию маммаглобина можно наблюдать так же и в оровой ткани молочной железы (Becker R.M.,1998; Watson М.А.,1999; Brien N.,2002), в нормальной и опухолевой ткани потовых желез, яичников, ейки матки и предстательной железы. (Grünewald К. 2002). В тоже время, :тается не изученной связь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с :новными клинико - морфологическими признаками доброкачественных и окачественных образований молочной железы.

Одним из направлений поиска новых методов диагностики является изучение молекулярных маркеров в сыворотке или плазме крови. Обнаружение белка маммаглобина (Zehentner В. К., и др. 2004, Bernstein J.L., 2005), и мРНК маммаглобина могут иметь высокое диагностическое значение при РМЖ. (Gilbey А.М , 2004, El-Sharkawi S. L. и др. 2007, Gargano G. и др. 2006). Полученные различными авторами результаты дают интервал информативности определения мРНК маммаглобина в крови от 11% до 97% (Suchy В, 2000, Gilbey A.M., 2004, Bernstein J.L.,2005, Cerveira N.. 2004, Zehentner В. К. и др. 2004).

Цель работы

Исследование диагностической информативности экспрессии мРНК маммаглобина в ткани молочной железы, а так же в периферической крови пациентов с различной патологией молочных желез.

Задачи исследования

1. Исследовать уровень экспрессии мРНК маммаглобина в нормальной и патологически измененной ткани молочной железы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

2. Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с клинико — морфологическими признаками опухоли.

3. Оценить взаимосвязь экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-рентгено-сонографическими характеристиками патологических образований молочных желез.

4. Определить информативность определения мРНК маммаглобина в крови для дифференциальной диагностики заболеваний молочных желез.

Научная новизна

ожет служить дополнительным дифференциально-диагностическим ритерием. Разработана методика определения мРНК маммаглобина в ериферической крови, установлена высокая специфичность метода (61%). [оказано отсутствие ложноположительных результатов для опухолей других окализаций, что позволяет рекомендовать его для дифференциальной иагностюси.

Научно-практическая значимость.

В результате проведенного исследования оценена клиническая тчимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК аммаглобина в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной :елезы в зависимости от клинико-морфологического состояния опухоли, а так :е как дополнительного диагностического критерия в комплексе с рентгено -энографическим методам исследования. Изучена чувствительность и пецифичность определения мРНК маммаглобина в периферической крови ациентов с различными заболеваниями молочной железы. Показана рактическая значимость метода для выявления первичной опухоли молочной :елезы, а так же для дифференциальной диагностики РМЖ с опухолями ругой локализации.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены: на XIV Российском ациональном конгрессе «Человек и лекарство», Москва в 2006 году; на VI еждународной конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность", 1осква - 2009 год; на научно-практической конференции с международным частием «Инновации и информационные технологии в диагностической, ечебно-профилактической и учебной работе клиник», Тверь - 2009 год. лробация работы прошла в ФГУ Российском научном центре ентгенорадиологии Росмедтехнологий 18 декабря 2009 года.

Публикации.

По теме работы опубликовано 8 работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, глав: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждения, а также Выводов и Списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 115 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 29 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных пациентов.

В на стоящем исследовании проанализированы образцы ткани молочной железы 111 пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом из которых: рак молочной железы - 69 пациенток; фиброаденома молочной железы - 42 пациентки. В качестве контроля использовали участки ткани молочной железы этих же пациенток без признаков патологии. Всего было проанализировано 210 образцов ткани.

В группу с доброкачественными новообразованиями молочных желез вошли пациентки в возрасте от 19 до 59 лет, средний возраст составил 33±10,00 года.

В группу больных раком молочной железы (РМЖ) вошли женщины в возрасте от 36 до 87 лет, средний возраст составил 51±15,00 год.

Все пациентки были обследованы и прошли комплексное лечение в ФГУ Российском научном центре рентгенрадиологии в период с ноября 2008 по декабрь 2009 года.

Таблица 1. Количество обследованных больных в зависимости от вида патологии молочной железы.

Количество

проанализированных Доля от общего числа

образцов, п обследованных, %

Образцы ткани молочной железы (п=210)

Рак молочной железы 69 32,85

Фиброаденома 42 20

молочной железы

Неизмененная ткань 99 47,15

молочной железы

Образцы крови (п=169)

Рак молочной железы 95 56,21

Доброкачественные 22 13,00

заболевания молочной

железы

Здоровые доноры 24 14,20

Опухоль другой 28 15,59

локализации

Так же было проанализировано 169 образцов цельной крови, среди которых: 95 образцов крови больных РМЖ, 22 пациентки с доброкачественными процессами молочной железы, 24 образца крови здоровых доноров и 28 образцов крови больных с другой локализацией опухолевого процесса.

Обработка образцов ткани и цельной крови методом ПЦР.

Образцы ткани молочной железы.

Операционный материал предоставлялся патоморфологом сразу после поступления в лабораторию. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование на уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестеронов, онкобелка с-егЬВ2, а так же амплификации гена Her-2/neu (метод флуоресцентной гибридизации in situ(FISH) проводилось в плановом порядке по стандартной методике. Для молекулярного анализа у каждой пациентки было взято две пробы ткани (нормальной и патологической) которые собирались в 2 стерильные пробирки, содержащие раствор EverFresh RNA (Клоноген, Санкт-Петербург) для предотвращения деградации РНК в образце и хранились при -70°С до проведения исследования.

Выделение общей РНК проводили набором RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, ермания) согласно протоколу выделения «Purification of Total RNA from .nimal Tissues». Выделенную РНК (35-55 мкл.) переводили в комплиментарую ДК (кДНК) при помощи реакции обратной транскрипции (ОТ) с спользованием набора QuantiTech Reverse Transcription (Qiagen, Германия) эгласно протоколу «Reverse Transcription with Elimination of Genomic DNA for Quantitative, Real-Time PCR». Полученную кДНК хранили при температуре -D°C.

Постановка ПЦР

Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структур экзонов и нтронов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК аммаглобина. Это позволило не применять дополнительный этап обработки уклеиновых кислот ДНК-азой. Для оценки относительного содержания мРНК аммаглобина в образцах использовали анализ содержания мРНК :ферентного гена гипоксантин - гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT1) в m же образце, характеризующимся низким и стабильным уровнем экспрессии РНК в клетке. Зонды для маммаглобина и HPRT1 метили Fam(dT). оответственно реакции амплификации маммаглобина и HPRT1 ставили в иных пробирках.

Детекцию мРНК маммаглобина проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-технология», Россия). Для проведения одной реакции ПЦР использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси; 1 мкл. MgCI2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 7,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл. прямого праймера (10 pmol), 1 мкл. обратного праймера (10 pmol) («Syntol», Россия), 0,5 мкл праймера «проба» содержащего флуорофор «Tag man», 5 мкл. образца кДНК. В работе использовали следующие праймеры:

а) для маммаглобина

Прямой 5'- GAAC ACCGAC AGC AGC А-3'

Обратный 5'- TCTCCAATAAGGGGCAGCC-3'

Проба 5 '-F AMTGGTCCTC ATGCTGGCGGCC-3' б) для HPRT1

Прямой 5'- AAGCCAGACTTTGTTGGATTTGA-3'

Обратный 5'- AACTTGAACTCTCATCTTAGGCTT-3'

Проба 5'-FAMAGCAGGAGATTGCCACCTACCGCA-3'

Критический цикл и исходное количество копий кДНК определяли с помощью компьютерной программы «ДТ-96», поставляемой вместе с прибором.

1 6 11 16 21 26 31 36 41 Номер цикла

Рисунок 1. Пример графиков накопления продуктов амплификации. По оси У - интенсивность флуоресценции, по оси Х- номер цикла амплификации.

Определение уровня экспрессии мРНК маммаглобина (МГА) относительно мРНК HPRT1 считали методом дельта- дельта Си-ти (АА Ct) (Ребриков Д.Н., 2009 ).

[MTA]/[HPRT1] = Е -tCt,-Cl2), где

[MTA]/[HPRT1] - нормированное по HPRT1 значение экспрессии маммаглобина, измеряется в относительных единицах, показывает сколько копий мРНК маммаглобина приходится на 1 копию HPRT1;

Е - эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;

Ctl - значение порогового цикла в образце для МГА;

Ct2 - значение порогового цикла в образце для HPRT1.

Анализ образцов крови.

Для анализа венозную кровь пациентов собирали в пробирки содержащие 3,2% цитрат натрия объемом не менее 3 мл. Далее пробирки помещали в холодильник с температурой 4-6 С на 30-60 минут, для разделения плазмы и форменных элементов крови.

Для выделения брали 1,5 мл образца на границе разделения плазмы и форменный элементов крови.

Выделяли РНК при помощи набора QIAmp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) с использованием протокола выделения «Purification of Total Cellular RNA from Human Whole blood». Полученную РНК хранили при температуре -70°С или проводили реакцию обратной транскрипции при помощи набора QuantiTest Reverse Transcription (Qiagen, Германия) с использованием протокола «Reverse Transcription - with Elimination of Genomic DNA for Quantitative, Real-Time PCR».

Полученную кДНК хранили при температуре -20°С.

Детекцию мРНК маммаглобина проводили методом двухступенчатой ПЦР (Nested-PCR) в режиме реального времени на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-технология», Россия), с применением интеркалирующего красителя SYBRGreen. В качестве матрицы использовали полученную ранее кДНК.

Для проведения одной реакции первого шага Nested-PCR использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси, содержащей KCl, ТрисНС1 (pH 8,8), 6,25 тМ MgCl2, Taq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, 1 мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 8,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл. прямого(№) олигонуклотида (10 pmol), 1 мкл. обратного(Ы2) олигонуклеотида (10 pmol) («Syntol», Россия), 4 мкл. образца кДНК.

На первом этапе использовались праймеры:

MAM (N1) - 5' GAA GTT GCT GAT GGT CCT CAT GCT GGC 3' MAM (N2) - 5' CTC ACC ATA CCC TGC AGT TCT GTG AGC 3'

Для проведения одной реакции второго шага Nested-PCR использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси, содержащей KCl, ТрисНС1 (pH 8,8), 6,25 тМ MgCl2, Taq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидгрифосфаты, глицерол, Tween 20, краситель SybrGreen;l мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия); 11,5 мкл. деионизованной воды, 1 мкл. прямого(№) олигонуклотида (10 pmol), 1 мкл. o6panroro(N4) олигонуклеотида (10 pmol) («Syntol», Россия), 1 мкл. образца полученного при первом этапе Nested-PCR.

Для второго этапа использовали праймеры:

МАМ (N3) - 5' CTC CCA GCA CTG СТА CGC AGG CTC 3'

MAM (N4) - 5' С AC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC АТС CG 3'

Условия проведения реакции в обоих этапах постановки были следующие: в течении 5 минут смесь прогревали при 95°С, затем было 45 циклов — 15 сек при 95°С , 20 сек при 60°С, 15 сек при 72 °С; по окончании смесь охлаждалась до 10°С.

Детекция продукта ПЦР

Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектировали электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном геле. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждали ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Если полоса электрофореза продукта определялась на уровне 200 н.п. маркерного фрагмента результат оценивался как положительный.

Специфичность также была подтверждена при секвенировании полученных продуктов.

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного пакета STATISTICA 6,0 фирмы (StatSoft Inc.).

Для выявления различий между количественными данными для независимых групп использовали метод ANO VA по Краскелу-Уолису (для трех и более независимых групп.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ связи экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-

морфологическими особенностями патологии молочных желез.

Морфологическая дифференциальная диагностика гиперпластических, предраковых процессов и рака молочной железы нередко бывает затруднительной. Поэтому современные молекулярно-генетические методы диагностики могут стать вспомогательным критерием дифференциальной диагностики патологических процессов. Мы исследовали уровень экспрессии мРНК маммаглобина при различных патологических процессах в ткани молочной железы.

На рисунке 2 показана экспрессия мРНК маммаглобина в неизмененной ткани молочной железы, при фиброаденоме и раке молочной железы.

Показано, что средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в неизмененной ткани молочной железы равен 59,6 отн.ед, при фиброаденоме молочной железе уровень экспрессии мРНК увеличен и равен 80,6 отн.ед, а при раке молочной железы - 161,0 отн.ед. Различия в группах были достоверными для групп «норма - РМЖ» (р=0,0057), при анализе групп «фиброаденома -РМЖ» достоверность составила - (р=0,061), в группе «норма-фиброаденома» достоверность ставила — (р=0,13).

200.00 130,00 160.00 140,00 120.00 -100.00 80.00 60.00 40.00 20,00 0,00

59.60

30,60

ь-

161.03

-Г

нормальном ¡кань

фиЬроаленомо

РМЖ

Рисунок 2. Средний уровень экспрессии мРНК в нормальной ткани молочной железы и при различной ее патологии.

В таблице 2 представлены результаты исследования зависимости уровня экспрессии мРНК маммаглобина от гистологического варианта рака молочной

железы. Нам не удалось обнаружить статистически значимых различий в уровне экспрессии мРНК маммаглобина между наиболее часто встречающимися гистологическими вариантами РМЖ.

Среднее значение, МАМ/НРЯ Т, отн.ед Станд арная ошибка Достоверность отличия с ИД, Р Достоверность отличия с ИП, Р Достоверность отличия с прочими формами рака, р

Инфильтративный дольковый рак 73,85 93,16 -

Инфильтративный протоковый рак 161,58 50,63 0,41 -

Прочие формы 133,94 118,75 0,69 0,83 -

Слизистый рак 492,60 167,95 0,32 0,06 0,08

Таблица 2. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина от гистологического строения рака молочной железы.

Также не выявлено статистически значимых отличий экспрессии мРНК маммаглобина от гистологической формы фиброаденомы молочной железы. Результаты предоставлены в таблице 3.

Среднее значение, МАМ/НРЯТ, отн.ед Стандартная ошибка Достоверность отличия со смешанной фиброаденомой, Р Достоверность отличия с интракана-ликулярной фиброаденомой, Р Достоверность отличия с листовидной фиброаденомой, Р

Смешанная фиброаденома (п-28) 58,37 30,01

Интракана-ликулярная фиброаденома (п-7) 183,06 60,03 0,07

Листовдная фиброаденом (п-3) 125,51 91,70 0,49 0,60

Перикана-ликулярная фиброаденома (п-3) 4,16 91,70 0,57 0,1 1 0,12

Таблица 3. Сравнение уровня экспрессии мРНК маммаглобина при различном гистологическом строении фиброаденомы молочной железы.

Анализ зависимости экспрессии мРНК мамаглобина от показателя Т опухоли (по классификации TNM) для рака молочной железы, (рис.4) обнаруживает тенденцию снижения уровня экспрессии мРНК маммаглобина при увеличении показателя опухоли Т.

500 ---,---.-,-.-

400

Рисунок 4. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина и показателя Т по классификации ТЫМ.

Всего было проанализировано 69 образцов ткани опухоли. Достоверные различия были выявлены для групп Т2-Т4 (р=0,013).

Достоверных отличий содержания мРНК маммаглобина в опухоли в от числа пораженных метастазами лимфоузлов не выявлено, однако имеется тенденция снижения уровня экспрессии при увеличение N.

Результаты исследования содержания мРНК маммаглобина в ткани опухоли в зависимости от степени злокачественности опухоли (С) представлены на рисунке 5. Обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии мРНК мамаглобина в опухоли между группами с низкой степенью злокачественности и высокой степенью злокачественности вЗ (р=0,0019), а так же между группами в2 (умеренная степень злокачественности) и вЗ (р=0,059). Достоверных различий межу 01 и в2 степенями злокачественности обнаружено не было (р=0,40). Интересно отметить, что чем выше степень злокачественности (ниже степень дифференцировки клеток) тем, меньше уровень экспрессии мРНК маммаглобина. Так при 01- уровень экспрессии мРНК маммаглобина - 333,7 отн.ед, при 02- 204,4 отн.ед, при 03 - 38,48 отн.ед., т.е. уровень экспрессии уменьшается в 10 раз.

400

cr <v

f 300

g 200

100

□ Mean

1 1 J I ±0,95*SE

степень злокачественности <£)

Рисунок 5. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от степени злокачественности опухоли (G).

Мы также проанализировали связь экспрессии мРНК маммаглобина с рецепторным статусом опухоли. Было установлено, что статистически значимых различий между уровнем экспрессии мРНК маммаглобина опухоли и уровнем рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухоли не нет.

Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина и рецептора с-егЪВ2.

Зависимость экспрессии онкобелка с-егЬВ2, определеямого методом ИГХ и мРНК маммаглобина представлена на рисунке 6. В 30 случаях (43,47%) реакция на белок с-егЬВ2 обнаружена не была, при этом, среднее значение экспрессии мРНК маммаглобина составило 195,2 отн.ед, слабоположительная реакция была обнаружена в 28 (42,0%) случаях, среднее значение маммаглобина - 81,1 отн.ед, положительная реакция на онкобелок с-егЬВ2 была обнаружена в 10 образцах (14,5%) в этой группе образцов средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина равен 290,1 отн.ед. Достоверность отличий между группами составила - (р=0,13; р=0,10).

1 2 3

степень злокачественности <£)

450 400 350

et ш

X 300 i-

Ё 250

X g 200 s

150 100 50 0

123 о Среднее

Реакция на белок с-егЬВ2 (метод иммуногастохимии); 1- Щ Среднее±0,95*Ст.ош. отрицательная, 2- слабоположительная, 3 - положительная

Рисунок 6. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от уровня экспрессии рецептора с-егЬВ2.

Мы также проанализировали амплификацию гена Her-2/neu исследованную методом FISH гибридизации у 34 женщин с диагнозом рак молочной железы. У 28 (73,68%) пациенток амплификации гена Her-2/neu не было обнаружено. Уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этой группе составил — 51,98 отн.ед. У 10 (26,32%) пациенток была обнаружена амплификация гена Нег-2/neu, и уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этих образцах составил 346,92 отн.ед. Отличия в группах достоверны (р=0,017). (Рис. 7). Из приведенных данных следует, что амплификация гена Her-2/neu в образцах опухоли молочной железы сопровождается высоким уровнем экспрессии мРНК маммаглобина.

Реакция на белок с-егЬВ2 (метод иммуногастохимии); 1-отрицательная, 2- слабоположительная, 3 - положительная

600 500

4 400 ш

ее зоо

Q. X

s 200

100

о1-■-------

нет есть Среднее

амплификация гена Her-2/neu, Среднее±0,95*Ст.ош. метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

Рисунок 7. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина амплификации гена Her-2/neu (метод флуоресцентной гибридизации in situ(FISH)).

Интеграция радиологических и молекулярно-биологических методов в дифференциальной диагностике заболеваний молочной железы.

Все пациентки, вошедшие в анализ, были обследованы при помощи современного комплекса клинико - рентгено - сонографических методов. Одним из ведущих методов диагностики различных форм рака молочной железы является рентгенологическое исследование - маммография. При изучении маммографического снимка оценивали такие показатели как : наличие диффузных изменений ( развитая железистая ткань, фиброзно-кистозная мастопатия), узловых образований (доброкачественного или злокачественного характера) в молочной железе, а также наличие кальцинатов (микро- или макрокальцинаты).

На рисунке 8 представлены результаты зависимости обнаруженных на маммограмме фоновых изменений в молочной железе с уровнем экспрессии мРНК маммаглобина в ткани молочной железы при фиброаденоме.

нет есть

амплификация гена Her-2/neu, метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH)

140 i

120 4

сГ I

¿100 i

0 __I_

a 80 --,-

1 ! Ё 60 !

2 Д

40 ■ |

20 __9______

0 ---.-.---

0 1 2

Диффузные изменения молочной железы. 0 - нет изменений, 1 - фиброзно-жировая инволюция, 2 - фиброзно-кистозная мастопатия

Рисунок 8. Зависимость уровня экспрессии мРНК от наличия диффузных изменений в ткани молочной железы при фиброаденоме молочной железы.

Среднее значение экспрессии мРНК маммаглобина при отсутствии диффузных изменений составляет - 22,26 отн.ед, при фиброзно-жировой инволюции - 118,93 отн.ед, а при фиброзно-кистозной мастопатии - 50,83 отн.ед. Результаты между группами «без диффузных изменений» и «фиброзно-жировая инволюция» статистически высоко достоверны (р= 0,00039).

В группу с фиброзно-кистозной мастопатией вошли 23 пациентки с мастопатией различной степени выраженности (от слабовыраженной до выраженной). Результаты представлены на рисунке 9.

160 -.-.--------——

140 120

I 100

С 80 ■ о.

| 60 ■ ^J^

40 ~Г

20 ■ _J_ Т

о ----------------■-

123 п Mean

Фиброзночсистозная мастопатия: 1-слаборываженная ФКМ, 2 ZU ±0,95*SE

умеренная ФКМ, 3 - ефраженная ФКМ

Рисунок 9. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина от степени выраженности фиброзно-кистозной мастопатии (ФКМ).

i I

и Mean Т~ ±0,95*SE

1 2 3

Фиброзночсистозная мастопатия: 1-слаборываженная ФКМ, 2 умеренная ФКМ, 3 - ефраженная ФКМ

Из представленных результатов видно, что увеличение выраженности фиброзно-кистозной мастопатии сопровождается увеличением уровня экспрессии мРНК маммаглобина.

Другими признаками, оцениваемым по маммографическому снимку при анализе маммограмм, является форма и структура патологического образования. Как правило, доброкачественные узловые образования имеют четкие контуры и однородную структуру. Из проанализированных нами маммограм 41 пациентки с фиброаденомой молочной железы характерные для доброкачественного образования контуры имели 36 (87,8 %) пациенток, средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этой группе составил 63,1 отн.ед.. На маммограммах 5 (12,2 %) пациенток узловые образования имели нечеткие, полициклические контуры. В этой группе уровень экспрессии составляет 206,4 отн.ед. (р=0,062) (рис.10).

240 220 200 180

«? 160

140

а.

£ 120

| 100 80 60 40 20

u 1 a Mean

Очертание контуров по маммографическом снимке : ~Т~ ±0,95*SE

0 - четкие, ровные; 1 - не ровные, полициклические контуры

Рисунок 10. Зависимость уровня экспрессии мРНК от формы доброкачественного узлового образования

Таким образом, можно сделать вывод, что высокая экспрессия мРНК маммаглобина в ткани фиброаденомы молочной железы сочетается с неблагоприятными факторами прогноза развития злокачественных образований молочных желез - выраженной фиброзно-кистозной мастопатией, а так же с неровными, полициклическими контурами узлового образования выявляемыми при маммографии.

Нами была проанализирована связь экспрессии мРНК маммаглобина в ткани опухоли и наличия на маммографических снимках микро- и

акрокальцинатов, что является одним из дополнительных признаков юкачественного процесса. Из 69 проанализированных маммограмм шьцинаты были обнаружены на 22 снимках. Микрокальцинаты были энаружены на 15 (21,7 %) маммограммах, а макрокальцинаты на 7 (10,1 %). редний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в ткани опухоли у пациенток микрокальцинатами был равен 97,45 отн.ед, у пациенток с акрокальцинатами - 425,08 отн.ед. (р=0,041) (Рис.11).

1 2 Кальцинаты. 1- макрокальцинаты, 2- микрокальцинаты

Меап " ±0.95-5Е

Рисунок 11. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от вида альцинатов в ткани молочной железы при РМЖ.

Таким образом, наличие более неблагоприятного маммографического ризнака -микрокальцинатов сочетается со сниженным уровнем экспрессии РНК маммаглобина. Эти результаты хорошо согласуются с нашими данными 5исунок 5), показывающими снижение уровня экспрессии маммаглобина при осте степени злокачественности опухоли.

Исследование экспрессии мРНК маммаглобина в крови.

Исследовались образцы периферической крови здоровых доноров, пациенток больных раком молочной железы, пациенток с фиброаденомой молочной железы и пациентов с опухолями другой локализации. (Табл.4).

Таблица 4. Частота обнаружения мРНК маммаглобина методом «Nested» ПЦР в цельной крови у различных групп пациентов.

Количество наблюдений Положительный результат Процент, положительных случаев.

Рак молочной железы 95 58 61%

Доброкачественные образования молочной железы Фиброзно-кистозная мастопатия 4 1 25%

Фиброаденома 16 4 25%

Фибросклероз 2 0 0

Опухоль другой локализации Опухоли ЖКТ 8 0 0

Опухоли органов дыхания 5 1 20%

Рак почки и предстательной железы 3 0 0

Рак матки, эндометрия 12 0 0

Здоровые доноры 24 0 0

В группе больных РМЖ мРНК маммаглобина была обнаружена в 61 % случаев.

У пациенток с доброкачественными образованиями молочной железы экспрессия мРНК маммаглобина была обнаружена в 22,7% случаев. В образцах крови пациентов с другой локализацией опухолевого процесса мРНК маммаглобина была обнаружена лишь в одном случае, у пациентки больной раком легкого. Среди образцов крови здоровых доноров мРНК маммаглобина не обнаружена.

Стоит отметить, что процент обнаружения мРНК маммаглобина в крови уменьшается с увеличением размера опухолевого узла (Рис.12).

Чувствительность метода составила 61%, а специфичность - 93%. Прогностическая ценность положительного результата равна 85%. . Для сравнения - используемый как сывороточный маркер рака молочной железы показатель СА15-3 имеет чувствительность 14,0%, а специфичность 92,3%. Прогностическая ценность положительного результата 66,7%. (М.КеуЬап1, 2005).

69.3%

- оьщсс

~ кодичеасю

> . пициснЮ'.:,

зо -------------------- ; ---------------------------- — -

- . , количос 1 [.о

52 6% ' положиюльных

20 ----------------------- ; . ......... - -.............. рсзулылюо

33.3%

10 - ,-----------, -- -...... --------------

Т1 12 ТЗ Т4

Рисунок 12. Распределение больных РМЖ по показателю Т (по классификации ТЫМ) и колличество пациентов у которых в периферической крови выявлена мРНК маммаглобина.

Таким образом, полученные результаты оценки информативности обнаружения мРНК маммаглобина в крови как метода диагностики РМЖ позволяют говорить о перспективности его использования не только для мониторинга опухолевого процесса, но и как возможного диагностического маркера РМЖ.

Выводы

1. Выявлены достоверные отличия между уровнем экспрессии мРНК маммаглобина в ткани рака молочной железы, фиброаденомы и неизмененной ткани молочной железы, который составил: в неизмененной ткани - 59,6 отн.ед., в ткани фиброаденомы - 80,6 отн.ед и в ткани РМЖ- 161,0 отн.ед.

2. Уровень экспрессии мРНК маммаглобина не зависит от гистологического варианта рака молочной железы и статуса рецепторов эстрогена и прогестерона.

3. Отмечается статистически достоверное снижение уровня экспрессии мРНК маммаглобина при снижении степени дифференцировки опухоли, а также определен высокий уровень экспрессии мРНК маммаглобина в опухолях с амплификацией гена Нег-2/пеи 345,9 отн.ед) по с равнению с группой, где амплификация гена Нег-2/пеи не обнаружена (51,9 отн.ед.) (р=0,017).

4. Отрицательные клинико-рентгенологические признаки, сочетаются с повышенным уровнем экспрессии мРНК маммаглобина у больных с выраженной фиброзно-кистозной мастопатией и доброкачественными узловыми образованиями молочной железы, что может являться дополнительным фактором прогноза развития злокачественного процесса в молочной железе.

5. Исследована информативность обнаружения мРНК маммаглобина в периферической крови как метода диагностики РМЖ. Установлено, что чувствительность метода обнаружения мРНК маммаглобина в крови составила - 61,0%, специфичность - 93,0%. Прогностическая ценность положительного результата равна 85%. Определение мРНК маммаглобина в крови может применяться, как для диагностики, так и для мониторинга РМЖ. Не обнаружена экспрессия мРНК маммаглобина в крови при другой локализации опухолевого процесса (рак шейки матки, эндометрия, предстательной железы.)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Боженко В.К. Васкевич Е.Ф. Рой Ю.И. Использование м-РНК для

диагностики в онкологии. Тезисы. XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».-М.-2006.С.128

2. Васкевич Е.Ф., Боженко В.К. «Исследование уровня мРНК маммаглобина

в крови больных раком молочной железы». Тезисы. XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». -М.- 2007. С.218

3. Васкевич Е.Ф., Кудинова Е.А., Джикия E.JL, Буйнова Д.А., Боженко В.К.

Исследование экспрессии мРНК Маммаглобина у пациенток с различной патологии молочной железы. Тезисы. VI международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность".-М.-2009. С.53

4. Васкевич Е.Ф., Меских Е.В., Боженко В.К. " мРНК маммаглобина в

периферической крови как диагностический маркер рака молочной железы". Мини-статья. Научно-практическая конференция с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник».-Тверь-2009. С. 295

5. Боженко В.К., Рожкова Н.И., Тащян A.A., Кудинова Е.А., Васкевич Е.Ф.

«Использование определения экспрессии тканеспецифической мРНК для диагностики метастазов рака». Тезисы. VII съезд онкологов России. - М.- 2009. С. 57.

6. Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Чазова H.JL, Мельникова Н.В., Кудинова

Е.А., Джикия Е.Л., Буйнова Д.С. «Исследование экспрессии мРНК маммаглобина А при различной патологии молочных желез». Вестник РНЦРР. - 2009. Выпуск 9. Доступно по URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v9/papers/bozhenko v9.htm

7. Н.И. Рожкова, В.К. Боженко, Д.К. Фомин, А.И. Плошница, A.A. Тащан, Е.А.

Кудинова, Е.Ф. Васкевич, M.JI. Мазо. «Молекулярно-биологические и радиологические технологии в комплексной диагностике патологии аксиллярной области». Опухоли женской репродуктивной системы. - М.-2009. №3-4.С.25-28

8. Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Кудинова Е.А., Чазова H.JL, Берщанская A.M.,

Мельникова Н.В. Возможности оценки экспрессии маммаглобина при различной патологии молочной железы. Литературный обзор. Вестник РНЦРР. - 2010. Выпуск 10. Доступно по URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/vlO/papers/bozhe vlO.htm

Подписано в печать 15. о 7.1 о Формат 60 х 84/16 Бумага офисная «Буе^Сору». Тираж 100 экз. Заказ № 613 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Оглавление диссертации Васкевич, Елена Федоровна :: 2010 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Современное состояние проблемы.

1.2 Маммаглобин. Структура и функции.

1.3Диагностическое использование маммаглобина.

1.3.1.Исследование экспрессии мРНК маммаглобина в ткани молочной железы.

1.3.2.Исследование экспрессии мРНК маммаглобина в периферической крови.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика обследованных пациентов.

2.2 Методы исследования

2.2.1 ПЦР. ОТ-ПЦР.

2.2.2 Процедура проведения РВ-ПЦР.

2.2.3 Иммуногистохимическое исследование.

2.2.4 Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

2.2.5 Лучевые методы исследования.

2.3 Статистический анализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Взаимосвязь экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-морфологическими особенностями опухолей молочных желез.

3.2 Роль молекулярно-биологических методов в комплексной диагностике заболеваний молочных желез.

3.3 Исследование экспрессии мРНК маммаглобина в крови.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Онкология", Васкевич, Елена Федоровна, автореферат

Рак молочной железы (РМЖ) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей у женщин. Ежегодно в мире регистрируется 1 млн. новых случаев рака молочной железы. (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008).

В настоящее время до 30-50% вновь обнаруженных РМЖ имеют III-IV стадию заболевания. Сложности своевременной диагностики обусловлены г неспецифичностью клинико — рентгено - сонографических проявлений как доброкачественных, так и злокачественных заболеваний молочной железы (Харченко В.П., Рожкова Н.И., 2009). Актуальным является поиск новых дифференциально-диагностических критериев, позволяющих различать на дооперационном этапе начальные проявления рака, предраковых процессов и различных форм доброкачественных новообразований (Летягин В.П. и др., 2005, Семиглазов В.Ф. и др., 2008).

Наряду с развитием клинико-рентгено-сонографических методов диагностики РМЖ в настоящее время все больше научных работ г посвящается молекулярно-генетической диагностике данного заболевания (Кушлинский Н.Е. и др., 2001). Определение мутантных генов и их РНК -продуктов составляет основу диагностики онкологических заболеваний. Молекулярно-генетические методы онкодиагностики высокочувствительны и часто, позволяют выявить патологию в доклинической, стадии заболевания. Определение молекулярно-генетических маркеров в ткани опухоли может давать дополнительную информацию о биологической характеристике опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам.

Одним из перспективных молекулярно-генетических маркеров РМЖ является маммаглобин, который принадлежит к семейству утероглобинов эпителиальных секреторных белков (Bustin S.A. и др. 2002; Kopreski M.S. и др. 1999; Chen X.Q. и др. 2000; Wong S.C. и др. 2004). Впервые ген, продуктом экспрессии которого является маммаглобйн (SCGB2A1), был идентифицирован Watson М.А и Flemind Т.Р в 1996 году. Экспрессия маммаглобина определяется в основном в эпителиальных клетках молочной железы. При этом мРНК маммаглобина в 10 раз интенсивней экспрессируется при злокачественных новообразованиях, чем при доброкачественных процессах (Watson М.А., 1996). Незначительную экспрессию маммаглобина можно наблюдать так же и в здоровой ткани молочной железы (Becker R.M., 1998; Watson М.А., 1999; O'Brien N.,2002), в нормальной и опухолевой ткани потовых желез, яичников, шейки матки и предстательной железы. (Griinewald К. 2002). В работах Nunez-Villar М. J. показано, что повышенная экспрессия маммаглобина в ткани опухоли молочной железы свидетельствует о менее агрессивном фенотипе опухоли

Nunez-Villar M.J., 2003). А в работе Е. Sasaki показано, что безрецидивная выживаемость пациентов с экспрессией маммаглобина в опухоли выше, чем t аналогичный показатель у пациентов с отсутствием экспрессии мРНК маммаглобина в опухоли (Sasaki Е., 2007).

В тоже время, остается не изученной связь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с основными клинико - морфологическими и рентгено-сонографическими признаками доброкачественных я злокачественных образований молочной железы.

Полученные различными авторами результаты дают интервал информативности определения мРНК маммаглобина в крови от 11% до 97% (Suchy В., 2000; Gilbey A.M., 2004; Bernstein J.L., 2005; Cerveira N., 2004; Zehentner В. К. и др. 2004). По мнению одних авторов при исследовании крови процент обнаружения мРНК маммаглобина увеличивается со стадией заболевания (Cerveira N., г

2004), а другие полагают, что такой зависимости нет (Mikhitarian К, 2008).

Цель работы

Задачи исследования t

2. Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с клинико - морфологическими признаками опухоли.

3. Оценить взаимосвязь экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-рентгено-сонографическими характеристиками патологических образований молочных желез. .

Научная новизна

Количественно определена экспрессия мРНК маммаглобина в нормальной ткани молочной железы, в ткани фиброаденомы и рака молочной железы на различных стадиях заболевания. Изучена взаимосвязь относительного содержания мРНК маммаглобина в ткани опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими особенностями опухоли. Впервые оценена связь уровня экспрессии с определенными рентгенологическими признаками образований молочных желез. Показано, что если на маммографическом снимке контуры доброкачественного образования имеют полициклические контуры отличные от картины классического доброкачественного (ровные, четкие контуры и однородную структуру) образования уровень экспрессии мРНК маммаглобина выше, чем среднее содержание маммаглобина в группе с доброкачественными заболеваниями, что может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием. Разработана методика определения мРНК маммаглобина в периферической крови, установлена высокая специфичность метода (61%). Показано отсутствие ложноположительных результатов для опухолей других локализаций, что позволяет рекомендовать его для дифференциальной диагностики.

Научно-практическая значимость.

В результате проведенного исследования оценена клиническая значимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК маммаглобина в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной железы в зависимости от клинико-морфологического состояния г опухоли, а так же как дополнительного диагностического критерия в комплексе с рентгено - сонографическим методам исследования. Изучена чувствительность и специфичность определения мРНК маммаглобина в периферической крови пациентов с различными заболеваниями молочной железы. Показана практическая значимость метода для выявления первичной опухоли молочной железы, а так же для дифференциальной диагностики РМЖ с опухолями другой локализации.

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование экспрессии мРНК маммаглобина у пациенток с различной патологией молочных желез."

выводы

3. Отмечается статистически достоверное снижение уровня экспрессии мРНК маммаглобина при снижении степени дифференцировки опухоли, а также определен высокий уровень экспрессии мРНК маммаглобина в опухолях с амплификацией гена Her-2/neu 345,9 отн.ед) по с равнению с группой, где амплификация гена Her-2/neu не обнаружена (51,9 отн.ед.) (р=0,017).

5.Исследована информативность обнаружения мРНК маммаглобина в периферической крови как метода диагностики РМЖ. Установлено, что чувствительность метода обнаружения мРНК маммаглобина в крови составила - 61,0%, специфичность - 93,0%. Прогностическая ценность положительного результата равна 85%. Определение мРНК маммаглобина в крови может применяться, как для диагностики, так и для мониторинга РМЖ. Не обнаружена экспрессия мРНК маммаглобина в крови при другой локализации опухолевого процесса (рак шейки матки, эндометрия, предстательной железы.)

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Васкевич, Елена Федоровна

1. Высоцкая И.В. Современные возможности терапии фиброзно-кистозной болезни Опухоли женской репродуктивной системы 2009.- №1-2с.44-46

2. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Тканевые маркеры как факторы прогноза при раке молочной железы // Практическая онкология.- 2002.- Т.З, №1.- С.38-44.

3. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных образований в 2006 г. Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, т. 19, №2 (прил. 1), 2008 с.91-119

4. Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ.

5. Кушлинский Н.Е., Герштейн Е.С. Современные возможности молекулярно-биохимических методов оценки биологического «поведения» рака молочной железы . Вестник РАМН.- 2001.- №9.- С.65-70.

6. Летягин В.П. Первичные опухоли молочной железы : практическое руководство. — М.: Миклош, 2005.

7. Путырский Ю.Л. Методы скрининга рака молочной железы у женщин. Медицинские новости. .- 2007. №11. - С. 20-24.

8. Ребриков Д.Ю., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. ПЦР в реальном времени. Москва. Бином. Лаборатория знаний, 2009.

9. Семиглазов В.Ф. Значение прогностических и предсказывающих факторов при выборе лечения у больных метастатическим раком молочной железы. Практическая онкология.- 2000.- №.2.- С.26-30.

10. Семиглазов В.Ф., Семиглазов В.В. Клетсель А.Е.-; Неоадьювантное и адьювантное лечение рака молочной железы. // 2009.- М., МИА.- с.288

11. Серебрякова С.В., Труфанов Г.Е., Фокин В.А., Юхно Е.А. Магнитно-гезонансная семиотика фиброаденом молочной железы. Опухоли репродуктивной женской системы. 2010.-№2.-С.4-9.

12. Харченко В.П., Рожкова Н.И. Маммалогия. Национальное руководство.-2009.- М.: Area XVII.- с.328

13. Харченко В.П., Рожкова Н.И., Меских Е.В. «Скрининг и возможности совершенствования ранней диагностики рака молочной железы», доклад. Вестник Московского Онкологического Общества, №11, ноябрь 2006

14. Anker P., Mulcahy Н., Chen X. Q., Stroun М. Detection of circulating tumor DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. \\ Cancer Metastasis Rev.,-1999,- 18: 65-73

15. Backus J., Laughlin Т., Wang Y. et al. Identification and characterization of optimal gene expression markers for detection of breast cancer metastasis. \\ Journal of Molecular Diagnostics. 2005- v.7 № 3.- p.327-336

16. Barad O, Meiri E, Avniel A, at all. MicroRNA expression detected by oligonucleotide microarrays: system establishment and expression profiling in human tissues. \\ Genome research, 2004.-14(12):2486-94 ,

17. Becker R.M., Darrow C., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Watson M.A., Fleming T.P. Identification of mammaglobin B, a novel member of the uteroglobin gene family. WGenomics.- 1998.- 54:70-78.

18. Bernstein J.L., Godbold J.H., Raptis G. et al. Identification of mammaglobin as a novel serum marker for breast cancer. \\ Clinical Cancer Research. 2005.-11.-528-35

19. Bhargava R., Beriwal S., Dabbs D.J. Mammaglobin vs GCDFP-15 An Immunohistologic Validation Survey for Sensitivity and Specificity. WAmerican Journal of Clinical Pathology .- 2007.- v.l27.-p.l03-l 13.

20. Bosma A.J., Weigelt В., Lambrechts A.C., et al. Detection of circulating breast tumor cells by differential expression of marker genes. \\ Clinical Cancer Research.-2002.-8,- 1871-7

21. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems// Journal of Molecular Endocrinology., 2002.-29.-P-23-39

22. Bustin S.A., Dorudi S. Molecular assessment of tumor stage and disease recurrrnce using PCR-based assays // Molecular Medicine Today.- 1998.-4.-p.389-396

23. Colpitts T.L., Billing-Medel P., Friedman P., Granados E.N., Hayden M., Hodges S., Menhart N., Roberts L., Russell J., Stroupe S.D. Mammaglobin is found in breast tissue as a complex with BU101. // Biochemistry. 2001. - 40.- p. 11048-11059.

24. Desiardin L.E., Perkins M.D., Wolski K., Haun S. and all. Measurement of sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA as a surrogate for respondsto chemothera py// American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine .1999.- 160:203-210.

25. Devilee P. and Cornelisse C.J. Somatic genetic changes in human breast cancer.// Biochimica et biophysica acta.- 1994.-1198:113-30

26. El-Sharkawy S.L., Waffa El Saied Abd El-aa., at all. Mammaglobin: A novel tumor marker for breast cancer. // Turkish journal of cancer.-2007.-v.37.-n.3.- p.89-97

27. Elwood V. E., Craig V.J. The Estrogen Receptor: A Model for Molecular Medicine // Clinical Cancer Research. 2003. - Vol. 9.- p .1980-1989.

28. Esslimani-Sahla M. et al. Increased estrogen receptor betacx expression during mammary carcinogenesis.// Clinical Cancer Research. 2005.- Vol.11, №9. -p. 3170-3174.

29. Fairman J., Riche L., Pieslak I., Lay M., Corson S., Fox E. at all. Quantitative RT-PCR to evaluate in vivo expression of multiple transgenes using a common intron. //Biotechniques.-1999.- 27.- p. 566-570, 572-574

30. Felty Q., Singh K.P., Roy D. Estrogen-induced G(l)/S transition of G(0)-arrested es-trogen-dependent breast cancer cells is regulated by mitochondrial oxidant signalling . // Oncogene.- 2005.- May 16.

31. Geffroy N. et al. Cell cycle regulation of breast cancer cells through estrogen-induced activities of ERK and Akt protein kinas'es. // Molecular Cell Endocrinolgy.- 2005,- Vol.237, №1.- p.l 1-23

32. Gentle A., Anastasopouios F., McBrien N.A. High- resolution semiquantitative real-time PCR without the use of a standard curve // Biotechniques.-2001.- 31 -p. 502, 504-506, 508.

33. Ghossein A., Rosai J., Polymerase chain reaction in the detection of micrometastases and circulating tumor cells. // Cancer.- 1996.- 78.- p. 10-16

34. Gilbey A.M., Burnell D, Coleman RE, et all. The detection of circulating breast cancer cells in blood. Journal of Clinical Pathology.- 2004.- 57.-p. 903-11.

35. Goedegebuure P.S., Watson M.A., Viehl C.T., Fleming T.P. Mammaglobin-based strategies for treatment of breast cancer. // Current cancer drug targets.-2004.- v.4.- №6.- p.531-42

36. Hansen R.K., Bissell M.J. Tissue archistructure and breast cancer: the role of ex-tracellular matrix and steroid hormones // Endocrine-Related Cancer. 2000. -№7.-p. 95-113

37. Harris C.C. Chemical and physical carcinogenesis: from animal models to molecular models in one decade. Advances Cancer Research.- 1988.- 50:25-70

38. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. Genome Research.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

39. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030

40. Houghton R.L., Dillon D.C., Molesh D.A., et all. Transcriptional complementarity in breast cancer: application to detection of circulating tumor cells.//Molecular Diagnostics.- 2001.- 6.-p.79-91

41. Ikeda K., Inoue S. Estrogen receptors and their downstream targets in cancer. // Archives of Histology and Cytology .- 2004.- Vol.67, №5.- p.435-442

42. Jiang W.G., Martin T.A., Mansel R.E. Molecular detection of micro-metastasis in breast cancer // Critical reviews in oncology/hematology.-2002 Jul.-43(1).-p. 13-31

43. Kang H.J. et al. Polymorphisms in the estrogen receptor-alpha gene and breast cancer risk. // Cancer Letters. 2002.- Vol.178, №2.- p. 175-180.

44. Kataoka A., Mori M., Sadanaga N., et all. RT-PCR detection of breast cancer cells in sentinel lymph nodes. // International Journal of Oncology.- 2000.-16,-p. 1147-1152

45. Kopreski M.S., Benko F.A., Kwak L.W., Gocke C.D. Detection of tumor messenger RNA in serum of patients with malignant melanoma. // Clinical Cancer Research.-1999.- 5.- p. 1961-1965

46. Krag D.N., Ashikaga Т., Moss T.J., et all. Breast cancer cells in the blood: a pilot study. // The breast journal.- 1999.- 5.- p. 354-8

47. Leone F., Perissinotto E., Viale A., et all: Detection of breast cancer cell contamination in leukapheresis product by real-time quantitative polymerase chain reaction. // Bone Marrow Transplant.-2001.- 27.- p. 517-523'

48. Leygue E, Snell L, Dotzlaw H, et al. Mammaglobin, a potential marker of breast cancer nodal metastasis. //The American journal of pathology.- 1999.-189.-p. 28-33

49. Lofts F.J., Hurst H.C., Sternberg M.J., Gullick W.J. Specific short transmembrane sequences can inhibit transformation by the mutant neu growth factor receptor in vitro and in vivo.// Oncogene. -1993.-8(10).-p.2813-20.

50. Lu J., Getz G., at all. MicroRNA expression profiles classify human cancers.//Nature.- 2005.- Jun 9.- 435(7043):834-8

51. Lun Y.C , Wu Chou Y.H., I-Ching Liao, Ann-Joy Cheng. The expression of mammaglobin mRNA in peripheral blood of metastatic breast cancer patients as an adjunct to serum tumor markers // Cancer letters.- 2003.- Volume 191.- Issue 1, p. 93-99

52. Macaluso M., Montanari M., Giordano A. The regulation of ER-(alpha) transcription by pRb2/pl30 in breast cancer. // Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO.- 2005. №4.- p. 20-22

53. Min С J., Tafra L., Verbanac K.M. Identification of superior markers for polymerase chain reaction detection of breast cancer metastases in sentinel lymph nodes. // Cancer Research.-1998.- 58.- p. 4581-4

54. Mitas M, Mikhitarian K, Walters C, et al. Quantitative real-time RT-PCR detection of breast cancer micrometastasis using a multigene marker panel.// International Journal of Oncology.- 2001.- 93.- p. 162-71

55. Morrison Т. B. Wels J.J., Wittwer C.T. Quantification of low-cory transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. // Biotechniques.-1998. 24.- p. 954-958, 960,962.

56. Mukherjee A.B., Kundu G.C., Mantile-Selvaggi G., et al: Uteroglobi: A novel cytokine?// Cell Mol Life Sci.- 1999.- 55.-p.771-787

57. Muller-Schottle F., Classen-Linke I., Beier-Hellwig K., Sterzik K., Beier H.M. Uteroglobin expression and release in the human endometrium. // Life Sciences & Medicine .- 2000.- 923.- p.332-335

58. Murphy L.C., Watson P. Steroid receptors in human breast tumorigenesis and breast cancer progression. // Biomedicine & pharmacotherapy.- 2002.- Vol.56, №2.- p.65-77.

59. Ni J., Kalff-Suske M., Gentz R. et al. All human genes of uterglobin family are localized on chromosome 1 lql2.2 and form a dense cluster. // Life Sciences & Medicine.- 2000.- 923.- p.25-42

60. O'Brien N.A., O'Donovan N., Ryan В., Hill A.D., McDermott E., O'Higgins N., Duffy M.J. Mammaglobin a in breast cancer: existence of multiple molecular forms. // International journal of cancer.-2005.- Apr 20.-114(4).-p. 623-7

61. O'Brien N, Maguire TM, O'Donovan N, Lynch N, Hill AD, McDermott E, O'Higgins N, Duffy MJ. Mammaglobin a: a promising marker for breast cancer.// Clinical Chemistry.- 2002 Aug.- 48(8).- p. 1362-4

62. Ouellette R.J., Richard D., Mai'cas E. RT-PCR for mammaglobin genes, MGB1 and MGB2, identifies breast cancer micrometastases in sentinel lymph nodes.// American Journal of Clinical Pathology . -2004.- v. 121.- p.637-643

63. Pasqualini J.R., Chetrite G.S. Recent insight on the control of enzymes involved in estrogen formation and transformation in human breast cancer // The Journal of steroid biochemistry and molecular biology. -'2005.- Vol.93, №2.-p.221-236.

64. Penault- Llorca F. Comments on the new American Joint Committee on Cancer TNM staging for breast cancer. What's new for the pathologist? Annales de pathologie.- 2003 .- Dec.- 23(6).-p.492-5

65. Perou C.M., Sorlie Т., Eisen M.B. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature.- 2000,- 406.-p. 747-752

66. Porter-Jordan K., Lippman M.E.: Overview of the biologic markers of breast cancer. // Hematology/oncology clinics of North America.-1994.- 8.-p.73-100

67. Punyadeera C, Dassen H, Klomp J, Dunselman G, Kamps R, Dijcks F, Ederveen A, de Goeij A, Groothuis P. Oestrogen-modulated gene expression in the human endometrium.// Cellular and molecular life sciences. 2005.-62.-p.239-250

68. Ramachandran C., Melnick S.J. Multidrug resistance in human tumors-molecular diagnosis and clinical significance. // The Journal of molecular diagnostics.- 1999.- 4.- p.81-94

69. Ross J.S, Linette G.P, Stec J. et al. Breast cancer biomarkers and molecular medicine. Expert review of molecular diagnostics.- 2003.-3.:p.573-585

70. Silva J.M., Dominguez G., Silva J., et al: Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics.// Clinical Cancer Research.-2001.-7.-p. 2821-2825

71. Sjodin A, Guo D, Hofer PA, Henriksson R, Hedman H. Mammaglobin in normal human sweat glands and human sweat gland tumors. // The Journal of investigative dermatology 2003.-121.-p.428-429

72. Sjodin A, Guo D, Sorhaug S, Bjermer L, Henriksson R, Hedman H. Dysregulated secretoglobin expression in human lung cancers. // Lung Cancer.2003.-41.-p.49-56.

73. Sotiriou C., Wirapati P., Loi S. et all. Gene expression profiling in breast cancer: Understanding the molecular basis of histologic grade to improve prognosis. // Journal of the National Cancer Institute.- 2006.- 98.- p.262-272

74. Span P.N., Grebenchtchikov N.I., Geurts-Moespot A., Sweep C. G. J. Concerns about mammaglobin assays. // Clinical Chemistry.- 2005.- v.51.- №2,-p.474-75

75. Stoeckelhuber M., Messmer E.M., Schmidt C., Xiao F., Schubert C., Klug J. Immunohistochemical analysis of secretoglobin SCGB 2A1 expression in human ocular glands and tissues.// Histochemistry and cell biology. 2006.- v. 126.-p. 103-109

76. Suchy В., Austrup F., Driesel G., et al: Detection of mammaglobin expressing cells in blood of breast cancer patients. // Cancer Letters.- 2000.-158.-p.171-178

77. Symmans W.F. A pathologist's perspective on emerging genomic tests for breast cancer.// Seminars in oncology.- 2007.- 34 (suppl 3): S4-S9.

78. Tassi R.A., Calza S., Ravaggi A., Bignotti E., Odicino F.E. Mammaglobin В is an independent prognostic marker in epithelial ovarian cancer and its expression is associated with reduced risk of disease recurrence.// BMC Cancer. -2009.-v.9.-p.253

79. Van't Veer L.J., Dai H., van de Vijver M.J. et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.//Nature .-2002.- 415 .-p.530 -536

80. Watson M.A., Dintzis S., Darrow C.M., Voss L.E., DiPersio J., Jensen R., Fleming T.P.: Mammaglobin expression in primary, metastatic, and occult breast cancer // Cancer Research.- 1999.- 59 p. 3028-3031

81. Watson MA., Fleming T.P. Isolation of differentially expressed sequence tags from human breast cancer // Cancer Research.-1994.-54.-p.4598-4602

82. Watson M.A., Fleming TP. Mammaglobin, a mammary-specific member of-bthe uteroglobin gene family, is overexpressed in human breast cancer // Cancer Research.- 1996.-56.-p.860-865

83. Wong M. L., Medrano J.F., Real-time PCR for mRNA Quantitation // Biotechniques.-2005.- 39.-p. 75-85

84. Wong S.C., Lo S.F., Cheung M.T. at all.: Quantification of plasma beta-catenin mRNA in colorectal cancer and adenoma patients // Clinical Cancer Research.-2004.- 10.-p.l613-1617

85. Zach O, Kasparu H, Wagner H, et al: Mammaglobin as a marker for the detection of tumor cells in the peripheral blood of breast cancer patients. // Annals of the New York Academy of Sciences.-2000.- 923.-p.343-345

86. Zafrakas M , Petschke В , Donner A , Fritzsche F , Kristiansen G , Kniichel R , Dahl E. Expression analysis of mammaglobin A (SCGB2A2) and lipophilin В

87. SCGB1D2) in more than 300 human tumors and matching normal tissues reveals their co-expression in gynecologic malignancies. // BMC Caiicer.-2006.- 6.-p. 88.

88. Zehentner B.K., Dillon D.C., Jiang Y., et al. Application of a multigene reverse transcription-PCR assay for detection of mammaglobin and complementary transcribed genes in breast cancer lymph nodes.// Clinical chemistry.- 2002.-48.-p. 1225-31.

89. Zehentner B.K., Feng Q., Dillon D.C., et al. Molecular and cellular markers for breast cancer // Proceedings of the American Association for Cancer Research.-2002.-43.-p.40

90. Zuo L., Li L., Wang Q., Fleming T. P., You S. Mammaglobin as a potential molecular target for breast cancer drug delivery. // Cancer cell international.-2009.- v.9 .- p.8